Застосування субстанції наночастинок срібла як протимікробного засобу внутрішньовенного введення в умовах генералізованої інфекції

Реферат: Застосування субстанції наночастинок срібла як протимікробного засобу внутрішньовенного введення в умовах генералізованої інфекції. UA 99784 U (12) UA 99784 U UA 99784 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до протимікробних засобів та може бути використана при створенні препаратів для лікування сепсису. На цей час септичні ускладнення становлять високу небезпеку. За останніми даними, наприклад, лише в США частота випадків сепсису складає 3 на 1000 осіб щорічно. У Великій Британії смертність від септичних ускладнень становить більш ніж 30 % та є причиною смерті 37000 людей щорічно. Етіологічна структура септичних захворювань включає грам-позитивні коки, зокрема Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, та грам-негативні палички: Escherichia сої і, Enterobacter, Pseudomonas aeruginosa. Особливу небезпеку представляють антибіотикорезистентні внутрішньогоспітальні штами Staphylococcus aureus MRSA та Pseudomonas aeruginosa. З огляду на вище вказане, пошук принципово нових лікарських засобів з високою антимікробною активністю є актуальним. Широко відома антимікробна активність срібла та його колоїдних розчинів. Антимікробні властивості гідрозолей срібла проти широкого спектру мікроорганізмів (бактерій, деяких грибів, вірусів та ін.) використовують при створенні як вже давно відомих лікарських препаратів, вживаних, наприклад, в отоларингології (Коларгол, Протаргол), так і пропонованих відносно недавно (Повіаргол за пат. RU № 2088234, 1996 p., Аргакріл за пат. RU № 2220982, 2004 p.). Ці та інші відомі препарати високодисперсного срібла звичайно готують із застосуванням як стабілізаторів природних або синтетичних полімерів. Однак незважаючи на це, основними недоліками більшості з них є агрегативна нестійкість у часі та широка полідисперсність і при цьому - недостатня біобезпечність. Тому найчастіше їх використовують як засоби зовнішнього застосування (для лікування ЛОР-захворювань, опіків, гнійних ран, у косметології тощо) або (рідше) для перорального введення. Відомостей про дослідження щодо протимікробного ефекту високодисперсного срібла при внутрішньовенному введенні, його впливу на гематологічні показники в умовах генералізованої інфекції, у джерелах інформації відсутні. В останні роки зусилля розробників націлені на створення монодисперсних та біобезпечних препаратів наноструктурного срібла. Так, в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України розроблено оригінальну технологію одержання субстанції наночастинок срібла з такими властивостями з використанням методу хімічної конденсації (за реакцією відновлення нітрату срібла таніном у присутності карбонату калію). Всебічними дослідженнями згідно вимог та протоколів Методичних рекомендацій "Оцінка безпеки лікарських нанопрепаратів", затверджених науково-експертною радою Державного експертного центру МОЗ України (протокол № 8 від 26.09.2013 p.), встановлена біосумісність та біобезпечність нової субстанції наночастинок срібла (скорочена назва AgNP), характеристику якої наведено у додатку 2 вказаних Методичних рекомендацій. Згідно з паспортом, субстанція AgNP - це стерильна водна дисперсія наночастинок срібла з вмістом срібла 0,08-8,0 мг/мл за металом, яка с монодисперсною (наночастинки мають сферичну форму та середній розмір 30-1 1,0 нм) та стабільною в часі за розміром та формою частинок. Вивчення рівня антимікробної активності субстанції AgNP по відношенню до широкого спектру мікроорганізмів згідно з Методичними вказівками МУК 4.2.1890-04 (Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - 2004. - Т.6, № 4. - С. 306-359) показало, що введення у середовище визначення субстанції наночастинок у кількості 43,2 та 21,6 мкг/мл за 3 5 металом повністю пригнічує ріст досліджуваних мікроорганізмів у засівних дозах 10 -10 3 КУО/см , що свідчить про дуже високу протимікробну ефективність. Встановлена біобезпечність, висока антимікробна активність, а також монодисперсність та стабільність субстанції AgNP зумовлюють перспективність її застосування для розробки ефективних засобів лікування гнійно-септичних захворювань. Задачею корисної моделі є розширення асортименту біобезпечних при внутрішньовенному введені протимікробних засобів, ефективних в умовах генералізованої інфекції, для створення на їх основі нових препаратів для лікування септичних ускладнень. Поставлену задачу вирішено застосуванням в умовах генералізованої інфекції субстанції наночастинок срібла як протимікробного засобу внутрішньовенного введення. В основу корисної моделі покладені результати досліджень протимікробної активності пропонованої субстанції AgNP по відношенню до патогенних тест-штамів мікроорганізмів, які можуть викликати септичні ускладнення, та впливу наночастинок срібла на гематологічні показники в умовах генералізованої інфекції. Наведені нижче дані щодо антимікробної активності субстанції AgNP по відношенню до клінічних полірезистентних ізолятів мікроорганізмів та приклади застосування субстанції AgNP при внутрішньовенному введенні дослідним тваринам в умовах генералізованої інфекції 1 UA 99784 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 демонструють її високу ефективність та успішність при лікуванні модельного септичного захворювання. Таким чином, задачу корисної моделі вирішено з досягненням необхідного технічного результату. Приклад 1. Визначали антимікробну активність субстанції AgNP в дослідженні in vitro по відношенню до клінічних полірезистентних ізолятів мікроорганізмів. Клінічні полі резистентні ізоляти: Klebsiella ozaenae 4348, Citrobacter freundii 4369, Escherichia coli 4358, Enterobacter aerogenes 2476, Proteus mirabilis 4363, Staphylococcus aureus 4312, Pseudomonas aeruginosa 283, були виділені від хворих хірургічного профілю із ран, сечі, зіскребів з цервікального каналу, зіву. 5 7 3 Виділені клінічні ізоляти мікроорганізмів засівали газоном в концентрації 10 та 10 КУО/см на чашки Петрі з твердим поживним середовищем (агар Мюлера-Хінтона). Суспензію мікроорганізмів готували на 0,9 % NaCl. Після підсушування чашок з культурами мікроорганізмів протягом 30 хвилин на поверхню агару наносили субстанцію AgNP (концентрація 0,8 мг/мл за металом), вміст срібла у краплі на чашці становив 10 мкг при нанесенні 12,5 мкл субстанції або 20 мкг при нанесенні 25 мкл субстанції відповідно. Культивування мікроорганізмів здійснювали в термостаті при температурі 37 °C протягом 24 годин. Обрахунок результатів проводили шляхом вимірювання зон повної затримки росту тест-культур. Після урахування діаметру зон затримки росту чашки зберігали при кімнатній температурі протягом 15 діб з метою виявлення можливого вторинного росту мікроорганізмів в зоні стерильності. Результати, наведені в таблиці 1, показують, що субстанція AgNP в дослідженні in vitro виявляє високу антимікробну активність по відношенню до широкого спектру клінічних полірезистентних ізолятів мікроорганізмів, виділених від хворих хірургічного профілю. Приклад 2. Вивчали ефективність субстанції AgNP при внутрішньовенному введенні дослідним тваринам в умовах генералізованої інфекції за показниками клінічних проявів інфекції та динаміки зміни маси тіла. Використовували субстанцію AgNP із вихідною концентрацією 8,0 мг/мл за металом. Для введення необхідної дози срібла вихідну субстанцію розводили водою для ін'єкцій. Дослідження проводили з використанням самців щурів лінії Wistar вагою 200±20 г у кількості 21 шт. Тварин розподіляли на 7 груп по 3 тварини у кожній групі таким чином: Група № 1: контрольні умовно-здорові інтактні тварини. Група № 2: контрольні умовно-здорові тварини, яким внутрішньовенно вводили 0,5 мл фізіологічного розчину (контроль на стрес-фактор) 1 раз на добу протягом 5 діб. Група № 3: тварини з неліченою генералізованою інфекцією. Група № 4: тварини з генералізованою інфекцією, яким внутрішньовенно вводили субстанцію AgNP у дозі 2 мг/кг. Група № 5: тварини з генералізованою інфекцією, яким внутрішньовенно вводили субстанцію AgNP у дозі 4 мг/кг. Група № 6: тварини з генералізованою інфекцією, яким внутрішньовенно вводили субстанцію AgNP у дозі 8 мг/кг. Група № 7: тварини з генералізованою інфекцією, яким внутрішньовенно вводили препарат порівняння (Цефтріаксон) у дозі 58,8 мг/кг. Моделювання генералізованої інфекції проводили шляхом внутрішньовенного введення у латеральну хвостову вену щурів груп №№ 3-7 0,5 мл суміші суспензій добових культур трьох мікроорганізмів: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus та Streptococcus zooepidemicus 8 у співвідношенні 1:1:1 (2,0×10 КУО кожного мікроорганізму в 1 мл суспензії). Концентрації мікроорганізмів у суспензії визначали за стандартом МакФарланда. Експериментальне лікування шляхом внутрішньовенного введення у латеральну хвостову вену субстанції AgNP та препарату порівняння (цефтріаксон) починали через 24 години після зараження та проводили протягом наступних 5 діб, виконуючи такі ін'єкції 1 раз на добу. Субстанцію наночастинок срібла вводили у дозах 2 мг/кг (група 4), 4 мг/кг (група 5) та 8 мг/кг (група 6), які становили відповідно 1/40, 1/20 та 1/10 значення показника LD 50 (80 мг/кг), встановленого для субстанції наночастинок срібла при токсикологічних дослідженнях. Антибіотик цефтріаксон, який використовували як препарат порівняння, є широко вживаним при лікуванні генералізованої інфекції та сепсису антибіотиком з групи цефалоспоринів III покоління із широким спектром протимікробної активності, включаючи бактерії Staphylococcus aureus, β-гемолітичні стрептококи з групи A, Pseudomonas spp. Цефтріаксон вводили у вигляді 2 UA 99784 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розчину в дозі 58,8 мг/кг, що становить терапевтичну дозу для щурів у перерахунку з терапевтичної дози для людини з використанням коефіцієнту видової чутливості. В перші 18 годин після інфікування та двічі кожного дня протягом експерименту (6 днів) проводили спостереження за клінічними проявами інфекції. Для спостереження динаміки зміни маси тіла тварин, їх зважували безпосередньо перед зараженням, на 3-ю і 5-у добу лікування та перед виведенням з експерименту. Спостереження за клінічними проявами інфекції: В перші години після інфікування у всіх тварин визначали пригнічення рухової активності, пілоерекцію та тремор, що свідчило про розвиток гарячки; тварини відмовлялись від їжі та води, спостерігалась гіпервентиляція. Після лікування в групах тварин, яким вводили субстанцію AgNP, відмічали поліпшення клінічних проявів, починаючи з 2-го дня лікування: зникла пілоерекція, відновилась рухова активність, з'явився апетит. У щурів, яким вводили цефтріаксон, не спостерігали ознак одужання. В останній день лікування стан цих тварин погіршився, вони практично не пересувались в клітці, скупчившись у куті, періодично відмічали тремор. У контрольних групах №№ 1, 2 відхилень у зовнішньому стані та поведінці тварин не було. Неліковані тварини групи № 3 на 2-у добу спостереження загинули. Результати спостережень за змінами маси тіла тварин наведено в таблиці 2. Наведені у таблиці 2 дані свідчать, що в групі інтактних тварин відмічалось статистично достовірне (Р=0,05) збільшення ваги протягом періоду експерименту. На 6-й день приріст ваги в цій групі становив 7 % від початкового значення. В групі тварин, яким вводився фізіологічний розчин, маса тіла не зазнала суттєвих змін. В дослідних групах тварин, яким вводили субстанцію AgNP, відзначали дозозалежні закономірності у змінах динаміки приросту маси тіла. Так, в групі щурів, яким вводили наночастинки срібла у найменшій дозі (група № 4), не спостерігалось значимих змін ваги протягом усього періоду досліджень. У групі № 5 спостерігали зменшення маси тіла (Р=0,10) на 10,4 %, порівняно із вихідними даними цього показника. Зниження маси тіла тварин протягом дослідження (Р=0,05) спостерігали і в групі № 6, де в останній день експерименту відмічали зменшення середньої ваги на 10,13 % від початкового показника. Водночас, в групі № 7, в якій дослідним тваринам вводили широковживаний у медичній практиці антибіотик цефтріаксон, спостерігали найбільш виражене достовірне зниження маси тіла тварин протягом усього періоду спостережень. Так, середня вага тварин у групі була меншою за вихідні дані на 10,25 % на 3-ю добу лікування і на 10,72 % в останній день експерименту (6-та доба). Таким чином, застосування нової субстанції AgNP забезпечило поліпшення клінічних проявів інфекції та не призвело до суттєвого зниження показників маси тіла тварин, в той час як цефтріаксон виявився менш ефективним. Приклад 3. Ефективність застосування субстанції AgNP при лікуванні генералізованої інфекції дослідних тварин порівняно із терапевтичною ефективністю цефтріаксону досліджували за зміною низки маркерних гематологічних показників: кількість лейкоцитів, еритроцитів, тромбоцитів, гемоглобін, гематокрит та відсоткове співвідношення лімфоцитів, моноцитів, нейтрофілів, еозинофілів та базофілів у лейкоцитарній формулі. У тварин всіх груп відбирали кров у контейнери з консервантом (ЕДТА) для подальших досліджень. Відбір крові здійснювали шляхом декапітації під хлороформним наркозом. Проводили статистичну обробку даних (MS Office Excel 2007), дисперсії двох вибірок порівнювали за допомогою тесту Фішера та в залежності від значення критерію Фішера застосовували простий або модифікований тест Стьюдента. Результати гематологічних досліджень відображені в таблиці 3. Аналіз даних таблиці 3: Показано, що внутрішньовенне введення субстанції AgNP у дозах 2,0 та 8,0 мг/кг на фоні генералізованої інфекції не спричинило пригнічення діяльності кровотворної системи тварин, про що свідчить несуттєве збільшення кількості еритроцитів і гемоглобіну та відсутність суттєвих відмінностей у показниках гематокриту, порівняно із відповідними показниками крові тварин контрольних груп №№ 1, 2. Не спостерігалось також зміни тромбоцитарних показників крові тварин дослідних груп №№ 4-6. Оскільки септичні ураження часто супроводжуються анемією, руйнуванням еритроцитів, виходом вільного гемоглобіну у плазму крові та підвищенням кількості тромбоцитів в крові, наведені вище дані свідчать про наявність позитивного терапевтичного ефекту від застосування для лікування субстанції AgNP. 3 UA 99784 U 5 10 15 Дуже важливим свідченням наявності лікувального ефекту є поліпшення лейкоцитарних показників у тварин всіх груп, яким вводили субстанцію AgNP: зниження загальної кількості 3 3 лейкоцитів до рівня 3,8×10 -4,8×10 кл/мкл та зменшення відсоткового вмісту моноцитів до рівня цього показника у тварин контрольних груп №№ 1,2. Такі дані підтверджують позитивну динаміку одужання, оскільки відомо, що септичні ускладнення після хірургічних втручань навпаки супроводжуються лейкоцитозом та моноцитозом. Таким чином, застосування нового протимікробного засобу в умовах генералізованої інфекції не тільки не призвело до пригнічення кровотворної системи дослідних тварин, але і дозволило покращити клінічні прояви інфекції та досягти ознак одужання. Водночас при лікуванні цефтріаксоном виявлено достовірне (Р=0,05) суттєве збільшення кількості тромбоцитів, порівняно з показниками контрольних груп тварин №№ 1, 2, та відхилення у лейкоцитарних показниках крові тварин групи № 7: лейкоцитоз нейтрофілія, моноцитоз. Все це, разом з погіршенням клінічних проявів інфекції, свідчить про те, що в умовах застосованої модельної генералізованої інфекції цей антибіотик виявився неефективним. Таблиця 1 Тест-штами Klebsiella ozaenae 4348 Citobacter frendii 4369 Escherichia coli 4358 Enterobacter aerogenes 2476 Proteus mirabilis 4363 Pseudomonas aeruginosa 283 Staphylococcus aureus 43 12 Діаметр зон затримки росту клінічних Засівна доза ізолятів мікроорганізмів, мм тестового штаму 10 мкг 20 мкг 3 КУО/см наночастинок наночастинок срібла у краплі срібла у краплі 5 10 12 15 7 10 12 15 5 10 10 15 7 10 11 14 5 10 10 15 7 10 11 14 5 10 10 12 7 10 10(вт) 13 5 10 13 17 7 10 13 171 5 10 14 16 7 10 12 20 5 10 10 13 7 10 10 13 Примітка: "вт" - наявність вторинного росту в зоні стерильності через 15 діб. Таблиця 2 № групи тварин №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 Маса тіла тварин, г Вихідні дані 3 доба 204,5±0,32* 217,0±0,78 207,5±0,19 213,0±0,58 216,5±4,85 Тварини загинули 231,0±3,16 230,67±2,28 221,0±9,29 208,67±8,19 227,67±3,01 220,0±4,78 211,33±0,32 189,67±4,00 5 доба 214,0±1,16 210,5±5,24 229,67±1,27 204,0±6,59 215,0±4,85 195,33±6,31 Примітка: М±m середнє значення ± довірчий інтервал (Р=0,05) 4 6 доба 208,0±0,19 207,5±2,33 225,0±1,92 198,0±4,94 204,0±4,31 188,67±8,27 UA 99784 U Таблиця 3 Гематологічні показники Лейкоцити. 3 10 /мкл Лімфоцити. % Моноцити, % Нейтрофіли, % Еозинофіли, % Базофіли, % Еритроцити, 6 10 /мкл Гемоглобін, г/дЛ Гематокрит, % Тромбоцити, % Групи тварин №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 10,03=0,56 11,43±0,77 7,03±0,39 5,53±0,65 4,50±0,32 5,55±0,10 15,90±2,63 73,90±0,93 3,87±0,28 16,00±0,95 0,97±0,24 5,27±0,27 68,87±2,13 3,30±0,12 16,30±0,92 2,87±0,74 6,67±0,46 56,57±1,64 6,35±0,02 24,85±1,57 1,97±0,32 9,93±0,37 61,57±1,36 4,15±0,29 15,75±0,87 9,07±1,97 6,13±0,43 7,61±0,21 8,08±0,21 7,91±0,08 8,98±0,19 8,42±0,29 8,99±0,14 7,70±0,30 55,70+1,84 3,80±0,62 29,57±0,5 1,83±0,35 6,60±0,35 52,47±3,99 4,80±0,12 23,95±1,03 0,30±0,12 12,70±0,23 72,99±4,34 8,70±1,12 34,20±3,80 0,70±0,00 5,50±1,07 13,37±0,33 13,70±0,32 13,57±0,09 15,20±0,17 14,43±0,41 15,37±0,32 13,50±0,49 38,43±0,73 39,87±0,87 40,30±0,45 44,73±1,14 40,47±1,11 42,73±0,60 38,60±1,41 589±27 584±28 738±35 516±52 601±59 695±7 821±24 Примітка: М=m – середнє значення ± довірчий інтервал (Р=0,05) ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Застосування субстанції наночастинок срібла як протимікробного засобу внутрішньовенного введення в умовах генералізованої інфекції. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5