Спосіб одержання антитіла до аb пептиду

1. Спосіб одержання антитіла до Аβ пептиду, який включає стадії: а) експресування антитіла у клітинах, які ендогенно експресують Аβ пептид; б) додання інгібітора гамма-секретази до живильного середовища, яке застосовується для вирощування згаданих клітин; і с) очищення антитіла зі згаданого живильного середовища, так щоб вміст Аβ пептиду в очищеному антитілі становив не більше ніж 0,02 нг/мл. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що до живильного середовища додають інгібітор гаммасекретази. 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що клітини є клітинами ссавців. 4. Спосіб за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що клітини є клітинами хом’яка, людини або миші. 5. Спосіб за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що клітини вибрані з групи, яку складають клітини CHO, HEK 293 та PER.C6. UA (21) a200609258 (22) 17.02.2005 (24) 25.01.2011 (86) PCT/US2005/005198, 17.02.2005 (31) 60/546,764 (32) 23.02.2004 (33) US (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) ДЕМАТТОС РОНАЛЬД БРЕНДЛІ, US, КУЧІБОТЛА УМА, US, ЯНГ ХСЮ-ЧУНГ, US, МАККЛЮР ДОН Б., US (73) ЕЛІ ЛІЛЛІ ЕНД КОМПАНІ, US (56) WO A 0246237, 13.06.2002. WO A 02088306, 07.11.2002. YOO E M ET AL: "Myeloma expression systems" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.,AMSTERDAM, NL, vol. 261, no. 1-2, 1 March 2002 (2002-03-01), pages 1-20, XP004341264 ISSN: 0022-1759. CHAUHAN NEELIMA B ET AL: "Intracerebroventricular passive immunization with anti-Abeta antibody in Tg2576." JOURNAL OF NEUROSCIENCE RESEARCH, vol. 74, no. 1, 1 October 2003 (2003-10-01), pages 142-147, XP002339442 ISSN: 0360-4012. MILLER DAVID L ET AL: "Humoral immune response to fibrillar beta-amyloid peptide." BIOCHEMISTRY, C2 2 (19) 1 3 ським Αβ 1-42 пептидом на Стадії 2А були, однак, негайно припинені після виявлення у чотирьох хворих клінічних ознак, які вказували на запалення центральної нервової системи (ЦНС). З часу припинення згаданих досліджень ще у одинадцяти хворих з'явились симптоми, які пов'язують із запаленням ЦНС (Оргогозо (Orgogozo) та інші, Neurology, 61:46-54 (2003); Шенк (Schenk) та інші, Сurr. Οpn. Іmmun., 16:599-606 (2004)). Введення Αβ пептиду для лікування хвороби Альцгеймера, як таке, викликало негативні явища і примусило звернути увагу на безпеку хворих. Альтернативним імунологічним засобом цілеспрямованого впливу на Αβ пептид є введення антитіл, специфічних до згаданого пептиду, шляхом, наприклад, пасивної імунізації. Оскільки пасивна імунізація не спричинює явища запам'ятовування Т- і В-клітинами подібно до того, як це відбувається у разі активної імунізації, варіант пасивної імунізації не викликає побоювань щодо безпеки хворого, які пов'язуються з активною імунізацією. Раніше було показано, що Αβ пептид продукується різноманітними лініями клітин, наприклад, К562, М17, НЕК 293 (культура клітин нирок людського ембріона), СНО (культура клітин яєчника китайського хом'ячка) і HUVEC (культура ендотеліальних клітин пупкової вени людини) (Шоджі (Shoji) та інші, Science, 258:126-129 (1992); Гаас (Haass) та інші, Nature, 359:322-325 (1992)). Відповідно, багато клітинних ліній, які можуть застосовуватись для експресії людських або гуманізованих антитіл для клінічного застосування, наприклад, СНО і НЕК 293, ендогенно містять АРР холопротеїн, а також - і β-секретази, необхідні для розщеплення АРР і, завдяки цьому, експресії Αβ пептиду природним шляхом. Викликало подив те, що під час одержання анти-Αβ антитіл було встановлено, що Αβ пептид, ендогенно продукований більшістю ліній клітин ссавців, які традиційно застосовувались для рекомбінантної експресії антитіл, у незначних кількостях зв'язується з експресованим анти-Αβ антитілом і проходить через процеси культивування клітин і очищення згаданого антитіла. Водночас із забрудненням Αβ пептидом одержаних рекомбінантним шляхом анти-Αβ антитіл, існує потенціал посиленої імуногенної реакції у хворого, унаслідок чого проблема запобігання забруднення, видалення або зниження кількості Αβ пептиду набуває першорядного значення. Окрім того, коли ендогенно продукований Αβ пептид не є людським, наприклад, у разі лінії клітин СНО, імуногенність нелюдського Αβ пептиду, зв'язаного з експресованим анти-Αβ антитілом, може викликати ще більші побоювання щодо безпеки хворих, завдяки чому проблема запобігання забруднення, видалення або зниження кількості Αβ пептиду стає життєво важливою. Цей винахід пропонує композицію, придатну для введення людині, яка містить анти-Αβ антитіло і є вільною від Αβ пептиду або включає прийнятно низькі кількості останнього. Окрім того, цей винахід пропонує композицію, придатну для введення людині, яка містить анти 93181 4 Αβ антитіло і є вільною від нелюдського Αβ пептиду або включає прийнятно низькі кількості останнього. Цей винахід додатково пропонує композицію, придатну для введення людині, яка містить антиΑβ антитіло і характеризується концентрацією Αβ пептиду, що не піддається визначенню. Цей винахід пропонує також спосіб одержання анти-Αβ антитіла, яке є вільним від Αβ пептиду або містить прийнятно низькі кількості останнього. Відповідно до одного із варіантів здійснення цього винаходу, пропонується експресія згаданого антитіла клітинами NS0. Відповідно до іншого варіанта здійснення, пропонується експресія згаданого антитіла клітинами, продукування Αβ в яких ліквідується шляхом видалення специфічного гена, наприклад, гена, що кодує АРР, β-секретазу або одного з генів -секретази чи шляхом видалення гена або підвищеної експресії -секретази. Відповідно до додаткового варіанта здійснення, пропонується продукування згаданого антитіла у культурі клітин, що містить інгібітор β- або секретази. Відповідно до іншого варіанта здійснення, пропонується очищення антитіла від Αβ пептиду шляхом підкислення або за допомогою гель-хроматографування за розміром молекул. На додаток до цього, винахід пропонує спосіб лікування людей, що страждають на такі стани та захворювання, як хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, церебральна амілоїдна ангіопатія, судинне слабоумство, легке порушення пізнавальної здатності тощо, із застосуванням композиції за цим винаходом. У цілях цього винаходу, що розкриваються і заявляються у цьому описі, терміни, що вживаються, мають наведене нижче визначення. Термін "антитіло" означає повне антитіло, у тому числі, але без обмеження, химерне, гуманізоване, людське, рекомбінантне, трансгенне, трансплантоване і одноланцюгове антитіло тощо або будь-які гібридні білки, кон'югати, фрагменти або їхні похідні, що містять один або декілька доменів, які селективно зв'язують Αβ пептид. Термін "антитіло", таким чином, означає повну імуноглобулінову молекулу, моноклональне антитіло, химерне антитіло, гуманізоване антитіло, людське антитіло або імунологічно ефективний фрагмент будь-якого з них. Фрагмент антитіла означає Fv-фрагмент, дисульфідно зв'язаний Fv-фрагмент, scFvфрагмент, Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент або Р(аb')2-фрагмент, які є добре відомими у цій галузі. Словосполучення "анти-Αβ антитіло" означає антитіло, яке розпізнає і зв'язує Αβ пептид. Термін "гуманізоване антитіло" означає антитіло, яке частково або повністю складається з амінокислотних послідовностей, одержаних із зародкової лінії людських антитіл або реаранжованої послідовності, і яке одержують шляхом зміни послідовності антитіла, що має нелюдську гіперваріабельну ділянку (CDR). Каркасні ділянки варіабельних ділянок замінюють на відповідні людські каркасні ділянки із залишенням нелюдської CDR по суті незмінною. Словосполучення "людські каркасні ділянки" означає геномні каркасні ділянки, а також включає ділянки, що містять одну або декі 5 лька амінокислотних замін. Зокрема, такі заміни включають мутації, при яких амінокислоту у конкретному положенні у людській каркасній ділянці замінюють амінокислотою з відповідного положення природної каркасної ділянки нелюдської CDR. Антитіло у контексті гуманізованого антитіла не обмежується повномірним антитілом і може включати фрагменти і одноланцюгові форми. Термін "Αβ пептид" або "Αβ" у цьому контексті включає пептиди, що складаються з 39, 40, 41, 42 і 43 амінокислот, одержані з β-амілоїдного білкапопередника (АРР) in vivo шляхом протеолізу і будь-які фрагменти цих пептидів, наприклад, скорочені на N-кінці пептиди, одержані з цих пептидів (які позначають, наприклад, х-42, де х=1, 2, 3 тощо), скорочені на С-кінці пептиди, одержані з 1-39, 40, 41 і 42 пептидів та пептиди, скорочені на обох кінцях. Подробиці кожної амінокислотної послідовності повномірних пептидів дивись на ПОСЛІДОВНОСТІ №1, людський Αβ пептид, і ПОСЛІДОВНОСТІ №2, Αβ пептид гризунів (наприклад, миші, хом'яка). Термін "β-секретаза", який вживають у цьому описі, означає фермент, залучений до процесування АРР, який розщеплює АРР з одержанням аміно-кінця Αβ пептиду. Термін "-секретаза" означає ферментний комплекс, залучений до процесування АРР, який розщеплює АРР після βсекретази з одержанням карбоксильного кінця Αβ. Термін "-секретаза" означає фермент, залучений до процесування АРР, який розщеплює АРР у межах послідовності Αβ (між 16 і 17 залишками Αβ пептиду) у каскаді реакцій з одержанням розчинного АРР, завдяки чому Αβ пептид не продукується. Словосполучення "інгібітори β- або секретази" означає молекули, які пригнічують (блокують або зменшують) ферментативну активність β- або -секретази. Словосполучення "прийнятно низькі рівні Αβ пептиду" означає рівень забруднення препарату анти-Αβ антитіла Αβ пептидом, який міг би вважатись безпечним і, таким чином, прийнятним або придатним для введення людині, зокрема, у складі фармацевтичної композиції. Зокрема, прийнятно низькими рівнями Αβ пептиду були б такі рівня, які не спричинювали б імуногенної реакції та/або посиленої імуногенної реакції у хворого, якому ввели анти-Αβ антитіло. Прийнятно низькі рівні могли б визначатись фахівцем у цій галузі техніки за допомогою методів, які традиційно застосовуються і є прийнятними у практиці розробки фармацевтичних композицій і лікарських форм із точки зору вимог безпеки. Словосполучення "концентрація Αβ пептиду, яка не піддається визначенню" означає концентрацію Αβ пептиду, яка знаходиться за межами визначення методів, які традиційно застосовуються для визначення концентрації Αβ пептиду у препараті анти-Αβ антитіла. До числа таких методів належать (але без обмеження) ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), аналіз із застосуванням підкисленого сечовинного гелю/вестерн-блотингу (як описано у Прикладах 1-3), мас-спектрометричні методи, аналітичні хроматографічні методи та інші високочутливі аналітичні методи. Наприклад, чут 93181 6 ливість аналізу із застосуванням підкисленого гелю/вестерн-блотингу, який описано у Прикладах 13, становить приблизно 1 пг Αβ/мкг LgG, у той час як межа виявлення ELISA, що застосовується у Прикладі 3, дорівнює 0,02 нг/мл. Концентрації Αβ, які виходять за межі визначення відповідних згаданих методів, не будуть піддаватись визначенню. Композиції за цим винаходом можуть бути одержані за допомогою будь-якого з декількох способів, відомих у цій галузі. Наведені нижче способи призначені для ілюстрування, але не для обмеження цього винаходу. Взагалі, продукування рекомбінантних антитіл здійснюють за допомогою способів, які можуть бути згруповані до трьох головних стадій: одержання лінії клітин, культивування клітин і очищення. Так, після одержання лінії клітин, анти-Αβ антитіло за цим винаходом одержують, як правило, за допомогою способу, який включає експресію антитіла у лінії клітин і очищення згаданого антитіла. Зміни, які вносять до будь-якої з цих стадій, можуть вплинути на експресію або характеристики одержаного антитіла. Ряд факторів може вплинути на експресію антитіла на стадії одержання лінії клітин, у тому числі генно-інженерні конструкції на основі векторів і лідерні послідовності, які входять до їхнього складу, що застосовуються для трансформації лінії клітин для забезпечення експресії антитіла, вибір типу клітин, вибір трансфікованих клітин, ампліфікація гена і скринінг лінії клітин. Експресія антитіла вибраною лінією клітин залежить від застосування живильного середовища для культури клітин. Модифікації живильних середовищ, наприклад, зміни температури, живильних речовин і рівня розчиненого кисню, можуть вплинути на експресію і якість продукту. Після експресії антитіла у культурі клітин, способи очищення, наприклад, різноманітні хроматографічні способи, фільтрація і буферний обмін, можуть змінити властивості бажаного продукту, а також чистоту і природу забруднювачів. З огляду на ці загальні стадії продукування рекомбінантних антитіл, цей винахід може бути здійсненим шляхом застосування конкретного способу або внесення специфічних модифікацій до кожної з цих стадій. Способи одержання композицій за цим винаходом залучають конкретні джерела лінії клітин, а також модифікації згаданої лінії клітин. Як згадувалось вище, лінія клітин впливає на експресію антитіла. Способи одержання композицій за цим винаходом включають застосування ліній клітин ссавців для експресії анти-Αβ антитіла. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згаданою лінією клітин ссавців є лінія клітин хом'яка, людини або миші. Відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, згаданою лінією клітин ссавця є СНО, НЕК 293, PER.C6 або NS0. Відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, згаданою лінією клітин ссавця є СНО або NS0. Застосуванню клітин NS0 для рекомбінантного продукування анти-Αβ антитіла віддається перевага з точки зору одержання анти-Αβ антитіла, що характеризується концентрацією Αβ пептиду, яка не піддається визначенню (дивись Приклад 3). 7 Для експресії рекомбінантних антитіл можуть застосовуватись лінії клітин ссавців, яким бракує АРР або однієї із секретаз (β- або -секретази). Лінію клітин, якій бракує або яка має знижені рівні АРР, β- або -секретази, можна одержати шляхом різноманітних маніпуляцій або модифікацій клітинної лінії. Лінії клітин, у яких ген(-и), що кодує(-ють) АРР, β- або -секретазу, є блокованим(-и), можна одержати способами, добре відомими у цій галузі. За альтернативним варіантом, згаданого ефекту відсутності гена можна досягти . шляхом модифікацій лінії клітин. Прикладом корисної модифікації лінії клітин є значне зниження кількості експресованого Αβ пептиду шляхом розкладу транскрипту РНК небажаного білка (наприклад, АРР або β- чи -секретази) за допомогою способу, відомого як інтерференція РНК. Для забезпечення можливості інтерференції РНК, клітини повинні бути стабільно або тимчасово трансфіковані або інфіковані послідовністю ДНК з одержанням опосередкованої плазмідами або вірусами експресії невеликих шпилькових структур РНК, які специфічно зв'язуються з транскриптом, який становить інтерес, із започаткуванням розщеплення і розкладу цього транскрипту за способами, відомими у цій галузі (Банан (Вапап) і Пурі (Puri), Curr. Pharm. Biotechnol, 5:441450 (2004); Нестерова (Nesterova) і Чо-Чанг (ChoChung), Curr. Drug Targets, 5:683-9 (2004); Медема (Medema), Biochem. J., 380:593-603, (2004)). Як альтернатива культурі клітин ссавців, для експресії білків застосовуються культури клітин трансгенних рослин або рослини (Хелвіг (Hellwig) та інші, 2004, Nature Biotechnology, 22:1415 (2004)) і може бути інше джерело для продукування антитіл, яким бракує Αβ. Подібним же чином, різні види дріжджів широко застосовують як альтернативу культурі клітин ссавців і вони можуть застосовуватись для експресії антитіл, яким бракує Αβ. Застосування цих способів знижує або запобігає продукуванню Αβ пептиду. Способи одержання композицій за цим винаходом включають також модифікації культури клітин. Ці способи, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, включають введення до культури клітин інгібіторів β- або -секретази з одержанням анти-Αβ антитіла з прийнятне низькими присутніми рівнями Αβ пептиду. Відомі різні інгібітори β- і -секретаз (наприклад, патент США №6,486,350, патент США №6,627,739, Доуві (Dovey) та інші, J. Neurochem., 76:173-181 (2001); Ю-Мінг (Yue-Ming) та інші, Nature, 405: 689-694 (2000)) і вони можуть бути застосовані у цих способах. Додаткові способи одержання композицій за цим винаходом підвищують продукування розчинного АРР у культурі клітин, завдяки чому знижується кількість продукованого Αβ пептиду. Продукування розчинного АРР може бути підвищеним шляхом підвищення активності -секретази у лінії клітин. Лінію клітин із підвищеною активністю секретази можна одержати способами, відомими у цій галузі. За альтернативним варіантом, продукування розчинного АРР підвищується шляхом додання міді до клітин СНО (Бочард (Borchardt) та інші, Biochem. J., 344:431-467 (1999)). Додання міді 93181 8 може також значно знизити рівні Αβ пептиду у вихідних клітинах СНО-К1 і у стійких до міді клітинах CHO-CUR3. Способи одержання композицій за цим винаходом включають також різні способи очищення. До цих способів належить захоплення антитіла з культури клітин Білком А. Подальше очищення може включати застосування агентів для дисоціації анти-Αβ антитіла і Αβ пептиду з подальшим відокремленням антитіла від антигену на основі хроматографічних різниць між цими двома одиницями. Дисоціативними агентами, яким віддається перевага, є кислота, сечовина, тіоціанат і детергент. Після дисоціації антитіла і антигену застосовують хроматографічні методи, здатні до відділення дисоційованого анти-Αβ антитіла від Αβ пептиду, з видаленням згаданого антигену з антитіла або з комплексу антитіло-антиген. До цих хроматографічних способів, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, належать гельхроматографія за розміром молекул, іонообмінна хроматографія, хроматографія з оберненою фазою і хроматографія з гідрофобною взаємодією. Додатково, як інший спосіб відділення антигену від антитіла, застосовують тангенціально-протокову фільтрацію. За способом очищення, якому віддається перевага, композиції за цим винаходом очищають на стадіях, які включають захоплення Білком А, нейтралізацію, розбавлення, підкислення антитіла, гель-хроматографію за розміром молекул і нейтралізацію (дивись Приклад 2). У іншому хроматографічному способі застосовують іммобілізоване антитіло до іншої антигенної детермінанти Αβ пептиду або антитіло з підвищеною спорідненістю до Αβ пептиду для виділення і видалення комплексу антитіло-антиген або згаданого антигену. Композиції за цим винаходом можуть застосовуватись для лікування хворих людей з такими станами і захворюваннями, як хвороба Альцгеймера, синдром Дауна, церебральна амілоїдна ангіопатія, судинне слабоумство, легке порушення пізнавальної здатності тощо. Αβ пептид може підвищити для хворого потенційні ризики імуногенності із ще більшою потенційною загрозою для здоров'я у разі, якщо згаданий Αβ пептид має нелюдське походження. Ключового значення, у такому разі, набуває запобігання утворенню, видалення або зниження кількості Αβ пептиду, як такого. Композиції за цим винаходом є придатними для введення людині у складі фармацевтичної композиції, що містить анти-Αβ антитіло і фармацевтично прийнятний наповнювач. Прикладами прийнятних наповнювачів є буфери, поверхневоактивні речовини, консерванти, солюбілізатори, ізотонічні агенти, стабілізатори тощо, розроблені таким чином, щоб бути прийнятними для обраного способу введення. Останнє видання довідника Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, штат Пенсільванія, яке включено до цього опису як посилання, надає скорочений опис способів одержання композицій, які, взагалі, є відомими лікарям-практикам. 9 93181 Наведені нижче приклади призначені для ілюстрування, а не для обмеження цього винаходу. Приклад 1 Експресія анти-Αβ антитіла у культурі клітин, що містить інгібітор -секретази Інгібітор -секретази (WO 98/28268) додають до культури клітин НЕК 293, у якій експресується анти-Αβ антитіло, для зменшення кількості Αβ пептиду, що експресується згаданими клітинами природним шляхом. Зразки культури клітин для цього прикладу включать контрольну культуру без доданого інгібітора, культуру, до якої додано 1 нМ інгібітора у час=0 з подальшим доданням через кожні 24 год впродовж 5 днів (для 5-денної трансфекції), і культуру, до якої інгібітор додають у час=0. Ці зразки очищають за допомогою колонки з Білком А, а також шляхом гель-хроматографування за розміром молекул. Згадані зразки аналізують на вміст Αβ пептиду шляхом відділення на підкислеСечовина 40% акриламід GAA (льодяна оцтова кислота) TEMED (Ν,Ν,Ν',Ν'тетраметилетилендіамін (ТЕМЕД)) (25%), мкл APS (персульфат амонію) (10 %), мкл dH2O 10 ному сечовинному гелі з подальшим проведенням вестерн-блотингу, як докладно описано нижче. Результати продукування і здійсненого подібним чином аналізу анти-Αβ антитіла наведено нижче у Таблиці 1. У наведеній нижче методиці описано спосіб денатурації зразків мурашиною кислотою з подальшим електрофорезом у підкисленій сечовинній поліакриламідній матриці: День 1 Апаратне оснащення 1) Почистити і зібрати акриламідні гельпланшети (наприклад, планшети фірми Hoeffer) для формування гелю у формувальному штативі (планшети 16 см х 14 см з 1,5 мм прокладками). Ретельно почистити планшети детергентом, прополоскати у дистильованій Н2О (dH2O), прополоскати ацетоном і, нарешті, прополоскати 100% EtOH. 2) Помітити планшети на рівні 10 см (22% розподільний гель) і 11,75 см (10% ступінчастий гель). Одержання гелю і концентрації гелю 1) Акриламід (40% розчин, наприклад, гель, що виготовляється фірмою Bio-Rad/номер за каталогом 161-0148). 2) Складові гелю 4% концентруючий гель 5,76 г 1,6 мл 1,6 мл 10% 2,88 г 2 мл 800 мкл 22% 11,56 г 17,6 мл 3,2 мл 450 мкл 200 мкл 600 мкл 100 мкл 100 мкл 100 мкл До 16 мл До 8 мл До 32 мл Завантажити сечовину, акриламід, льодяну оцтову кислоту (GAA) і dН2О у 50 мл конічні пробірки. Піддати нетривалому інтенсивному перемішуванню і інкубувати на водяній бані (55°С). Енергійно перемішувати кожні декілька хвилин, доки сечовина повністю не перейде до розчину. Дегазувати 22% та 10% розчини, і перенести їх на лід; 4% концентруючий гель залишити на водяній бані. Розливання гелю (при кімнатній температурі) 1) Додати Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраметилетилендіамін (TEMED) до 22% розчину і обережно перевернути декілька разів для перемішування. Після цього додати 10% розчин APS (персульфат амонію), і декілька разів перевернути. За допомогою 25 мл піпетки повільно наливати розчин між планшетами, доки його рівень не досягне 10 см помітки. 2) Обережно нанести верхній 750 мкл шар GAA. За допомогою піпетки Ρ1000 забезпечити дуже повільне стікання 5% розчину GAA з одного боку скляних планшетів на 22% розподільний гель. 3) Залишити до полімеризації при кімнатній температурі щонайменше впродовж 1 год. 4) Додати TEMED і 10% розчин APS до 10% розчину акриламіду таким самим чином, що і до 22%. Видалити верхній шар і додавати згаданий розчин, доки його рівень не досягне другої помітки на рівні 11,75 см. Знову обережно нанести верхній 750 мкл шар 5% розчину GAA, як вказувалось вище. Залишити гель до полімеризації впродовж 30 хв. 5) Перед доданням 4% концентруючого гелю, внести штатив із гель-планшетами до термостата (37°С) на 15 хв для нагрівання гелю. Це сприяє правильній полімеризації лунок. Дегазувати 4% концентруючий гель і зберігати його при температурі 55°С. Видалити верхній шар. Додати TEMED, перевернути декілька разів, після чого додати 10% APS. Швидко вилити цей розчин, і ввести чисту, насухо протерту 12-лункову "гребінку" (або 15лункову "гребінку"). Після виливання концентруючого гелю знову помістити штатив до термостата на 15 хв, після чого вийняти його. Залишити до полімеризації на столі. Повна полімеризація концентруючого гелю відбудеться щонайменше через 1,5 год. *Примітка: На стадіях полімеризації у розподільному гелі можуть з'явитись повітряні "кишені". Ці "кишені" утворюються, головним чином, унаслідок зміни температури гелю під час і після полімеризації. Ці порожнини не впливають на характеристики згаданого способу. Одержання зразків 11 Аналіз з міграцією 3 мг білка у верхню частину одного стовпчика гелю забезпечить одержання прийнятно забарвлених смуг. Умови проведення аналізу білка мають наведений нижче вигляд. Зразок: 30 мкл білка (100 мг/мл) (максимальна концентрація білка). 80 мкл мурашиної кислоти (98%) (№ за каталогом фірми ICN 15162-90). 20 мкл підкисленого буфера для зразка (80% мурашиної кислоти, 60% цукрози і 0,02% метилового зеленого; буфер одержують шляхом розчинення 6 г цукрози у ~8 мл ~99% мурашиної кислоти. Нагріти і перемішувати одержану суміш. Після розчинення цукрози об'єм розчину довести до 10 мл за допомогою ~99% мурашиної кислоти. Додати 2 мкл 1% розчину метилового зеленого). 1 мкл β-меркаптоетанолу. *Примітка: Відрегулювати об'єми за потребою. Однак кінцева концентрація мурашиної кислоти завжди повинна знаходитись у межах 70-90%. Ледери: Маркери молекулярної маси фірми Pharmacia. Діапазон молекулярних мас 2512-16949 (номер за каталогом 80-1129-83). Відновити білок у 1 мл PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин). Зберігати 10 мкл аліквоти при температурі -20°С. Розморозити 1 аліквоту для кожного необхідного ледера і додати 90 мкл мурашиної кислоти (98%), 20 мкл підкисленого буфера для зразка і 1 мкл βмеркаптоетанолу. *Примітка: Не відновлюйте ці ледери за інструкціями виробника (оскільки SDS (додецилсульфат натрію) спричинить змазування ледерів). Зразки BSA (сироватковий альбумін великої рогатої худоби) Під час кожної процедури розподілу дві зовнішні смуги зазнають викривлення. Для зведення негативних ефектів, що викликаються цим викривленням, до мінімального рівня, внесіть зразки до зовнішніх смуг на кожному боці гелю. Зразки BSA=1 мл 5% розчину BSA, 90 мл мурашиної кислоти (98%), 20 мкл підкисленого буфера для зразка і 1 мкл β-меркаптоетанолу. Процедура розподілу на гелі Процедура попереднього розподілу: Скласти апарат у прохолодній кімнаті. Залити нижню камеру (три чверті об'єму) попередньо охолодженим підкисленим розподільним буфером. Додати відповідну кількість буфера до верхньої камери. Здійснити процедуру попереднього розподілу при напрузі між анодом і катодом, що становить 250 В, впродовж 30 хв. *Видалити повітряні бульбашки у нижній частині гелю і перевірити, чи не витік буфер із верхньої камери. **Підкислений розподільний буфер = 250 мл льодяної оцтової кислоти + 3750 мл dН2О. Внесення зразків: Перед внесенням зразків, прополоскати лунки буфером для видалення надлишкової сечовини. Внести зразки, ледери і зразки BSA до зовнішніх смуг. Зверніть увагу на те, що два ледери застосовуються таким чином, що перед перенесенням одна смуга, яка містить пепти 93181 12 дний ледер, вирізується і забарвлюється кумасі блакитним. Ступінчаста напруга: Процедура розподілу на гелі відбувається при наведеній нижче напрузі між анодом і катодом:  хв при 25 В; 15  хв при 50 В; 15  хв при 100 В; 15  хв при 200 В; 15  ~15 год при 275 В. **Здійснювати процедуру розподілу на гелі, доки фронт забарвлення не виявиться на відстані ~2-2,5 см від нижньої частини, що, як правило, спостерігається наступного ранку, якщо процедуру розподілу було розпочато наприкінці дня. День 2 Умови перенесення для підкисленого сечовинного гелю (процедура розподілу на гелі у прохолодній кімнаті (4°С)) За ніч до перенесення необхідно приготувати буфер наведеного нижче складу і зберігати його у прохолодній кімнаті. Буфер для перенесення: Трис-основа Гліцин Метанол dH2O 12,36 г 57,6 г 800 мл До 4 л Нейтралізувати підкислений сечовинний гель перед перенесенням. Обережно вийняти гель і перенести його на промитий скляний піддон. Додати 200 мл буфера для перенесення, і обережно похитати впродовж 15 хв. Повторити цю стадію промивки у загальній кількості чотири рази. Здійснити перенесення, як це робиться за звичайних умов (2,5 год при 100 вольтах). Забарвлювання і знебарвлювання понсо-S Після перенесення візуалізуйте білки ледера шляхом забарвлювання понсо-S. Нітроцелюлозу забарвлюють впродовж 5 хв у 0,1% розчині понсоS у 5% оцтовій кислоті. Після знебарвлювання мембрани за допомогою dH2O (три дуже коротких промивання) мембрану необхідно піддати цифровому скануванню і помітити ледери незагостреним олівцем. Збережіть цей файл. *Примітка: Цей ледер застосовується виключно для порівняльного аналізу первинної структури. За цим способом пептиди розділяють за їх молекулярною масою (розміром) і зарядом. Наприклад, два пептиди однакової молекулярної маси, але з різними зарядами, ймовірно, мають різну результуючу рухливість. З цієї причини завжди проганяйте стандарти Αβ пептиду щонайменше у одній лунці, що забезпечить можливість точної ідентифікації Αβ пептиду. **Важливо: Усі смуги з пептидного стандартного ледера не переносяться. У разі коли ледер, одержаний за допомогою кумасі блакитного, розміщують на одній лінії з нітроцелюлозою, забарвленою понсо-S, стає очевидним, що смуги 10,7 кДа та 6,2 кДа не переносяться. Умови проведення вестерн-блотингу 13 93181 Прокип'ятіть нітроцелюлозну мембрану у PBS впродовж 5 хв. Продовжуйте далі у відповідності до звичайних умов проведення вестерн-блотингу. Стадія блокування: Блокувати мембрану у 5% розчині молока у 1Х забуференому трис фізіологічному розчині/0,125% Твін 20® (TBS/T) впродовж 45 хв у 50 мл об'ємі. Первинне антитіло Застосувати відібрану кількість анти-Αβ антитіл (наприклад, 3) таким чином, щоб зв'язувальні епітопи відібраних антитіл зв'язувались із різними ділянками Αβ пептиду. Забезпечити умови для того, щоб відібрані антитіла також надавали можливість здійснення стандартної візуалізації щонайменше 79 пг. Розчин первинного антитіла одержують у 5% розчині молока у TBS/T, наприклад, 1:1000 розведення відібраних антитіл у 20 мл загальному об'ємі. Залишити розчин первинного антитіла на шютль-апараті на ніч. День 3 Тричі промити мембрану у 1% розчині BSA у TBS/T, кожного разу впродовж 10-15 хв. Вторинне антитіло 14 Розчин вторинного антитіла одержують у 1% розчині молока у TBS/T з 1:6000 розведенням антимишачої HRP (пероксидаза з хрону) (№7076 за каталогом фірми Cell Signaling) у 50 мл загальному об'ємі. Витримати мембрану у розчині вторинного антитіла впродовж 3 год. Після вторинного антитіла тричі промити мембрану TBS/T, кожного разу впродовж 10-15 хв. Проявлення Розмістити мембрану у розчині для підсилення хемілюмінесценції (ECL) (№34080 за каталогом фірми Pierce Super Signal West Pico) на 5 хв перед проявленням. Максимальна чутливість цього способу залежить від реактивів, які були використані під час проведення вестерн-блотингу. Для прикладу, докладний опис якого було наведено вище, максимальна чутливість цього аналізу становить ~1 пг/мкг IgG. Для зразків, концентрацію IgG (мг/мл) визначають шляхом визначення оптичної густини при 280 нм і ділення цієї величина на коефіцієнт екстинкції 1,4. Аналізи зразків, які одержали за цим прикладом, дали наведені нижче результати: Таблиця 1 Аналіз на підкисленому сечовинному гелі очищеного антитіла з клітин з/без інгібітора -секретази Зразки FL1 (пг/мкг IgG) Т12 (пг/мкг IgG) Т23 (пг/мкг IgG) Без інгібітора Інгібітор кожні 24 год впродовж 5 днів Інгібітор у Т=0 70 38 70 Сумарний hАв40 (пг/мкг IgG) 178 4 0 3 7 56 27 52 135 1 Повномірний hΑβ40 hΑβ40, скорочений на N-кінці, № 1 3 hΑβ40, скорочений на N-кінці, № 2 2 Приклад 2 Очищення анти-Αβ антитіла шляхом кислотної дисоціації антитіла і Αβ пептиду Анти-Αβ антитіло експресують у клітинах НЕК 293, які культивують у культурі. Антитіло очищають із культурального середовища на колонці, заповненій Білком А-агарозою, і елююють 100 мМ розчином гліцинового буфера, рН 3,1. Пул фракцій, елюйованих з Білка А, доводять до приблизно рН 7,4 шляхом додання невеликого об'єму 1 Μ розчину трис-буфера, рН 8,0. Після цього згаданий пул елюйованих фракцій доводять до приблизно рН 2 шляхом розведення 1:1 у 1М розчині гліцину, рН 2. Після приблизно 10 хв інкубування при кімнатній температурі підкислений пул піддають гельхроматографуванню на колонці 26/60 Superdex 200 (фірма Amersham) із застосуванням мобільної фази, що містить 50 мМ розчин гліцину і 150 мМ розчин NaCl, рН 2, зі швидкістю потоку 30 см/год. Антитіло, елюйоване з гель-хроматографічної колонки, нейтралізують шляхом додання трисбуфера і діалізують проти PBS при рН 7,4. Аналізи на денатурованому підкисленому сечовинному градієнтному поліакриламідному гелі (додатковий опис цієї методики дивись у Прикладі 1) надали можливість визначення маси Αβ пептиду у пг на мкг IgG для зразків, які одержали за цим способом очищення шляхом кислотної дисоціації. Наведені нижче результати одержали після очищення анти-Αβ антитіла за допомогою згаданого способу кислотної дисоціації. 15 93181 16 Таблиця 2 Аналіз на підкисленому сечовинному гелі очищеного антитіла з клітин НЕК 293: лише гель-хроматографія (без підкислення) або підкислення і гель-хроматографія Зразок НЕК 293, без кислоти, гель-хроматографія НЕК 293, кислота і гель-хроматографія FL1 (пг/мкг IgG) Т12 (пг/мкг IgG) Т23 (пг/мкг IgG) Сумарний hΑβ40 (пг/мкг IgG) 70 38 70 178 4 0 3 7 1 Повномірний hΑβ40 hΑβ40, скорочений на N-кінці, № 1 3 hΑβ40, скорочений на N-кінці, № 2 2 Приклад 3 Експресія анти-Αβ антитіла ν клітинах NS0 Анти-Αβ антитіло експресують у клітинах NS0, які культивують у культурі. Антитіло очищають із культурального середовища на колонці, заповненій Білком А-агарозою і елююють 100 мМ розчином гліцинового буфера, рН 3,1. Пул фракцій, елюйованих з Білка А доводять до приблизно рН 7,4 шляхом додання невеликого об'єму 1 Μ розчину трис-буфера, рН 8,0. Після цього згаданий пул елюйованих фракцій розбавляють 1:1 PBS і піддають гель-хроматографуванню на колонці 26/60 Superdex 200 (фірма Amersham) із застосуванням мобільної фази, до складу якої входить PBS і 150 мМ розчин NaCl, рН 7,4, зі швидкістю потоку 30 см/год. Антитіло, елюйоване з гельхроматографічної колонки, діалізують проти PBS при рН 7,4. За допомогою аналізу на денатурованому підкисленому сечовинному градієнтному поліакриламідному гелі, у анти-Αβ антитілах, одержаних цим способом, Αβ пептиду виявлено не було. Імуноферментний твердофазний аналіз (ELISA) застосовують для кількісного визначення концентрації Αβ пептиду. Лунки 96-лункового планшета для проведення ELISA (Nunc MaxiSorp F96 або С96) сенсибілізують анти-Αβ антитілами (наприклад, 2 або більше) (це дозволить розпізнати антигенні детермінанти за межами центральної зв'язувальної ділянки Αβ пептиду (наприклад, 1725)) з концентрацією кожного антитіла, наприклад, 7,5 мкг/мл у буфері для сенсибілізації поверхонь, впродовж ночі з охолодженням. Після відсмоктування розчину для сенсибілізації поверхонь із планшетів, лунки блокують 300 мкл/лунку HBST/Blotto (0,25% (у відношенні маси до об'єму) знежиреного сухого молока у забуференому HEPES фізіологічному розчині (10 мМ і 150 мМ, відповідно) з EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота) (3 мМ) і Твій 20® (0,5% (у відношенні маси до об'єму)), впродовж 1-2 год при кімнатній температурі, після чого один раз промивають буфером для промивання (1Х PBS з 0,1% (у об'ємному відношенні) Твій 20®) і відсмоктують. Зразки, що містять антитіло, відповідним чином розбавляють у HBST/Blotto і наносять на планшети для проведення ELISA (100 мкл/лунку). До еквівалентних розведень додатково додають 0,4 нг/мл синтетич ного Αβ пептиду 1-40 гризунів для забезпечення точного кількісного визначення у матриці розбавленого зразка. Як стандарт застосовують синтетичний Αβ пептид 1-40 разом з очищеним анти-Αβ антитілом (з менше ніж 1 млн-1 сумарного Αβ пептиду гризунів). Випробуванню піддають також контрольні зразки, що містять антитіло (для контролю сумарного Αβ пептиду) і синтетичний Αβ пептид 142 гризунів, доданий до антитіла (для контролю Αβ пептиду 1-42). Планшет для проведення ELISA інкубують впродовж 1-2 год при кімнатній температурі. Лунки чотири рази промивають буфером для промивання і відсмоктують. Після цього до кожної лунки додають (100 мкл/лунку) розбавлений (1:10000) кон'югат ослячого антилюдського IgGлужної фосфатази (№709-056-149 за каталогом фірми Jackson Immunoresearch) у HBST/Blotto. Після інкубування впродовж 1-2 год при кімнатній температурі, чотириразового промивання буфером для промивання і відсмоктування лунок, до кожної лунки додають 100 мкл розчину (1,0 мг/мл) субстрату pNPP (№50-80-00 за каталогом фірми Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) у 1Х буферному розчині DEA (діетаноламін). Планшет для проведення ELISA інкубують при кімнатній температурі з періодичним струшуванням. Оптичну густину визначають при 405 нм за допомогою планшет-рідера після достатнього для стандартів розвитку забарвлення (звичайно, 2,0-2,5 одиниць оптичної густини). Межа визначення дорівнює 0,02 нг/мл. Межа кількісного визначення дорівнює 0,1 нг/мл. Рівень концентрації для стандартів визначають за допомогою аналізу ААА (Американська академія алергологів). Для зразків концентрацію IgG (мг/мл) визначають шляхом визначення оптичної густини при 280 нм і ділення цього значення на коефіцієнт екстинкції 1,4. За допомогою аналізу ELISA, у анти-Αβ антитілах, експресованих у клітинах NS0, як описано вище, Αβ пептиду виявлено не було. Приклад 4 Катіонообмінне зниження вмісту Αβ пептиду ν препараті гуманізованого анти-Αβ антитіла Препарат гуманізованого анти-Αβ антитіла експресують у клітинах СНО. Антитіло очищають із культурального середовища на колонці, заповненій Білком А-агарозою, і елююють 100 мМ розчином гліцинового буфера, рН 3,1. Пул фракцій, 17 елюйованих із Білка А доводять до приблизно рН 7,4 шляхом додання невеликого об'єму 1Μ розчину трис-буфера, рН 8,0. Препарат антитіла, за визначенням за допомогою ELISA, містить 15-20 млн1 Αβ пептиду хом'яка. Згадане антитіло додатково очищають шляхом катіонообмінного хроматографування наведеним нижче способом. Вихідний матеріал (препарат антитіла) діафільтрують проти 50 мМ розчину ацетату натрію при рН 5,2 (5 об'ємів, із застосуванням поліефірсульфонового тангенціально-протокового ультрафільтра з 30000 смугою пропускання) для зниження питомої електропровідності у процесі приготування для внесення до катіонообмінної колонки. Після цього діафільтрований розчин білка вносять до колонки SP Sepharose High Performance (фірма GE Healthcare) (0,66 см х 15 cm, заповнена з розрахунку 15 мг білка на 1 мл об'єму колонки), зрівноваженої 50 мМ розчином ацетату натрію при рН 5,2. Усі операції здійснюють при кімнатній температурі і з лінійною швидкістю потоку 115 см/год. Після завантаження колонку промивають 5 об'ємами колонки 50 мМ розчином ацетату натрію при рН 5,2 і антитіло елюють або поетапно (5 об'ємів колонки, 50 мМ розчин ацетату натрію, 135 мМ розчин NaCl, рН 5,2), або лінійним градієнтом (15 об'ємів колонки) 0-150 мМ розчину NaCl у 50 мМ розчині ацетату натрію, рН 5,2. Фракції головного піка об'єднують (з одержанням виходу приблизно 90%). Анти-Αβ антитіло, очищене подібним шляхом, забезпечило одержання пулів, 93181 18 що мали менший вміст Αβ пептиду, аніж вихідний матеріал (10 млн-1 у разі поетапно елюйованого матеріалу і 9 млн-1 у разі градієнтно елюйованого матеріалу). Приклад 5 Зменшення вмісту Αβ в анти-Αβ антитілах за допомогою імуноафінного очищення Анти-Αβ антитіло, яке зв'язується з центральною ділянкою людського Αβ між амінокислотами 13-28, експресують у клітинах НЕК 293, які культивують у культурі. Забруднювальний людський Αβ пептид відокремлюють від цього антитіла за допомогою імуноафінного очищення із застосуванням спрямованого проти карбоксильного кінця моноклонального антитіла Abeta 40, 2G3, сполученого з гранулами агарози. Препарат антитіла перемішують впродовж ночі з гранулами, сполученими з 2G3, у об'ємному відношенні 10:1. Після інкубування впродовж ночі гранули агарози осаджують для видалення комплексів 2G3-Aβ. Після цього за допомогою ELISA визначають кількість Αβ пептиду, присутнього у препараті анти-Αβ антитіла перед і після імуноафінного очищення. Було встановлено, що препарати анти-Αβ антитіл, піддані імуноафінному очищенню подібним шляхом і аналізовані за допомогою ELISA, мали 10-25 пг Αβ/мкг IgG перед очищенням і вміст Αβ після очищення, який не піддавався визначенню. Зменшення вмісту забруднювального Αβ було підтверджено аналізом на підкисленому гелі/вестернблотингом, як описано у Прикладі 1. 19 Комп’ютерна верстка А. Рябко 93181 Підписне 20 Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601