Спосіб кріоконсервування клітин ембріональної печінки собаки

Корисна модель відноситься до ветеринарної медицини та біотехнології і може бути використана для кріоконсервування клітин ембріональної печінки (КЕП) собаки. Трансплантація гемопоетичних клітин є одним з перспективних напрямків лікування захворювань системи кровотворення та корекції імунітету у тварин. Ембріональна печінка містить велику кількість клітин -попередників усі х ростків кровотворення, в тому числі і гемопоетичних клітин. Однак, широке застосування в практиці ветеринарної медицини не можливо без достатньої кількості заздалегідь заготовлених клітин, які мають високій рівень життєздатних кровотворних елементів, що здатні відновлювати гемопоез при трансплантації тваринам. Рішення цієї проблеми можливо за допомогою методів низькотемпературного консервування, які дозволяють зберігати біоматеріал придатним для трансплантації протягом багатьох років. В Україні відсутні способи кріоконсервування клітин ембріональної печінки собаки. Існує спосіб кріоконсервування й підготовки до трансфузії гемопоетичних клітин кордової крові [патент України 42599, МПК А01N1/00, A01N1/02, A61К35/14], що включає розведення цільної крові стабілізатором крові в співвідношенні 4:1, видалення еритроцитів, видалення надосаду клітинної суспензії, додавання рівного об'єму кріоконсерванту на основі полівінілпіролідона з подальшим заморожуванням і розморожуванням суміші, при якому видалення еритроцитів проводять після розведення цільної кордової крові розчином, що стабілізує, обробкою розведеної кордової крові розчином гідроксиметил-крохмалю для осадження еритроцитів. Після чого осад відокремлюють, а вільний від еритроцитів надосад клітинної суспензії концентрують, а кріоконсервант додають до концентрату клітинної суспензії. Недоліком даного способу є його багатоетапність, що ускладнює спосіб і погіршує умови стерильності. Невизначений режим заморожування гемопоетичних клітин людини не дозволяє одержати позитивні результати, тому що життєздатність клітин забезпечується лише у вузькому інтервалі швидкості зниження температури. Це приводить до зниження періоду зберігання й зменшенню кількості життєздатних клітин після періоду зберігання. Відомий спосіб кріоконсервування клітин кісткового мозку [патент Росії 2144290, МПК А01N1/02, опубл. 20.01.2000], який здійснюють шляхом поетапного заморожування у присутності кріозахисного розчину, при якому суспензію клітин заливають у м'який одноразовий контейнер, заповнений на 10-30%. На першому етапі контейнер поміщають у рідкий холодоагент за температури від мінус 26 до мінус 30°С та витримують 15-25хв. На другому етапі контейнер поміщають у схови ще-холодильник за температури від мінус 40 до мінус 50°С. Недоліком способу є те, що зазначений режим заморожування травматичний для гемопоетичних клітин людини, тому що температура зберігання мінус 40-50°С недостатня для тривалого зберігання гемопоетичних клітин. Все це призводить до зменшення періоду зберігання та зниження кількості життєздатних клітин після періоду зберігання. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб збереження тканини (переважно шкіри) ссавців при кріогенній температурі [патент США 5891617, МПК А01N001/02, дата публікації 06.04.99p.], що передбачає занурення зазначеної тканини у розчин кріозахисного середовища (1,5-2,5М гліцерин у середовищі Dulbecco's Modified Eagle's MediuM (DMEM)), його змішування, внесення зародків льоду в позаклітинний простір кріоконсерванту та перфузованої тканини, охолодження позначеної тканини зі швидкістю 10°С/хв. до температури мінус 6°С, або проводять заморожування зі швидкістю 1°С/хв. до температури мінус 8°С. Після чого продовжують охолодження зі швидкістю 0,3°С до температури мінус 70°С. Цей спосіб може бути прототипом. Але, недоліком зазначеного способу є те, що ініціація кристалоутворення здійснюється за допомогою внесення зародків льоду в позаклітинний простір, що ускладнює спосіб і погіршує умови стерильності кріозахисного середовища. Застосування середовища Dulbecco's Modified Eagle's MediuM у більшості країн не дозволено для внутрішньовенного використання і тому клітини, отримані у такий спосіб, не можна використати у більшості випадків лікування. Зазначені режими заморожування травматичні для гемопоетичних клітин людини та тварин, тому що швидке зниження температури на першому етапі викликає ріст більших кристалів, які руйнують мембрани клітин. Низька швидкість заморожування на завершальному етапі охолодження істотно затягує процес виконання способу. Температура мінус 70°С недостатня для тривалого зберігання гемопоетичних клітин. Завдяки тому, що спосіб передбачає використання великої кількості кріопротектору (гліцерину), отримані у такий спосіб клітини перед використанням слід відмивати від кріопротектору, що ускладнює спосіб і забезпечує негативний вплив додаткових дій на клітини. Зазначені недоліки приводять до зменшення періоду зберігання та кількості життєздатних клітин після розморожування. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб кріоконсервування клітин ембріональної печінки собаки, що включає внесення кріозахисного середовища, перемішування, заморожування шляхом додавання у суспензію клітин кріозахисного середовища, до складу якого входить полівінілпіролідон (ПВП) (Мм 12300-12600) - 90,0-100,0, глюкоза - 50,0-60,0, лактоза - 30,0-35,0, гідроцитрат натрію - 7,0-10,0, натрій фосфорнокислий двозаміщений - 5,0-7,5, вода бідистильована - решта, та заморожування у три етапи: зі швидкістю 0,5-1,0°С/хв. до мінус 8,5-10,5°С, зі швидкістю 1,0-4,5°С/хв. до мінус 30-40°С, зі швидкістю 10-12°С/хв. до мінус 130-196°С. Внаслідок застосування нової сукупності ознак способу, ініціація кристалоутворення здійснюється без додаткового контакту із клітинною суспензією, що спрощує спосіб і поліпшує умови стерильності кріозахисного середовища, яке дозволене для внутрішньовенного використання. Зазначені режими заморожування не травматичні для гемопоетичних клітин собаки, тому що емпірично підібраний режим зниження температури не викликає ріст більших кристалів, які можуть порушити цілісність клітинної мембрани. Зазначені переваги приводять до подовження періоду зберігання та збільшенню кількості життєздатних кліток після періоду заморожування. Порівняльний аналіз із прототипом дозволяє зробити висновок, що спосіб, який заявляється відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином: У суспензію КЕП, що призначена для низькотемпературного зберігання, після підрахунку кількості живих клітин, при постійному перемішуванні додають рівний об'єм кріозахисного середовища до складу якого входить ПВП (Мм 12300-12600) - 90,0-100,0, глюкоза - 50,0-60,0, лактоза - 30,0-35,0, гідроцитрат натрію - 7,0-10,0, натрій фосфорнокислий двозаміщений - 5,0-7,5, вода бідистильована - решта. Клітинну суспензію розливають в ампули по 4см 3 і заморожують. Заморожування здійснюють у три етапи, при цьому на першому етапі зі швидкістю 0,51,0°С/хв. до мінус 8,5-10,5°С, на другому етапі зі швидкістю 1,0-4,5°С/хв. до мінус 30-40°С, а на третьому етапі - зі швидкістю 10-12°С/хв. до мінус 130-196°С. Приклад 1 До 100см 3 суспензії клітин ембріональної печінки при постійному перемішуванні додавали 100см 3 кріозахисного середовища, суспензію розливали у стерильні кріопробірки (фірма Nunc) по 4см 3 і заморожували. Заморожування здійснювали у три етапи: зі швидкістю 0,5-1,0°С/хв. до мінус 8,5-10,5°С; зі швидкістю 1,0-4,5°С/хв. до мінус 30-40°С та зі швидкістю 10-12°С/хв. до мінус 130-196°С. Приклад 2 Відтавання суспензії КЕП здійснювали безпосередньо перед використанням, для чого ампули поміщали в водяну баню за температури 40°С до появлення рідкої фази у зразку, після чого ампули вилучали і усі маніпулювання з клітинами проводили при кімнатній температурі в стерильних умовах. Приклад 3 Визначали концентрацію живих клітин: 0,1см 3 концентрату ресуспендованого у середовищі RPMI осаду клітин, що отримували після центрифугування, вносили у пробірку, у яку попередньо наливали 0,9см 3 розчину Хенкса (розведення 1:10). До ретельно перемішаної суспензії клітин додавали 0,1% розчин трипанового синього в об'ємі 1см 3 (розведення 1:20). Піпеткою відбирали частину добре змішаної суспензії клітин з барвником і заправляли рахункову камеру Горяєва. Виготовлений за таким способом препарат негайно переглядали під світловим мікроскопом МБИ-3. По всій площі камери рахували незабарвлені (живі) клітини. Загальну концентрацію живих клітин вираховували за формулою: A ´ B ´ 100 X= 0,9 де X - кількість кліток в 1см 3 досліджуваній суспензії, А - кількість підрахованих живих клітин у камері Горяєва, В - коефіцієнт розведення (у нашому випадку 20), 1000 - кількість кубічних міліметрів в 1см 3 0,9 - обсяг рахункової камери Горяєва в кубічних міліметрах. Спосіб, що заявляється, є доступним, простим у виконанні. Він забезпечує збільшення періоду зберігання й збільшення кількості життєздатних клітин після періоду заморожування. Застосовані у способі середовища дозволені для внутрішньовенного використання й тому клітини, отримані у такий спосіб, можна використовувати в більшості випадків лікування тварин. Зазначені режими заморожування не травматичні для клітин ембріональної печінки собаки, тому що емпірично підібраний режим зниження температури не викликає ріст великих кристалів, які можуть зруйнувати клітинну мембрану.