Спосіб лікування гліобластоми тимозином-a1

1. Спосіб лікування гліобластоми, згідно з яким хлоретилнітрозосечовину вводять в комбінації з пептидом тимозин- a 1 (ТА1). 2. Спосіб за п.1, де хлоретилнітрозосечовина означає BCNU. 3. Спосіб за п.2, де BCNU вводять у дозі 150200мг/м 2. 4. Спосіб за п.1, де пептид ТА1 означає тимозинa 1 і вводять його в дозі від 0,001мг/кг маси тіла/день до 10мг/кг маси тіла/день. 5. Спосіб за п.4, де тимозин- a 1 вводять в дозі 0,02 мг/кг маси тіла/день. (19) (21) 20040705523 (22) 10.12.2002 (24) 15.02.2007 (86) PCT/US02/39329, 10.12.2002 (31) 60/337,149 (32) 10.12.2001 (33) US (46) 15.02.2007, Бюл. № 2, 2007 р. (72) Вондс Джек Р., US, Де Ла Монте, US (73) РОД АЙЛЕНД ХОСПІТЛ, US (56) GAR ACI ET AL.: 'Th ymosin alpha 1 in the treatment of cancer: from basic research to clinical application' INT. J. IMMUNOPHAR MACOL. vol. 22, 2000, pages 1067-1076 WO, A, 01/82949, 08.11.2001 3 77999 4 нах мозку (наприклад, Aquafedda й ін.). Комбінація Фіг.1 показує, що тималфазин мінімально кармустин плюс радіотерапія давала скромний впливає на життєздатність і мітохондріальну фунвиграш у тривалій (18-місячній) виживаності пацієкцію клітин 9L. нтів, уражених злоякісною гліобластомою, у порівФіг.2 показує посилену експресію проапоптонянні з однією радіотерапією, хоча відмінності між тичних генів у клітинах 9L, які піддані впливу тимакривими виживаності були незначними, на рівні лфазину протягом 72 год. 0,05 (Walker, 1980). Фіг.3 показує, що тималфазин (THY) робить гліобластомні клітини 9L більш чутливими до зниТимозин a1 (тималфазин) являє собою пептид щення окисним стресом або хіміотерапією з з 28 амінокислот, синтетичну форму природної BCNU. сполуки, яка знайдена в системі кровообігу (Bodey, Фіг.4 показує, що тималфазин робить гліобла2000; Bodey, 2001). Тималфазин стимулює ріст і стомні клітини 9L більш чутливими до опосередкодиференціювання тимоцитів, продукцію IL-2, реваного гранзимом В знищення; панель А показує цепторів Т-клітинного IL-2, IFN-g і INF-a (Andreone, вплив на клітини, піддані впливу наповнювача або 20001; Sztein, 1989; Knutsen, 1999; Spangelo, 2000; тималфазину (24год. - гострий, 72год. - хронічний), Tijerina, 1997; Garbin, 1997; Attia, 1993; Cordero, потім розділені для додаткової обробки наповню1992; Baxevamis, 1994 й 1990; Beuth, 2000). Тимавачем протягом 1год., і панель (В) показує вплив лфазин застосовувався в клінічних випробуваннях на клітини, піддані впливу наповнювача або тимадля лікування інфекції, яка викликається вірусом лфазину (24год. - гострий, 72год. - хронічний), погепатиту В (L-Y Chan, 2001), гепатиту С (H.L. Chan, тім розділені для додаткової обробки наповнюва2001; Sherman, 1998; Schinazi), карцином легені чем протягом 3год. або голови й шиї, меланоми (Bodey, 2000 й 2001; Фіг.5 показує часовий хід розвитку клінікоGaraci, 2000) і синдрому набутого імунодефіциту нейропатологічних аномалій після імплантації (AIDS) (Billich, 2002). Багатообіцяючі результати 10000 гліобластомних клітин 9L у праву лобову цих досліджень разом з доказом зниженої Тчастку головного мозку дорослих щурів Long клітинної сприйнятливості гліобластом привели до Evans. даної роботи, яка оцінює потенційну терапевтичну Фіг.6 показує вплив BCNU і комбінації вигоду імунотерапії тималфазином при лікуванні BCNU+тималфазин (THY) на прогресування гліобзлоякісних гліом і яка визначає механізми, за якиластоми in vivo. ми тималфазин проявляє свою протипухлинну дію. Фіг.7 показує знижене гліобластомне навантаГліобластоми є високозлоякісними новоутвоження й 25% вилікування в щурів, оброблених реннями центральної нервової системи, які майже комбінацією BCNU+тималфазин (THY). завжди мають фатальний результат у межах 12 У цей час знайдено, що тималфазин може помісяців від постановки діагнозу. Недавні дослітенціювати опосередковане імунною системою дження показали, що імунотерапія з використанзнищення клітин гліобластоми, що уможливлює ням прозапальних цитокінів, таких, як IL-2 або ILйого застосування як ад'юванта в комбінації із 12, може збільшити виживаність пацієнтів із гліобхлорнітрозосечовиною як хіміотерапевтичної споластомами. Тимозин a1 (тималфазин) являє солуки ефективної антигліобластомної терапії. бою пептид тимусу, який діє як імуномодулятор, Винахід застосовний до пептидів тималфазину збільшуючи продукцію IL-2 і Т-клітинну проліфера(ТА1), включаючи природний ТА1, а також синтецію. Дана робота демонструє значно знижене пухтичний ТА1 і рекомбінантний ТА1, який має амінолинне навантаження й посилену відповідь лімфокислотну послідовність природного ТА1, амінокисмононуклеарних запальних клітин у пацієнтів, яких лотну послідовність в основному подібну до нього лікували комбінацією тималфазин+BCNU, у порівабо його скорочену форму і їх біологічно активні нянні з усіма іншими групами. Експерименти in аналоги, які мають заміщену, укорочену, подовжеvitro продемонстрували, що обробка тималфазину, замінену або по-іншому модифіковані послідоном не мала прямого впливу на життєздатність вності, які мають біологічну активність, по суті поабо мітохондріальну функцію в культивованих клідібну до активності ТА1, наприклад, пептид, що є тинах 9L. Однак обробка тималфазином приводипохідним ТА1, який має достатню амінокислотну ла до значного підвищення рівнів експресії проагомологію з ТА1, так що він функціонує по суті тим поптотичних генів, включаючи FasL, FasR й TNFaже самим чином й в основному з такою ж активнісIR (65,89%, 44,08% й 22,18%, відповідно). Крім тю, як ТА1. того, обробка тималфазином робила клітини 9L Дослідження in vivo з використанням експерибільш чутливими до окисного стресу, так що звиментальної моделі гліобластоми демонстрували, чайні не летальні дози перекису водню вбивали що в той час як обробка з BCNU повинна значно 30-50% клітин 9L, які були оброблені тималфазизнижувати пухлинне навантаження, відповіді були ном. Подальші дослідження виявили, що тималнеоднорідними, у багатьох випадках не дають дефазин підсилює чутливість клітин 9L до В- (Ттектованих реакцій. Однак обробка комбінацією клітинного) гранзиму або опосередкованої BCNU тималфазин+BCNU забезпечувала значний теразагибелі. Результати показують, що тималфазин певтичний виграш як відносно зниження середньопідсилює опосередковану хлоретилнітрозосечовиго пухлинного навантаження, так і вилікування ною ліквідацію гліобластоми in vivo і що тималфапухлин приблизно в 25% випадків. Опосередковані зин опосередковує свої ефекти шляхом активації комбінацією тималфазин+BCNU зниження пухлинпроапоптотичних механізмів, роблячи злоякісні ного навантаження були асоційовані зі збільшенклітини більш чутливими до окисного стресу й ням лімфо-мононуклеарних клітинних інфільтратів знищення за допомогою гранзиму В (Т-клітинного) всередині й навколо злоякісних клітин у мозку. У або хіміотерапії. 5 77999 6 випадках, коли не було знайдено залишкової пухня базальної експресії генів виживаності. Щоб долини, були визначені тільки тканина гліотичного сліджувати цю гіпотезу, заявники визначили, чи є рубця й слабке запалення, асоційовані з початкооброблені тималфазином клітини більш чутливими вими клітинними інфільтратами. Вилікування гліодо окисного стресу або до загибелі, опосередкобластоми спостерігали приблизно в 25% груп, обваної хлоретилнітрозосечовиною. Дослідження роблених низькими дозами й високими дозами показали, що після обробки тималфазином протякомбінації тимал фазин+ВCNU. гом 24 або 72год. сублетальні концентрації переДосить несподівана знахідка полягала в тому, кису водню або BCNU вбивали 25% або 40%, відщо гр упи, які одержували тільки тималфазин, харповідно, клітин 9L. Отже, принаймні деякі з ефектів чувалися так само, як контрольна, або гірше. Частималфазину швидше були опосередковані його то мозки оброблених тималфазином щурів були дією на пухлинні клітини, ніж були тільки результабільше опухлими й виходили за межі ділянки четом імунної модуляції й рекрутменту Т-клітин і марез запалення й набряк, що з'єднався із масою крофагів. пухлини, яка росте. Щодо цього примітний той Були встановлені імуномодулюючі властивості факт, що щури, оброблені більш низькою конценттималфазину й споріднених молекул. їх головними рацією комбінації тималфазин+BCNU, мали кращі ефектами є посилення продукції прозапальних показники, ніж ті, які були оброблені більш висоцитокінів і проліферації лімфоцитів. Активовані Ткою концентрацією тималфазин±ВСNU, оскільки лімфоцити вбивають клітини-мішені за допомогою загибель пухлинних клітин була однаковою у двох взаємодій генів FasL-FasR і шляхом активації сисгрупах, але набряк й утворення грижі переважали теми перфорин-гранзим. Виявлення підвищеної в групі, яка одержувала більш високу концентраекспресії FasL/FasR в оброблених тималфазином цію тималфазину. гліобластомних клітинах 9L припускає, що активоОтже, обробка одним тималфазином не знивані Т-клітини могли б ефективно вбивати ці клітищувала гліобластоми й, можливо, була пошкоджуни-мішені за допомогою взаємодій генів FasLвальною завдяки надлишковому набряканню за FasR. Однак, використовуючи новий аналіз in vitro, відсутності супутньої загибелі клітин. Результати створений із застосуванням SLO (агента, що спридалі дозволили припустити, що тималфазин має яє проникності) і рекомбінантного гранзиму В заслабке або не виявляє прямого цитотоксичного мість Т-клітин. заявники продемонстрували, що вітливу на клітини злоякісних пухлин і що додаткооброблені тималфазином гліобластомні клітини 9L ва загибель пухлинних клітин, яка спостерігається швидко гинули, піддаючись впливу SLO і гранзиму при обробці комбінацією тималфазин+BCNU, була В. Ці знахідки припускають, що тималфазин може опосередкована непрямими діями тималфазину. У ефективно сприяти опосередкованій імунною сисмозку оброблених тималфазином щурів виявлення темою загибелі гліобластомних клітин декількома підвищеної щільності лімфо-мононуклеарних зашляхами: (1) збільшенням базальних рівнів експальних клітин, які були охарактеризовані як перепресії проапоптотичних генів, роблячи клітини важно Т-клітини й макрофаги, дозволило припусбільш чутливими до окисного стресу і цитотоксичтити, що тималфазин відіграє важливу роль у них/хіміотерапевтичних агентів; (2) збільшення рекрутингу ефекторних імунних клітин у злоякісних рівнів FasR, який міг би взаємодіяти з FasL на акпухлинах. тивованих Т-клітинах і привести до прискореного Була проведена серія експериментів in vitro, апоптозу; і (3) рекрутингом активованих Т-клітин і щоб визначити механізм, за яким тималфазин макрофагів і посиленням опосередкованої перфоопосередковує свої антигліобластомні впливи. рином-гранзимом загибелі пухлинних клітинПочаткові дослідження визначили, що тималфазин мішеней. Крім того, результати чітко вказують на не має прямої цитотоксичної дії на клітини гліобте, що обробка тималфазином гліобластом ефекластоми. Те ж саме було правильно для інших тивна при використанні в комбінації із хлоретилнітипів клітин, включаючи клітини нейробластоми й трозосечовинами, але не як єдиний агент. Резульпостмітотичні кортикальні нейрони. Щоб розширитати забезпечують істотний доказ того, що ти ці дослідження заявники оцінювали, чи впливає тималфазин, введений поодинці, може бути шкіднесприятливо тималфазин на функцію клітин й, ливим через посилене набрякання й запалення можливо, робить їх більш чутливими до апоптозу. при мінімальній загибелі пухлинних клітин. Отже, Щоб це здійснити, заявники досліджували рівні найбільш підходящою роллю для тималфазину експресії генів, які діють на користь апоптозу й при терапії гліобластом є роль як допоміжного виживаності, а також гена росту й « ха ускипінг» агента для посилення імунної відповіді хазяїна й гена. Ці дослідження виявили, що обробка тималзнищення залишкових пухлинних клітин, які перефазином протягом 24 або 72 год приводить до жили загальноприйняту хіміотерапію. значного підвищення рівня проапоптотичних генів На закінчення робота, описана в контексті, у клітинах гліобластоми 9L. Подібні результати демонструє, що тималфазин має антигліобластобули отримані для нейробластомних клітин Sy5y. мну дію, яка опосередковується декількома шляУ клітинах 293 відзначений той же феномен, за хами, включаючи: (1) модуляцію генів проапоптовинятком того, що механізми, які діють на користь зу/виживаності, що приводить до підвищеної виживаності, були інгібовані, і проапоптотичні гени чутливості п ухлинних клітин до окисного стресу не піддавалися впливу. Ці знахідки припускають, або цитотоксичних/хіміотерапевтичних агентів; (2) що хоча тималфазин не має прямої цитотоксичної активацію опосередкованих FasR-FasL каскадів дії, він може робити клітини більш чутливими до загибелі імунних клітин; і (3) посилення чутливості цитотоксичних агентів шля хом посилення базальклітин-мішеней до опосередкованої перфориномної експресії проапоптотичних генів або ослабленгранзимом загибелі імунних клітин. Однак терапе 7 77999 8 втичні ефекти тималфазину у відношенні його ансироватки (FCS), 2мМ L-глутаміну й 100мкМ не тигліобластомних властивостей залежали від сунезамінних амінокислот (Gibco-BRL, Grand Island, путнього введення хлоретилнітрозосечовин, підNY). Всі клітинні лінії витримували при 37°С у звокреслюючи тим самим, що тималфазин був би ложеній атмосфері, яка містить 5% СО2. Клітинні більш підходящим як ад'ювантний імуномодулялінії були отримані від Американської колекції титор, а не певний протипухлинний агент. Очевидно пів культур і були сертифіковані як вільні від патотакож, що при комбінуванні з іншими хіміотерапевгенів. тичними сполуками тималфазин проявляв би поОбробка тимозином αϊ: для гострої обробки дібні позитивні ефекти в полегшенні зменшення клітини, висіяні в 96-лункові планшети при щільнопухлинного навантаження, прогресування й рецисті клітин 20000клітин/лунку, обробляли 10-5Μ тидивів при значно більш високих швидкостях, ніж ні, малфазину протягом 24год. Клітини, оброблені що спостерігаються тепер при загальноприйнятій хронічно тималфазином, вирощували у флаконах хіміотерапії. й обробляли кожні 24год. із 10-5Μ тималфазину Винахід застосовний до нативного (тобто до (доданого у свіжому середовищі) протягом всієї природного) тималфазину, а також до синтетичнообробки (3 дні). Крім того, для визначення кривої го тималфазину й рекомбінантного тималфазину, доза-відповідь на тималфазин для клітин 9L клітиякий має амінокислотну послідовність нативного ни обробляли розведеними за серіями кількостями тимозину, амінокислотних послідовностей в оснотималфазину, одержуючи концентрації тималфавному подібних до нього, або скороченої його позину в діапазоні від 50мкМ до 0,022мкМ. слідовності і їх біологічно активних аналогів, які Перекис водню використали, щоб індукувати у мають заміщені, укорочені, подовжені, замінені клітинах окисний стрес. Клітини, які були оброблеабо іншим способом модифіковані послідовності, ні тималфазином або наповнювачем протягом які мають біологічну активність, по суті подібну до 24год, були піддані дії перекису водню з діапазоактивності тималфазину. ном концентрацій від 9мкМ до 1,8мкМ і потім оціВиділення, характеристика й застосування тинювалися на життєздатність і мітохондріальну фумалфазину описане, [наприклад, у патентах US нкцію, використовуючи аналізи з барвниками 4079127, 4353821, 4148788 й 4116951]. Кількість кристалічний фіолетовий (CV) і тіазоліл голубий тималфазину, необхідна для того, щоб домогтися (МТТ), як описано. В експериментах, у яких розвепотрібного ступеня потенціювання хіміотерапевтидені за серіями кількості тималфазину вводили в чного ефекту BCNU, може бути визначена за доклітини, постійну кількість 1,8мМ перекису водню помогою рутинних експериментів титрування дози. використали для обробки клітин. Для клітин 9L Було знайдено, що тималфазин безпечний для була побудована крива перекису водню для того, людини при введенні в таких високих дозах, як щоб визначити точну концентрацію перекису вод16мг/кг маси тіла/день. Переважна доза тималфаню, якою обробляти клітини. зину знаходиться в діапазоні 0,001мг/кг маси тіМТТ-аналізи проводили на клітинах ліній 9L й ла/день до 10мг/кг маси тіла/день, доза приблизно 293, щоб визначити вплив обробки тималфазином 0,02мг/кг маси тіла/день є найбільш переважною. й індукованого перекисом водню окисного стресу Хлорнітрозосечовина може бути введена в дона мітохондріальну функцію клітин. Після обробки зі приблизно 90-250мг/м 2 за допомогою ін'єкції, додавали 10мкл МТТ у кожну лунку, що містить перорально, за допомогою біодеградованої капсу100мкл середовища. Планшети інкубували з барвли або якими-небудь іншими звичайними спосоником МТТ у термостаті на 37°С впродовж 15хв.бами, відомими фахівцям. Вона може бути дана як 1год. залежно від типу клітин. Потім середовище однократна доза або розділена на щоденні ін'єкції, видаляли, і в кожну лунку додавали 200мкл підкитакі, як 75-100мг/м 2, на два послідовних дні. Насленого ізопропанолу. Планшети стр ушували при ступне дозування від початкової дози повинно кімнатній температурі доти, поки не відбувався бути скоректовано відповідно до гематологічної лізис, потім зчитували при 540нм на приладі Packвідповіді пацієнта на попередню дозу. Аналіз крові ard SpectraCount™. повинен реєструватися щотижня, і повторні курси Кристалічний фіолетовий (CV) також викорисне повинні даватися раніше 6 тижнів через те, що тали для фарбування клітин в 96-лункових плангематологічна токсичність є відстроченою й кумушетах. Після відділення середовища в кожну лунку лятивною. Переважною хлоретилнітрозосечовидодавали 20мкл кристалічного фіолетового й ною є та, яка може бути введена в дозі 150струшували при кімнатній температурі протягом 200мг/м 2 внутрішньовенно кожні 6 тижнів. BCNU 10хв. Потім планшети промивали декілька разів може бути також введена шляхом імплантації біотеплою водою й сушили. У кожну лунку додавали деградованих капсул (наприклад, Gliadel, Guilford 100-200мкл (залежно від щільності клітин) ЗФР Pharmaceuticals) безпосередньо в ложі пухлини. об./1% додецилсульфат натрію (SDS). Планшети Якщо введення відбувається за допомогою біодеінкубували при кімнатній температурі на вібраторі градованої капсули, тималфазин, який співводитьдоти, поки клітини не були достатньо лізовані. ся, можна зручно об'єднати з BCNU безпосередПланшети зчитували при 540нм, щоб визначити ньо в капсулі. відмінності в життєздатності клітин між різними досліджуваними групами. Приклад 1: обробка тимозином a1 ліній пухМікротитраційні імуноцитохімічні імунофермелинних клітин 9L й 293 Лінії пухлинних клітин: щурячі клітини гліоблантні (MICE) аналізи (de la Monte, 1999) були проведені на клітинах 9L й 293. Клітини висівали в 96стоми 9L і клітини нирки людини 293 підтримували лункові планшети, обробляли 10-5Μ тималфазив модифікованому Дюльбекко середовищі Ігла ном протягом 24год., фіксували гістологічно протя(DMEM) з додаванням 5% ембріональної телячої 9 77999 10 гом ночі перед дослідженням, використовуючи (дані не наведені). Таким чином, результати МІСЕМІСЕ-аналіз. Фіксовані клітини просочували 0,05% аналізів вказують, що на двох лініях клітин тималсапоніном у трис-забуференому фізіологічному фазин діє за різними шляхами, щоб підвищити розчині (TBS) (50мМ трис, рН7,5, 0,9% хлористий чутливість клітин до клітинної загибелі шляхом натрій) блокували з Superblock-TBS (Pierce, Rockапоптозу. ford, IL) і потім інкубували протягом ночі при 4°С з Підтвердження здатності тималфазину підвипервинними антитілами до антигену ядра проліщувати чутливість клітин 9L й 293 до апоптозу феруючо ї клітини (PCNA), bcl-2, h21/Wwaf-1, p53, було отримано при дослідженні індукованого пеFasL, FasR, TNF-R1 або GAPDH, кожне розведене рекисом водню окисного стресу. Як визначено за до 0,5-1мкг/мл в TBS, що містить твін-20 й 0,5% МТТ-аналізами, клітини 9L, оброблені тималфазибичачий сироватковий альбумін (TBST-BSA). Імуном протягом 24год. і згодом перекисом водню нореактивність визначали, використовуючи перокпротягом 24год., дійсно виявляли значну втрату сидазу хрону, кон'юговану вторинним антитілом життєздатності в порівнянні із клітинами 9L, обро(Pierce, Rockford, IL) і розчинний субстрат тетрабленими тільки перекисом водню протягом 24год. метилбензидин (ТМВ) (Pierce, Rockford, IL). Реакції (Фіг.3). Клітини 9L, оброблені тималфазином й зупиняли додаванням 1Μ сірчаної кислоти й вимі270мкМ перекисом водню, демонстрували знирювали поглинання при 450нм на приладі для зчиження функціонування мітохондрій на 26,6%, як тування мікропланшет Spectracount (Packard Inвидно за МТТ-аналізом, у порівнянні із клітинами strument Co., Meriden, CT). Потім щільність клітин 9L, обробленими тільки 270мкМ перекисом водню вимірювали фарбуванням прирослих клітин з бар(Фіг.3). Подібні результати були отримані при вивником кумасі голубий і визначенням поглинання користанні клітин 293 в аналізах як мішеней (дані елюйованого барвника (de 1a Monte, 1999). Індекс не наведені). MICE склав розраховане співвідношення поглиПриклад 2: дослідження індукованого гранзинання ТМВ і кумасі голубого, визначене в тій же мом апоптозу культуральній лунці. Використали середнє значенДослідження за допомогою МІСЕ-аналізу, опиня ± стандартне відхилення (SD) результатів, сані вище, демонстрували індуковану тималфазиотриманих від 16 повторюваних культуральних ном експресію TNF-R1, FasL й FasR у клітинах 9L лунок, для міжгрупових статистичних порівнянь. гліобластом. Для того щоб визначити диференціаПервинні експерименти, у яких клітини 9L були льну чутливість гліобластомних клітин 9L, обробоброблені протягом 24год. різними концентраціялених (чи ні) тималфазином, до апоптозу, індукоми тималфазину, показали незначне ослаблення ваного цитотоксичними Т-лімфоцитами (CTL), функціонування клітинних мітохондрій, як видно за проводили експериментальні аналізи, у яких клітиМТТ-аналізами (Фіг.1). Вимірювали мітохондріальни 9L обробляли тималфазином як гостро протяну функцію, оскільки клітинна загибель може бути гом 24год., так і хронічно протягом 72год., після опосередкована скоріше дисфункцією мітохондрій, чого вони були вирощені, пересіяні в 96-лункові а не апоптозом або некрозом. Дослідження дечорні планшети (7,5´105клітин/75мкл/лунку) і підмонстрували подібні рівні життєздатності й МТТдані дії 20000одиниць/мл стрептолізину О (SLO) активності в обробленому наповнювачем контролі плюс 100нг рекомбінантного гранзиму В (реакційй оброблених тималфазином культурах (Фіг.1), ний об'єм 100мкл) протягом 1 або 3год. при 37°С. вказуючи на те, що тималфазин не має прямої Використали SLO замість перфорину, щоб зробити цитотоксичної дії на клітини гліобластоми 9L, що клітини проникними, а рекомбінантний гранзим В співпадало з результатами in vivo. Подібні резульвикористали для стандартизації аналізу. Контротати були отримані й у відношенні інших клітинних льні дослідження включали паралельні реакції, у ліній, включаючи ниркові клітини 293 і нервові кліяких SLO, гранзим В або обидва були виключені. тини SH-Sy5y (дані не наведені). Щільність життєздатних клітин вимірювали, викоОскільки тималфазин не має прямої цитотокристовуючи АТФ люмінесцентний аналіз ATPlite сичної дії, були досліджені інші потенційні механі(Packard Instrument Company, Meriden, CT), який зми, за якими тималфазин може функціонувати, мав широкий лінійний динамічний діапазон, що щоб інгібувати ріст гліобластом. Щодо цього докорелює відносні світлові одиниці із щільностями сліджували експресію генних продуктів, які актиклітин між 103 до 106 клітин на культуральну лунку. вують або апоптоз, або виживаність клітин, викоЗлоякісні пухлинні клітини знищуються in vivo ристовуючи експресію гена «хаускіпинг» як цитотоксичними Т-клітинами й макрофагами, які контроль. Дослідження проводили в 96-лункових обновляються за допомогою прозапальних цитокіпланшетах, використовуючи мікротитраціоний імунів, таких, як IL-2 й IL-12. Цитотоксичні Т-клітини ноцитохімічний імуноферментний (MICE) аналіз, знищують пухлинні клітини шляхом вивільнення щоб генерувати дані від множинних повторюваних перфорину, який викликає утворення отворів у культур. Обробка тималфазином протягом 24 год мембранах клітин-мішеней, і гранзиму В, який випривела до значно підвищених рівнів FasR кликає ензиматичну деструкцію й загибель клітин(44,8%), FasL (65,89%) і TNF-R1 (22,18%) відносно мішеней. Для вивчення потенційної ролі тималфаоброблених наповнювачем контролів (р