Застосування субстанції наночастинок срібла як протимікробного засобу при лікуванні гнійно-запальних захворювань щелепно-лицевої ділянки

Реферат: Застосування субстанції наночастинок срібла як протимікробного засобу при лікуванні гнійнозапальних захворювань щелепно-лицевої ділянки UA 99785 U (12) UA 99785 U UA 99785 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до протимікробних засобів, які можуть бути застосовані при лікуванні гнійно-запальних процесів у щелепно-лицевій хірургії та стоматології. Гнійно-запальні захворювання щелепно-лицевої ділянки є складними у лікуванні та складають вагому частину загальної кількості стоматологічних хірургічних захворювань. Переважають гнійно-запальні процеси у формі абсцесів та флегмон, періоститу, остеомієліту, нагноєння кісткової рани тощо. Серед найбільш розповсюджених збудників виділяють агресивний мультирезистентний Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Micrococcus, гриби роду Candida albicans тощо. Особливої уваги заслуговує факт зростання кількості небезпечних для життя ускладнень, обумовлених розповсюдженням резистентних штамів-збудників, перенасиченістю організму фармакологічними препаратами, послабленням імунної системи та алергізацією організму хворого. В цих умовах задача розробки та впровадження нових альтернативних антибіотикам засобів протимікробної терапії є особливо актуальною. Широко відома висока біологічна активність срібла та його колоїдних розчинів Препарати на основі колоїдного срібла застосовуються як антимікробні, протигрибкові та антивірусні засоби. Серед відомих препаратів високодисперсного срібла є такі, що давно застосовують у практиці лікування, наприклад, ЛОР-захворювань, зокрема Коларгол, Протаргол, та створені відносно недавно протимікробні препарати - Аргакрил за патентом РФ № 2220982, 2004 p., Повіаргол за патентом РФ № 2088234, 1996 p. Відомі препарати містять у значній кількості як стабілізатори колоїдних частинок срібла білки та полімери, наприклад, казеїн, поліакрилову кислоту, полівінілпіролідон тощо, які можуть обумовлювати їх недоліки та викликати побічні ефекти у пацієнтів при лікуванні. Так, препарати Коларгол і Протаргол через наявність у їх складі білків (казеїн, желатин) виявляють алергічну дію і не піддаються строгій стандартизації; препарат аргакрил містить поліакрилову кислоту з великою молекулярною масою і тому має високу в'язкість. Крім того, спільним недоліком більшості відомих засобів є широкий розподіл частинок срібла за розмірами та втрата їх агрегативної стійкості з часом. Основними вимогами до високоефективного антимікробного препарату доопераційної та післяопераційної профілактики, а також терапії стоматологічних хірургічних хворих є широкий спектр активності у відношенні до найбільш розповсюджених збудників, бактерицидний механізм дії, біосумісність та біобезпечність, відсутність впливу на розвиток резистентності збудників. Необхідними вимогами до засобу такого призначення на основі високодисперсного срібла є також монодисперсність та стабільність у часі. Таким вимогам в значній мірі відповідає водна дисперсія наночастинок срібла, яку нещодавно одержано в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України. Створена оригінальна технологія синтезу наночастинок срібла методом хімічної конденсації з водного розчину AgNO3 забезпечує одержання монодисперсної та стабільної у часі субстанції. Біобезпечність, біосумісність та антимікробна активність нової субстанції встановлені за результатами всебічних досліджень відповідно до критеріїв Методичних рекомендацій "Оцінка безпеки лікарських нанопрепаратів", затверджених науково-експертною радою Державного експертного центру МОЗ України (протокол № 8 від 26.09.2013 p.). В додатку 2 до цих методичних рекомендацій наведено паспорт наночастинок срібла (скорочена назва AgNP) із середнім розміром 30±1 нм, описано спосіб одержання нової субстанції AgNP та представлені результати оцінки її антимікробних властивостей. Задачею корисної моделі є створення на основі високодисперсного срібла нового протимікробної засобу, ефективного у лікуванні гнійно-запальних захворювань щелепнолицевої ділянки, що дозволить розширити асортимент препаратів такого призначення. Поставлена задача вирішена застосуванням як протимікробного засобу при лікуванні гнійнозапальних захворювань щелепно-лицевої ділянки субстанції наночастинок срібла. В основу корисної моделі покладені результати досліджень антимікробної активності нової субстанції AgNP по відношенню до клінічних ізолятів мікроорганізмів збудників гнійно-запальних захворювань щелепно-лицевої ділянкита вивчення її терапевтичної ефективності при лікуванні тварин. Наведені нижче приклади застосування субстанції AgNP для лікування модельного гнійного абсцесу щелепної ділянки лабораторних щурів підтверджують її більш виражену ефективність, порівняно із найбільш поширеними традиційними антимікробними терапевтичними засобами. Таким чином, задачу корисної моделі вирішено з досягненням необхідного технічного результату. 1 UA 99785 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 1 Визначали антимікробну активність субстанції наночастинок срібла по відношенню до клінічних ізолятів патогенних мікроорганізмів Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus, грибів роду Candida albicans та дріжджоподібних грибів. Клінічні ізоляти мікроорганізмів були виділені від хворих відділення щелепно-лицевої хірургії № 2 та травматологічного пункту Київської міської клінічної лікарні № 12. Забір матеріалу був здійснений у хворих обох статей, віком від 17 до 67 років з діагнозом абсцеси та флегмони різних відділів щелепно-лицевої ділянки та виділений у бактеріологічній лабораторії КМКЛ № 12. Використовували стерильну субстанцію AgNP у воді, синтезовану в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України, яка згідно з паспортом мала наступні характеристики: розмір частинок срібла 30±1,0 нм, концентрація субстанції 1,6 мг/мл за металом. Як препарати порівняння використовували препарати хлоргексидин та фурацилін, які є традиційними засобами антимікробної профілактики і терапії у щелепно-лицевій хірургії. Антимікробну активність нової субстанції наночастинок срібла та традиційних антимікробних засобів визначали в дослідженнях in vitro методом серійних розведень в агарі згідно з МУК 4 4.2.1890-04, 2004 р. за кінцевої засівної дози клінічних ізолятів мікроорганізмів на чашках 10 3 КУО/см . Стерильні препарати срібла та комерційні протимікробні засоби вносили в охолоджене до 50 °C стерильне поживне середовище визначення (середовище Мюлера-Хінтона), перемішували та розливали на чашки Петрі. Кінцеві концентрації наночастинок срібла в середовищі визначення складали 0,08 мг/мл та 0,16 мг/мл за металом. Кінцева концентрація хлоргексидину в середовищі визначення складала 5 мг/мл, а фурациліну - 0,13 мг/мл. Результати проведених досліджень антимікробного впливу субстанції AgNP та препаратів порівняння на клінічні ізоляти збудників гнійно-запальних захворювань щелепно-лицевої ділянки хворих наведені в таблиці 1, де застосовані такі позначення: 0 - ріст відсутній, + - поодинокі колонії, ++ - помірний ріст, +++ - виражений ріст, ++++ інтенсивний ріст. Наведені у табл. 1 дані щодо високої антимікробної ефективності дослідженої субстанції наночастинок срібла, яка більш виражена, порівняно з дією хлоргексидину та фурациліну, свідчать про перспективність застосування субстанції AgNP як протимікробного засобу та створення на її основі нових препаратів для лікування гнійно-запальних захворювань щелепнолицевої ділянки. Приклад 2 Терапевтичну ефективність антимікробної дії субстанції наночастинок срібла визначали на моделі гнійного абсцесу щелепної ділянки лабораторних тварин. Дослідження проводили з використанням лабораторних щурів лінії Wistar вагою 250-300 г. Дослідні тварини були поділені на 5 груп по 10 тварин у кожній групі: Група 1 - контрольна група - умовно-здорові тварини. Група 2 - контрольна група - тварини із розкритим неліченим абсцесом; Група 3 - експериментальна група - тварини, у яких розкритий абсцес промивали субстанцією AgNP у концентрації 0,8 мг/мл за металом; Група 4 - експериментальна група - тварини, у яких розкритий абсцес промивали препаратом Декасан (1 мл розчину містив 0,2 мл декаметоксину); Група 5 - експериментальна група – тварини, у яких розкритий абсцес промивали препаратом Хлоргексидин (1 мл розчину містив 0,5 мл хлоргексидину біглюконату). Моделювання абсцесу щелепної ділянки проводили шляхом підшкірної ін'єкції лабораторним тваринам 2-5 груп у піднижньощелепну ділянку 0,5 мл суспензії добової культури 7 клінічного ізоляту Staphylococcus aureus (5×10 КУО/мл), яка містила 9 % мас. активованого вугілля. На четверту добу після ін'єкції дослідним тваринам суспензії культури клінічного ізоляту Staphylococcus aureus з порошком активованого вугілля у місці введення спостерігалось виникнення гнійно-запального процесу по типу абсцесу із вираженим набряком м'яких тканин правої піднижньощелепної ділянки. Дослідні тварини 2-5 груп, порівняно із контрольною групою умовно-здорових тварин, були млявими, відрізнялись поганим апетитом. Шкіра над наявним інфільтратом була напруженою, гіперемованою. Приклад 3 Для визначення антимікробної активності субстанції AgNP, порівняно з відомими препаратами, при лікуванні модельних абсцесів тварин здійснювали мікробіологічний контроль 2 UA 99785 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стану абсцесу шляхом посівів патологічного матеріалу (гною з осередку ураження) на м'ясопептонний агар та жовточно-сольовий агар Чистовича (поживне середовище, елективне для стафілококів) та інкубації посівів за t=37 °C протягом 24 годин. Посів гною, взятого стерильним тампоном з вогнища ураження, виконували одразу після розкривання абсцесу та через 1 добу після першого промивання розкритих абсцесів протимікробними засобами. Розкривання абсцесу зовнішнім доступом та струменеве промивання розкритого абсцесу субстанцією наночастинок срібла та препаратами порівняння проводили за загальноприйнятою в практиці щелепно-лицевої хірургії методикою. Розкривання абсцесу здійснювали у тварин груп 2-5 зовнішнім доступом на 4-ту добу після зараження, виконуючи розріз шкіри над центром інфільтрату - довжиною, не меншою від довжини інфільтрату. Промивання розкритих абсцесів протимікробними засобами здійснювали 1 раз на добу протягом наступних 3 діб. Розкриті абсцеси промивали струменево із розрахунку 4 мл кожного засобу на 1 тварину. Розкриті абсцеси тварин групи 3 промивали субстанцією AgNP, групи 4 - препаратом Декасан, а групи 5 - препаратом Хлоргексидин. Посів гною, взятого з осередку ураження одразу після розкривання абсцесу у тварин 2-5 груп виявив значну мікробну контамінацію: кількість колоній S. aureus у всіх досліджених зразках 8 8 3 в середньому складала 8×10 -11×10 КУО/см . Через одну добу після першого промивання розкритих абсцесів в контрольній групі із розкритими неліченими абсцесами (тварини групи 2) кількість колоній S. aureus у вогнищі абсцесу залишалась на тому ж рівні. Водночас, кількість колоній S. aureus, що висівалися у пробах матеріалу із осередку запалення, відібраного після одноразового промивання розкритих абсцесів субстанцією AgNP та препаратами порівняння, суттєво зменшилась (дивись табл. 2). Наведені у таблиці 2 дані показують, що субстанція AgNP виявила найбільш виражену антимікробну активність при лікуванні модельних абсцесів тварин, порівняно з відомими комерційними препаратами, які характеризуються значно меншою ефективністю. Приклад 4 З метою вивчення ефективності лікування модельного гнійного абсцесу щелепної ділянки лабораторних щурів субстанцією AgNP та препаратами порівняння проводили гістологічні дослідження, для чого на 5 добу після останнього промивання протимікробними засобами розкритих абсцесів (12 доба від початку експерименту) здійснювали забій тварин контрольних та дослідних груп шляхом декапітації з використанням як анестетика - хлороформу. Відокремлювали ділянки нижньої щелепи в області осередку ураження та фіксували у 4 % розчині формаліну. Результати гістологічних досліджень наведені на мікрофотографіях Фіг. 1-5. На фіг. 1-2 наведено мікрофотографії розкритого, але не лікованого абсцесу у тварин групи 2. На фіг. 3 наведено мікрофотографію абсцесу у тварин 4 групи при застосуванні Хлоргексидину. На фіг. 4 представлені мікрофотографії абсцесу у тварин 5 групи після 3-разової обробки Декасаном. На фіг. 5 наведено мікрофотографії абсцесу тварин 3 групи після 3-разової обробки субстанцією AgNP. Представлена на мікрофотографіях Фіг. 1 та Фіг. 2 картина нелакованого абсцесу у тварин групи 2 свідчить про всі наявні ознаки запалення. На знімку "а" Фіг. 1 показано сформований бар'єр навколо абсцесу; на знімку "б" - забиті чужорідними тілами макрофаги навколо гнійного вогнища з чужорідними та інфекційними тілами всередині. Мікрофотографії Фіг. 2 свідчать про наявність таких ознак запального процесу не лікованого абсцесу, як: "а" - муфта з лейкоцитів навколо венули; "б" - лейкоцити та фібробласти у набряклій сполучній тканині навколо абсцесу; "в" - чужорідні тіла в макрофагах; "г" - чужорідні тіла в макрофагах та зруйновані лейкоцити (показано стрілкою). Аналіз мікрофотографій Фіг. 1, 2 свідчить про те, що на 12 день розвитку запалення у щурів, які не отримували ніякого лікування, було сформоване відокремлене захисним валом велике гнійно-некротичне вогнище, всередині якого знаходили чужорідні тіла та зруйновані лейкоцити у складі гнійно-некротичних мас. Осередок гнійно-некротичних змін займав найбільшу площу і найбільше поширювався вглиб тканин. До складу захисного валу входили фібробласти. Навколо вогнища спостерігали рясну капілярну сіть, стаз крові у дрібних судинах, набряк, велику кількість лейкоцитів та гістіоцитів. 3 UA 99785 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Таким чином, у тварин групи 2 спостерігали чіткі ознаки гнійно-септичного процесу. Аналіз мікрофотографії Фіг. 3 показує, що при застосуванні Хлоргексидину в 5 групі тварин на 12 добу від початку експерименту прояви запалення дещо зменшувались, проте залишались чітко видимими: навколо інфекційних агентів знаходили зруйновані лейкоцити; скупчення чужорідних тіл всередині порожнини, оточеної зруйнованими лейкоцитами та невелику частину чужорідних тіл в макрофагах (показано стрілками). Результати лікування Декасаном тварин групи 4 представлені на мікрофотографіях Фіг. 4, де на знімку "а" показано скупчення чужорідних тіл на межі дерми у ділянці проколу, переважна частина чужорідних тіл у макрофагах; на знімку "б" - потоншені м'язові волокна у прилеглих до абсцесу ділянках; на знімку "в" - стаз крові у судинах навколо абсцесу. Таким чином, при застосуванні Декасану в 4 групі тварин на 12 добу від початку експерименту значно зменшувалась кількість зруйнованих лейкоцитів (гною) навколо чужорідних тіл, що свідчить про зменшення інфекційних агентів серед них. Скупчення чужорідних тіл знаходили на межі дерми у ділянці проколу, тобто ураження локалізувалось у більш поверхневих шарах підщелепної ділянки. Значна маса чужорідних тіл знаходилась в макрофагах, що проникали до оточеного валом вогнища запалення. Зберігався набряк тканин. На межі ушкодженої зони спостерігали густу сіть наповнених кров'ю судин, стаз крові у багатьох із них, що свідчить про продовження запальних змін. Представлена на мікрофотографіях Фіг. 5 картина лікування модельного абсцесу тварин групи 3 із застосуванням субстанції AgNP свідчить, що після обробки абсцесу субстанцією наночастинок срібла у ділянці введення інфекційного агента спостерігали значне пригнічення запального процесу. На знімках Фіг. 5 показано: "а" - скупчення чужорідних тіл, що має невелику площу; "б" - сіть кровоносних судин у прилеглих до абсцесу ділянках; "в" - чужорідні тіла у макрофагах; "г" - фібробласти та колагенові волокна у складі сполучно-тканинної капсули навколо абсцесу. Аналіз знімків Фіг. 5 (а, б, в, г) та порівняння їх з відповідними знімками Фіг. 3, 4 показує, що набряк прилеглих тканин після обробки абсцесу субстанцією наночастинок срібла менш виражений, ніж при застосуванні препаратів порівняння. Значна маса чужорідних тіл знаходиться в макрофагах та зберігаються лише невеликі осередки чужорідних тіл, оточених зруйнованими лейкоцитами, що може вказувати на наявність в таких ділянках інфекції. У прилеглих ділянках менш розвинута сіть судин, в них значно рідше зустрічаються агреговані еритроцити, що вказує на стаз крові. Серед гістіоцитарних клітин навколо абсцесу з'являються фібробласти, тканинні базофіли. У капсулі абсцесу добре видимі колагенові волокна. Значне прискорення переходу запального процесу до стадій проліферації та організації уражених ділянок у хворих тварин, яким здійснювали лікування абсцесу шляхом промивання субстанцією AgNP, свідчить про знищення інфекційного агента в цих ділянках організму, на відміну від характеру дії препаратів порівняння, які виявилися менш ефективними. Наведені результати гістологічних досліджень засвідчили, що промивання розкритого абсцесу субстанцією наночастинок срібла сприяє вираженому пригніченню запального процесу та швидкому загоєнню рани. Спостерігається більш виражений лікувальний ефект, порівняно з відомими препаратами. Таблиця 1 Клінічні ізоляти Staphylococcus aureus Micrococcus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Гриби роду Candida albicans Дріжджоподібні гриби Субстанція AgNP 0,08 0,16 мг/мл мг/мл Контроль росту тестштаму Хлоргексидин, 5 мг/мл Фурацилін, 0,13 мг/мл ++++ + + 0 0 ++++ ++++ 0 +++ + 0 0 0 0 0 ++++ + 0 0 0 ++++ ++ 0 0 0 ++++ +++ 0 0 0 4 UA 99785 U Таблиця 2 Кількість колоній S. aureus, що висівалися у пробах матеріалу із вогнища запалення, 3 КУО/см 0 8 8 8×10 -10×10 3 9×10 4 7×10 5 2×10 Групи тварин 1 2 3 4 5 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Застосування субстанції наночастинок срібла як протимікробного засобу при лікуванні гнійнозапальних захворювань щелепно-лицевої ділянки 5 UA 99785 U 6 UA 99785 U 7 UA 99785 U Комп’ютерна верстка М. Шамоніна Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8