Композиція інкапсульованих клітин печінки

Реферат: Винахід належить до мікрокапсул, які містять оболонку капсули, що інкапсулює суспензію терапевтично ефективної кількості клітин печінки в фізичному контакті зі стимулюючою клітини печінки кількістю еритропоетину. Також винахід належить до способу отримання мікрокапсул, до способу профілактики або терапевтичного лікування захворювань печінки. UA 99686 C2 (12) UA 99686 C2 UA 99686 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується мікрокапсул, що містить клітини печінки і сритропоетин, способів отримання вказаних мікрокапсул і способів лікування пацієнта, що включають застосування вказаних мікрокапсул у пацієнта. Хоча печінка здорового індивідуума здатна самостійно регенерувати за допомогою відновлення або заміни пошкодженої або хворої тканини, на жаль, після загибелі або серйозного пошкодження певної кількості клітин печінки в результат захворювання або травм, то відмовити може цілий орган. Така недостатність, будь вона гострою або хронічною недостатністю, може бути причиною захворювання і смерті. Терапія захворювань печінки включає загальноприйняті способи, такі як введення лікарських засобів. Однак до існуючого рівня техніки також належить трансплантація печінки або її частин. Крім того, широко відома трансплантація популяцій клітин печінки пацієнтам, наприклад, як описано в WO 2004/009766 А2. Однак як і раніше існує велика проблема розробки способів терапії для лікування гострих або хронічних захворювань печінки з доставкою клітин печінки потребуючому цього пацієнту, де способи оптимізовані відносно життєздатності, приживлення, проліферації і диференціювання трансплантованих клітин печінки в тканини-мішені. У Haque et al. (Biotechnology Letters 27 (5) (2005), 317-322)) описане дослідження in vitro мікрокапсул з альгінату-хітозану як альтернатива трансплантації клітин печінки для лікування печінкової недостатності. У Chandrasckaran et al. (Tissue Engineering 12 (7), (2006)) дописані клітини-попередпики клітин печінки, поміщених в електростатично генеровані гранули. Незважаючи на зусилля з розробки терапевтичних систем, що ефективно доставляють клітини печінки в тканину-мішень пацієнта, все ще зберігається необхідність надання більш надійних терапевтичних способів лікування захворювань печінки, зокрема, способів, що забезпечують високу життєздатність і фізіологічну активність клітин печінки в організмі-мішені. Дане керівництво вирішує вказану проблему за допомогою надання мікрокапсул, що містять оболонку капсули, переважно біологічно сумісну оболонку капсули, що інкапсулює суспензію терапевтично ефективної кількості клітин печінки в фізичному контакті зі стимулюючою клітини печінки кількістю еритропоетину. У переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, що містять оболонку капсули і ядро, де оболонка капсули інкапсулює в ядрі суспензію терапевтично ефективної кількості клітин печінки і стимулюючу клітини печінки кількість еритропоетину, зокрема, де еритропоетин (що позначається нижче як ЕРО) і клітини печінки знаходяться в фізичному контакті один з одним так, щоб забезпечувати стимулюючу дію ЕРО на клітини печінки. Таким чином, в переважному варіанті здійснення даний винахід передбачає надання мікрокапсул, що містять оболонку капсули, переважно отриману з біологічно сумісної речовини оболонки капсули, і ядро, оточене вказаною оболонкою капсули. У одному з переважних варіантів здійснення даного винаходу ядро містить суспензію терапевтично ефективної кількості клітин печінки в фізичному контакті зі стимулюючою клітини печінки кількістю еритропоетину. У іншому переважному варіанті здійснення ядро містить матрикс, переважно отриманий з біологічно сумісної речовини матриксу, де суспензія терапевтично ефективної кількості клітин печінки поміщена у вказаний матрикс в фізичному контакті зі стимулюючою клітини печінки кількістю еритропоетину. 1 Ісреважно речовина матриксу є такою ж як речовина оболонки капсули. У іншому варіанті здійснення біологічно сумісна речовина матриксу може являти собою речовину відмінну від речовини оболонки капсули. Таким чином, даний винахід стосується керівництва по інкапсуляції спільно еритроіюетину і клітин печінки в біологічно сумісній оболонці капсули так, щоб еритропоетин знаходився в фізичному контакті з клітинами дпечінки так, щоб виявляти щонайменше один з видів своєї біологічної дії на клітини печінки, зокрема, стимуляція клітин печінки. Однією з переваг за даним винаходом є те, що клітини печійки і [!капсульовані в оболонку капсули і, таким чином, не викликають ніякої побічної реакції, зокрема, алергічної або імунної реакції, у пацієнта, якому переважно трансплантують мікрокапсулу. Крім того, тісний контакт еритропоетину з клітиною печінки стимулює вказані клітини печінки до виконання їх біологічної функції так, щоб забезпечувати пацієнту біологічні функції печінки. У особливо переважному варіанті здійснення клітини печінки містяться в мікрокапсулі в такій концентрації, щоб знаходитися в фізичному контакті одна з одною, забезпечуючи навіть більш виражений ефект при стимуляції еритропоетином. Таким чином, в особливо переважному варіанті здійснення винахід передбачає, що клітини печінки, які містяться в мікрокапсулах, знаходяться в фізичному контакті одна з одною і знаходяться в фізичному контакті з еритропоетином. У контексті даного винаходу вираз "клітини печінки знаходяться в фізичному контакті з еритроиоетином" означає, що еритропоетин здатний виявляти щонайменше одну зі своїх 1 UA 99686 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біологічних функцій на клітину печінки, зокрема, здатний досягати і оборотно або необоротно зв'язуватися рецепторами еритропоетину, що знаходяться на клітині печінки. У контексті даного винаходу вираз "клітини печінки, що знаходяться в фізичному контакті одна з одною" означає, що клітини печінки знаходяться в мікрокапсулі за даним винаходом в такій тісній близькості одна до одної, що клітини торкаються одна одної і забезпечують стабільне середовище, дуже схоже на природний фізіологічний стан в печінці. У контексті даного винаходу термін "стимуляція клітин печінки" означає, що еритропоетин підвищує біологічну функціональність клітин печінки, переважно у пацієнта, якому трансплантують мікрокапсулу, підвищує життєздатність клітин печінки, підвищує їх стабільність при зберіганні і/або підвищує їх потенціал відносно успішного здійснення їх біологічної функції після трансплантації індивідууму. У контексті даного винаходу "біологічна сумісність" означає, що речовина, зокрема, речовина оболонки капсули і/або речовина матриксу здатна зберігати життєздатними інтегровані клітини печінки і забезпечує взаємодію між еритропоетином і клітинами печінки. У особливо переважному варіанті здійснення термін "біологічно сумісний" означає, що речовина дозволяє, переважно довготривалу, імплантацію пацієнту, при збереженні, проте, функції поміщених клітин печінки без виклику якого-небудь небажаного місцевого або системного ефекту у індивідуума, зокрема алергічних і імунних реакцій. У особливо переважному варіанті здійснення термін "біологічно сумісний" означає, що речовина здатна на/давати як субстрат підтримуючу активність клітин печінки, включаючи стимуляцію молекулярної і механічно подібної системи між клітинами печінки і EPO, переважно з метою оптимізації регенерації печінки без виявлення будь-яких небажаних ефектів в клітинах і у індивідуума. У контексті даного винаходу термін "еритропоетин" означає глікопротеїновий гормон, що контролює еритропоез або утворення клітин крові, переважно речовину, яка у відповідному дозуванні, контролює ріст, диференціювання і дозрівання стовбурових клітин від еритробластів до еритроцитів. Нритропоетин являє собою глікопротеїн, що містить 166 амінокислот, три ділянки глікозилування, і з молекулярною масою приблизно 34000 Да. Під час НРО-індукованого диференціювання клітин-попередників еритроцитів, індукується синтез глобіну, підвищується синтез комплексу гема, і збільшується кількість рецепторів феритину. Таким чином, клітина може поглинати більше заліза і синтезувати функціональний гемоглобін. У зрілих еритроцитах гемоглобін зв'язує кисень. Таким чином, еритроцити і гемоглобін, що міститься в них, відіграють ключову роль в забезпеченні організму киснем. Ці процеси ініційовані взаємодією ЕРО з відповідним рецептором на клітинній поверхні клітин-ііонсредників еритроцитів (Graber and Krantz, Ann. Rev. Med. 29(1978), 51-56). У контексті даного винаходу термін "еритропоетин" включає еритропоетин дикого типу, зокрема, еритропоетин людини, і його похідні. У контексті даного винаходу похідні еритропоетину являють собою рекомбінантні білки еритроиоетину, що характеризуються щонайменше зміною однієї амінокислоти, зокрема, делецією, додаванням або заміною ще однієї амінокислоти в порівнянні з IiPO дикого типу і/або білки еритропоетину з відмінним патерном глікозилування в порівнянні з еритропоетином дикого типу. У особливо переважному варіанті здійснення похідні еритропоетину також являють собою злиті білки або зрізані білки еритропоетину дикого типу або їх похідні. У особливо переважному варіанті здійснення похідне еритропоетину також являє собою еритропоетин дикого типу, що містить відмінний патерн глікозилування в порівнянні з патерном глікозилування дикого типу. Термін "еритропоетин", що застосовується в цьому документі, включає ЕРО будь-якого походження, зокрема, ЕРО людини або тварини. Таким чином, термін, що застосовується в даному документі, включає не тільки природний, або іншими словами форми ЕРО дикого типу, але також його похідні, також названі модифікації, мутеїни або мутанти, за умови, що вони демонструють біологічні ефекти еритропоетину дикого типу. Відносно даного винаходу під "похідними" також розуміють такі похідні еритропоетину, які незважаючи на збереження основною структуру еритропоетину, отримують за допомогою заміщення одного або декількох атомів або молекулярних груп, або залишків, зокрема, заміщенням цукрових ланцюгів, таких як етиленгліколь, і/або амінокислотні послідовності, яких відрізняються від природного білка еритропоетину людини або тварини щонайменше одним положенням, але фактично мають високий ступінь гомології на рівні амінокислот і порівняну біологічну активність. Похідні еритропоетину, які можна застосовувати в даному винаході, наприклад, відомі з WO 94/25055, EP 0148605 B1 або WO 95/05465. Зокрема "гомологія" означає ідентичність послідовності щонайменше 80%, переважно щонайменше 85% і конкретно переважно щонайменше більше 90%, 95%, 97% і 99%. Таким 2 UA 99686 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином відомий фахівцеві в даній галузі термін "гомологія" стосується ступеня спорідненості між двома або більше поліиептидними молекулами. Її визначають по збігу між послідовностями. Такий збіг може означати або ідентичний збіг, або ж консервативну заміну амінокислоти. Відносно винаходу термін "похідне" також включає злиті білки, в яких функціональні домени іншого білка знаходяться на N-кінцевій ділянці або на C-кінцевій ділянці. У одному з варіантів здійснення винаходу ліей інший білок, наприклад, може являти собою GM-CSF, VEGF, PIGF, статин або інший фактор, що мас стимулюючі ефекти на ендотеліальні клітини-попередники. У додатковому варіанті здійснення винаходу інший білок також може являти собою фактор, що мас стимулюючий ефект на клітини печінки. Відмінності між похідним еритропоетину і природним, або еритропоетином дикого типу, можуть з'являтися, наприклад, в результаті мутацій, таких як делеції, заміщення, вставки, додавання, заміни основ і/або рекомбінацій нуклеотидних послідовностей, що кодує амінокислотні послідовності еритропоетину. Очевидно, такі відмінності також можуть являти собою варіації природної послідовності, такі як послідовності з іншого організму, або послідовності, що мутували за природою, або мутації, вибірково введені в послідовності нуклеїнових кислот, що кодують еритропоетин, відомими в даній галузі загальноприйнятими способами, такими як хімічні засоби і/або фізичні засоби. Таким чином, відносно винаходу термін "похідне" також включає мутантні молекули еритропоетину, або іншими словами мутсїни еритропоетину. За винаходом, також можна використовувати аналоги пептидів або білків еритропоетин. Відносно даного винаходу термін "аналоги" включає сполуки, що не містять будь-якої амінокислотної послідовності ідентичної амінокислотної послідовності еритропоетину, але що мають тривимірну структуру в значній мірі схожу з тривимірною структурою еритропоетину так, що вони мають порівнянну біологічну активність. Наприклад, аналоги еритропоетину можуть являти собою сполуки, які містять амінокислотні залишки з прийнятною конформацією, що відповідають за зв'язування еритропоетину з його рецепторами, і, таким чином, здатні стимулювати основні властивості поверхні зв'язувальної області 'еритропоетину. Сполуки цього класу описані, наприклад, у Wrighton et al., Science, 273(1996), 458. Застосовуваний за винаходом ЕРО можна отримувати різними способами, наприклад, за допомогою виділення з сечі людини або з сечі або плазми (включаючи сироватку) пацієнтів, які страждають на апластичну анемію (Miyake et al.. J.В.C. 252 (1977), 5558). Наприклад, ЕРО людини можна також отримувати з тканинних культур клітин раку нирки людини (JA Unexamined Application 55790/1979), з клітин лімфобластів людини, що мають здатністьліродукувати ЕРО людини (JA Unexamined Application 40411/1982), і з культури гібридоми, отриманої злиттям клітин клітинної лінії людини. ЕРО також можна отримувати способами генної технології, використовуючи прийнятні ДНК або PHK, що кодують відповідну амінокислотну послідовність ЕРО для отримання бажаного білка за допомогою генетичної інженерії, наприклад, в бактерії, в дріжджах або в рослині, клітинній лінії тварини або людини. Наприклад, такі способи описані в EP 0148605 В2 або в EP 0205564 В2 і в EP 0411678 B1. У контексті даного винаходу в переважному варіанті здійснення похідні еритропоетину являють собою функціональні і підтверджені клінічними випробуваннями похідні ЕРО, переважно вибрані з групи, що складається з епостину, що також називається прокритом, епогену, епрексу або неорекормону, епоетину дельта, що також називається динепо, дарбепоетину, що також називається аранеспом, PD-поетину, CERA (постійного антагоніста рецепторів сритроноетину) і метоксиполіетиленгліколь-епоетину бета, що також називається мірцеру. У переважному варіанті здійснення даного винаходу мікрокапсула являє собою переважно кулеподібну гранулу, отриману з біологічно сумісної речовини оболонки капсули, що містить поміщену в неї терапевтично ефективну кількість клітин печінки в фізичному контакті зі стимулюючою клітини печінки кількісно сритроноетину. У контексті даного винаходу переважно мікрокапсула являє собою гранулу, переважно діаметром від 10 мкм до 10 мм, переважно від 140 мкм до 10 мм, переважно від 50 мкм до 1 мм, переважно від 60 мкм до 800 мкм, переважно від 100 до 700 мкм. У переважному варіанті здійснення даного винаходу мікрокапсули за даним винаходом містять клітини печінки, еритропоетин і біологічно сумісну речовину оболонки капсули. Переважно в доповнення до вказаних вище трьох елементів передбачати покриття мікрокапсули і/або біологічно сумісного матриксу в ядрі мікрокапсули. Таким чином, в особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, що містить терапевтично ефективну кількість клітин печінки, інкапсульованих в біологічно сумісній речовині матриксу в фізичному контакті зі стимулюючою клітини печінки кількістю еритропоетину. 3 UA 99686 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У особливо переважному варіанті здійснення клітини печінки поміщені в оболонку капсули в формі суспензії, переважно в формі суспензії клітинної культури. Переважно суспензія клітин печінки знаходиться в формі клітин печінки, що містяться в середовищі для культивування клітин або в фізіологічно прийнятному водному розчині. Переважно суспензія клітин печінки являє собою суспензію клітин печінки в середовищі для культивування клітин. У особливо переважному варіанті здійснення клітини печінки в формі суспензії поміщені в матрикс, що міститься в оболонці, переважно в формі суспензії клітинної культури, переважно в формі клітин печінки, що містяться в середовищі для культивування клітин або в фізіологічно прийнятному водному розчині. У особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де клітини печінки вибрані з групи, що складається з клітин-попередників клітин печінки, стовбурових клітини печінки, гепатобластів, генатоцитів і ендотеліальних клітин. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де клітини печінки отримують з печінки дорослого, з печінки ембріона, з печінки плоду, з печінки новонародженого або з культур клітин печінки. Переважно клітини печінки являють собою живі клітини печінки. У і переважному варіанті здійснення клітини печінки можна отримувати у живого або померлого, що зокрема нещодавно помер, донора. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де клітини печінки являють собою клітини печінки людини, клітини печінки примата, що не є людиною, клітини печінки свині, клітини печінки собаки, клітини печінки кішки, клітини печінки кролика, клітини печінки миші або клітин печінки щура. У особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де середній діаметр мікрокапсул складає від 100 до 700 мкм, переважно від 200, 300, 400, 500, 600 або 650 до 700 мкм. У особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де 4 8 5 терапевтично ефективна кількість клітин печінки складає від 10 до 10 , переважно від 10 до 7 10 клітин печінки/мл суспензії. У особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де середній діаметр клітин печінки складає від 8 до 14 мкм, переважно від 9 до 12 мкм. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де -7 -2 стимулююча клітини печінки кількість еритропоетину складає від 10 до 10 , переважно від 10 7 -3 -7 -5 -6 -5 до 10 , переважно від 10 до 10 і переважно від 10 до 10 Од/мл суспензії. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де ЕРО являє собою еритропоетин дикого типу або рекомбінантний еритропоетин. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де речовина оболонки капсули вибрана з групи, що складається з альгінату, альгінат-хітозану (AC), альгінат-полі-L-лізину (АРА), термогелеутворювального полімеру і PEG-гідрогелю. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де речовина матриксу вибрана з групи, що складається з альгінату, альгінат-хітозану (AC), альгінат-полі-L-лізину (АРА), термогелеутворювального полімеру і PEG-гідрогелю. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де в доповнення до клітин печінки в мікрокапсулі знаходиться щонайменше один додатковий тип клітин. У особливо переважному варіанті здійснення щонайменше один додатковий тип клітин, що знаходиться в мікрокапсулі, вибраний з групи, що складається із зірчастих ендотеліоцитів печінки, жовчних клітин, гематопоетичних клітин, моноцитів, клітин макрофагів, лімфоцитів і ендотеліальних клітин. Крім того, в переважному варіанті здійснення даного винаходу передбачено, що мікрокапсула в доповнення до клітин печінки і ЕРО містить щонайменше один додатковий фактор росту, переважно вибраний з групи, що складається з HGH (фактора росту людини), VEGF (фактора росту ендотелію судин), CSF (колонієстимулюючого фактора), тромбопоетину, комплексу SCF (Skp, куліну, що містить F-box комплексу), SDF (фактора-1 стромальних клітин), NGF (фактора росту нервів), PIGF (білка біосинтез глікозилфосфатидилінозитол-якоря класу Ф), інгібітору HMGCoA-редуктази, інгібітору АСЕ (ангіотензинперетворюючого ферменту), інгібітору AT-1 і донора NO. У особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується мікрокапсул, де мікрокапсули є покритими. У особливо переважному варіанті здійснення даного винаходу покриття являє собою полімерне покриття, цукрове покриття, покриття з цукрового спирту і/або жирове або воскове покриття. 4 UA 99686 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується способу отримання вказаних вище мікрокапсул, що включає: а) отримання суспензії терапевтично ефективної кількості клітин печінки і стимулюючої клітини печінки кількості еритропоетину, b) змішування суспензії клітин печінки і еритропоетину для приведення їх в фізичний контакт один з одним і c) інкапсуляція суспензії клітин печінки і еритропоетину в речовині оболонки капсули, так щоб сформувати мікрокапсулу. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується способу, де мікрокапсули, що отримуються на етапі с), кріоконсервують. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується способу профілактики або терапевтичного лікування захворювання печінки у потребуючого цього індивідуума, що включає введення мікрокапсул за даним винаходом потребуючому цього індивідууму. У особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується способу, де захворювання печінки являє собою гепатит, цироз, вроджені порушення обміну речовин, гостру печінкову недостатність, гострі інфекції печінки, гостру хімічну токсичність, хронічну печінкову недостатність, холангіт, біліарігай цироз печінки, синдром Алажиля, недостатність альфа-1антитрипсину, аутоімунний гепатит, атрезію жовчних протоків, рак печінки, полікістозне захворювання печінки, жирову дистрофію печінки, галактоземію, камені жовчного міхура, синдром Жильбера, гемохроматоз, гепатит А, гепатит В, гепатит C і інші вірусні інфекції гепатиту, порфірію, первинний склерозуючий холангіт, синдром Рейє, саркоїдоз, тирозинемію, хворобу накопичення глікогену 1 типу або хворобу Вільсона. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується способу, де введення проводять за допомогою введення мікрокапсул під капсулу печінки, в селезінку, в печінку, в паренхіму печінки або в селезінкову артерію, або у ворітну вену. У особливо переважному варіанті здійснення даного винаходу введення і проводять за допомогою введення потребуючому цього індивідууму, де введення є місцевим, ентеральним або парентеральним введенням. У переважному варіанті здійснення місцеве введення являє собою нашкірне, інгаляційне, вагінальне або інтраназальне введення. У переважному варіанті здійснення ентеральне введення проводять через рот, за допомогою шлункового живильного зонда або ректально. У переважному варіанті здійснення парентеральне введення проводять за допомогою ін'єкції або інфузії, переважно внутрішньовенним, внутрішньоартеріальним, внутрішньом'язовим, внутрішньосерцевим, підшкірним, внутрішньокістковим, інтрадермальним, інтратекальним, інтраперитонеальним або ііправезикальним введенням. Крім того, в переважному варіанті здійснення парентеральне введення являє собою транедермальне, трансмукозальне або інгаляційне введення. Крім того, в переважному варіанті здійснення даний винахід стосується способу культивування клітин печінки в середовищі для культивування, переважно in vitro, включаючи культивування мікрокапсул за даним винаходом у прийнятному для культивування середовищі і в умовах, прийнятних для підтримування або підвищення життєздатності клітин печінки. У особливо переважному варіанті здійснення даний винахід стосується способу підтримування або підвищення енергетичного стану клітин печінки в середовищі для культивування, переважно in vitro, що включає культивування мікрокапсул за даним винаходом у прийнятному середовищі для культивування і в умовах, прийнятних для підтримання або підвищення енергетичного стану клітин печінки. Додаткові переважні варіанти здійснення даного винаходу є об'єктом підпунктів формули винаходу. На фігурі як показник енергетичного стану клітини проілюстроване підношення АТФ/АДФ після культивування клітин печінки, інкапсульованих з KPO або без ЕРО. Приклад 1 -3 Клітини печінки в присутності ЕРО (510 одиниць/мл), інкапсульовані з альгінатом в 4 8 концентрації від 10 до 10 клітин/мл в гранули із середнім діаметром від 100 до 700 мкм, більш життєздатні, ніж клітини печінки, ідентично інкапсульовані без ЕРО. Відношення АТФ/АДФ застосовують як показник енергетичного стану клітин. Якщо протягом експерименту відношення АТФ/АДФ збільшується з більшою швидкістю або залишається більшим, ніж у необроблених клітин, тоді ці дані підтверджують гіпотезу. Інкапсуляція клітин печінки з єдиного вихідного матеріалу кріоконсервованих клітин печінки людини проводили, використовуючи пристрій електростатичної генерації гранул. Клітини печінки суспендували у відповідному середовищі для культивування і змішували з 2% розчином 5 UA 99686 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 альгінату натрію в співвідношенні 1:1. Отриманий 1% розчин альгінату, що містить клітини печінки в концентрації від 4 мільйонів клітин/мл вводили в 1CC шприц, оснащений ангіокатетером 24 калібру. Ангіокатетер в основі проколювали голкою 23 калібру для застосування як позитивного електроду при електростатичному литті. Шприц вводили в шприцевий насос (Braintree Scientific BS-8000, Braintree, MA) і розташовували так, щоб краплі, що виходять з ангіокатетера падали перпендикулярно до поверхні 125 мМ розчину хлорид -3 кальцію (CaCI2) (загальноприйнятого або буфера Cytonet 4 з 1% альбуміном людини, з 510 і -6 510 Од/мл ЕРО або без ЕРО) в 250 мл аналітичну склянку. Відстань від наконечника ангіокатетера до поверхні СаСІ2 встановлювали приблизно на 2,5 см. Продуктивність насоса встановлювали в діапазоні від 0,75 до 1,5 мл/хв. Заземлений електрод занурювали в збираючу CaCl2 баню. Створювали електростатичний потенціал між наконечником ангіокатетера і банею з CaCl2, використовуючи високовольтне джерело постійного струму (Spellman model RHR30PF30, Нauppauge, NY) в діапазоні від 3,8 до 6 кВ. Розмір гранул (500 мкм) контролювали регулювання потенціалу, що застосовується. Коли шприцевий насос включали в присутності високого електростатичного потенціалу, виступаючий розчин альгінату натрію витягували у вигляді маленьких крапель, які при контакті з розчином CaCl2 полімеризувались в твердий альгінат кальцію. Після інкапсуляції клітин печінки альгінатні гранули утримували в середовищі Уїльяма E з додаванням 10% сироватки, 244 одиниць/мл пеніциліну, 0,244 мг/мл, 5,5 мМ глутаміну, 0,195 одиниць/мл інсуліну, 0,017 мкг/мл глюкагону, 0,73 мкг/мл преднізолону, 0,54 мкг/мл дексаметазону і культивували протягом 2 годин. Витягання з капсул проводили за допомогою поміщення гранул в 100 мМ цитрат. Коли альгінат розчинявся, клітини двічі промивали PBS і осаджували центрифугуванням при 200xG протягом однієї хвилини. Метаболіти екстрагували за допомогою поміщення клітин в 4% хлорну кислоту і гомогенізацією протягом 20 секунд в ручному мікрогомогенізаторі. Потім зразок центрифугували при 14000xG протягом трьох хвилин і видаляли супернатант з метаболітами. Хлорну кислоту нейтралізували KOH і видаляли нерозчинний перхлорат калію за допомогою центрифугування. Потім для визначення АТФ, АДФ зразок аналізували методом BЕPX способом, описаним в "Measurements of ATP in Mammalian Cells" (Manfredi et al. Methods 2002 (4), 317-326). Для визначення рівня АТФ/АДФ використовували три паралельні планшети. Результати Відношення АТФ/АДФ є показником енергії і відображає вплив всіх біохімічних шляхів обміну на метаболічний стан клітин. Підтримування відношення АТФ/АДФ (див. фігуру), що спостерігається в клітинах печінки, інкапсульованих з ЕРО, однозначно демонструє, що клітини здатні підтримувати шляхи виробництва енергії, необхідні для будь-якої функції клітин. У цьому експерименті відношення АТФ/АДФ підтримувалося в групі, обробленій ЕРО, але не підтримувалося в необроблених контролях. Незважаючи на те, що група, оброблена ЕРО, була здатна підтримувати відношення АТФ/АДФ, відношення АТФ/АДФ в контролях опускалося нижче за 0,5. Це демонструє, що ЕРО може передавати сигнали за допомогою каскаду, не керованого рецептором ЕРО, забезпечуючи клітинам трофічну стимуляцію. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 55 1. Мікрокапсули, які містять оболонку капсули, що інкапсулюють суспензію терапевтично ефективної кількості клітин печінки в фізичному контакті зі стимулюючою клітини печінки кількістю еритропоетину. 2. Мікрокапсули за п. 1, де клітини печінки вибрані з групи, яка складається з клітинпопередників клітин печінки, стовбурових клітин печінки, гепатобластів, ендотеліальних клітин і гепатоцитів. 3. Мікрокапсули за п. 1 або 2, де клітини печінки отримують з печінки дорослого, з печінки ембріона, з печінки плоду, з печінки новонародженого або з культур клітин печінки. 4. Мікрокапсули за будь-яким з пп. 1-3, де клітини печінки являють собою клітини печінки людини, клітини печінки примата, що не є людиною, клітини печінки свині, клітини печінки собаки, клітини печінки кішки, клітини печінки кролика, клітини печінки миші або клітини печінки щура. 5. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де середній діаметр мікрокапсул складає від 100 до 700 мкм. 6. Мікрокапсули за будь-яким з пп. 1-5, де середній діаметр клітин печінки складає від 8 до 14 мкм. 6 UA 99686 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 7. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де терапевтично ефективна кількість клітин 4 8 печінки складає від 10 до 10 клітин печінки/мл суспензії. 8. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де стимулююча клітини печінки кількість -7 -2 -7 -3 еритропоетину складає від 10 до 10 , переважно від 10 до 10 Од/мл суспензії. 9. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де еритропоетин являє собою еритропоетин дикого типу або рекомбінантний еритропоетин. 10. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де оболонка капсули отримана з біологічно сумісної речовини, вибраної з групи, яка складається з альгінату, альгінат-хітозану (АС), альгінат-полі-L-лізину (АРА), термогелеутворювального полімеру і PEG-гідрогелю. 11. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де в доповнення до клітин печінки в мікрокапсулі знаходиться щонайменше один додатковий тип клітин. 12. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де мікрокапсули є покритими. 13. Мікрокапсули за будь-яким з попередніх пунктів, де мікрокапсула містить біологічно сумісний матрикс, в який поміщені клітини печінки і еритропоетин. 14. Спосіб отримання мікрокапсул за будь-яким з попередніх пунктів, який включає: a) отримання суспензії терапевтично ефективної кількості клітин печінки і стимулюючої клітини печінки кількості еритропоетину, b) змішування суспензії клітин печінки і еритропоетину для приведення їх в фізичний контакт один з одним і c) інкапсуляцію суспензії клітин печінки і еритропоетину в біологічно сумісній речовині оболонки капсули, так щоб сформувати мікрокапсулу. 15. Спосіб за п. 14, де мікрокапсули, що отримуються на етапі с), кріоконсервують. 16. Спосіб профілактики або терапевтичного лікування захворювання печінки потребуючого цього індивідуума, що включає введення мікрокапсул потребуючому цього індивідууму за будьяким з пп. 1-13. 17. Спосіб за п. 16, де захворювання печінки являє собою гепатит, цироз, вроджені порушення обміну речовин, гостру печінкову недостатність, гострі інфекції печінки, гостру хімічну токсичність, хронічну печінкову недостатність, холангіт, біліарний цироз печінки, синдром Алажиля, недостатність альфа-1-антитрипсину, аутоімунний гепатит, атрезію жовчних проток, рак печінки, полікістозне захворювання печінки, жирову дистрофію печінки, галактоземію, камені жовчного міхура, синдром Жильбера, гемохроматоз, гепатит А, гепатит В, гепатит С і інші викликані вірусом інфекції гепатиту, порфірію, первинний склерозуючий холангіт, синдром Рейє, саркоїдоз, тирозинемію, хворобу накопичення глікогену 1 типу або хворобу Вільсона. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 15-17, де введення проводять за допомогою введення мікрокапсул під капсулу печінки, в селезінку, в печінку, в паренхіму печінки або в селезінкову артерію, або у ворітну вену. 19. Спосіб введення клітин печінки індивідууму, що включає введення мікрокапсул індивідууму за будь-яким з пп. 1-13. 20. Спосіб культивування клітин печінки в середовищі для культивування, що включає культивування мікрокапсул за будь-яким з пп. 1-13 у прийнятному середовищі для культивування. 7 UA 99686 C2 Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8