Спосіб і пристрій для виявлення дуже малих кількостей частинок

1. Спосіб виявлення малих кількостей частинок шляхом реєстрації преципітатів антигенантитіло, який включає: - приготування пробного флюїду, який містить в основному частинки з певним максимальним розміром, причому частинки мають принаймні два місця зв'язування антитіл; - приготування флюїду, що містить антитіло, в якому частинки мають в основному певний максимальний розмір; - контактування пробного флюїду з флюїдом, що містить антитіло, в результаті чого отримують реакційний флюїд, причому антитіло у присутності частинки з принаймні двома місцями зв'язування антитіл може утворювати преципітат антигенантитіло; - пропускання світлового променя крізь реакційний флюїд; - реєстрацію сигналу шляхом вимірювання фотоприймачем екстинкції на межі світло-темрява світлового конуса, що утворюється при проходженні лазерного променя крізь вимірювальну камеру з реакційним флюїдом, причому сила сигналу залежить від величини і кількості утворених преципітатів антиген-антитіло. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що чутливість виявлення частинок перебуває у фемто- і аттомолярному діапазоні. 3. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, який відрізняє ться тим, що стадія приготування пробного флюїду, що містить в основному частинки з певним максимальним розміром, включає: a) приготування флюїду, додавання проби до флюїду і відокремлення частинок, розмір яких пе 2 (19) 1 3 85560 4 - вимірювальну камеру і - фотоприймач, виконаний зі здатністю вимірювання екстинкції на межі світло-темрява світлового конуса, утвореного при проходженні лазерного променя крізь вимірювальну камеру, що містить частинки у флюїді. Винахід стосується способу і пристрою для виявлення дуже малих кількостей частинок шляхом реєстрації продуктів реакції антиген-атитіло, причому спосіб має дуже високу чутливість - аж до фемто - чи аттомолярного діапазону. Із рівня техніки відомі різні способи для виявлення дуже малих кількостей частинок наприклад, нефелометричний і турбідиметричний способи, а також спосіб, що має назву DLS (dynamic-lightscattering=динамічне розсіювання світла). При нефелометричному і турбідиметричному способах використовують е фект Тіндалла (Tyndall), згідно з яким при освітленні маленької частинки виникає ширококутне розсіяне світло. Розсіяння світла можна зареєструвати або шляхом вимірювання ослаблення інтенсивності падаючого світлового променя після проходження через розсіювальне середовище або шляхом визначення інтенсивності відхиленого вбік світла. У першому разі говорять про метод турбідиметрії або вимірювання поглинання світла, а у другому разі - про власне нефелометрію чи тіндаллометрію. Інший підхід пропонує метод, що називається методом динамічного розсіювання світла (dynamiclight-scattering=DLS). При цьому методі розглядають лише одну (або кілька) точок на світловій сфері, що охоплює частинку, і оцінюють додатково модуляцію яскравості, викликану броунівським рухом молекул. Шляхом фокусування на одному єдиному спостережному об'ємі намагаються зменшити перешкодні накладення розсіяного світла від кількох частинок. Внаслідок цього частинка пролітає маленький освітлений об'єм дуже швидко, тому оптоелектронна схема має розпізнавати значні флуктуаційні частоти. Обробка таких сигналів є дуже витратною, тому ця система може бути застосована для кількісного аналізу лише умовно. До того ж відомі із рівня техніки способи виявлення мають інші недоліки. Першим слід згадати те, що, хоча чутливість виявлення описаних вище способів останніми роками значно зросла, у найрізноманітніших галузях є гостра потреба у способі виявлення з вищою чутливістю. Крім того, відомі із рівня техніки способи виявлення потребують наявності все ще порівняно великих кількостей пробного матеріалу, що зокрема у медично-технічних застосуваннях може бути пов'язано зі значним навантаженням для обстежуваної особи. Тому задачею винаходу є розробка способу виявлення невеликих кількостей частинок, який має вищу чутли вість, ніж способи рівня техніки. Згідно з винаходом ця задача вирішена у способі виявлення незначних кількостей частинок шляхом реєстрації преципітатів антиген-антитіло, який включає: приготування пробного флюїду, який містить в основному частинки з певним максимальним розміром, причому частинки мають принаймні два місця зв'язування антитіл; приготу вання флюїду, що містить антитіло, який містить в основному частинки певного максимального розміру; контактування пробного флюїду з флюїдом, що містить антитіло, в результаті чого отримують реакційний флюїд, причому антитіло у присутності частинки з принаймні двома місцями зв'язування антитіл може утворювати преципітат антигенантитіло; пропускання світлового променя крізь реакційний флюїд; реєстрація сигналу шляхом вимірювання фотоприймачем екстинкції на межі світло-темрява світлового конуса, що утворюється при проходженні лазерного променя крізь вимірювальну камеру з реакційним флюїдом, причому сила сигналу залежить від величини і кількості утворених преципітатів антиген-антитіло. Крім того, задача винаходу вирішена у пристрої для реєстрації невеликих кількостей частинок, який містить: джерело світла, вимірювальну камеру і фотоприймач, розрахований на здійснення вимірювання екстинкції на межі світло-темрява світлового конуса, що утворюється при проходженні лазерного променя крізь вимірювальну камеру, в яку поміщено флюїд з частинками. Розсіяне вперед світло утворює конус, на межі світлотемрява якого встановлений фотоприймач. Лазер і фотоприймач розміщені в основному на одній осі, одначе з таким зміщенням, що лазерний промінь проходить мимо фотоприймача зовсім поруч. Короткий опис фігур На фігурах схематично зображено: Фіг.1a-d Процеси при утворенні преципітату антиген-антитіло із використанням бівалентного антитіла. Фіг.2а Результат реєстрації із застосуванням відповідного винаходові способу, причому пробний флюїд, що містить частинку, досліджували після фільтрації фільтром з розмірами пор 200нм (до додавання антитіла). Сигнали відповідають частинкам, діаметр яких менший, ніж пори фільтра. По осі x відкладено розмір частинок, по осі у - кількість частинок. Фіг.2b Результат реєстрації, причому була досліджена реакційна суміш, отримана після одночасного окремого впорскування профільтрованих фільтром з розміром пор 200нм розчинів пробного флюїду і флюїду з антитілом. У цій реакційній суміші здійснювали реакцію і отримували мікропреципітати, діаметр яких більший, ніж пори використовуваного фільтра. По осі x відкладено розмір частинок, по осі у - кількість частинок. Фіг.3 Установка для здійснення відповідного винаходові способу. Під час численних дослідів, що привели до цього винаходу, вдалося розробити спосіб, чутливість якого у 1000 разів перевищує чутливість порівнюваних способів рівня техніки. Таке значне підвищення чутливості базується на зміненому фізичному методі реєстрації, при якому здійснюють реєстрацію сигналу шляхом вимірювання фо 5 85560 топриймачем екстинкції на межі світло-темрява світлового конуса, що утворюється при проходженні лазерного променя крізь вимірювальну камеру з реакційним флюїдом у поєднанні з аналітичним приготовленням проби, узгодженим з таким методом вимірювання. Крім того, цей винахід дозволяє зменшити об'єм вимірювальної камери приблизно у 30-50 разів. Тоді як способи рівня техніки потребують об'єму вимірювальної камери в діапазоні 1,6мл, у відповідному винаходові способі можуть бути використані вимірювальні камери в діапазоні мікролітрів (близько 40мкл). Це надає значної переваги, оскільки кожна проба для отримання уніфікованої матриці, яка має, наприклад, однакову прозорість, в'язкість і т.п., має бути розведена; у порівнянні зі способами рівня техніки для відповідного винаходові способу проба має бути розведена менше. Крім того, відповідний винаходові спосіб забезпечує зменшення необхідної кількості матеріалу проби. Тоді як способи рівня техніки потребують понад 100мкл, для відповідного винаходові способу достатніми є кількості матеріалу проби, у багато разів менші (близько 3,5мкл). Термін «частинка» у смислі даної заявки означає усяку тривимірну структур у, що має коефіцієнт заломлення, відмінний від коефіцієнта заломлення несучого середовища. Термін «преципітація» у смислі даної заявки описує здійснюваний при реакції розчинних антигенів зі специфічними антитілами процес утворення комплексу антиген-антитіло, який має меншу розчинність у використовуваному розчиннику, ніж використовуваний антиген чи використовуване антитіло, що веде спочатку до помутніння реакційної суміші, а потім до седиментації цього комплексу антиген-антитіло. Відповідний винаходові спосіб уможливлює виявлення малих кількостей частинок. Наприклад, у разі низькомолекулярних речовин, тобто речовин з молекулярною вагою до 500г/моль, при застосуванні відповідного винаходові способу граничне значення виявлення може досягати діапазону фемто- і аттограмів на літр, тоді як для звичайних способів вона лежить у діапазоні мікро-, нано- чи пікограмів на літр. У разі речовин з молекулярною вагою в діапазоні понад 500г/моль границя виявлення лежить вище; наприклад, у разі речовин з молекулярною вагою 150000г/моль (наприклад, IgG-антитіло) границя виявлення становить близько 300фемтог/л. Це означає, що пробний флюїд може містити частинки в діапазоні фемто- чи аттомоль на літр. На першій частковій стадії відповідного винаходові способу здійснюють приготування пробного флюїду, який містить в основному частинки з певним максимальним розміром. Це може бути здійснено двома шляхами. Згідно з першим варіантом для цього спочатку готують флюїд, який містить в основному лише частинки з певним максимальним розміром, а потім до флюїду додають пробу, що містить в основному частинки з певним максимальним розміром. Згідно з другим варіантом спочатку готують флюїд, пробу 6 додають до флюїду, а потім відокремлюють частинки, що переважають певний розмір. Максимальний розмір частинок у пробному флюїді чи в інши х флюїда х, що містять в основному лише частинки певного максимального розміру, може бути вибраний в залежності від бажаного застосування. При використанні багатьох звичайних антитіл може бути здійснене відокремлення частинок, більших, ніж 20-450нм, переважно більших, ніж 100-300нм, зокрема більших, ніж 200нм. Таке відокремлення може бути здійснене, наприклад, за допомогою фільтрів з відповідним розміром пор: 20-450нм, переважно 100-300нм, зокрема 200нм, або іншим відомим фахівцеві чином. Якщо аглютинацію розглядати приблизно як площину, то зменшення удвічі розміру фільтра для кількості молекул, яка вміщує виявлювані продукти реакції, проявляється у квадратичній залежності. Наприклад, якщо замість 200-нанометрового фільтра використовується 100-нанометровий, то необхідна лише чверть від потрібних при 200-нанометровому фільтрі молекул антиген-антитіло, які мають прореагувати між собою, щоб отримати виявлюваний результат. Додатково до цього, наприклад, у разі використання 25-нанометрових фільтрів є можливість виявляти тримери антиген-антитіло-антиген. Одначе при використанні фільтрів з настільки малими розмірами пор слід працювати дуже уважно, оскільки уже невелика кількість молекул може приводити до реакції, придатної для реєстрації. Для того, щоб могла відбува тися реакція зшивання, наявні у пробному флюїді частинки повинні мати принаймні два місця зв'язування антитіл і діяти таким чином як антиген. Фігури 1a-1d схематично пояснюють, що чужорідні речовини чи частинки, такі як бактерії, віруси, токсини, протеїни, функціонують як антигени і реагують з антитілом за принципом «ключ-замок» (Фіг.1b). При цьому бівалентне антитіло, наприклад, антитіло імуноглобулін G (IgG), зв'язує два антигени (Фіг.1с). Оскільки кожен антиген може зв'язувати кілька антитіл, відбувається зшивання (преципітація), яка реєструється відповідним винаходові способом (Фіг.1d). Для антитіл з вищою валентністю преципітація здійснюється аналогічним чином. У разі, коли використовуваний антиген має більшу кількість місць зв'язування антитіл, реакція зшивання відбувається ще краще. Відповідний винаходові спосіб придатний для будь-яких антигенів, що мають принаймні два місця зв'язування антитіл. Досліджувані частинки повинні мати розмір понад 10нм, і одночасно бути меншими, ніж вибраний максимальний розмір частинок. Молекули, менші, ніж 10нм, можуть діяти як гаптени. Гаптени є неповними антигенами, тобто їх молекулярний розмір не достатній, щоб викликати імунну відповідь чи спричиняти аглютинацію. Ці низькомолекулярні речовини хоча і є високоспецифічними у місці зв'язування антитіла, одначе вивищуються із цих місць зв'язування недостатньо для того, щоб друге антитіло могло приєднатися до них. Вони блокують антитіло, не даючи можливості відбутися реакції зшивання. Більші антигени, наприклад, бактерії, перед вимірюванням мають бути подрібнені відомими фахівцеві хімічними чи 7 85560 фізичними способами, наприклад, шляхом обробки ультразвуком, кислотами, лугами, поверхневоактивними речовинами. При цьому перевагою є те, що таким чином із однієї єдиної бактерії можуть бути отримані десятки фрагментів, і більше не має потреби здійснювати аглютинацію окремих бактерій між собою. Отримані таким чином фрагменти, наприклад, поверхневі протеїни, у свою чергу представляють менші антигени і можуть викликати специфічно вимірювану реакцію із підходящим антитілом. До того ж, антиген має бути в основному розчинним у використовуваному буферному розчині і повинен мати низьку схильність до адсорбції у стінки застосовуваних пристроїв і фільтрів. Крім того, відповідний винаходові спосіб охоплює також приготування флюїду, що містить антитіло. При способі згідно з винаходом в принципі можуть бути використані усі бажані антитіла. Антитілами, які особливо добре зарекомендували себе для здійснення відповідного винаходові способу, є, наприклад, бівалентний імуноглобулін G (IgG) або десятивалентний імуноглобулін Μ (Ig M). При цьому відомим фахівцеві чином можуть бути отримані антитіла з певною специфічністю. До того ж, в залежності від типу частинок, що підлягають виявленню, можуть бути використані також інші антитіла, приналежні до іншого класу антитіл. При цьому антитіла можуть бути моноклональними чи поліклональними. При використанні моноклональних антитіл для здійснення преципітації можуть розглядатися два моноклональних антитіла, орієнтовані на різні антигени. Як уже було сказано стосовно антигену, також і антитіло має бути в основному розчинним у використовуваному буферному розчині і повинне мати низьку схильність до адсорбції у стінки застосовуваних пристроїв і фільтрів. При здійсненні відповідного винаходові способу небажаний, надто великий надлишок антигенів чи антитіл може бути уникнутий різним чином, наприклад, шляхом приготування рядів розведень. Інакше надто великий надлишок антигенів чи антитіл міг би призвести до гальмування преципітації (до так званого «феномену прозони), оскільки при значному надлишку антитіл кожен епітоп (з'єднувальне місце антигена) моновалентно зв'язує лише одне єдине антитіло і перехресне зшивання більше не можливе, або оскільки при завеликому надлишку антигенів часто утворюються тримери із однієї молекули антитіла і двох молекул антигена. Як флюїд - як для приготування пробного флюїду, так і для приготування флюїду, що містить антитіла, в принципі може бути використаний будь-який газ чи будь-яка рідина. Переважним флюїдом є рідина. Часто як про рідину йдеться про воду або відомі із рівня техніки буферні розчини, такі як PBS (phosphate buffered saline=фосфатний буферний солевий розчин), зокрема коли в основу способу аналізу покладена біохімічна реакція. Одначе в принципі у разі рідини може йтися також і про іншу прозору рідину, наприклад про рідкі вуглеводні, кислоти чи луги. 8 На наступній стадії відповідного винаходові способу пробний флюїд вводять у контакт з флюїдом, що вміщує антитіло, причому антитіло у присутності антигена може утворювати преципітат антиген-антитіло, який тепер може бути виявлений з використанням відповідного винаходові пристрою. Крім цього, часто значний інтерес становить визначення наявності гаптенів у пробі. Гаптени є неповними антигенами, тобто вони надто малі, щоб мати змогу зв'язати більше, ніж одне антитіло. Гаптенами можуть бути зокрема фармацевтичні препарати, наркотики, пестициди, отруйні речовини, стероїдні гормони чи мікотоксини. Гаптени специфічно зв'язуються з антитілами. Одначе вони лише блокують паратопи антитіла; ланцюгова реакція відбутися не може. Мінімальний розмір для імуногена (повного антигена) становить від 5 до 10кДа, тобто більше 30 залишків амінокислоти, тобто понад 3нм у довжину, тому що починаючи від цього розміру принаймні дві молекули антитіл зв'язуються з цим антигеном з відповідно наявними епітопами і викликають ланцюгову реакцію, яка багатократно веде до преципітації. Виявлення гаптенів може бути здійснене, наприклад, за допомогою гідрофільних макромолекулярних мультиспейсерів (hmM) або подібних, відомих фа хівцеві сполук. Гідрофільні макромолекулярні мультиспейсери відомі у рівні техніки і містять гідрофільну макромолекулу, наприклад, альбумін. До цієї гідрофільної макромолекули за допомогою відомих із рівня техніки спейсерів хімічно приєднують однакові чи різні молекули гаптенів. У разі, коли гідрофільний макромолекулярний мультиспейсер має щонайменше дві однакові молекули гаптена, він може бути використаний для преципітації. Така молекула може бути використана для тесту виявлення антитіла, який базується на реакції заміщення. Таким чином, у разі гаптенів вимірювальний принцип базується на реакції заміщення, що буде описано далі для прикладу, причому розглядаються лише піки реакцій при негативних пробах, тобто при негативних пробах здійснюється виявлення реакційних продуктів. Якщо проба крові чи слини має бути досліджена на наявність гаптена, наприклад, кокаїну, то до розведеної краплинки крові чи слини додають антитіло, специфічне до кокаїну. Приблизно через хвилину додають невелику кількість синтетично отриманого кокаїнового hmM, тобто гідрофільну макромолекулу, через спейсер зв'язану з молекулами кокаїну. Якщо у пробі є кокаїн, він діє як гаптен і блокує місця зв'язування антитіл. Подальше додавання кокаїнового hmM ілюструє відсутність ефекту. Одначе, якщо у пробі кокаїн був відсутній, то місця зв'язування антитіл не блокуються і додавання кокаїнового hmM веде до утворення ланцюга, яке у формі росту частинок може бути підтверджене відповідним винаходові способом, наприклад, із використанням описаного нижче пристрою Q-MAP. За відповідним винаходові способом світловий промінь, зокрема когерентний світловий промінь, наприклад, лазерний промінь, пропускають крізь досліджувану рідину. Нижче відповідний винахо 9 85560 дові спосіб описується із посиланням на лазерний світловий промінь, одначе це не виключає використання інших, відомих фа хівцеві придатних джерел світла. Наприклад, лазерний промінь може бути вироблений описаним нижче детальніше, відповідним винаходові пристроєм, який називається також пристрій для кількісного вимірювання аттомолярних кількостей продуктів преципітації (Q-MAP=quantitative measurement of attomolar precipitation-products). Одначе альтернативно можуть бути використані також інші пристрої, які можуть бути розроблені фахівцем на основі розкриття суті цього винаходу. Лазер надсилає промінь крізь досліджувану рідину і визначає кількість наявних у ній частинок та їх розмір. При цьому за допомогою фотоприймача здійснюють вимірювання екстинкції на границі світло-темрява світлового конуса, що утворюється при проходженні лазерного променя крізь вимірювальну камеру, що містить реакційний флюїд (причому фотоприймач може мати регульоване підсилення сигналу, а також регульовану робочу точку), тобто пристрій працює як «молекулярний фотоелемент». Описаний нижче пристрій Q-MAP здатен виявляти частинки з розмірами від 20нм до 5мкм, одначе на основі цього вимірювання не можна зробити висновок про структуру чи склад виявлених частинок. Лазер і фотоприймач розміщені майже на одній осі. Лазерний промінь проходить лише трохи зміщеним від фотоприймача. Розсіяне вперед світло утворює конус, на межі світлатемряви якого встановлений фотоприймач. Кожна частинка, що перебуває у флюїді всередині вимірювальної камери і попадає у лазерний промінь, спричинює сигнал, причому кількість сигналів відповідає статистичному розподілу частинок у вимірювальній камері. Коли частинки, навіть найменші, у фокусі лазера проходять крізь світловий конус, вони його затемнюють, дають скачок тіні. Зміну первинної яскравості (без викликаної частинками тіні) вимірюють. Швидкісний комп'ютер, наприклад, Pentium, може розрізняти до 10000 проходів частинок за секунду. Менші частинки рухаються швидше, ніж великі; час проходження є безпосередньою мірою для розміру частинок. У разі одночасного потрапляння кількох частинок до лазерного променя вимірюється лише найбільша. На підставі різних швидкостей, з якими частинки перетинають лазерний промінь, за допомогою відомого фахівцеві рівняння СтоксаЕйнштейна (Stokes-Einstein) можна визначити розміри частинок. При цьому вимірюванні менше значення має абсолютний розмір частинок, ніж зміна розміру частинок (викликана ростом частинок). Вибраний фільтр служить мірою для визначення початку росту частинок. Чим більші пори фільтра, тим більшими повинні стати преципітати, щоб відрізнятися від «основного шуму». При розмірах пор фільтра 100-200нм для утворення придатного для вимірювання сигналу придатні лише деякі вирощені частинки. Оскільки частинки розподілені статистично, ріст частинок також завжди відбувається у фокусі лазера, розміщеному всередині вимірювальної камери. 10 Швидкість, з якою частинки перетинають лазерний промінь, реєструють шля хом вимірювання часу, протягом якого частинка проходить промінь (від початку зміни яскравості до кінця). При цьому виявилося, що чим чистіший розчин, тим вірогідніше перебування однієї частинки у лазерному промені, і відповідно чим брудніший розчин, тим більше сигналів накладаються, що призводить до зменшення чутли вості. Сила сигналу залежить від розміру і кількості преципітатів антиген-антитіло. При сталій концентрації атитіл зростання виміряного сигналу безпосередньо пов'язане з концентрацією антигенів. Відповідне винаходові виявлення може бути здійснене наприклад, таким чином: усі флюїди, що підлягають дослідженню, через фільтр з певним розміром пор впорскують до вимірювальної камери, завдяки чому при дослідженні пробного флюїду чи флюїду, що містить антитіла, для кожного окремо при обробці виникають лише сигнали від частинок, менших від певного розміру. При відповідному винаходові способі як використовувані антитіла, так і використовувані антигени, мають розміри, менші від певного граничного значення, і є, таким чином, меншими, ніж розміри пор фільтра, використаного для відокремлення (наприклад, менше, ніж 200нм), завдяки чому вони при фільтруванні не були відокремлені. На Фіг.2 представлені результати дослідження пробного флюїду на основі розчину NaCI. На цих фігурах вздовж осі x відкладено розмір частинок, а вздовж осі у - кількість частинок. Як видно із Фіг.2а, у розчині наявні лише частинки до певного максимального розміру, причому кількість частинок зменшується зі збільшенням їх розміру. Аналогічний результат дослідження отримують для фільтрованого флюїду, що містить в основному лише частинки певного розміру (не зображено). Після одночасного, роздільного введення пробного флюїду і флюїду з антитілами у вимірювальній камері відбувається реакція з утворенням мікропреципітатів, розміри і кількість яких потім реєструють. Такий результат вимірювання для прикладу наведений на Фіг.2b, на якому видно появу частинок, розміри яких переважають визначений граничний розмір, наприклад, 200нм. Таким чином, утворення більших частинок свідчить про те, що реакція відбулася. Якщо ж реакція з утворенням більших частинок не відбувається, це значить, що досліджувана рідина не містить даного антигена. Вимірювання можуть бути розпочаті у будьякий момент часу після наповнення реакційної камери пробним флюїдом і флюїдом з антитілом. Згідно з доцільною формою виконання цього винаходу вимірювання розпочинають лише через 60 секунд після наповнення вимірювальної камери, оскільки під час впорскування флюїдів легкі коливання потоків можуть привести до конвективних неоднорідностей. Ослаблення вимірювального сигналу, що наступає після цього, уможливлює наближену кількісну реєстрацію чи оцінку різних концентрацій антигена. При цьому початкова концентрація обох учасників реакції грає вирішальну 11 85560 роль. Чим вищі ці початкові концентрації, тим довшим є інтервал часу до вимірюваного зменшення максимуму преципітації. При здійсненні відповідного винаходові способу доцільним є дотримання якомога вищої чистоти використовуваних флюїдів і фільтрування фільтром з розмірами пор наприклад, 200нм, щоб уникнути або мінімізувати вплив основних шумів при реєстрації. Крім того, матеріали, з яких виготовлені застосовувані при здійсненні способу пристрої, повинні виділяти якомога менше частинок. Наприклад, вимірювальна камера може бути виготовлена із політетрафторетилену (ПТФЕ). Для уникнення впливу виділених матеріалами (наприклад, вимірювальною камерою) частинок протягом тривалого часу слід дотримуватися якомога коротшого часу вимірювання. Крім того, концентрації використовуваних розчинів антигенів чи антитіл мають бути настільки низькими, щоб під час реакції антиген-антитіло не утворювалися надто багато чи надто великі преципітати, оскільки в іншому разі кілька частинок одночасно можуть потрапити до променя, що значною мірою утруднило б визначення часу проходження. Найвищу чутливість відповідний винаходові спосіб має у фемто- і аттомолярному діапазоні. Особливою перевагою відповідного винаходові способу є те, що він уможливлює також кількісний чи напівкількісний аналіз. Для оцінки кількісної реєстрації можуть бути застосовані два способи. Згідно з першим способом оцінки визначають площу (F) під вимірювальною кривою у моменти часу t1 і t2 (наприклад, t1=120 секунд, a t2=180 секунд), причому через рівняння FN=(Ft1+F t2):2 отримують добре наближене значення FN для площі, із якого потім може бути отримане чисельне значення кількості частинок. При цих дуже низьких концентраціях ріст частинок лінійний, тобто наприклад, подвоєння концентрації веде до подвоєння площі вимірювального сигналу. Альтернативний і/або доповнюючий метод отримання кількісного висновку базується на розведенні розчинів до досягнення кінетичної границі бімолекулярної реакції. При концентраціях до 100аттомоль вільні довжини пробігу частинок учасників реакції надто великі (>100мкм) і при попередньо заданому часі вимірювання не відбувається преципітація, придатна для реєстрації. При концентраціях понад 10наномоль починається стеричне гальмування внаслідок завеликої кількості і завеликих розмірів продуктів реакції; крім того, проявляється пояснений вище «феномен прозони». При концентрації розчину 10мікромоль вільна довжина пробігу частинки становить уже лише 100нм. Визначений ступінь розведення у цій фізичній кінцевій точці залежить лише від температури і конвекції, оскільки в'язкість при високих розведеннях, наприклад, у PBS, не грає ролі. Якщо ці обидва параметри підтримувати сталими, то ступінь розведення початкових розчинів є безпосередньою мірою для концентрації розчинів. 12 Точне кількісне визначення концентрації проб при здійсненні відповідного винаходові способу може бути виконане за допомогою еталонного розчину з відомою концентрацією відповідного протеїну, причому застосування цього методу відоме фахівцеві. Згідно з іншою формою здійснення способу можуть бути виконані безперервні і/або багатократні вибіркові вимірювання флюїду у вимірювальній камері. Завдяки цьому можна зокрема встановити кінцеву точк у реакції і утворити середні значення вимірювань. Доцільним є здійснення вимірювання для несучого флюїду, вільного від частинок з розмірами понад певне значення, перед введенням до камери антитіла і/або проби; результат цього вимірювання може бути використаний як опорне значення для вимірювання преципітату. При здійсненні відповідного винаходові способу обходяться порівняно невеликими кількостями флюїду і тому ви трати на видалення із використовуваного флюїду речовин, розмір частинок яких перевищує певне значення, можуть бути знижені. Для видалення таких речовин використовуваний флюїд, наприклад, за допомогою клапанних пристроїв може бути пропущений через шунт з фільтром, який відокремлює вказані речовини. Фільтрування використовуваного флюїду може бути здійснене перед введенням проби через певний, попередньо заданий інтервал часу, щоб гарантувати, що у ньому більше не містяться речовини, які заважатимуть вимірюванню. Матеріали, що мають частинки з розмірами понад певне встановлене значення, можуть бути видалені із проби за допомогою фільтрів, інтегрованих у місця введення флюїдів, або встановлених перед ними. Після введення проби отриманий таким чином пробний флюїд може бути профільтрований через певний час, щоб видалити перешкодні матеріали, які могли потрапити до флюїду з пробою чи із провідної системи. Згідно з іншою формою виконання способу несучий флюїд після додавання антитіла, яке підтвердило чи не підтвердило наявність антигена, знову фільтрують перед введенням іншого антитіла. Завдяки цьому можуть бути видалені занесені до несучого флюїду матеріали, які можуть перешкоджати вимірюванням. Крім того, таким чином із використаного флюїду може бути видалений також виявлений продукт реакції, щоб аналізувати можливо наявні подальші компоненти проби. Відповідний винаходові спосіб придатний для численних застосувань у галузі аналізу води (виявлення складових і шкідливих речовин), харчових технологій (виявлення мікроорганізмів, складових речовин) або біологічних чи медичних тестів (наприклад, виявлення ДНК- чи РНК-послідовностей, бактерій чи алергенів (тести на алергію)). Крім того, можливі застосування у галузі гідрофільних макромолекулярних мультиспейсерів, ДНК-зондів чи кількісної полімеразної ланцюгової реакції (PCR). Зокрема відповідний винаходові спосіб може бути застосований також для виявлення інфекційного пріонного протеїну PrPSc при проведенні тестів BSE (bovine spongiform encephalopathy=коров'яча губчаста енцефалопа 13 85560 тія). Оскільки відповідний винаходові спосіб здатен виявляти вкрай малі кількості цього пріонного протеїну, він придатний для виявлення інфекційного пріонного протеїну PrPSc у крові. До того ж, відповідний винаходові вимірювальний спосіб Q-MAP надає швидку і просту можливість тестування адсорбційної поведінки різних протеїнів на різних поверхнях. Таким чином може бути здійснений неруйнівний контроль високополірованих поверхонь на «значення адсорбції протеїну», причому відхилення від заданого значення вказують на дефекти поверхні. Таким чином можуть бути просто і швидко виявлені дефекти на поверхні тонкої металевої плівки, нанесеної методом осадження із парової фази. Крім того, може бути перевірена повна іммобілізація певного протеїну на поверхні, що має велике значення, наприклад, у галузі ДНК-аналітики і технології біочіпів. Інша можливість застосування відповідного винаходові способу може базуватися на здатності визначати вплив хімікатів на поверхню. Зокрема можуть бути здійснені тести «До/Після» для виявлення змін при обробці поверхонь, оскільки протравлена поверхня має більшу площу, ніж не протравлена, і тому зможе адсорбувати більшу кількість антигенного матеріалу,наприклад, протеїну. При цьому може бути визначена, наприклад, кількість протеїну, що залишився у розчині. Ще одна можливість застосування базується на тому, що відповідним винаходові способом можна перевірити також стан внутрішніх поверхонь шлангів і труб. Після закінчення стадій власне відповідного винаходові способу преципітати антиген-антитіло можуть бути розчинені, наприклад, протеїназою К у разі речовин, що не р уйнуються протеїназою К (наприклад, пріони і речовини, що не містять амінокислот), і піддають наступним стадіям обробки чи дослідження. Важливою перевагою відповідного винаходові способу є можливість здійснення кількісної реєстрації. До того ж, спосіб може бути здійснений повністю автоматично, що забезпечує значну економію витрат. Крім того, відповідний винаходові спосіб уможливлює виявлення збудників хвороб у рідинах чи виділеннях тіла, зокрема у крові, у дуже малих кількостях. Це надає значної переваги, оскільки має бути взята дуже мала кількість крові, наприклад, одна краплинка (близько 10-20мкм) просто із пальця чи мочки вуха трубочкою без залучення лікаря чи досвідченої медсестри. Такі тести можуть бути здійснені, наприклад, в аптеці або ж у будинках для людей похилого віку чи у реабілітаційних закладах; вони просто і швидко дають висновок про наявність зараження певною бактерією. Особливою перевагою є те, що як взяття проби, так і здійснення відповідного винаходові способу із застосуванням відповідного винаходові пристрою не потребує від виконавця медичної освіти чи високої кваліфікації. Альтернативно за допомогою такого тесту у крові за допомогою специфічних антитіл можуть бути виявлені також інші 14 речовини, наприклад, наркотики чи лікарські засоби. Тоді як у разі наявних у продажу вимірювальних приладів співвідношення між антигенами і антитілами не може відрізнятися більше, ніж у 2-3 рази, з використанням способу Q-MAP вимірювання можливі навіть тоді, коли співвідношення між антигенами і антитілами відрізняється від ідеального у 100 разів. (При тій же концентрації антитіла ідеальна концентрація антигена може бути знижена до 1% або збільшена до 10000%. Сказане дійсне також для антитіла при сталій концентрації антигена). Це цікаве відхилення від «Хайдельбергської кривої» ("Heidelberger-Kurve") у фемто- чи аттомолярному діапазоні, спричинене незначними просторовими обмеженнями молекул, робить зайвим витратне у часі утворення рядів розведень. Особливо придатний відповідний винаходові спосіб для дослідження накопичених проб, що цікаво зокрема для досліджень законсервованої крові (наприклад, з точки зору вірусу імунодефіциту чи гепатиту) і тест-проб на BSE. Із застосуванням відповідного винаходові способу можна виконувати близько 50 вимірювань за годину, що при 8-10-годинному робочому дні дає щонайменше 400 досліджень за день або понад 80 000 вимірювань за рік. У разі 10-100 накопичених проб на кожне вимірювання за допомогою лише одного вимірювального приладу за рік можна дослідити 800000-8 00 00 проб. При дослідженні консервованої крові до неї за один раз можна додавати, наприклад, 10 різних антитіл (проти 10 різних хвороб), щоб встановити, чи придатна ця кров для використання. У разі позитивної реакції цю кров слід викидати, оскільки все-одно - чим вона заражена: вірусом імунодефіциту чи гепатитом. У разі, коли треба встановити, який збудник дав позитивну реакцію, антитіла можуть додаватися окремо. Якщо, наприклад, у разі 100 флаконів консервованої крові одночасно застосувати 10 різних антитіл, то за допомогою всього лише одного вимірювання, яке триває близько 60 секунд, можна встановити, чи придатні усі 100 флаконів для використання. Спосіб вимірювання, для якого достатньо такої малої кількості продукту, і який має високу чутливість аж у фемто- чи аттомолярному діапазоні, досі не відомий із рівня техніки і є значним прогресом. До того ж, цей винахід охоплює комп'ютерний програмний продукт, що має засоби програмного кодування, записані на носії, придатному для зчитування комп'ютером, для здійснення відповідного винаходові способу при виконанні комп'ютерного програмного продукту на комп'ютері, мережному пристрої або іншому пристрої, зокрема аналітичному пристрої для реєстрації. Крім того, цей винахід о хоплює комп'ютерний програмний продукт, що має програмний код і здатен завантажуватися із сервера для здійснення відповідного винаходові способу при виконанні комп'ютерного програмного продукту на комп'ютері, мережному пристрої або іншому пристрої, зокрема аналітичному пристрої 15 85560 для реєстрації (наприклад, описаному в цій заявці пристрої для реєстрації). Крім того, цей винахід стосується пристрою для виявлення малих кількостей частинок, який називається також як пристрій для кількісного вимірювання аттомолярних кількостей продуктів преципітації (Q-MAP=quantitative measurement of attomolar precipitation-products). Такий пристрій містить джерело світла, причому як джерело світла використовують переважно лазер. Вимірювальна камера такого пристрою має бути виготовлена із матеріалу, що не виділяє частинок і уможливлює наскрізне проходження світлового променя, зокрема лазерного променя. Такі матеріали відомі фахівцеві. Наприклад, вимірювальна камера може бути виготовлена із політетрафторетилену (ПТФЕ). Вимірювальна камера має об'єм до 100мкл, переважно 30-50мкл, зокрема 40мкл. Відповідний винаходові пристрій містить фотоприймач, що має регульоване підсилення сигналу і регульовану робочу точк у. Фотоприймач може бути вибраний із групи, що включає теплові детектори, фотодіоди, зокрема детектори фотопровідності, фотогальванічні детектори, лавинні діоди, діодні матриці, фотопомножувачі. Відповідний винаходові пристрій для реєстрації уможливлює виявлення частинок розмірами від 20нм до 5мкм. Додатково цей винахід представляє також набір для якісного і/або кількісного виявлення певних частинок, наприклад, протеїнів чи гормонів, причому певні частинки мають принаймні два місця зв'язування антитіл. Набір містить описаний вище пристрій для реєстрації, принаймні одне антитіло, що може бути специфічним до певної частинки, і принаймні один флюїд для приймання проби. Такий набір може бути розрахований спеціально на певні потреби користувача і містить взаємно узгоджені компоненти і відповідний опис для користувача, який за допомогою цього набору відразу і дуже просто може здійснювати виявлення частинок. Для прикладу такий набір може бути застосований для виявлення певного збудника захворювання у малій кількості крові або для описаного вище дослідження поверхні. Вичерпний опис Фіг.3 Нижче винахід детальніше пояснений за допомогою наведеного для прикладу, схематичного креслення пристрою для здійснення відповідного винаходові способу, яке не обмежує об'єму винаходу. Пристрій 1 для зміни проб 1 може впорскувати до змішувачів 2 і 3 як різні антигенні розчини (наприклад, проби крові), так і різні розчини з антитілами, щоб одну пробу послідовно досліджувати на наявність різних можливих збудників. Змішувачі 2 і 3 для розчинів, що містять відповідно антигени і антитіла, можуть служити не лише для розведення відповідних розчинів, але й для промивання вимірювальної камери буферним розчином (PBS) чи розчином з антитілом. 16 Фільтри 4 є змінними і мають розміри пор, наприклад, 200нм. Клапан 5 може бути виконаний таким чином, що розчини можуть окремо або разом подаватися до вимірювальної камери 6, де безперервно, одиночними чи багаторазовими вибірками здійснюють виявлення частинок. Насос 7 є малогабаритним вакуумним насосом, який відсмоктує усі розчини. У своїй роботі він узгоджений з клапаном 5, і після вимірювання відсмоктує вміст вимірювальної камери до посудини 8 для відходів. Вона може містити дезинфікуючу чи стерилізуючу рідину, яка відразу робить нешкідливими усі можливо небезпечні речовини. У разі, коли впорскнуте антитіло з антигеном із проби реагують з утворенням преципітату антигенантитіло, вони стають частинками з розмірами, що перевищують певне значення. Ці преципітати спричинюють сигнал, який явно відрізняється від сигналів можливо наявних у несучому флюїді частинок, що мають розміри, менші від певного значення. Внаслідок цього ці продукти реакції однозначно розпізнаються пристроєм для виявлення частинок. Факт виявлення свідчить, що у пробі міститься певна речовина, і за певних обставин згідно з описаними вище методиками може бути визначений також її вміст. У разі, коли після впорскування першого розчину з антитілом пристрій для реєстрації не виявив частинок з розмірами понад встановлене значення, або коли передбачається, що у пробі міститься інший антиген, який не вступає у специфічну реакцію з використаним антитілом, може бути впорскнутий розчин з іншим антитілом. Перед цим можливо виявлені раніше преципітати можуть бути видалені із вимірювальної камери шляхом промивання. Наведені нижче приклади служать для пояснення винаходу. Об'єм правової охорони даного винаходу жодним чином не обмежується предметом цих прикладів. Приклади Приклад 1: Тестування крові на наявність коров'ячої губчастої енцефалопатії (BSE) Поголів'я великої рогатої худоби у Німеччині становить близько 15 мільйонів. Щороку в Німеччині здійснюють 2-3 мільйони BSE-тестувань (ELISA і Western Blot) мозку мертвих тварин. Швидкісне BSE-тестування (ELISA чи Western Blot) триває 6-8 годин. Із застосуванням відповідного винаходові способу збудник BSE у живій тварині може бути виявлений за лише однією краплиною крові протягом двох хвилин; витрати становлять лише незначну частину. Приклад 2: Перевірка консервованої крові на наявність збудника нової хвороби КройцфельдаЯкоба (Creutzfeld-Jakob; nCJK) Для захисту населення від можливого ризику перенесення nCJK через кров пропонувалося багато різних заходів. Найбільш обіцяючим успіх було б тестування кожного окремого донора на наявність інфекції, так як на гепатит чи СНІД. Одначе збудник перебуває в організмі хворого у дуже малих кількостях. Надійне тестування у рівні техніки відсутнє. Відповідний винаходові спосіб у змозі виявити збудника у крові чи у продуктах крові. 17 85560 Приклад 3: Застосування у харчовій промисловості Мікотоксини є сильними отруйними продуктами розпаду деяких грибів. Мікотоксини є гаптенами і тому з використанням відповідного винаходові способу може бути здійснене їх виявлення і кількісний аналіз. При скринінгових обстеженнях, наприклад, усього суднового вантажу кави, чаю, борошна чи горіхів достатньо здійснити якісне тестування, яке може бути проведено на місці за пару хвилин. Для того, щоб встановити, чи була тварина незаконно вигодувана із використанням гормонів, необхідно пробу м'яса перевірити на наявність близько 15 різних гормонів. Гормони також є гаптенами, тому з використанням відповідного винаходові способу може бути здійснене їх виявлення і кількісний аналіз. Для тестування вагітності і для досліджень щитоподібної залози також потрібна перевірка на наявність гормонів. Оскільки великі бойні обробляють 2000-3000 голів великої рогатої худоби за місяць, для виявлення недозволеного відгодовування необхідно виконати близько 50-100 вибіркових проб. На даний час гормональне тестування шматка м'яса (на наявність близько 15 різних гормонів) коштує 600 євро. Тому бойні обходяться лише 5-10 вибірко 18 вими пробами на місяць, чого явно не достатньо для виявлення недозволеного відгодовування. В ході переговорів з великими бойнями був проявлений інтерес до 10-разового збільшення кількості виконуваних дешевих тестів (близько 60-70 євро за тестування шматка м'яса) на основі відповідного винаходові способу. Звичайне тестування на наявність гормонів не може запропонувати такої ціни. Приклад 4: Виявлення засобів захисту рослин Тубулінові мономери є окремими маленькими білковими кульками, які шляхом реакції з носієм енергії GTP виростають у довгі ланцюги. Інгібітори та інші токсини уповільнюють, а то й припиняють цей ріст ланцюгів. Окремі ланцюги сплітаються у канатоподібні структури, так звані протофіламенти. Ці протофіламенти зв'язуються у свою чергу у мікротрубочки, які грають вирішальну роль у поділі клітин. Шляхом гальмування розвитку мономерів у ланцюги впливають на поділ клітин і знищують шкідників. І навпаки, цей спосіб надає можливість виявляти залишки засобів захисту рослин у продуктах харчування і забезпечувати таким чином підвищений захист споживачів. Із застосуванням відповідного винаходові способу можна здійснювати безпосередні вимірювання ходу описаного вище росту ланцюгів чи його гальмування. 19 Комп’ютерна в ерстка C. Литв иненко 85560 Підписне 20 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601