Послідовність днк, що кодує rip-асоційований білок (rap-2), компетентний до реплікації експресуючий вектор, трансформована клітина-хазяїн, білок rap-2, спосіб його отримання, антитіло, фармацевтична композиція

Номер патенту: 76081

Опубліковано: 17.07.2006

Автори: Уоллах Девід, Лі Йонган, Хорвіц Маршалл С., Ковалєнко Андрєй

Є ще 26 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Послідовність ДНК, що кодує RIP-асоційований білок (RAP-2), його ізоформи, фрагменти або аналоги, яка включає послідовність, що показана на фіг. 1, причому згадані білок RAP-2, його ізоформи, фрагменти або аналоги здатні зв'язуватися з білком RIP або здатні модулювати або опосередковувати внутрішньоклітинну активність RIP.

2. Послідовність ДНК за п. 1, що включає послідовність, показану на фіг. 2.

3. Послідовність ДНК за п. 2, що кодує RAP-2, його ізоформи, фрагменти або аналоги, що містять принаймні частину послідовності, показаної на фіг. 3.

4. Компетентний по реплікації експресуючий вектор, що включає послідовність ДНК, охарактеризовану у будь-якому з пп. 1-3, необов'язково функціонально сполучений з регуляторними послідовностями, промоторами або іншими послідовностями ДНК, що забезпечують експресію, в правильній орієнтації.

5. Компетентний по реплікації експресуючий вектор за п. 4, здатний експресуватися в еукаріотичній клітині-хазяїні.

6. Компетентний по реплікації експресуючий вектор за п. 4, здатний експресуватися у прокаріотичній клітині-хазяїні.

7. Трансформована еукаріотична або прокаріотична клітина-хазяїн, що містить реплікований експресуючий вектор, охарактеризований у будь-якому з пп. 4-6.

8. Білок RAP-2, його ізоформа, фрагмент, функціональні аналоги або похідні, що кодуються послідовністю ДНК, охарактеризованою у будь-якому з пп. 1-3, причому згадані білок, його ізоформа, фрагмент, аналоги і похідні здатні зв'язуватися з RIP.

9. Білок RAP-2 за п. 8, здатний модулювати або опосередковувати внутрішньоклітинну активність RIP в механізмах запалення, виживання клітин або загибелі клітин, в яких RIP бере участь напряму або опосередковано через зв'язування з іншими внутрішньоклітинними модуляторами або медіаторами цих механізмів.

10. Білок RAP-2, його ізоформа, фрагмент, аналоги і похідні за п. 8, причому згадані білок, ізоформа, аналоги, фрагменти і похідні містять, принаймні частину амінокислотної послідовності, показаної на фіг. 3.

11. Спосіб отримання білка RAP-2, його ізоформи, фрагмента, аналогів або похідних, охарактеризованих у будь-якому з пп. 8-10, що включають культивування трансформованих клітин-хазяїв, охарактеризованих у п. 7 в умовах, сприятливих для експресії згаданих білка, ізоформи, аналога, фрагмента або похідного, здійснення необхідних, посттрансляційних модифікацій з метою отримання згаданих білка, фрагментів, аналогів або похідних і виділення згаданих експресованих білка, фрагментів, аналогів або похідних.

12. Антитіло або його активні фрагменти або похідні, специфічні відносно білка RAP-2, його ізоформи, фрагмента, аналога або похідного, охарактеризованих у будь-якому з пп. 8-10.

13. Спосіб модулювання або опосередковування модульованих або опосередкованих білком RIP внутрішньоклітинних ефектів на механізми запалення, загибелі клітин або виживання клітин, в яких RIP бере участь напряму або опосередковано через інші модулятори/медіатори цих механізмів, що включає обробку згаданих клітин одним або декількома білками RAP-2, його ізоформами, аналогами, фрагментами або похідними відповідно до будь-якого з пп. 8-10, здатними зв'язуватися з RIP і модулювати або опосередковувати згадану внутрішньоклітинну активність RIP, причому згадана обробка згаданих клітин включає внесення в згадані клітини одного або більшого числа згаданих білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних у формі, придатній для їх проникнення всередину клітин, або внесення в згадані клітини послідовності ДНК, що кодує згадані один або декілька білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних, у формі відповідного вектора, що включає згадану послідовність, причому вказаний вектор здатний ефективно вносити згадану послідовність в згадані клітини таким чином, щоб згадана послідовність експресувалась у згаданих клітинах.

14. Спосіб модулювання модульованого/опосередкованого білком RIP впливу на клітини за п. 13, причому згадана обробка клітин включає внесення в згадані клітини послідовності ДНК, що кодує згадані білок RAP-2, його ізоформи, аналоги, фрагменти або похідні, у формі відповідного вектора, що включає згадану послідовність, причому вказаний вектор здатний забезпечувати ефективне внесення згаданої послідовності у згадані клітини таким чином, щоб згадана послідовність експресувалась у згаданих клітинах.

15. Спосіб за пп. 13 або 14, де згадана обробка згаданих клітин здійснюється шляхом трансфекції згаданих клітин рекомбінантним вектором на основі вірусу тварини, що включає наступні етапи:

(а) конструювання рекомбінантного вектора на основі вірусу тварини, що включає послідовність, яка кодує поверхневий вірусний білок (ліганд), який здатний зв'язуватися зі специфічним поверхнево-клітинним рецептором на поверхні згаданих клітин, обробка яких проводиться, і другу послідовність, що кодує білок, вибраний з білка RAP-2, його ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних, охарактеризованих у будь-якому з пп. 8-10, так, щоб у разі експресії у згаданих клітинах, він був здатний модулювати/опосередковувати активність RIP; і

(б) інфікування згаданих клітин згаданим вектором за (а).

16. Спосіб модулювання модульованого/опосередкованого білком RIP впливу на клітини, що включає обробку згаданих клітин антитілами або їх активними фрагментами або похідними, охарактеризованими у п. 12, причому згадана обробка здійснюється шляхом застосування відповідної композиції, що містить згадані антитіла, їх активні фрагменти або похідні, відносно згаданих клітин, причому, коли білок RAP-2 або його ділянки попадає на зовнішню поверхню згаданих клітин, то згадану композицію готують для позаклітинного застосування, а, коли згадані білки RAP-2 є внутрішньоклітинними, то згадану композицію готують для внутрішньоклітинного застосування.

17. Спосіб модулювання модульованого/опосередкованого білком RIP впливу на клітини, що включає обробку згаданих клітин олігонуклеотидною послідовністю, що кодує антисмислову послідовність по відношенню принаймні до частини послідовності ДНК, що кодує білок RAP-2, охарактеризованої у будь-якому з пп. 1-3, причому згадана олігонуклеотидна послідовність здатна блокувати експресію білка RAP-2.

18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що згадана олігонуклеотидна послідовність вводиться у клітини за допомогою вірусу, отриманого способом за п. 15.

19. Спосіб обробки пухлинних клітин або ВІЛ-інфікованих клітин, або інших хворих клітин, що включає:

(а) конструювання рекомбінантного вектора на основі вірусу тварини, що включає послідовність, яка кодує поверхневий вірусний білок, здатний зв'язуватися зі специфічним рецептором на поверхні пухлинних клітин або рецептором на поверхні ВІЛ-інфікованих клітин, або рецептором інших хворих клітин, і послідовність, що кодує білок, вибраний з білка RAP-2, його ізоформи, аналогів, фрагментів і похідних, охарактеризованих у будь-якому з пп. 8-10, так, щоб у разі експресії в згаданих пухлинних, ВІЛ-інфікованих або іншого типу хворих клітинах, він був здатний модулювати/опосередковувати активність RIP по прямому або опосередкованому знищенню згаданої клітини; і

(б) інфікування згаданих пухлинних або ВІЛ-інфікованих клітин, або інших хворих клітин згаданим вектором по (а).

20. Спосіб модулювання впливу RIP на клітини, що включає застосування рибозимної процедури, в якій вектор, що кодує рибозимну послідовність, здатну взаємодіяти з клітинною послідовністю мРНК, що кодує білок RAP-2, охарактеризований у будь-якому з пп. 8-10, вносять в згадані клітини у формі, яка забезпечує експресію згаданої рибозимної послідовності у згаданих клітинах, причому, коли згадана рибозимна послідовність експресується у згаданих клітинах, то вона взаємодіє із згаданою клітинною послідовністю мРНК і розщеплює згадану послідовність мРНК, внаслідок чого відбувається пригнічення експресії згаданого білка RAP-2 у згаданих клітинах.

21. Спосіб за будь-яким з пп. 13-20, де вказаний білок є принаймні однією з ізоформ RAP-2, її аналогом, фрагментом або похідним.

22. Фармацевтична композиція, призначена для модулювання впливу RIP на клітини, що містить як компонент принаймні один білок RAP-2, охарактеризований у будь-якому з пп. 8-10, його біологічно активні фрагменти, аналоги, похідні або їх суміші.

23. Фармацевтична композиція, призначена для модулювання впливу RIP на клітини, що містить як компонент рекомбінантний вектор на основі вірусу тварини, що кодує білок, здатний до зв'язування поверхнево-клітинного рецептора і кодування принаймні одного білка RAP-2, його ізоформи, активного фрагмента або аналога, охарактеризованих у будь-якому з пп. 8-10.

24. Фармацевтична композиція, призначена для модулювання впливу RIP на клітини, що містить як компонент олігонуклеотидну послідовність, що кодує антисмислову послідовність по відношенню до послідовності ДНК білка RAP-2, охарактеризованої у будь-якому з пп. 1-3.

25. Спосіб модулювання процесів, прямо- або непрямомодульованих/опосередкованих білком RIP, що включають обробку клітин одним або декількома білками RAP-2, ізоформами, аналогами, фрагментами або похідними, охарактеризованими у будь-якому з пп. 8-10, здатними зв'язуватися з RIP, причому згадана обробка згаданих клітин включає внесення в згадані клітини одного або декількох згаданих білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних у формі, сприятливій для їх проникнення всередину клітин, або внесення у згадані клітини послідовності ДНК, що кодує згадані один або декілька білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних, у формі відповідного вектора, що включає згадану послідовність, причому вказаний вектор здатний забезпечувати ефективне внесення згаданої послідовності у згадані клітини таким чином, щоб згадана послідовність експресувалась у згаданих клітинах.

26. Спосіб модулювання процесів, прямо- або непрямомодульованих/опосередкованих білком RIP, таких як пригнічення NF-кВ і активація кіназ JNK і р38, що включає обробку клітин одним або декількома білками RAP-2, їх ізоформами, аналогами, фрагментами або похідними, охарактеризованими у будь-якому з пп. 8-10, причому згадана обробка клітин включає внесення у згадані клітини одного або декількох згаданих білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних у формі, сприятливій для їх попадання всередину клітин, або внесення в згадані клітини послідовності ДНК, що кодує згадані один або декілька білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних, у формі відповідного вектора, що включає згадану послідовність, причому вказаний вектор здатний забезпечувати ефективне внесення згаданої послідовності у згадані клітини таким чином, щоб згадана послідовність експресувалась у згаданих клітинах.

27. Фрагмент за будь-яким з пп. 8-10, який є пептидом.

Текст

1. Послідовність ДНК, що кодує RIPасоційований білок (RAP-2), його ізоформи, фрагменти або аналоги, яка включає послідовність, що показана на Фіг.1, причому згадані білок RAP-2, його ізоформи, фрагменти або аналоги здатні зв'язуватися з білком RIP або здатні модулювати або опосередковувати внутрішньоклітинну активність RIP. 2. Послідовність ДНК за п.1, що включає послідовність, показану на Фіг.2. 3. Послідовність ДНК за п.2, що кодує RAP-2, його ізоформи, фрагменти або аналоги, що містять принаймні частину послідовності, показаної на Фіг.3. 4. Компетентний по реплікації експресуючий вектор, що включає послідовність ДНК, охарактеризовану у будь-якому з пп.1-3, необов'язково функціонально сполучений з регуляторними послідовностями, промоторами або іншими послідовностями ДНК, що забезпечують експресію, в правильній орієнтації. 5. Компетентний по реплікації експресуючий вектор за п.4, здатний експресуватися в еукаріотичній клітині-хазяїні. 6. Компетентний по реплікації експресуючий вектор за п.4, здатний експресуватися у прокаріотичній клітині-хазяїні. 7. Трансформована еукаріотична або прокаріотична клітина-хазяїн, що містить реплікований екс UA (21) 2000105892 (22) 18.03.1999 (24) 17.07.2006 (86) PCT/IL99/00158, 18.03.1999 (31) 123758 (32) 19.03.1998 (33) IL (31) 126024 (32) 01.09.1998 (33) IL (46) 17.07.2006, Бюл. № 7, 2006 р. (72) Уоллах Девід , IL, Ковалєнко Андрєй , IL, Хорвіц Маршалл С., US, Лі Йонган , US (73) ЙЄДА РІСЕРЧ ЕНД ДІВЕЛОПМЕНТ КО. ЛТД., IL, АЛЬБЕРТ ЕЙНШТЕЙН КОЛЛЕДЖ ОФ МЕДСІН ОФ ЙЄШИВА ЮНІВЕРСІТІ, US (56) WO 9625941 A, 29.08.1996 WO 9636730 A, 21.11.1996 WO 9715586 A, 01.05.1997 WO 9745542 A, 04.12.1997 DATABASE DNA SEQUENCE DATABASE2 "Online! EMBL, Heidelberg, FRG, Accession No. AB020656, 9 February 1999 (1999-02-09), OHARA O. ET AL.: H. sapiens mRNA for KIAA049 protein" & NAGASE T. ET AL.: "Prediction of the coding sequences of unidentified human genes, XII. The complete sequence of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro". DNA RES., vol.5, 1998, pages 355-364 ROTHWARF D.M. ET AL."IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkB kinase complex". NATURE, vol.395, 17 September 1998 (1998-09-17), pages 297-300 YAMAOKA S. ET AL. " Complementation cloning of NEMO, a component of the IkB kinase complex 2 (19) 1 3 76081 4 пресуючий вектор, охарактеризований у будьне внесення згаданої послідовності у згадані кліякому з пп.4-6. тини таким чином, щоб згадана послідовність екс8. Білок RAP-2, його ізоформа, фрагмент, функціпресувалась у згаданих клітинах. ональні аналоги або похідні, що кодуються послі15. Спосіб за пп.13 або 14, де згадана обробка довністю ДНК, охарактеризованою у будь-якому з згаданих клітин здійснюється шляхом трансфекції пп.1-3, причому згадані білок, його ізоформа, фразгаданих клітин рекомбінантним вектором на осгмент, аналоги і похідні здатні зв'язуватися з RIP. нові вірусу тварини, що включає наступні етапи: 9. Білок RAP-2 за п.8, здатний модулювати або (а) конструювання рекомбінантного вектора на опосередковувати внутрішньоклітинну активність основі вірусу тварини, що включає послідовність, RIP в механізмах запалення, виживання клітин або яка кодує поверхневий вірусний білок (ліганд), загибелі клітин, в яких RIP бере участь напряму який здатний зв'язуватися зі специфічним поверхабо опосередковано через зв'язування з іншими нево-клітинним рецептором на поверхні згаданих внутрішньоклітинними модуляторами або медіаклітин, обробка яких проводиться, і другу послідоторами цих механізмів. вність, що кодує білок, вибраний з білка RAP-2, 10. Білок RAP-2, його ізоформа, фрагмент, аналойого ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних, ги і похідні за п.8, причому згадані білок, ізоформа, охарактеризованих у будь-якому з пп.8-10, так, аналоги, фрагменти і похідні містять, принаймні щоб у разі експресії у згаданих клітинах, він був частину амінокислотної послідовності, показаної здатний модулювати/опосередковувати активність на Фіг.3. RIP; і 11. Спосіб отримання білка RAP-2, його ізоформи, (б) інфікування згаданих клітин згаданим вектором фрагмента, аналогів або похідних, охарактеризоза (а). ваних у будь-якому з пп.8-10, що включають куль16. Спосіб модулювання модульованотивування трансформованих клітин-хазяїв, охараго/опосередкованого білком RIP впливу на клітини, ктеризованих у п.7 в умовах, сприятливих для що включає обробку згаданих клітин антитілами експресії згаданих білка, ізоформи, аналога, фраабо їх активними фрагментами або похідними, гмента або похідного, здійснення необхідних, посохарактеризованими у п.12, причому згадана обттрансляційних модифікацій з метою отримання робка здійснюється шляхом застосування відповізгаданих білка, фрагментів, аналогів або похідних і дної композиції, що містить згадані антитіла, їх виділення згаданих експресованих білка, фрагмеактивні фрагменти або похідні, відносно згаданих нтів, аналогів або похідних. клітин, причому, коли білок RAP-2 або його ділянки 12. Антитіло або його активні фрагменти або похіпопадає на зовнішню поверхню згаданих клітин, то дні, специфічні відносно білка RAP-2, його ізофорзгадану композицію готують для позаклітинного ми, фрагмента, аналога або похідного, охарактезастосування, а, коли згадані білки RAP-2 є внутризованих у будь-якому з пп.8-10. рішньоклітинними, то згадану композицію готують 13. Спосіб модулювання або опосередковування для внутрішньоклітинного застосування. модульованих або опосередкованих білком RIP 17. Спосіб модулювання модульовановнутрішньоклітинних ефектів на механізми запаго/опосередкованого білком RIP впливу на клітини, лення, загибелі клітин або виживання клітин, в що включає обробку згаданих клітин олігонуклеояких RIP бере участь напряму або опосередковано тидною послідовністю, що кодує антисмислову через інші модулятори/медіатори цих механізмів, послідовність по відношенню принаймні до частищо включає обробку згаданих клітин одним або ни послідовності ДНК, що кодує білок RAP-2, охадекількома білками RAP-2, його ізоформами, анарактеризованої у будь-якому з пп.1-3, причому логами, фрагментами або похідними відповідно до згадана олігонуклеотидна послідовність здатна будь-якого з пп.8-10, здатними зв'язуватися з RIP і блокувати експресію білка RAP-2. 18. Спосіб за п.17, який відрізняється тим, що модулювати або опосередковувати згадану внутрішньоклітинну активність RIP, причому згадана згадана олігонуклеотидна послідовність вводиться обробка згаданих клітин включає внесення в згау клітини за допомогою вірусу, отриманого спосодані клітини одного або більшого числа згаданих бом за п.15. білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних 19. Спосіб обробки пухлинних клітин або ВІЛу формі, придатній для їх проникнення всередину інфікованих клітин, або інших хворих клітин, що клітин, або внесення в згадані клітини послідовновключає: сті ДНК, що кодує згадані один або декілька білків, (а) конструювання рекомбінантного вектора на ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних, у фооснові вірусу тварини, що включає послідовність, рмі відповідного вектора, що включає згадану посяка кодує поверхневий вірусний білок, здатний лідовність, причому вказаний вектор здатний ефезв'язуватися зі специфічним рецептором на повективно вносити згадану послідовність в згадані рхні пухлинних клітин або рецептором на поверхні клітини таким чином, щоб згадана послідовність ВІЛ-інфікованих клітин, або рецептором інших експресувалась у згаданих клітинах. хворих клітин, і послідовність, що кодує білок, виб14. Спосіб модулювання модульованораний з білка RAP-2, його ізоформи, аналогів, го/опосередкованого білком RIP впливу на клітини фрагментів і похідних, охарактеризованих у будьза п.13, причому згадана обробка клітин включає якому з пп.8-10, так, щоб у разі експресії в згадавнесення в згадані клітини послідовності ДНК, що них пухлинних, ВІЛ-інфікованих або іншого типу кодує згадані білок RAP-2, його ізоформи, аналоги, хворих клітинах, він був здатний модулювафрагменти або похідні, у формі відповідного векти/опосередковувати активність RIP по прямому тора, що включає згадану послідовність, причому або опосередкованому знищенню згаданої клітивказаний вектор здатний забезпечувати ефективни; і 5 76081 6 (б) інфікування згаданих пухлинних або ВІЛпрямомодульованих/опосередкованих білком RIP, інфікованих клітин, або інших хворих клітин згадащо включають обробку клітин одним або декільконим вектором по (а). ма білками RAP-2, ізоформами, аналогами, фраг20. Спосіб модулювання впливу RIP на клітини, що ментами або похідними, охарактеризованими у включає застосування рибозимної процедури, в будь-якому з пп.8-10, здатними зв'язуватися з RIP, якій вектор, що кодує рибозимну послідовність, причому згадана обробка згаданих клітин включає здатну взаємодіяти з клітинною послідовністю внесення в згадані клітини одного або декількох мРНК, що кодує білок RAP-2, охарактеризований у згаданих білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або будь-якому з пп.8-10, вносять в згадані клітини у похідних у формі, сприятливій для їх проникнення формі, яка забезпечує експресію згаданої рибозивсередину клітин, або внесення у згадані клітини мної послідовності у згаданих клітинах, причому, послідовності ДНК, що кодує згадані один або деколи згадана рибозимна послідовність експресукілька білків, ізоформ, аналогів, фрагментів або ється у згаданих клітинах, то вона взаємодіє із похідних, у формі відповідного вектора, що вклюзгаданою клітинною послідовністю мРНК і розщечає згадану послідовність, причому вказаний векплює згадану послідовність мРНК, внаслідок чого тор здатний забезпечувати ефективне внесення відбувається пригнічення експресії згаданого білка згаданої послідовності у згадані клітини таким чиRAP-2 у згаданих клітинах. ном, щоб згадана послідовність експресувалась у 21. Спосіб за будь-яким з пп.13-20, де вказаний згаданих клітинах. білок є принаймні однією з ізоформ RAP-2, її ана26. Спосіб модулювання процесів, прямо- або нелогом, фрагментом або похідним. прямомодульованих/опосередкованих білком RIP, 22. Фармацевтична композиція, призначена для таких як пригнічення NF-кВ і активація кіназ JNK і модулювання впливу RIP на клітини, що містить як р38, що включає обробку клітин одним або декількомпонент принаймні один білок RAP-2, охарактекома білками RAP-2, їх ізоформами, аналогами, ризований у будь-якому з пп.8-10, його біологічно фрагментами або похідними, охарактеризованими активні фрагменти, аналоги, похідні або їх суміші. у будь-якому з пп.8-10, причому згадана обробка 23. Фармацевтична композиція, призначена для клітин включає внесення у згадані клітини одного модулювання впливу RIP на клітини, що містить як або декількох згаданих білків, ізоформ, аналогів, компонент рекомбінантний вектор на основі вірусу фрагментів або похідних у формі, сприятливій для тварини, що кодує білок, здатний до зв'язування їх попадання всередину клітин, або внесення в поверхнево-клітинного рецептора і кодування призгадані клітини послідовності ДНК, що кодує зганаймні одного білка RAP-2, його ізоформи, активдані один або декілька білків, ізоформ, аналогів, ного фрагмента або аналога, охарактеризованих у фрагментів або похідних, у формі відповідного будь-якому з пп.8-10. вектора, що включає згадану послідовність, при24. Фармацевтична композиція, призначена для чому вказаний вектор здатний забезпечувати ефемодулювання впливу RIP на клітини, що містить як ктивне внесення згаданої послідовності у згадані компонент олігонуклеотидну послідовність, що клітини таким чином, щоб згадана послідовність кодує антисмислову послідовність по відношенню експресувалась у згаданих клітинах. до послідовності ДНК білка RAP-2, охарактеризо27. Фрагмент за будь-яким з пп.8-10, який є пептиваної у будь-якому з пп.1-3. дом. 25. Спосіб модулювання процесів, прямо- або не Даний винахід загалом стосується рецепторів, що відносяться до суперродини рецепторів TNF/NGF, і контролю їх біологічних функцій. Надродина рецепторів TNF/NGF включає рецептори, такі як рецептори р55 і р75 чинників некрозу пухлин (TNF-R: тут і далі вони позначаються як p55-R і p75-R) і рецептори FAS-лігандів (також що позначаються як FAS/APO1 або FAS-R: тут і далі буде позначатися як FAS-R) і інші. Конкретно даний винахід стосується нових білків, які зв'язуються з іншими білками, які самі по собі зв'язуються напряму або опосередковано з членами рецепторної родини TNF/NGF і іншими внутрішньоклітинними білками-модуляторами. Більш конкретно, винахід стосується одного такого білка, що позначається тут і далі як RAP-2 (що відповідає RIP-асоційованому білка-2), і його ізоформ, фрагментів, похідних, рівно як і білків, що зв'язуються з білком RAP-2. Білок RAP-2 зв'язується з білком RIP («взаємодіючий з рецепторами білок») і має здатність модулювати або опосередковувати функції RIP, таким чином будучи здатним модулювати або опосередковувати, як напряму, так і не прямо, функції інших білків, які зв'язуються з RIP прямо або опосередковано. Білки, що зв'язуються з RAP-2 є модуляторами/медіаторами функцій RAP-2. Чинник некрозу пухлин (TNF-α.) і лімфотоксин (TNF-β) (тут і далі абревіатура TNF відноситься і до TNF-α до TNF-β) є багатофункціональними протизапальними цитокінами, в основному мононуклеарними фагоцитами, що виробляються, які характеризуються багатостороннім впливом на клітини [D.Wallach, 1986, In «Interferon 7», ed. I. Gresser, Acad. Press, London, pp.83-122; Beutler & Cerami, 1987]. I TNF-α, і TNF-β виявляють свою активність шляхом зв'язування на специфічних поверхово-клітинних рецепторах. Деякі з їх ефектів, мабуть, є цінними для організму: наприклад, вони можуть руйнувати пухлинні клітини або інфіковані вірусом клітини і сприяти протибактеріальній активності гранулоцитів. У цьому значенні TNF 7 76081 8 бере участь в захисті організму проти пухлин і інстрічається у вигляді гомотримеру, а раз так, то фекційних агентів, а також грає роль у відновленні було підтверджено, що він індукує внутрішньокліпісля пошкоджень. Отже, TNF може бути використинні сигнали через TNF-R р55 за рахунок його таний як протипухлинний агент, при застосуванні здатності зв'язуватися молекулами рецепторів і якого він зв'язується зі своїми рецепторами на утворювати з ними перехресну зшивки, тобто приповерхні пухлинних клітин, таким чином ініціюючи зводити до агрегації цих рецепторів. процеси, що призводять до загибелі цих пухлинІншим представником надродини рецепторів них клітин. Також TNF може бути використаний як TNF/NGF є FAS-рецептор (FAS-R), який також напроти інфекційний агент. зивають FAS-антигеном, що є поверховоОднак, крім того і TNF-α, і TNF-β виявляють і клітинним білком, експресованим в різних тканинегативні ефекти. Є підтвердження того, що наднах і що характеризується гомологією, з рядом мірне вироблення TNF-a може грати істотну патоповерхово-клітинних рецепторів, включаючи TNFгенну роль в патогенезі деяких захворювань. НаR і NGF-R. Рецептор FAS-R опосередковує загиприклад, відомо, що вплив TNF-α, насамперед, на бель клітин в процесі апоптозу (Itoh et al., 1991) і, судинну систему організму є основною причиною мабуть, є негативним селективним чинником аутосимптомів септичного шоку (Тгасеу et аl, 1986). реактивних Т-лімфоцитів: тобто в процесі дозріПри деяких захворюваннях TNF може зумовлювавання Т-лімфоцитів FAS-R опосередковує апоптоти надмірне зниження маси тіла (кахексію) внаслітичну загибель Т-клітин, що розпізнають власні док придушення активності адипоцитів і внаслідок антигени. Також було встановлено, що мутації в зумовлення анорексії, через що TNF-α також назигені FAS-R (мутації Ірг) зумовлюють лімфопролівають кахектином. Також він був описаний як меферативні синдроми у мишей, які схожі із системдіатор пошкодження тканин при ревматоїдних заною червоною лихоманкою, що є аутоімунним захворюваннях (Beutler & Сегаті, 1987) і як основний хворюванням людини (Watanabe-Fukunaga et al., медіатор пошкоджень, що виявляються при реакції 1992). Лігандом рецептору FAS-R, мабуть, є моле«трансплантат проти господаря» (Piquet et аl., кула, що асоціюється з клітинними поверхнями, 1987). Крім того, TNF відомий як учасник запальщо знаходиться, крім інших клітин, на Т-кілерах них процесів і багатьох інших захворювань. (або цитотоксичних Т-лімфоцитах - CTL): отже, Два диференційованих і незалежно один від коли такі клітини CTL контактують з клітинами, одного експресованих рецептори - р55 і р75 TNFнесучими FAS-R, вони виявляються здатними інR, причому обидва зв'язуються з TNF-α і TNF-β, дукувати апоптотичну загибель клітин, несучих ініціюють і (або) опосередковують згадувану вище рецептор FAS-R. Крім того, були сформовані мобіологічну активність TNF. Ці два рецептори хараноклональні антитіла, які специфічні по відношенктеризуються наявністю структурно різних внутріню до FAS-R, при тому, що такі моноклональні шньоклітинних доменів, що підтверджує диференантитіла здатні індукувати загибель клітин, несуціювання обслуговуючих їх сигнальних систем чих FAS-R, за механізмом апоптозу, включаючи [див. Hohmann et al., 1989, Engelmann et al., 1990; мишачі клітини, трансформовані кДНК, що вклюBrockhaus et al., 1990; Leotscher et al., 1990; Schall чає ген FAS-R людини (Itohetal, 1991). et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; Заявниками було зроблено ряд спроб [див., Heller et al., 1990]. Однак, клітинні механізми, нанаприклад, європейські патентні заявки приклад, різні білки і можливі інші чинники, які за№№186833, 308378, 398327 і 412486] проконтролучені у внутрішньоклітинну передачу сигналів лювати небажані ефекти TNF за рахунок придуTNF-рецепторам р55 і р75, доки не встановлені. шення зв'язування TNF з їх рецепторами, викорисЦе той внутрішньоклітинний сигнальний механізм, товуючи для цієї мети антитіла до TNF або який має місце звичайно після зв'язування ліганду, цитоплазматичні рецептори TNF з метою забезпетобто TNF (α і β), на його рецепторі, який відповічення конкуренції по скріпленню TNF з поверхнедає за включення каскаду реакцій, що неминуче во-клітинними рецепторами TNF-R. Крім того, з призводить до реакції, що виявляється, клітини на урахуванням того, що зв'язування TNF з їх рецепданий TNF. торами є необхідним для вияву TNF-індукованих Що стосується згадуваної вище цитоцидної дії клітинних ефектів, заявники намагалися [див., наTNF, то в більшості досліджених до теперішнього приклад, європейську патентну заявку 568925] часу клітин такий ефект в основному опосередкозабезпечити модуляцію впливу TNF шляхом зміни вується рецептором TNF-R р55. Антитіла, специактивності рецепторів TNF-R. фічні відносно позаклітинного домену (тобто ліКоротко, [заявка ЕР 568925] стосується спосоганд-зв'язуючого домену) рецептора TNF-R р55, бу модулювання передачі сигналу і (або) відщепсамі можуть опосередковувати цитоцидний ефект лення від TNF-R таким чином, щоб пептиди або [див. європейську патентну заявку 412486], що інші молекули могли взаємодіяти з рецептором корегує з ефективністю перехресного зшиття цих або самі, або опосередковано через ефекторні рецепторів антитілами, що, як вважається, є перпептиди, взаємодіючі з цим рецептором, що таким шим етапом в формуванні внутрішньоклітинного чином повинно модулювати нормальні функції сигнального каскаду. Далі, мутаційний аналіз TNF-R. У [заявці ЕР 568925] описується конструк(Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) покація і дана характеристика різних мутантних рецепзав, що біологічні функції TNF-R p55 залежать від торів TNF-R р55, несучих мутації у позаклітинних, цілісності його внутрішньоклітинного домену. Відтрансмембранних і внутрішньоклітинних доменах повідно, було підтверджено, що ініціація внутрішTNF-R р55. У цьому випадку в згаданих вище доньоклітинного сигналу веде до цитоцидного вияву менах були ідентифіковані сегменти, які є ключорецептора TNF-R р55. Більш того TNF (α і β) зувими в забезпеченні функцій рецептору TNF-R 9 76081 10 р55, тобто функцій зв'язування з лігандом і подаватися один з одним) з внутрішньоклітинними дольшої передачі сигналу і включення внутрішньокменами цих рецепторів - білка MORT-1 (або FADD) літинного сигнального шляху, що забезпечує зрез FAS-R (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., штою ефекти дії TNF на дані клітини, що 1995; Kischkel et al., 1995) і білка TRADD з p55-R спостерігаються. Крім того, також описується ряд (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Три білки, які підходів до виділення і ідентифікації білків, пептизв'язуються з внутрішньоклітинним доменом FASдів або інших чинників, які здатні зв'язуватися з R і p55-R по їх дільниці «згубного домену», залурізними дільницями згаданих вище доменів TNF-R, ченій в індукцію загибелі клітин під впливом цих при тому, що ці білки, пептиди і інші чинники морецепторів внаслідок гетерологічної асоціації гожуть брати участь в регуляції або модулюванні мологічних дільниць, і які також здатні опосередактивності TNF-R. Також [в заявку ЕР 568925] ковувати клітинну загибель, були ідентифіковані в включений ряд підходів до виділення і клонуванню процедурі скрінінгу, званій «подвійною гібридизапослідовностей ДНК, що кодують такі білки і пепцією дріжджів». Один з цих білків - MORT-1 (Boldin тиди; до конструювання експресуючих векторів, et al., 1995b) - також відомий як білок FADD необхідних для вироблення даних білків і пептидів; (Chinnaiyan et al., 1005), який специфічно зв'язуі до формування антитіл або їх фрагментів, які б ється з рецептором FAS-R. Інший білок - TRADD взаємодіяли з TNF-R або із згаданими вище біл(див. також Hsu et al., 1995, 1996) - зв'язується з ками і пептидами, які зв'язуються з різними дільрецептором p55-R, третій білок - RIP (див. також ницями TNF-R. Однак, [в заявці ЕР 568925] не конStanger et al., 1995) - зв'язується і з FAS-R, і з p55кретизуються реальні білки і пептиди, які б R. Крім зв'язування з FAS-R і p55-R, ці білки також зв'язувалися з внутрішньоклітинними доменами здатні зв'язуватися один з одним, що забезпечує рецептору TNF-R (наприклад TNF-R р55), а також функціональний «обмін» між FAS-R і p55-R. Таке не описаний «двохгібридний підхід» до виділення і зв'язування відбувається за консервативною дільідентифікації таких білків або пептидів, які зв'язуницею послідовності - «модулю домену загибелі», ються з внутрішньоклітинними доменами TNF-R. - що є загальним для цих рецепторів і білків, що Також [в заявці ЕР 56892] не представлені білки зв'язуються з ними. Більш того хоч в двохгібридабо пептиди, здатні зв'язуватися з внутрішньокліному дріжджовому тесті було показано, що білок тинним доменом FAS-R. MORT-1 зв'язується з FAS-R спонтанно, в клітинах Хоч і відомо, що рецептори чинника некрозу ссавців таке зв'язування має місце тільки після пухлин (TNF) і структурно родинний ним рецептор стимуляції даного рецептору: це підтверджує, що FAS-R зумовлюють в клітинах шляхом стимуляції MORT-1 бере участь в початковій події сигнальнолігандів, виробляються лейкоцитами, деструктивго шляху FAS-R. Білок MORT-1 не включає будьну активність, що призводить до їх власної загибеяких мотивів, характерних для вияву каталітичної лі, проте механізми такого опосередковування активності: отже, його здатність опосередковувати доки зрозумілі не до кінця. Мутаційний аналіз позагибель клітин, як передбачається, не заснована казує, що сигнальні шляхи рецепторів FAS-R і на власній активності MORT-1, а швидше всього TNF-R р55, спрямованого на цитоктоксичність, пов'язана з активацією іншого(їх) білка(ів), які зв'язалучають різні дільниці їх внутрішньоклітинних зуються з MORT-1 і діють по наступних етапах доменів (Brakebusch et al, 1992; Tartaglia et al., цього сигнального каскаду. При клітинній експресії 1993, Itoh & Nagata, 1993). Ці дільниці (т.з. «згубні мутантного MORT-1, позбавленого N-кінцевої часдомени») характеризуються схожістю амінокислотини молекули, як було показано, відбувається тних послідовностей. Є тенденція до самоасоційоблокування індукції цитотоксичності під дією ваності «згубних доменів» у FAS-R і p55-R. Така FAS/APO1 (FAS-R) або p55-R (Hsu et al., 1996; самоасоційованість, мабуть, зумовлює агрегацію Chinnaiyan et al., 1996): це вказує на те, що ця Nрецепторів, що є необхідною для ініціація сигналькінцева дільниця передає сигнали про цитоцидний ного шляху [див. Song et al., 1994; Wallach et al., вплив обох цих рецепторів через деякі білок1994; Boldin et al., 1995], а при інтенсивній експребілкові взаємодії. сії цих рецепторів вона може призводити до зумоТаким чином, мотиви «доменів загибелі» в влення, не залежних від лігандів сигналів [Boldin et складі рецепторів p55-R і FAS-R, рівно як і три al., 1995]. асоційованих з ними білки MORT-1, RIP і TRADD, Як і при інших ефектах, що зумовлюються ремабуть, є сайтами таких міжбілкових взаємодій. цепторами, індукція клітинної загибелі рецептораТри білки MORT-1, RIP і TRADD взаємодіють з ми TNF і FAS-R забезпечується рядом міжбілкових внутрішньоклітинними доменами рецепторів p55-R взаємодій, що тягнуться від зв'язування ліганду на і FAS-R за рахунок зв'язування їх «доменів загиберецепторі до заключної активації каталітичних лі» з такими ж в складі рецепторів, а «згубні домеефекторних функцій, які у випадку, що аналізуєтьни» і RIP, і TRADD самоасоціюються (хоч в цьому ся визначають некаталітичні міжбілкові взаємодії, відношенні білок MORT-1 відрізняється тим, що які ініціюють сигнал загибелі клітин: зв'язування його «згубний домен» в самоасціаціях не бере гримувальних молекул TNF або ліганду FAS-R з участь). Більш того білки MORT-1 і TRADD дифевідповідними рецепторами, подальші взаємодії з ренційовано зв'язуються з p55-R і FAS-R і також іншими внутрішньоклітинними доменами зв'язуються один з одним. Більш того і MORT-1, і (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh & TRADD ефективно зв'язуються з RIP. Отже, можна Nagata, 1993), що визначаються здатністю посліпередбачити, що взаємодія між трьома білками довностей «доменів загибелі» до самоасоціюванMORT-1, RIP і TRADD є важливим компонентом ня (Boldin et al., 1995a), і індукції зв'язування двох загального процесу модуляції внутрішньоклітинноцитоплазматичних білків (які також можуть зв'язуго сигналу, що опосередковується цими білками. 11 76081 12 Порушення взаємодії між цими трьома внутрішляцію NF-KB за нормальним ендогенним механізньоклітинними білками буде зумовлювати модумом, а також блокування в цих клітинах індукції ляцію ефектів, що визначаються такою взаємодіактивності NF-KB під дією TNF через FAS-R і блоєю. Наприклад, придушення зв'язування білка кування індукції NF-KB білками TRADD, RIP і TRADD з M0RT-1 може модулювати взаємодію MORT-1 (які є білками-адаптерами, що зв'язуютьFAS-R-p55 TNF-R. Таким же чином, придушення ся з цими рецепторами p55-R і/або FAS-R). Всі RIP додатково до згаданого вище придушення рецептори p55-R, p75-R, FAS-R і їх адаптерні білки зв'язування TRADD з MORT-1 може додатково MORT-1, TRADD і RIP зв'язуються з білком TRAF2 змінити взаємодію FAS-R-p55 TNF-R. напряму або опосередковано, а він, в свою чергу, Моноклональні антитіла, проти «домену загизавдяки здатності зв'язуватися з кіназою NIK мобелі» p55-R, зокрема, у відношенні зв'язуючого дулює індукцію NF-KВ. сайта TRADD і RIP, також можуть бути використані Серед згадуваних вище білків-адаптерів, задля придушення або запобігання скріплення цих лучених до підтримки тонкого балансу між загибілків, таким чином зумовлюючи модуляцію взаєбеллю клітин і виживанням клітин після стимуляції модії між FAS-R і p55-R. FAS-R і (або) p55-R, білок RIP, як представляєтьТакож недавно було встановлено, що, крім акся, грає найбільш важливу роль. У С-кінцевій частивності, що згадувалася вище, по індукції загибетині білка RIP [див. Stanger et al., 1955; також лі клітин і її модуляції, опосредкованих різними Malinin et al., 1997] є дільниця, яка забезпечує інрецепторами і білками, що зв'язуються з ними, дукцію цитотоксичності незалежним чином, а тавключаючи FAS-R, p55-R, MORT-1, TRADD, RIP, кож за рахунок асоціації із «згубними доменами» MACH, Mch4 і G1, ряд цих рецепторів і білків, що MORT-1, p55-R, FAS-R і TRADD. Також білок RIP зв'язуються з ними також залучені до модуляції включає протеїнкіназний домен в своїй N-кінцевій активності ядерного транскрипційного чинника NFчастині, а також проміжний домен, який, як вважаKB, який є ключовим медіатором життєздатності ється, забезпечує «перетин» (зв'язування) з білком або виживання клітин, будучи відповідальним за TRAF2, таким чином включаючи його в індукцію контроль експресії значного числа генів, пов'язаNF-KB. Відповідно, подробиці, що стосуються паних з імунітетом і запальними процесами. Наприраметрів і послідовностей (нуклеотидної і амінокиклад, було встановлено, що TNF-α може ефективслотної) RIP були включені в згадувані вище пубно стимулювати активацію чинника NF-KB: таким лікації [зокрема, Stanger et al., 1992], які включені чином TNF-α здатний індукувати два типи сигналів тут для зведення у вигляді бібліографічних посив клітинах - один з них опосередковує загибель лань. клітин, а інший захищає клітини від індукції загиТакож TNF є одним з цитокінів, що беруть белі за рахунок включення експресії генів під контучасть в ініціації і модуляції антивірусної активносролем NF-KB (див. Beg & Baltimore, 1996; Wang et ті організму-господаря. Схожим чином в еволюції al., 1996; Van Antwerp et al., 1996). Схожий подвійвірусів сформувалася експресія генів, білкові проний ефект також був описаний і для рецептору дукти яких регулюють активність таких цитокінів, і FAS-R (див. відсилання до такого ефекту в згадаці цитокін-регулюючі вірусні білки, як вважається, ній вище статті Van Antwerp et al., 1996). Отже, забезпечують проникнення даного вірусу в оргаможна передбачити існування тонкого балансу між нізм тварини-реципієнта. Одним з найбільш добре загибеллю клітин і виживанням клітин внаслідок вивчених прикладів таких білків є білок Е3-14.7-кД, стимуляції різних типів клітин дією TNF-α і (або) що представляє аденовіруси-С людини типів 2 і 3, ліганду FAS-R, при тому, що кінцевий результат який активний як могутній антагоніст цитолізу, стимуляції залежить від того, за яким внутрішньоопосередкованого TNF. клітинним механізмом мала місце більш сильна З метою виділення молекулярних компонентів стимуляція, внаслідок чого в результаті або має сигнального каскаду TNF, який стає мішенню білка місце загибель клітини (звичайно за типом апоптоЕ3-17,4-кД в процесі вірусної інфекції, недавно з зу), або зберігається життєздатність клітини завдядопомогою двохгібридного скрінінга було виділено ки активації чинника NF-KB. білок Е3-17,4-кД людини (білок FTP-2 - «чотирнадКрім того, недавно заявниками даного винахоцять кілодальнон/взаємодіючий/білок»: «Fourteenду було додатково встановлено вірогідний мехаK interacting Protein: Y.Li et al., 1988). Було встанонізм, за яким члени родини рецепторів TNF/NGF влено, що білок FIP-2 сам по собі не є токсичним, активують NF-KB [див. Malinin et al., 1997 і різні і, в протилежність захисному ефекту Е-14,7-кД у бібліографічні посилання, що є в цій публікації, а відношенні цитотоксичності, індукується надексптакож тематично пов'язані заявки на патент Ізраїресією TNFR-I або RIP поза зв'язуванням з будьлю №№IL-117800 і IL-119133]. Коротко, було встаяким з двох вищезазначених білків. Було встановновлено, що деякі члени родини рецепторів лено, що білок FIP-2 характеризується певним TNF/NGF здатні активувати NF-KB опосередковарівнем гомології з RAP-2 - білком за даним винано через загальний білок-адаптер -TRAF2. Вперше ходом. Загальний рівень схожості між RAP-2 і FIP2 встановлена протеїнкіназа, позначена як NIK [див. вельми низький, на що вказує повне зіставлення цитовані вище за Malinin et al., 1997 і заявки ILамінокислотних послідовностей (Фіг.3). Однак, 117800 і IL-119133], здатна зв'язуватися з білком гомологія стає більш істотною по конкретних дільTRAF2 і стимулювати активність чинника NF-KB. ницях у напрямі до С-кінцевих частин цих білків, Дійсно, було показано [див. згадувані публікацію досягаючи майже повної ідентичності для 30 СMalinin et al. і ізраїльські заявки], що експресія в кінцевих амінокислот. Також заслуговує уваги той клітинах дефіцитних за кіназою NIK мутантів зумофакт, що, крім вищезазначеного С-кінцевого довлює нездатність цих клітин зумовлювати стимумену, передбачуваний мотив типу «лейцинова 13 76081 14 блискавка» в послідовності FIP-2 в істотній мірі асоційованого запалення і активності по виживанконсервативний для RAP-2 (за винятком заміни ню клітин. Таким же чином за рахунок здатності ізолейцину на аланін). рецепторів FAS-R, p55-R і їх модуляторних білків Схожа послідовність, позначена HYPL, що коMORT-1 і TRADD індукувати NF-KB і виживання дує білок, пов'язана з хворобою Гентінгтону, яка клітин напряму або опосередковано внаслідок приблизно є відособленим гомологом RAP-2, незв'язування з RIP або зв'язування з TRAF2, з яким щодавно була внесена в базу даних GenBank під зв'язується RIP, білки за даним винаходом також назвою «білок, взаємодіючий з гентінгтином» можуть бути медіаторами процесів підтримки житHYPL (депозитарний №AF049614). Проте, повідотєздатності клітин за рахунок активності в тому ж млень про функції цього білка доки немає. або близько родинному внутрішньоклітинному У недавній статті Ямаоки із спіавт. [S.Yamaoka сигнальному каскаді, в складі якого деякі із згадаet al., 1998] повідомляється про ідентифікацію гоних вище білків активні по забезпеченню виживанмолога RAP-2 миші. Мишачий гомолог NEMO ня клітин. Схожим чином, оскільки p75-R зв'язуєть(ключовий модулятор чинника NF-KB) був ідентися з TRAF2, з яким зв'язується RIP, нові білки за фікований при пошуку молекул, які б регулювали даним винаходом також можуть бути модулятораактивацію сигнального шляху NF-KB. Був охаракми RIP-пов'язаного опосередковування активності, теризований клітинний варіант HTLV-1 Тахщо зумовлюється рецептором p75-R. трансформованих фібробластів пацюка, позначеІншим об'єктом даного винаходу є представний як 5R, який не реагував ні на один з перевірелення антагоністів (наприклад, антитіл, пептидів, них стимулів, що активують NF-KB (LPS, РМА, ILорганічних сполук або навіть деяких ізоформ) зга1, TNF), і протестовано за його генетичною комданих вище нових білків RAP-2, їх ізоформ, аналоплементованості. Внаслідок цієї процедури була гів, фрагментів і похідних, які можуть бути викоривиділена кДНК, що кодує білок NEMO з молекулястані для придушення сигнальних шляхів або, що рною масою 48кД. Засновуючись на цих даних, більш конкретно, запальної цитотоксичності або була встановлена відсутність даного білка в клітимеханізмів виживання клітин, якщо це є бажаним. нах 5R і його входження до високомолекулярного Ще одним об'єктом даного винаходу є застоІКВ-кіназного комплексу, необхідного для його фосування згаданих вище білків RAP-2, їх ізоформ, рмування. В моделі in vitro білок NEMO здатний аналогів, фрагментів і похідних з метою виділення утворювати гомодиміри і напряму взаємодіяти з і охарактеризування додаткових білків або чинниΙΚΚβ. ків, які можуть бути залучені до регуляції рецепто[У ізраїльській патентній заявці №120485] рної активності, наприклад, інших білків, які зв'япредставляється RIP-асоційований білок, позназуються з білками RAP-2 і впливають на їх чений RAP, який специфічно зв'язується з білком активність, і (або) з метою виділення і ідентифікаRIP і придушує індукцію NF-KB. ції інших рецепторів, розташованих вище або ниж[Ізраїльська патентна заявка №123758] і дана че по сигнальному ланцюжку, в якому беруть заявка стосуються іншого RIP-асоційованого білка, участь дані білки, їх аналоги, фрагменти і похідні, позначеного як RAP-2, який характеризується таа, отже, в функціонування яких вони також залукою ж або схожою активністю. чені. Відповідно до даного винаходу білок RAP-2 Також даний винахід представляє білки, також позначається як 303, або RAP-303, або RATRAP2-зв’язуючися, які здатні модулюва303. Для зручності далі тут він буде позначатися ти/опосередковувати функції RAP-2. як RAP-2. Ще одним об'єктом даного винаходу є предОб'єктом даного винаходу є представлення біставлення інгібіторів, які можуть бути внесені в лка RAP-2, включаючи всі його ізоформи, аналоги, клітини з метою зв'язування або взаємодії з RAP-2 фрагменти і похідні, здатні зв'язуватися з білком і вірогідними ізоформами RAP-2, при тому, що ці RIP (тут і далі RIP, що позначається просто інгібітори можуть придушувати RIP-асоційовану «RIP»). Оскільки RIP здатний напряму або опосеактивність в процесах цитотоксичності, а, отже, редковано взаємодіяти з внутрішньоклітинними коли це є бажаним, підвищувати життєздатність медіаторами запалення, цитотоксичності і (або) клітин, або які можуть придушувати RIPзагибелі клітин, такими як p55-R і FAS-R, і з їх адаасоційовану активність в процесах забезпечення птерними або модуляторними білками, такими як, виживання клітин, отже, таким чином, якщо це наприклад, MORT-1, TRADD, Mch4, MACH, G1 і бажано, підвищуючи рівень цитотоксичності. іншими, то нові білки за даним винаходом за рахуБільш того об'єктом даного винаходу є застонок зв'язування з RIP таким чином виявляються сування згаданих вище нових білків RAP-2, їх ізоздатні придушувати внутрішньоклітинний сигнальформ і аналогів, фрагментів і похідних в якості ний каскад, що ініціюється зв'язуванням FASантигенів для отримання поліклональних і (або) ліганду зі своїм рецептором, a TNF зі своїм рецепмоноклональних антитіл до них. Ці антитіла, в тором (p55-R), a раз так, то нові білки за даним свою чергу, можуть бути використані, наприклад, винаходом є модуляторами опосередкованого для очищення нових білків з різних джерел, таких p55-R і FAS-R впливу на клітини. Також здатний як клітинні екстракти або лінії трансформованих взаємодіяти з білком TRAF2, таким чином будучи клітин. здатним взаємодіяти напряму або непрямо з NIK, Далі, дані антитіла можуть бути використані а, оскільки RIP активний як модулятор запального для цілей діагностики, наприклад, для ідентифікапроцесу і механізмів клітинної життєздатності, що ції захворювань, пов'язаних з аномальним функцізалучається до індукції чинника NF-KB, то нові онуванням клітинних процесів, що опосредковубілки за даним винаходом є модуляторами RIPються p55-R, FAS-R і іншими родинними 15 76081 16 рецепторами. себе модуляцію/опосредковування активності RIP Іншим об'єктом даного винаходу є представза рахунок специфічного зв'язування з RIP, при лення фармацевтичних композицій, що містять тому, що така модуляція/опосредковування RIP згадані вище білки RAP-2, з ізоформи або аналоги, дією RAP-2 включає модуляцію/опосредковування фрагменти або похідні, рівно як і фармацевтичні механізмів запалень, загибелі клітин і виживання композиції, що містять згадані вище антитіла або клітин, в які RIP залучений напряму або непрямо, інших антагоністів. а раз так, то такий RAP-2 може розглядатися як Відповідно до даного винаходу було виділено посередній модулятор/медіатор всіх перераховановий білок RAP-2. RAP-2 здатний зв'язуватися з них вище білків, а, мабуть, і ряду інших чинників, RIP або взаємодіяти з ним, а, отже, він є модулящо беруть участь в запаленнях, загибелі клітин тором або медіатором внутрішньоклітинної активабо виживанні клітин, з якими зв'язується RIP, або ності білка RIP. RIP залучений до модуляції або з якими RIP взаємодіє напряму або опосередопосередковування внутрішньоклітинних сигнальковано. них механізмів, наприклад, механізмів, асоційоваТакож даний винахід представляє два нових них з цитотоксичністю або загибеллю клітин, в RАР2-зв'язуючихся білка, ідентифікованих в двохяких RIP має власною цитотоксичністю і в зв'язку, гібридній дріжджовій системі з використанням як прямому або опосередкованому, з рядом інших «наживки» повно розмірної амінокислотної послібілків загибелі клітин, таких як, наприклад, MORTдовності білка RAP-2. 1, TRADD, МАСИ, Mch4, G1, p55-R і p75-R, з якими Застосовуючи повно розмірний білок RAP-2 як RIP може зв'язуватися або інакше асоціюватися «наживку» в двохгібридній системі, був виявлений напряму або непрямо через мотив «домену загиновий RAP2-взаємодіючий білок, що позначається белі», присутній в послідовності RIP і в складі всіх в даному тексті як клон №10 (або №10-кодований інших вище перелічених білків; іншим механізмом білок, або RAT-зв'язуючийся білок №10, або RBPє механізм запалення, клітинної життєздатності 10). Послідовність виділеної кДНК була далі виабо виживання, в яких RIP може належати роль значена за допомогою стандартних методів секвепрямого або непрямого активатора завдяки наявнування, відомих в даній області техніки, в сторону ності кіназного мотиву або домену в складі послі5 і з виділенням часткової відкритої кодуючої рамдовності RIP і здатності RIP зв'язуватися з білком ки даного білка, позбавленої, однак, старт-кодону. TRAF2, який може зв'язуватися з кіназою NIK, яка, Аналіз в двохгібридній системі репертуару в свою чергу, напряму залучена до активації транзв'язування клону №10 показав, що цей білок не скрипційного чинника NF-KB, який грає ключову тільки зв'язується з RAP-2, але також виявляє дороль в запаленнях і здатності до виживання клісить могутню афінність у відношенні TRAF2. Одтин. Крім того, рецептор p55-R також здатний взанак, клон №10 не зв'язується з RIP, TRADD, ємодіяти з TRADD і TRAF2 (через TRADD) і також MORT-1, МАСH, TNFR-1, TIP60 і NIK, рівно як і з залучений до активації NF-KB, таким чином берудеякими контрольними білками (наприклад, ламічи участь в механізмі виживання, а, отже, RIP за ном і циклином-D). Однак, не можна виключати, рахунок здатності зв'язуватися або взаємодіяти з що зв'язування клону №10 з кіназою NIK може FAS-R, TRADD і p55-R (через TRADD), рівно як і з бути виявлене в клітинах ссавців, виходячи з паTRAF2, також може бути залучений до модуляції раметрів NIK в клітинах дріжджів. Як було показазапалення і активацій виживання клітин з участю но, клон №10 зв'язується з RAP-2 в межах Сцих білків. Відповідно, RIP є модулятором або мекінцевих 200 амінокислот послідовності останньодіатором цих механізмів і схожим чином новий го, тобто дільниці, необов'язково зв'язуючоїся з білок RAP-2 за даним винаходом за рахунок зв'яRIP, TIP60, NIK і ΙΚΚβ. Ця послідовність, однак, зування з RIP є модулятором або медіатором зганеточна, що привело до необхідності проведення даних внутрішньоклітинних механізмів. декількох кіл пошуку бази даних Gen-Bank з метою RAP-2 було виділено і клоновано з викорисідентифікації гомологів клону №10. Єдиним білтанням двохгібридної дріжджової системи, секвеком, що виявив істотну міру схожості з білком, що новано і охарактеризовано: у відповідності з детакодується клоном №10, виявився білок F40F12.5 льно описаним нижче, RAP-2 розглядається як гіпотетична молекула нематоди C.elegans, для високоспецифічний білок, що RIP-зв'язується, отякої точна фізіологічна роль доки не встановлена. же, що є модулятором/медіатором RIP. RAP-2 не Цікаво, що F40F12.5, як було встановлено, хазв'язується з TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R і рактеризується певною схожістю з деякими предМАСН. Крім того, передбачається, що RAP-2 не ставниками високо консервативної родини контровключає характерного модуля або мотиву «згубльованих убіквітином протеаз. Ці ферменти ний домен», що відповідає тому, що сам по собі врівноважують деструктивні наслідки активності RAP-2 не зумовлює цитотоксичності. убіквітинової системи, яка, як відомо, «керує» біПо використанню протягом подальшого тексту льшістю клітинних процесів руйнування білків. При поняття «RIP-активність» закликано включити його тому, що убіквітинлігази забезпечують прикріпленактивність по модуляції/опосредковуванню запаня поліубіквітинової структури до призначеного до лень і механізмів загибелі і виживання клітин. Ця руйнування білка, убіквітинпротеази запобігають активність визначається тут вище і тут нижче, рівефективному «розгалуженню» цієї структури. Таке но як, і у всіх публікаціях, що цитувалися і патентприпущення про функції F40F12.5, засноване на них заявках, повний зміст яких включено для звесхожості згадуваних вище контрольованих убіквідення у вигляді бібліографічних посилань. тином протеаз, однак залишається під питанням, Подібним чином по використанню в даному тексті тому що не був досліджений можливий вияв цим поняття «активність RAP-2» закликано включити в білком якої-небудь каталітичної активності по від 17 76081 18 ношенню до поліубіквітину. Більш того ряд полодільниці нативного білка RAP-2; жень роблять даний збіг малоймовірним: (б) послідовності ДНК, здатні гібридизуватися (а) амінокислотні залишки, які, як вважається, з послідовністю (а) в умовах середньої міри жорстскладають основу каталітичної дільниці в будькості, які кодують біологічно активний білок RAP-2; якому з підкласів убіквітинпротеаз, не є консерваі тивними ні в F40F12.5, ні в клоні №10; (в) послідовності ДНК, які відрізняються вна(б) за винятком їх каталітичних сайтів, фермеслідок вирожденності генетичного коду від послінти, що відносяться до контрольованих убіквітидовностей ДНК, визначених в (а) і (б), які біологічном протеаз, що походять від різних видів (від бакно активний білок RAP-2. терій до людини), не виявляють будь-скільки Іншим конкретним варіантом вищезазначеної істотної схожості послідовностей, в той час як послідовності ДНК за даним винаходом є послідоF40F12.5 і клон №10 характеризуються наявністю вність ДНК, що включає принаймні частину посліпевного рівня гомології. довності, що кодує принаймні одну ізоформу білка Таким чином, передбачається, що RAP-2 є RAP-2. У іншому варіанті вищезазначеною посліспецифічним, RIP-зв'язуючим білком і, отже, модовністю ДНК є послідовність гену білка RAP-2 дулятором/медіатором внутрішньоклітинної активвідповідно до показаного на Фіг.1. Ще в одному ності RIP. RАР2-зв'язуючися білки, завдяки їх здаваріанті представляється послідовність ДНК, покатності зв'язуватися з RAP-2, виявляють посередній зана на Фіг.2. вплив на RIP і таким шляхом також є модулятораДаний винахід представляє білки RAP-2, а тами/медіатором внутрішньоклітинної активності кож їх аналоги, фрагменти або похідні, що кодуRIP. ються будь-якою з вищезгаданих послідовностей Таким чином, RAP-2 можливо грає роль модуза даним винаходом, при тому, що згадані білки, лятора/медіатора активності по запаленням, вианалоги, фрагменти і похідні здатні зв'язуватися з живанні клітин і (або) загибелі клітин, в які RIP заRIP і модулювати/опосередковувати його біологічлучений напряму або непрямо, особливо тих, які ну активність відносно внутрішньоклітинних мехапов'язані з цитотоксичністю і запальними проценізмів загибелі клітин і (або) виживання клітин. сами, що зумовлюються або різними стимулами, Конкретний варіант даного винаходу предстащо індукуються, включаючи ті, які передаються вляє білки RAP-2 і їх аналоги, фрагменти і похідні. рецепторами родини рецепторів TNF/NGF, а таАмінокислотна послідовність білка RAP-2, розшикож, можливо, і іншими (по схемі участі RIP в таких фрована по послідовностях ДНК, показаних на внутрішньоклітинних процесах, а, отже, участь Фіг.1 і 2, показана на Фіг.3. У іншому варіанті предRAP-2, див. Фіг.1 в публікації Malinin et al., 1997). ставлена будь-яка ізоформа білка RAP-2, її аналоТакож RAP-2 може служити інгібітором цитотоги, фрагменти і похідні. ксичності і запалень за рахунок його присутності як Також даним винаходом представляються частина комплексу з іншими білками, наприклад, компетентні по реплікації експресійні системи, що RIP, і білками, що зв'язуються з RIP, а раз так, то включають згадану вище ДНК, при тому, що ці він може порушувати цитотоксичність або запальні компетентні по реплікації експресійні системи здавияви цих інших білків (наприклад, p55-R, FAS-R, тні експресуватися у відповідних прокаріотичних MACH, Mch4, G1 і MORT-1), що зрештою зумовабо еукаріотичних клітинах-господарях; а також лює придушення їх цитотоксичної активності або їх спосіб вироблення білка RAP-2 або його аналогів, запальної активності. фрагментів або похідних за даним винаходом Також RAP-2 може служити як підсилювач або шляхом культивування трансформованих клітиніндуктор цитотоксичності і запалення, що забезпегосподарів в умовах, сприятливих для експресії чується активністю інших білків, наприклад, RIP і згаданих білка, його аналогів, фрагментів або поінших зв'язуючихся з RIP білків відповідно до вкахідних, для здійснення посттрансляциійних модизаного вище, маючи на меті рекрутинг цих білків з фікацій згаданого білка, якщо це необхідно для участю RIP, при тому, що такий рекрутинг служить отримання згаданого білка, і для екстрагування для забезпечення цитотоксичної активності з учасзгаданого експресованого білка, його аналогів, тю різних білків або для забезпечення їх запальної фрагментів або похідних із культурального сереактивності. довища згаданих трансформованих клітин або з Також аналогічним чином RAP-2 може служиекстрактів згаданих трансформованих клітин. Прити в якості інгібітору або індуктора механізму виведені вище визначення покликані включити всі живання клітин відповідно до відміченого вище за ізоформи білка RAP-2. рахунок залучення RIP до роботи цього механізму. У іншому аспекті даний винахід також предВідповідно, даний винахід представляє посліставляє антитіла або їх активні похідні або фрагдовність ДНК, що кодує RIP-асоційований білок менти, специфічні відносно білка RAP-2, його ана(RAP-2), його ізоформи, аналоги або фрагменти, логів, фрагментів і похідних за даним винаходом. здатні зв'язуватися з RIP і модулювати або опосеУ ще одному аспекті даного винаходу предредковувати внутрішньоклітинну активність RIP, ставляються різні шляхи застосування згаданих при тому, що згадана внутрішньоклітинна активвище послідовностей ДНК або білків, які вони коність пов'язана з модулювандують відповідно до даного винаходу, при тому, ням/опосередковуванням запалень і (або) загибелі що, крім інших, можуть бути такі шляхи застосуклітин, і (або) виживання клітин. вання: Зокрема, даний винахід представляє послідо(1) Спосіб модулювання внутрішньоклітинних вність ДНК, вибирану з групи, яка включає: механізмів запалення, загибелі клітин і (або) вижи(а) послідовність кДНК, похідну від кодуючої вання клітин, що модулюються або опосередкову 19 76081 20 ються білком RIP, RIP,_ модулювання внутрішньовнутрішньоклітинного застосування. клітинних механізмів запалення, загибелі кл RAP(5) Спосіб модулювання механізмів запалення, 2, їх ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних, загибелі клітин і (або) виживання клітин, опосередздатних зв'язуватися з RIP, при тому, що згадана кованих впливом лігандів родини TNF на клітини обробка згаданих клітин включає внесення в згачерез вплив на білок RIP, що включає обробку дані клітини згаданих одного або декількох білків, згаданих клітин олігонуклеотидною послідовністю, їх ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних в що кодує протисмислову послідовність по відноформі, придатній для проникнення їх всередину шенню принаймні до частини послідовності білка клітини, або внесення в згадані клітини послідовRAP-2 за даним винаходом, при тому, що згадана ності ДНК, що кодує згадані один або декілька білолігонуклеотидна послідовність здатна блокувати ків, їх ізоформ, аналогів, фрагментів або похідних, експресію білка RAP-2. в формі відповідного вектору, що включає згадану (6) Спосіб описаний (2), призначений для обпослідовність, при тому, що вказаний вектор здатробки пухлинних клітин або ВІЛ-інфікованих кліний забезпечувати вбудовування згаданої послітин, або хворих клітин іншого типу, що включає: довності в згадані клітини таким шляхом, щоб зга(а) конструювання рекомбінантного вектора на дана послідовність експресувалась в згаданих основі вірусу тварини, що включає послідовність, клітинах. що кодує вірусний поверхневий білок, здатний (2) Спосіб модулювання механізмів запалення, зв'язуватися на специфічному рецепторі поверхні загибелі клітин і (або) виживання клітин, опосередпухлинних клітин або на рецепторі поверхні ВІЛковуваних лігандами родини TNF за рахунок вплиінфікованих клітин, або на рецепторі, що знахову на клітини через вплив на білок RIP у відповіддиться на інших хворих клітинах, а також послідоності з п.(1), при тому, що згадана обробка клітин вність, що кодує білок, вибираний з білка RAP-2, включає внесення в згадані клітини згаданих білка його аналогів, фрагментів і похідних за даним виRAP-2 або його ізоформ, аналогів, фрагментів або находом, які, будучи експресовані в згаданих пухпохідних в формі, придатній для проникнення вселинних, ВІЛ-інфікованих або інших хворих клітиредину клітини, або внесення в згадані клітини нах, здатний знищувати згадану клітку через послідовності ДНК, що кодує вказаний білок RAP-2 взаємодію з білком RIP; і або його ізоформи, аналоги, фрагменти або похід(б) інфікування згаданих пухлинних або ВІЛні, при тому, що вказаний вектор здатний забезпеінфікованих клітин або інших хворих клітин згадачувати вбудовування згаданої послідовності в зганим в (а) вектором. дані клітини таким шляхом, щоб згадана (7) Спосіб модулювання механізмів загибелі послідовність експресувалась в згаданих клітинах. клітин і (або) виживання клітин, опосередкованих (3) Спосіб, описаний в (2), де згадана обробка впливом лігандів родини TNF на клітини через згаданих клітин здійснюється шляхом трансфекції білок RIP, що включає застосування рибозимної згаданих клітин рекомбінантним вектором на оспроцедури, в якій вектор, що кодує рибозимну понові вірусу тваринного, що включає наступні етаслідовність, здатну взаємодіяти з клітинною посліпи: довністю мРНК, яка кодує білок RAP-2 за даним (a) конструювання рекомбінантного вектора на винаходом, вносять в згадані клітини в формі, яка основі вірусу тварини, що включає послідовність, забезпечує експресію згаданої рибозимної посліщо кодує поверхневий вірусний білок (ліганд), який довності в згаданих клітинах, при тому, що, коли здатний зв'язуватися на специфічному поверховозгадана рибозимна послідовність експресується в клітинному рецепторі на поверхні клітини, несучій згаданих клітинах, вона взаємодіє із згаданою клірецептор FAS-R або p55-R, а також другу послідотинною послідовністю мРНК і розщеплює згадану вність, що кодує білок, вибираний з білка RAP-2 і послідовність мРНК, внаслідок чого відбувається його ізоформ, аналогів, фрагментів і похідних, які, придушення експресії згаданого білка RAP-2 в у разі експресії в згаданих клітинах, здатний модузгаданих клітинах. лювати/опосередковувати внутрішньоклітинні ме(8) Спосіб, вибираний з перерахованих вище ханізми запалень, загибелі клітин і (або) виживанспособів за даним винаходом, при тому, що згаданя клітин.; і на кодуюча послідовність білка RAP-2 включає (b) інфікування згаданих клітин згаданим в (а) принаймні будь-яку одну з ізоформ, аналогів, фравектором. гментів і похідних RAP-2 відповідно до даного ви(4) Спосіб модулювання механізмів запалення, находу, яка здатна зв'язуватися з RIP. загибелі клітин і (або) виживання клітин, опосеред(9) Способи виділення і ідентифікації білків вікованих впливом лігандів родини TNF на клітини дповідно до даного винаходу, здатних зв'язуватися через вплив на білок RIP, що включає обробку з білком RIP, що включають застосування двохгібзгаданих клітин антитілами або їх активними фраридної дріжджової системи, в якій послідовність, гментами або похідними відповідно до даного вищо кодує вказаний білок RIP входить до складу находу, при тому, що згадана обробка здійснюєтьодного гібридного вектора, а послідовність з бібліся за допомогою відповідної композиції, що отеки кДНК або геномної клонотеки входить до містить згадані антитіла, їх активні фрагменти або складу другого гібридного вектора, при тому, що ці похідні, відносно згаданих клітин, при тому, що, вектори потім використовуються для трансформаколи принаймні частина білка RAP-2 попадає на ції дріжджових клітин-господарів з виділенням позовнішню поверхню клітини, згадана композиція зитивно трансформованих клітин і подальшою формується для позаклітинного застосування, а екстракцією згаданого другого гібридного вектору коли згадані білки RAP-2 є повністю внутрішньокдля виділення послідовності, що кодує білок, який літинними, то згадана композиція формується для зв'язується із згаданим білком RIP. 21 76081 22 (10) Спосіб відповідно до будь-кого з перераIII. Спосіб, такий же як вказано вище, при тому, хованих вище пп.(1)-(9), при тому, що згаданим що вказаний білок RAP-2 представлений будьбілком RAP-2 є будь-яка з ізоформ RAP-2, будьяким з ізоформ RAP-2, при тому, що згадані ізоякий з її аналогів, фрагментів і похідних. форми здатні посилювати ефект дії RIP. (11) Спосіб відповідно до будь-якого з перераIV. Спосіб, такий же як вказано вище, при тохованих вище (1)-(10), при тому, що білок RAP-2 му, що вказаний білок RAP-2 є будь-яким з ізоабо будь-хто з його ізоформ, аналогів, фрагментів форм RAP-2, при тому, що згадані ізоформи здатні або похідних залучені до модуляції клітинного випридушувати дію RIP або дію на клітини іншого яву, опосередкованого або будь-якого іншого мемедіатора або індуктора, таким чином також придіатора, що модулюється з участю або індуктора, з душуючі дію FAS-R або p55-R на клітини або дію яким згадані білок RAP-2, його ізоформа, аналог, на клітини іншого цитотоксичного медіатора або фрагмент або похідне здатні зв'язуватися напряму індуктора. або опосередковано. V. Спосіб, такий же як вказано вище, при тому, Даний винахід також представляє фармацевщо згадані білок RAP-2, його ізоформа, аналог, тичну композицію, призначену для модулювання фрагмент або похідне здатні посилювати або примеханізмів запалень, загибелі клітин і (або) вижидушувати RIP-асоційований вплив на запалення і вання клітин, опосередкованих впливом білків ромеханізм виживання клітин за рахунок прямого або дини TNF на клітини через вплив на білок RIP або опосередкованого придушення NF-KB або прямої впливом будь-якого іншого медіатора або індуктоабо непрямої активації кінази JNK і р38. ра на клітини відповідно до того, що вказувався Виділення білків RAP-2, їх ідентифікація і охавище, що містить як активний компонент одне з рактеризування можуть бути здійснені із застосунаступного: ванням будь-кого з стандартних процедур, що ви(1) білок RAP-2 відповідно до даного винаходу користовуються для виділення і ідентифікації і біологічно активні фрагменти, аналоги, похідні і їх білків, наприклад, двохгібридної дріжджової сиссуміші; теми, методів афінної хроматографії і будь-яких (2) рекомбінантний вектор на основі вірусу інших добре відомих стандартних процедур, що тварини, кодуючий білок, здатний зв'язуватися на застосовується для подібних цілей. поверхово-клітинному рецепторі, і кодуючий білок Ще в одному аспекті даного винаходу сам по RAP-2 або біологічні активні фрагменти або анасобі білок RAP-2 або його ізоформа, фрагмент або логи за даним винаходом; похідне застосовується як «приманка» в двохгіб(3) олігонуклеотидну послідовність, що кодує ридній дріжджовій системі для пошуку білків, що з протисмислову послідовність послідовності білка ними зв'язуються. RAP-2 за даним винаходом, при тому, що вказаний Білки, які зв'язуються з RAP-2, його ізоформаолігонуклеотид може бути другою послідовністю в ми, фрагментами або похідними, також входять в складі вищезазначеного (2) рекомбінантного векоб'єм даного винаходу. тору на основі вірусу тварини. Інші аспекти і варіанти даного винаходу також Також даний винахід представляє: представляється з урахуванням викладеного в I. Спосіб модулювання запалення, внутрішньонижченаведеному докладному описі даного винаклітинних механізмів загибелі клітин і (або) вижиходу. вання клітин, що модулюються/опосередкованих Необхідно зазначити, що при використанні білком RIP, або впливу на клітини будь-якого іншопротягом даного тексту терміни «модуляго медіатора або індуктора, або будь-якого іншого ція/опосредковування RIP, або FAS-ліганду, або індуктора або інгібітору транскрипційного чинника вплив TNF на клітини», а також будь-які інші, наNF-KB, що включає обробку згаданих клітин у відприклад «модуляція/опосредковування», що викоповідності зі способом по будь-якому з приведених ристовуються в описі, покликані охопити як обробвище пп.(1)-(10) білками RAP-2, його ізоформами, ку in vitro, так і in vivo, а також, крім того, аналогами, фрагментами або похідними або поспридушення або посилення/зумовлення. лідовностями, що кодують білки RAP-2, його ізоНа Фіг.1 (А, В) (SEQ ID NO 1) показана нуклеоформи, аналоги або фрагменти, при тому, що згатидна послідовність гену RAP-2: старт-і стопидана обробка зумовлює посилення або кодони підкреслено. Стрілка вказує на початок придушення згаданого RIP-опосередкованого 1500-нуклеотидного клону, отриманого при двохгіефекту, а таким чином і ефекту, опосередкованого бридному скрінінзі. FAS-R або p55-R, або згаданим іншим медіатором На Фіг.2 (А, В) (SEQ ID NO 2) показана нуклеоабо індуктором, або іншим індуктором або інгібітотидна послідовність клону №41072 (див. приклад ром NF-KB. І): старт- і стопи-кодони підкреслені. II. Спосіб, такий же як вказано вище, при тому, На Фіг.3 А (/1, /2) показані розшифровані аміщо згадані білок RAP-2, його аналог, фрагмент нокислотні послідовності сплайсінгових варіантів або похідне є тією частиною білка RAP-2, яка спелюдини (повний 20.4 і Human shrt) і миші (повний цифічно залучена до зв'язування з RIP або із згаNEMO і Mouse part) RAP-2, а В (/І/ /2) показує опуданим іншим медіатором або індуктором, або інбліковану послідовність FIP-1, зіставлену на основі шим індуктором або інгібітором NF-KB, або програми, отриманій від ВСМ Search Launcher згадана послідовність білка RAP-2 кодує ту части(Baylor Coil. Med., Houston, NX). Гомологічні амінону білка RAP-2, яка специфічно залучена до зв'якислоти обведені, ідентичні амінокислоти затінені. зування з RIP або із згаданим іншим медіатором Зірочки (В) означають передбачуваний мотив типу або індуктором, або іншим індуктором або інгібіто«лейцинової блискавки» в послідовності FIP-2. ром NF-KB. На Фіг.4 проілюстрована молекулярна харак 23 76081 24 теристика RAP-2. На А показані дані НозернKB і АР-1 за зв'язування з ДНК. Клітини НЕК-293Т блотингу MTN Blot I (Clontech) людини з ДНКбули трансфіковани вказаними білками або по фрагментом RAP-2. На В відображений аналіз окремості (-), або разом з pcRAP-2 (+). Ядерні ексзв'язування RAP-2 з RIP, детально описаний в тракти, отримані з цих клітин, інкубували з 32Рприкладі 3. На С визначено взаємодію NIK/-RAP-2, поміченими олігонуклеотидами, що включають як і на В, за винятком того, що антитіла анти-FLAG класичні розпізнаючі послідовності для АР-1 (А) були використані в методі Вестерн-блотингу з поабо для NF-KB (В). Продукти реакції аналізували дальшої імунопреципітацією з антитілом до гексаелектрофоретично в неденатуруючому ПААГ. гістидину. Стрілка позначає положення імунопреНа Фіг.9. показано, що RAP-2 придушує вихідципітованих білків. ний рівень NF-KB в клітинах НЕК-293Т і HeLa, неНа Фіг.5 показано графік негативної регуляції постійно трансіфкованих різною кількістю або активації NF-KB і c-Jun дією різних стимулів під RAP-2 (смислова), або RAP-2-a/s (протисмислова). впливом ектопічної експресії RAP-2 відповідно до Всі маніпуляції були здійснені відповідно до опиописаного в прикладі 4. Клітини лінії НЕК-293Т саного для Фіг.6 в прикладі 4. були трансфіковани по типу, що перемежається На Фіг.10 (А, В) (SEQ ID NO 3) показано частрепортерною плазмідою (HIVLTR-Luc або CMVкова нуклеотидна послідовність клону №10. Luc для варіанту з NF-KB і GAL4-Luc для варіанту На Фіг.11 відображені функціональні властиз c-Jun [В] тестів на активацію), експресуючим веквості послідовних делецій RAP-2. На А дано схетором для відповідного індуктора і або порожньою матичне уявлення послідовних С-кінцевих делецій плазмідою (pcDNA3 - помічена на Фіг.окремо), або в RAP-2. Всі варіанти скорочення зберігають повплазмідою, що кодує повно розмірний RAP-2 ністю N-кінцеву частину RAP-2, в той час як їх С(pcRAP-2 - помічена на Фіг.плюсом). Рівень актикінцеві дільниці позначені стрілками. Дільниці зв'явації репортерного люциферазного гену виражали зування RIP, NIK, ΙΚΚβ і ТІР60 підкреслені. Три у «відносних люциферазних одиницях» (R.L.U.). заштрихованих області відповідають передбачуНа Фіг.6 показано, що RAP-2 виявляє схожу ваним мотивами типу «лейцинової блискавки». На репресивну активність у відношенні NF-KB і c-Jun В показаний ефект надекспресій делеційних консв широкому діапазоні концентрацій. Білок TRAF2 трукцій, описаних в А, на активацію NF-KB в клітибув експресовано по типу, що перемежається в нах НЕК-293Т під дією RelA, TRAF2, TNF і NIK з клітинах НЕК-293Т нарівні з різними вказаними використанням для NF-KB репортерної люцифекількостями конструкцій або pcRAP-2 (смислова), разної плазміди HIV-LTR-Luc. Рівень активації реабо pcRAP-2-a/s (протисмислова). Для оцінки акпортерного люциферазного гену виражали у «відтивації NF-KB (А) і c-Jun (В) включали репортерці носних люциферазних одиницях» (R.L.U.). плазміди, відповідно, pHIVLTR-Luc і pGAL4-Luc. На Фіг.12 показане картирування функціонаЛюциферазний, тест проводили відповідно до льних і зв'язуючих дільниць в RAP-2: описаного для фігури 5 в прикладі 4. (А) Різні делеції в складі RAP-2 були протестоНа Фіг.7 показано, що RAP-2 має могутній повані щодо їх здатності зв'язувати вказані білки в тенціал по сигналу до фосфорилюванню c-Jun без трансіфкованих клітинах дріжджів (непарні стовппорушення рівня активації кінази JNK1/2. ці) і клітинах ссавця НЕК-293Т (парні стовпці). У (А) Тотальні лізати клітин НЕК-293Т, трансфідвох розташованих з правого краю стовпцях покакованих вказаними експресуючими конструкціями зана здатність одних і тих же делецій, трансіфкоабо з pcDNA3-носієм, позначеної на Фіг.знаком ваних в клітини НЕК-293Т у великому об'ємі, що «мінус» (-), або pcRAP-2, позначеної на Фіг.знаком детально описане в прикладі 9, придушувати ак«плюс» (+), були ідентифіковані з допомогою Вестивацію NF-KB і зумовлювати гіперфосфорилютерн-блотингу з використанням антитіл до фосфовання c-Jun у відповідь на обробку TNF-0. Опукрильованого Jun відповідно до описаного в приклість перехресть пропорційна інтенсивності даного ладі 5. Контроль, показаний на нижньому малюнку, ефекту. Стрілки вказують на те, що ефекти помібуло повторно гібридизовано з антитілами до зачених конструкцій, що спостерігаються відносно гального антигену c-Jun (NEB). стимуляції RelA диференційовані (див. Фіг.11У). (B) Активовану JNK1/2 з клітин НЕК-293Т, (В) Узагальнююча схема, що представляє розтрансіфкованих або pcDNA3, або pcRAP-2, обробташування зв'язуючих (верхня частина) і функціолених hrTNF-α з метою збільшення періоду часу, нальних (нижня частина) дільниць RAP-2 у відповиявляли з допомогою Вестерн-блотингу тотальвідності з даними делеційного аналізу, показаного них лізатів з використанням антитіл до фосфорина (А), протягом осьової структури даного білка. льованої кінази JNK, що детально описано в прикЗаштриховані дільниці вказують на можливе поладі 5. ложення кордонів відповідних мінімальних сегмен(C) Клітини НЕК-293Т були котрансфіковани тів. порожнім вектором, pcDNA3 і pcRIP в різних споНа Фіг.13 показано, що залишок серину-148 в лученнях разом з плазмідою, експресуючою HAпослідовності RAP-2 є суттєвим для його здатності JNK1. Потім JNK1 імунопреципітували по його Nіндукувати гіперфосфорилювання по залишку секінцевому маркеру НА, а її здатність фосфорилюрину-63. вати бактерійний очищений химерний антигенний Показаний Вестерн-блот, в якому «wt» познаGST-Jun визначали в кіназному тесті in vitro. Прочає дикий тип, S148F позначає заміну серина на дукти цієї реакції аналізували методом електроаланін в 148-м положенні, a «vector» відповідає форезу в SDS-ΠΑΑΓ. Стрілкою відмічений GSTконтрольному («порожньому») вектору. Jun. У одному з своїх аспектів даний винахід стосуНа Фіг.8 показано, що RAP-2 не конкурує з NFється нових білків RAP-2, які здатні зв'язуватися з 25 76081 26 білком RIP, таким чином опосредковуючи або мокодуючої рамки. дулюючи внутрішньоклітинну активність RIP, осоФізіологічне значення взаємодії RIP/RAP-2 бубливо тоді, коли RIP залучений до модуляції або ло додатково підтверджене при трансфікуванні опосередковування механізмів запалень, загибелі клітин ліній НЕК-293Т і HeLa. Однак, утворення клітин і (або) виживання клітин, що детально було такого комплексу не приводило до каталітичної описано вище. Таким чином, RAP-2 може придуактивності RIP, на що вказувала відсутність фосшувати активність RIP в механізмах загибелі кліфорилювання RAP-2 при надекспресії RIP. тин, запалень і виживання клітин, RAP-2 може поЕксперименти по трансфекції в клітинах НЕКсилювати активність RIP в механізмах запалень, 293Т ссавця також підтвердили утворення стабізагибелі або виживання клітин, або ж він посилює льного комплексу білків RAP-2/NIK. активність RIP в одному з цих механізмів, придуRAP-2, мабуть, є ключовим елементом перешуючи його в інших механізмах. дачі сигналів в ланцюгу чинників NF-KB і с-Jun, Більш конкретно, відповідно до даного винаоскільки він зв'язується з NIK, ΙΚΚβ і ТІР60 (ацилтходу представляється новий білок RAP-2. Білок рансфераза гістонів) і модулює транскрипцію, заRAP-2 було секвеновано і охарактеризований, і лежну від NF-KB і c-Jun. Дійсно, посилена ектопічбуло встановлено, що RAP-2 є RIP-зв'язуючимся на експресія RAP-2 зумовлює придушення білком, що характеризується специфічністю у відпов'язаної з NF-KB відповіді, в той час як видаленношенні RIP, але не виявляє властивостей зв'язуня цього білка з клітини із застосуванням протисвання відносно ряду білків, для яких відома участь мислової конструкції зумовлює посилення трансау внутрішньоклітинних сигнальних механізмах, які ктивації NF-KB і c-Jun. пов'язані із запальними процесами, загибеллю Також було встановлено, що RAP-2 має потеклітин або виживанням клітин. Також RAP-2, манціал по гіперфосфорилюванню c-Jun, яке не опобуть, не має в своєму складі доменів, звичайних середковується активністю кінази JNK. RAP-2 не для білків, які активні в будь-якому з цих механізпридушує зв'язування c-Jun і RelA з ДНК. Зв'язуючі мів, тобто RAP-2 не включає мотиву або модуля і функціональні домени в складі RAP-2 були іден«домену загибелі», він не включає кіназного мотитифіковані при секвенуванні делеційних варіантів. ву або домену і він не включає протеазного мотиву Ці дослідження дозволили встановити, що дільниабо домену. Встановлена послідовність RAP-2 ці зв'язування RIP, NIK і ТІР60 перекриваються і також є унікальною послідовністю відносно послізнаходяться в районі амінокислотних залишків 95довностей, що використовувалися для порівняння 264 послідовності RAP-2. Подальші функціональні з ряду баз даних, включаючи GeneBank і бази даефекти, опосередковані білком RAP-2, однак, як них Human Genome level 1 і «dbest». Як уточнювабуло з'ясовано, пов'язані з N-кінцевим доменом лося вище (також з посиланням на всі згадувані даного білка, що охоплюється амінокислотами публікації і патентні заявки) за RIP залучений у 1-264. внутрішньоклітинні механізми запалення, загибелі З точки зору висловленої вище, RAP-2, маклітин і виживання клітин. Отже, регуляція або буть, є ключовим елементом процесів регуляції контроль активності RIP можуть впливати на будьсигналів в механізмі реакції на стреси: ектопічна кого з цих механізмів або на всі ці механізми тоді, експресія смислової конструкції придушує відпоколи вони ініціюються, наприклад, у відповідь на відь, в той час як протисмислова конструкція позв'язування TNF або FAS-ліганду на своїх рецепсилює таку відповідь. Дійсно, RAP-2 також відомий торах (зокрема, на p55-R, як рецепторі TNF). RIP в лабораторії, в якій працюють заявники, як білок може грати ключову роль у визначенні того, який RAT (білок-атенюатор RIP): тому в даному тексті механізм активується в більшій мірі, що визначавін також позначається як RAT і (або) RAT-303, і ється здібністю до зв'язування з рядом цитотокси(або) клон 303. чних білків, що включають в своїй послідовності Існування множинних сплайсінгових варіантів «згубні домени», а також з рядом білків, що мають вказує на те, що, принаймні частково, «розгалужекіназну активність. Відповідно, такі білки як білок ний» ефект дії RAP-2 при конкретних умовах, маRAP-2 за даним винаходом, які можуть специфічно буть, визначається присутністю декількох «блоків зв'язуватися з RIP, можуть грати важливу роль в послідовностей», які є необхідними для зв'язуванмодулюванні активності RIP, таким чином модуня, помічення, переміщення і модифікацій даного люючи міру індукції одного з вказаних механізмів в білка у вигляді його переважаючої ізоформи. Напорівнянні з іншими. Отже, білок RAP-2 за даним приклад, якщо, дійсно, зв'язування RAP-2 з ТІР60 винаходом представляє собою найважливіший визначається ядерною локалізацією RAP-2, то модулятор або медіатор внутрішньоклітинних сигможна передбачити, що варіанти RAP-2 з втраченальних шляхів. ним при сплайсінзі сигналі ядерної локалізації У доповнення до повно розмірного білка RAP(NLS) можуть перетворюватися в дефектні, або, з 2 за даним винаходом були клоновані більш короіншого боку, надзвичайно активні в придушенні ткі кДНК, для яких була встановлена наявність NF-KB/AP-1 варіанти. Проведене секвенування не «блоків» послідовностей, похідних від деяких взапоказало того, що RAP-2 включає декілька кластеємно віддалених дільниць «повної» кДНК, причирів позитивно заряджених амінокислот (глутаміноною чого може бути альтернативний сплайсінг ва кислота, лізин і аргінін), характерних для більтого ж самого гену. Мишачий гомолог гену RAP-2 шості відомих сигнальних мотивів NLS. людини був ідентифікований в аналогічному скріЗв'язування RAP-2 з RIP було встановлене по нінзі пулу маркерів EST миші. Як було встановлетій дільниці білка RAP-2, яка починається на аміно, часткова послідовність кДНК миші по суті іденнокислотах 177-218 і закінчується на 264-й амінотична своєму гомологу людини на дільниці кислоті. RIP-зв'язуючий домен в складі RAP-2 не 27 76081 28 перекривається ні із сайтом зв'язування ΙΚΚβ, ні із можливий ключ до нових терапевтичним прийомів сайтом зв'язування NIK. відносно таких захворювань. З точки зору передЗв'язування з ТІР60, що є членом родини ядебачуваної важливої ролі RIP у вияві токсичності рних білків, що визначаються як ацетилтрансферецепторами FAS-R і p55-R і, отже, важливої регурази гістонів, картується на дільниці, відповідній ляторної ролі RAP-2 рецепторів FAS-R і p55-R амінокислотам 95-264. Дільниця, залучена в гомочерез модуляцію RIP, представляється важливим димеризацію, була встановлена на амінокислотах створити лікарські засоби, які б могли блокувати 217-264. цитотоксичні функції RIP, можливо, за рахунок Накопичені дані підтверджують, що всі функціблокування зв'язування RAP-2 з RIP або придуональні вияви RAP-2 (а саме придушення NF-KB і шення будь-яким іншим шляхом взаємодії між індукція гіперфосфорилювання c-Jun) картуються RAP-2 і RIP при тих умовах, при яких RAP-2 вистуна одній і тій же дільниці. пає як підсилювач RIP-опосередкованої цитотокБілок, що кодується клоном №10, мабуть, зв'ясичності (як відзначалося вище, RIP є цитотоксичзується на дільниці, що починається між амінокисним сам по собі і в поєднанні з іншими білками, в лотами 218-309 і що закінчується на амінокислоті послідовності яких є «згубні домени»). 416, а, отже, його зв'язуючий сайт може включати Подібним же чином відомо (див. вище), що дільниці, що перекриваються, сайтів зв'язування з рецептори FAS-R і p55-R залучені до активації RIP, NIK, ΙΚΚβ і ТІР60. транскрипційного чиннику NF-KB і таким чином в Далі, можливо, що дільниця, істотна в зв'язку з забезпечення життєздатності (виживання) клітин. ефективною модуляцією сигналів, що зумовлюОтже, коли бажаним є знищення клітин, наприються всіма індукторами, знаходиться в N-кінцевій клад, пухлинних клітин, ВІЛ-інфікованих клітин і дільниці даного білка. подібного, то бажаним має бути посилення цитокДільниця, що покривається амінокислотами тосичної дії FAS-R і p55-R (і асоційованих з ними 95-416, має деякий ефект, який, однак, істотно білків, таких, як, наприклад, MORT-1, МАСН, Mch4, слабше в порівнянні з тим, який зумовлюється G1, TRADD), в той же час пов'язаний з придушенповно розмірним білком, що, отже, може визначаням їх здатність індукувати NF-KB. Отже, коли взатися посиленою агрегацією ендогенного білка ємодія або зв'язування RAP-2 з RIP зумовлює RAP-2. сприяння вірогідної функції RIP в посиленні індукБільш того за винятком RelA, всі індуковані в ції NF-KB (можливо, через білок TRAF2 і, мабуть, проведених заявниками експериментах ефекти через кіназний домен і/або проміжну домен білка можуть бути викликані по мінімуму приблизно сотRIP), то бажаним може бути блокування такої взанею N-кінцевих амінокислот послідовності білка ємодії між RAP-2 і RIP з метою придушення або, RAP-2. Дійсно, навіть фрагмент з амінокислотами принаймні, для запобігання сприянню активації 1-102 зумовлює виразний ефект, хоч і вельми сеNF-K В, таким чином домагаючись зсуву в балансі редній по силі. ефектів, що індукуються TNF або лігандом FAS у З іншого боку, придушення RelAбік вияву цитотоксичності, які зрештою приводили опосередкованого ефекту вимагає присутності б до загибелі клітин. більшої частини білка RAP-2. У зв'язку з цим заявСхожим чином при протилежній ситуації (по никами були визначені кордони такої дільниці в відношенню до описаного вище), коли зв'язування складі амінокислот 1-264, який, мабуть, додає аміRAP-2 з RIP реально зумовлює придушення запанокислотам дільниці 157-264 деякі специфічні зв'яльних або цитотоксичних ефектів FAS-R і p55-R і зуючі властивості, асоційовані з чинником RelA. коли бажаним є заблокувати їх цитотоксичну дію, З точки зору описаних вище спостережень пенаприклад, при запаленнях, різних аутоімунних редбачається наступне: захворюваннях і при подібному, при яких потрібна (а) за винятком RelA, зв'язування RAP-2 з RIP, підвищена життєздатність клітин, то важливим є клоном №10 і, що найбільш ймовірно, з NIK і ТІР60 створення лікарських засобів, які б посилювали не є обов'язковим для функціонування даного білвзаємодію між RAP-2 і RIP з метою посилення зака в якості інгібітору надекспресії, що індукується гального рівня придушення загибелі клітин і зсуву чинником NF-KB; в балансі у бік виживання клітин. Також ясно, в (б) вплив RAP-2 на індуковану надекспресію світлі сказаного вище, що при тому, що взаємодія RelA активацію, ймовірно, принаймні частково, RAP-2 з RIP зумовлює придушення функцій RIP зумовлюється відмінними подіями зв'язування. По відносно активації NF-KB, то, коли бажаним є збесуті всі згадувані вище білки можуть визначатися реження життєздатності клітин, необхідним є блояк чинники даної активності, на що вказують дані кування даної взаємодії між RAP-2 і RIP, що таким експериментів, проведених до теперішнього часу. чином посилює активність RIP щодо сприянню Завдяки унікальній здатності FAS-R і рецептоактивації NF-KB. рів TNF зумовлювати загибель клітин, рівно як і У зв'язку з всім сказаним вище, можна заклюздібності рецепторів TNF опосередковувати різні чити, що RIP характеризується ключовою роллю в тканино-ушкоджуючі ефекти, порушення функцій підтримці балансу між індукцією і опосередковуцих рецепторів може бути шкідливим для організванням механізмів запалення, загибелі клітин або му. Дійсно, і надмірна, і недостатня функція таких виживання клітин: отже, RAP-2 відіграє аналогічно рецепторів, як було встановлено, зумовлює патоважливу роль, будучи модулятором білка RIP. логічні вияви при різних захворюваннях. ІдентифіВплив на взаємодію/зв'язування RAP-2/RIP з викокація молекул, які беруть участь в сигнальних ристанням різних лікарських засобів або прийомів шляхах цих рецепторів, і виявлення механізмів відповідно до того, що описується вище і далі замодулювання функцій цих молекул представляє безпечить можливість зсуву у внутрішньоклітинних 29 76081 30 сигнальних механізмах від загибелі клітин до виАналоги, які в істотній мірі відповідають білка живання клітин, і навпаки, якщо це представляєтьRAP-2, є тими поліпептидами, в складі яких одна ся бажаним. або більше число амінокислот нативної амінокисТакож даний винахід стосується послідовності лотної послідовності білка RAP-2 замінені на інші ДНК, що кодує білок RAP-2, а також білків RAP-2, амінокислоти, делеговані і (або) додані, внаслідок що кодуються такими послідовностями ДНК. чого білок, що виходить в результаті виявляє по Більш того даний винахід додатково стосуєтьсуті таку ж або більш високу біологічну активність ся послідовностей ДНК, що кодують біологічно білка RAP-2, якому вони відповідають. активні аналоги, фрагменти і похідні білка RAP-2, а З метою досягнення істотної відповідності білтакож самі аналоги, фрагменти і похідні, що ними ка RAP-2 зміни в складі послідовності білків RAP-2, кодуються. Отримання таких аналогів, фрагментів таких як його ізоформи, повинні бути, в принципі, і похідних здійснюється стандартними методами невеликими. Хоч число таких змін може переви[див., наприклад, керівництво Sambrook et al., щувати десять, переважно, щоб таких змін було 1989], в яких в послідовності ДНК, що кодує білок менш десяти, більш переважно - не більш п'яти, а RAP-2, один або більше число кодонів можуть бунайбільш переважно - не більш трьох таких змін. ти делеговані, додані або замінені іншими з отриПри тому, що будь-який метод може бути застосоманням аналогів, що характеризуються принаймні ваний для пошуку потенційно біологічно активних заміною одного амінокислотного залишку в порівбілків, які б відповідали білкам RAP-2, одним з нянні з нативним білком. таких методів є застосування стандартних прийоСеред названих вище послідовностей ДНК за мів мутагенезу у відношенні ДНК, що кодує даний даним винаходом, які кодують білок RAP-2, його білок, з отриманням внаслідок невеликих модифіізоформу, аналог, фрагмент або похідне, також, як кацій. Ці білки, експресовані такими клонами, потім варіант даного винаходу, включаються послідовможуть бути піддані скрінінгу по їх здатності зв'яності ДНК, здатні гібридизуватися з послідовністю зуватися з RIP і модулювати активність RIP віднокДНК, похідною від кодуючого сегмента нативного сно модулювання/опосередковування внутрішньогену білка RAP-2, при тому, що таку гібридизацію клітинних механізмів, що описувалися вище. проводять в умовах середньої міри жорсткості, а «Консервативними» замінами є такі зміни, які в гібридизовані послідовності ДНК кодують біологічзв'язку з очікуваними наслідками не приведуть до но активний білок RAP-2. Такі гібридизовані послізмін активності даного білка і які звичайно першидовності ДНК, отже, включають послідовності ДНК, ми зазнають перевірки тому, що вони не зумовякі характеризуються відносно високим рівнем люють істотних змін в розмірі/ заряді або конфігугомології з нативної послідовністю кДНК RAP-2, a рації даного білка, що, отже, як очікується, не раз так, то являють собою РАР2-подібні послідовпризведе до зміни його біологічних властивостей. ності, які можуть бути, наприклад, природно похідКонсервативні заміни білків RAP-2 включають ними послідовностями, що кодують різні ізоформи аналог, при тому, що принаймні один амінокислотRAP-2, або нативними послідовностями, що кодуний залишок в складі поліпептиду був по консерють білки, що відносяться до групи РАР2-подібних вативному типу замінений на відмінну амінокислопослідовностей, що кодують білок, що має активту. Такі заміни переважно виконують у ність білка RAP-2. Крім того, ці послідовності мовідповідності з наступним переліком, показаним в жуть включати, наприклад, ненативні синтезовані таблиці ΙΑ, при тому, що заміни можуть бути виштучним шляхом послідовності, які схожі з нативзначені в рутинних дослідах з метою забезпечення ною послідовністю кДНК RAP-2, але при цьому структурних і функціональних властивостей синтевключають ряд бажаних модифікацій. Такі синтезованої поліпептидної молекули із збереженням тичні послідовності, отже, включають всі можливі тієї біологічної активності, яка характерна для білпослідовності, що кодують аналоги, фрагменти і ка RAP-2. похідну RAP-2, при тому, що всі вони мають актиТаблиця ІА вність білка RAP-2. Для отримання різних вищезазначених РАР2Початковий залишок Приклад заміни подібних послідовностей, що природно зустрічааланін гліцин, серин ються стандартні процедури скрінінгу і виділення аргінін лізин аспарагін глутамін, гістидин нативних зразків ДНК або РНК з різних тканин моаспарагінова кислота глутамінова кислота жуть бути застосовані з використанням нативної цистеїн серин кДНК RAP-2 або її фрагментів як зондів [див. прикглутамін аспарагін лади стандартних процедур, описаних у Sambrook глутамінова кислота аспарагінова кислота et al., 1989]. гліцин аланін, пролін гістидин аспарагін, глутамін Таким же чином для отримання згадуваних ізолейцин лейцин, валін вище різних синтетичних РАР2-подібних послідовлейцин ізолейцин, валін ностей, що кодують аналоги, фрагменти або похіаргінін, глутамін, глутамінова кислолізин дну RAP-2 ряд стандартних методів може бути та метіонін лейцин, тирозин, ізолейцин використаний у відповідності з детально описаним фенілаланін метіонін, лейцин, тирозин тут нижче з метою отримання таких аналогів, фрасерин треонін гментів і похідних. треонін серин Поліпептид або білок, який «в істотній мірі відтриптофан тирозин повідає» білка RAP-2, включає не тільки сам білок тирозин триптофан, фенілаланін валін ізолейцин, лейцин RAP-2, але також і поліпептиди або білки, які є аналогами RAP-2. 31 76081 32 З іншого боку, інша група замін в білці RAP-2 тентах США №№RE-33653, 4959314, 4588585 і представлена тими замінами, внаслідок яких при4737462, видані Merk et al., 5116943, виданий наймні один амінокислотний залишок в даному Koths et al., 4965195, виданий Namen et al., поліпептиді віддаляється, а відмінний залишок 4879111, виданий Chong et al., і 5017691, виданий вбудовується на його місце у відповідності з табLee et al.; а також заміщені по лізину білки, предлиці IB. Типи замін, які можуть бути вироблені в ставлені патентом США №4904584 (виданий Shaw складі даного поліпептиду, можуть бути засновані et al.]. на аналізі частот амінокислотних замін при порівКрім консервативних замін, що обговорювалинянні гомологічних білків у різних видів, таких, як ся вище, які в істотній мірі не змінюють активності ті, які показані в таблиці 1-2 у G.E.SchuIz et al, білка RAP-2, також або консервативні заміни, або 1978, «Principles of Protein Structure», Springerменш консервативні і в більшій мірі випадкові заVerlag, New York, NY і на Фіг.3-9 у T.E.Creighton, міни, які приводять до посилення біологічної акти1983, «Proteins: Structure and Molecular Properties», вності аналогів білків RAP-2, входять в масштаб W.H.Freeman & Co., San Francisco, CA. Засновуюданого винаходу. чись на подібному аналізі, альтернативні консерПісля того, як точний ефект заміни або делеції вативні заміни визначені тут як заміни в межах підтверджений, фахівцеві в даній області техніки однієї з 5 груп. має бути зрозумілим, що такий ефект заміни (замін), делеції (делецій) і т.п.повинен бути оцінений Таблиця IB із застосуванням рутинних тестів на зв'язування і загибель клітин. Скрінінг на основі стандартного Невеликі аліфатичні, неполярні або слабополярні залишки: 1. тесту не будуть включати будь-яких незаплановааланін, серин, треонін (пролін, гліцин) них додаткових експериментів. Полярні, негативно заряджені залишки і їх аміди: аспарагін, 2. аспарагінова кислота, глутамінова кислота, глутамін Прийнятними аналогами RAP-2 є такі аналоги, Полярні, позитивно заряджені залишки: гістидин, аргінін, які зберігають принаймні здатність зв'язуватися з 3. лізин RIP, таким чином, як відзначалося вище, опосредВеликі аліфатичні неполярні залишки: метіонін, лейцин, 4. ковуючи активність RIP відносно внутрішньокліізолейцин, валін (цистеїн) 5. Великі ароматичні залишки: феніланін, тирозин, триптофан тинних механізмів, що описувалися вище. У цьому значенні можуть бути отримані аналоги, які будуть Три амінокислотних залишки, укладені в примати т.з. «домінантно-негативним виявом», а саме веденій вище таблиці в дужки, грають специфічну такий аналог буде дефектним або по скріпленню з роль в архітектурі білка. Гліцин є єдиним залишRIP, або по подальшому виробленню сигналу, або ком, що не має бічного ланцюга і тому забезпечує по будь-якій іншій активності, що є наслідком такогнучкість ланцюжку. Це, однак, зумовлює тенденго зв'язування. Такі аналоги можуть бути викорисцію утворення іншої вторинної структури, ніж αтані наприклад, для придушення виявів RIP або спіральної. Пролін, завдяки своїй незвичайній геодля придушення індукції NF-KB (прямої або опосеметрії, значно ущільняє ланцюжок, зумовлюючи редкованої), що зумовлюється RIP, що залежить тенденцію утворення структур типу β-вигинів, хоч в від того, яка з цієї активності є основною з опоседеяких випадках цистеїн може бути здатним брати редкованих взаємодією RAP-2 і RIP (див. вище), участь в формуванні дисульфідних зв'язків, які що буде зумовлюватися такими аналогами за раграють важливу роль в укладанні і підтримці просхунок їх конкуренції з нативним RAP-2 за зв'язуторової структури білка (в його «фолдінзі»). Треба вання з RIP. відзначити, що в публікації, що цитувалася вище На генетичному рівні такі аналоги звичайно Schuiz et al. приведені вище групи 1 і 2 об'єднані. отримують із застосуванням методу направленого Також треба помітити, що тирозин за рахунок його мутагенезу у відношенні нуклеотидів в складі ДНК, здатності утворювати водневі зв'язки характеризущо кодує білок RAP-2, таким чином утворюючи ється істотною схожістю з серином і треоніДНК, яка кодує аналог, після чого синтезують таку ном, і т.д. ДНК і експресують поліпептид в рекомбінантній Консервативні амінокислотні заміни відповідно клітинній культурі. Звичайно такі аналоги виявлядо даного винаходу, наприклад, так, як зазначалоють таку ж або підвищену біологічну активність в ся вище, відомі в даній області техніки, тому можпорівнянні з нативним білком: Ausubel et al., на чекати, що будуть збережені біологічні і струк1987/1995, «Current Protocols in Molecular Biology» турні властивості даного поліпептиду після такої Greene Publ. & Wiley Intersci., New York, NY; амінокислотної заміни. Більшість делецій або заSambrook et al., 1989, «Molecular Cloning: A мін відповідно до даного винаходу є такими, які не Laboratory Manual», Cold Spring Harbor Lab., Cold приводять до різких змін в параметрах даного білSpring Harbor, NY. ка або поліпептидної молекули. Ці «параметри» Отримання білка RAP-2 відповідно до виклавизначаються таким чином, щоб врахувати і зміни деного тут або альтернативної нуклеотидної посу повторній структурі, наприклад, таких як αлідовності, що кодує такий же поліпептид, але відспіралі або в площини, і зміна в біологічній активмінної від нативної послідовності через зміни, що ності, наприклад, в скріпленні з RIP і (або) опосевизначаються відомою вирожденністю генетичного редкуванні впливу RIP на загибель клітин. коду, може бути здійснено із застосуванням метоПрикладами вироблення амінокислотних замін ду направленого (сайт-специфічного) мутагенезу в білках, які можуть бути використані для отритієї ДНК, яка кодує раніше отриманий аналог або мання аналогів білків RAP-2 з метою їх викориснативний варіант білка RAP-2. Метод направленотання відповідно до даного винаходу, включають го мутагенезу дозволяє отримувати аналоги шлябудь-які відомі методи, такі як представлені [в пахом використання специфічних олігонуклеотидних 33 76081 34 послідовностей, які кодують послідовність ДНК, що ДНК, що повторюються. Ця реакція може бути вивключає бажану мутацію, рівно як і достатня кількористана замість клонування єдине що для цього кість сусідніх з нею нуклеотидів, з метою отриманпотрібно, це встановлення нуклеотидної послідовня послідовності затравка необхідної довжини і ності. З метою здійснення ПЛР затравки конструскладу для отримання стабільного дуплексу по юють таким чином, щоб вони були комплементарні обидві сторони від делеційного стику, що є. Звипредставляючій інтерес послідовності. Потім зачайно переважними є затравки, що складаються травки отримують шляхом автоматичного синтезу приблизно з 20-25 нуклеотидів, при тому, що по 5ДНК. Оскільки затравки можуть бути вистроєні 10 комплементарних нуклеотидів на кожній стороні таким чином, щоб гібридизувати з будь-якою дільпослідовності змінені. Загалом, метод направленицею даного гену, то можуть бути вибрані такі ного мутагенезу добре відомий в науці, прикладом умови, що можуть виникати помилки при спаровучому може служити [публікація Adelman et al., ванні комплементарних основ. Ампліфікація цих 1983, DNA, 2, 183], зміст якої включений тут для помилкових дільниць може призводити до синтезу зведення у вигляді бібліографічного поси-лання. мутантного продукту, внаслідок чого буде утворюЯк має бути зрозумілим, метод направленого ватися пептид, що характеризується новими власмутагенезу звичайно заснований на використанні тивостями (тобто це і буде направлений мутагефагового вектору, який існує і в одноланцюговій, і нез): див. також, наприклад, Ausubel, цит. вище, в двохланцюговій формах. Звичайними векторами, розділ 16. Також шляхом сполучного синтезу комщо застосовується в методі направленого мутагеплементарної ДНК (кДНК) з використанням зворонезу, є такі вектори, як фаг М13, наприклад, відпотної транскриптази в ПЛР як початковий матеріал відно до викладеного [у Messing et al., 1981, In «3d може бути використана РНК для цілей синтезу Cleveland Symp. Macromolecules & Recombinant внутрішньоклітинного домену рецептора пролакDNA», ed. A.Walton, Elsevier, Amsterdam], зміст тина без клонування. якої включений тут для зведення у вигляді бібліогБільш того ПЛР-затравки можуть бути сконстрафічного посилання. Цей фаг легко доступний на руйовані таким чином, щоб включати нові рестрикомерційній основі і його використання, в принципі, кційні сайти або інші елементи, такі як стопдобре відомо фахівцям в даній області техніки. З кодони, по кінцях генного сегменту, який буде аміншого боку, плазмідні вектори, які включають одпліфікуватися. Таке внесення рестрикційних сайтів ноланцюговий сайт початку реплікації (Veira et al., по 5'- і 3'-кінцям ампліфікованої генної послідовно1987, Meth. Enzymol., 153, 3), можуть бути використі забезпечить генному сегменту, що кодує білок стані для отримання одноланцюгової ДНК. RAP-2 або його фрагмент, можливість лігування Загалом, метод направленого мутагенезу в на інші послідовності і (або) по сайтах клонування зв'язку з тим, що описується в даному тексті здійсв складі векторів. нюють спочатку шляхом отримання одноланцюгоПЛР і інші методи ампліфікації РНК і (або) ДНК вого вектору, який включає в своїй послідовності добре відомі в науці і можуть бути використані послідовність ДНК, яка кодує шуканий поліпептид. відповідно до даного винаходу без додаткових Олігонуклеотидну затравку, несучу бажаним чиекспериментів, засновуючись на представленій тут ном мутувавшу послідовність, отримують синтетиінформації. Відомі методи ампліфікації ДНК і РНК чним шляхом за допомогою автоматичного полінувключають, таким чином не обмежуючись, полімеклеотидного синтезу. Потім цю затравку разну ланцюгову реакцію (ПЛР) і схожі ампліфікавипалюють на одноланцюговий вектор, що вклюційні процеси [див., наприклад, патенти США W чає кодуючу білок послідовність, і обробляють 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, видані Mullis ферментами з ДНК-полімеразною активністю, таet al., 4795699 і 4921794, видані Tabor et al., кими як фрагмент Кленова ДНК-полімерази І 5142033, виданий Innis, 5122464, виданий Wilson Е.соіі, з метою завершення синтезу ланцюга, що et al., 5091310, виданий Innis, 5066584, виданий включає мутацію. Таким чином, мутантна послідоGyilensten et al., 4889818, виданий Gelfand et al., вність і другий ланцюг несуть бажану мутацію. 4994370, виданий Silver et al., 4766067, виданий Такий гетеродуплексний вектор потім використоBiswas, 4656134, виданий Ringold, а також Innis et вують для трансформації відповідних клітин, таких al., (eds.), «PCR Protocols: A Guide to Method and як клітини Е.соlі штамма JM101, а після цього відApplications»] і опосередковану РНК ампліфікацію, бирають ті клони, які несуть рекомбінантні вектов яка як матриця використовується РНК, що є прори, що включають бажану мутантну послідовність. тисмисловою по відношенню послідовності-мішені, Після відбору такого клону мутантну послідовдля цілей синтезу двохланцюгової ДНК [патент ність білка RAP-2 може бути виділена і вбудована США №5130238, виданий Maiek et al.: торгова мадо складу відповідного вектора - звичайно трансрка способу NASBA], і імуно-ПЛР, в якій поєднуферного або експресуючого вектора такого типу, ється використання ампліфікації ДНК з поміченням який може бути використаний для трансфекції відантитіл (Ruzicka et al., 1993, Science, 260, 487; повідного організму-господаря. Sano et al., 1992, Science, 258, 120; Sano et al., Таким чином, ген або нуклеїнова кислота, що 1991, Biotechniques, 9, 1378), при тому, що повний кодує білок RAP-2, також може бути детектовано, зміст цих патентів і наукових публікацій включений отримано і (або) модифіковано in vitro, in situ і тут для зведення у вигляді бібліографічних поси(або) in vivo із застосуванням відомих методів амлань. пліфікації ДНК або РНК, таких як ПЛР і хімічний Аналогічним чином біологічно активні фрагмесинтез олігонуклеотидів. ПЛР забезпечує ампліфінти білків RAP-2 (наприклад, будь-яких RAP-2 або кацію (збільшення в кількості) конкретних послідойого ізоформ) можуть бути отримані відповідно до вностей ДНК за рахунок реакцій полімеризації описаного вище відносно аналогів білків RAP-2. 35 76081 36 Відповідними фрагментами білків RAP-2 є ті фраНовий білок RAP-2, його аналоги, фрагменти і гменти, які зберігають активність RAP-2 і які мопохідні можуть характеризуватися рядом шляхів жуть модулювати або опосередковувати біологічну використання, наприклад: активність RIP або інших білків, що асоціюються з (1) білок RAP-2, його аналоги, фрагменти і поRIP напряму або непрямо. Відповідно, можуть бухідні можуть бути використані для модулювання ти отримані такі фрагменти білків RAP-2, які буфункцій білка RIP відносно механізмів або западуть виявляти домінантно-негативний або доміналень, або загибелі клітин, або виживання клітин нтно-позитивний ефект так само, як було відповідно до описаного вище. Наприклад, якщо відмічено вище для аналогів. Необхідно зазначиRAP-2 може модулювати вплив RIP на активацію ти, що ці фрагменти представляють окремий клас транскрипційного чинника NF-KB, JNK (кінази Jun) аналогів за даним винаходом, а саме вони визнаі кінази р38, то такі ефекти RAP-2 будуть призвочаються як дільниці білків RAP-2, похідні від повно дити до посилення такої взаємодії RAP-2/RIP, коли розмірної послідовності білка RAP-2 (наприклад, бажаним буде використати це в протипухлинних, послідовності будь-якого RAP-2 або їх ізоформ), проти- і прозапальних цілях, проти ВІЛ-інфекцій і при тому, що кожна дільниця або фрагмент має т.п.У цьому разі білок RAP-2, його аналоги, фрагбудь-яку з описаних вище активність. Такий фрагменти або похідні, які здатні модулювати запаленмент може бути, наприклад, пептидом. ня, посилювати цитотоксичність або блокувати Схожим чином похідні можуть бути отримані ефект по підтримці життєздатності клітин, можуть за допомогою стандартних модифікацій бічних бути внесені в клітини за допомогою відомих станланцюгів одного або більшого числа амінокислотдартних прийомів. Наприклад, коли білок RAP-2 є них залишків в складі білка RAP-2, його аналогів внутрішньоклітинним (як передбачається) і повиабо фрагментів або шляхом з'єднання білка RAPнен бути внесений тільки всередину тих клітин, на 2, його аналогів або фрагментів з іншою молекуякі через RIP впливають FAS-ліганд або TNF, або лою, наприклад, антитілом, ферментом, рецептоінші цитотоксичні білки, то необхідно використати ром і т.п., що добре відомо в даній області техніки. систему специфічного внесення такого білка в такі Відповідно, по використанню в даному тексті терклітини. Одним з шляхів вирішення цієї проблеми мін «похідні» охоплює похідні, які можуть бути є створення рекомбінантного вірусу тварини, наотримані на основі функціональних груп, які є в приклад, похідного від вірусу коров'ячої віспи, до складі бічних ланцюгів залишків, що знаходяться ДНК якого повинні бути приєднані два наступних на N- або С-кінцях, із застосуванням відомих в гени: ген, що кодує ліганд, який зв'язується повернауці методів, і ці похідні також попадають в об'єм хово-клітинними білками, специфічно експресоваданого винаходу. Похідні можуть бути хімічними них цими клітинами, наприклад, такий як білок складовими, такими як залишки вуглеводів і фосgp120 вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), який фатів, утворюючи фракцію, яка буде мати таку ж специфічно зв'язується на деяких клітинах (СD4або більш високу біологічну активність в порівнянпозитивні лімфоцити і родинний лейкоз), або будьні з білками RAP-2. який інший ліганд, який специфічно зв'язується з Наприклад, похідні можуть включати аліфатиклітинами, несучими рецептори FAS-R або p55-R, чні ефір карбоксильних груп, аміди карбоксильних внаслідок чого рекомбінантний вірусний вектор груп за рахунок реакції з амонійної групою з пербуде здатний зв'язуватися на таких клітинах, несувинними або повторними амінами, N-ацильні похічих рецептори FAS-R або p55-R; і ген, що кодує дні або вільні аміногрупи амінокислотних залишків, білок RAP-2. Таким чином, експресія білка, що утворюваних ацильними складовими (наприклад, зв'язується на клітинній поверхні забезпечить віалканоїльними або карбоциклоароїльними групарусу специфічність відносно пухлинної клітини або ми), або 0-ацильні похідні вільних гідроксильних іншої клітини, несучої рецептори FAS-R або p55-R, груп (наприклад, у залишків серину або треоніну), як мішені, після чого послідовність, що кодує білок що утворюються ацильними складовими. RAP-2, буде внесена в клітини за допомогою даноТермін «похідні» покликаний включити тільки го вірусу, а після експресії в цих клітинах станетьті похідні, в яких не відбувається замін однієї аміся посилення опосередкованого білком RIP впливу нокислоти на іншу амінокислоту в межах двадцяти ліганду FAS-R або TNF або незалежного від RIP амінокислот, що зустрічаються в природних умотакого впливу. Конструювання такого рекомбінанвах. тного вірусу тварин засновується на стандартних RAP-2 є білком або поліпептидом, наприклад, процедурах (див., наприклад, Sambrook et al., послідовністю, складеною залишками амінокислот. 1989). Інша можливість заснована на внесенні поПоліпептид, що включає більш великі послідовнослідовностей білка RAP-2 (наприклад, будь-якого сті, якими є повна послідовність білка RAP-2 відбілка RAP-2 або їх ізоформ) в формі олігонуклеоповідно до даних тут визначень, попадає в об'єм тидів, які можуть бути адсорбовані цими клітинами даного винаходу, якщо довжина такого поліпептиз подальшою їх експресією всередині них. ду за рахунок вставок, що є не зумовлює пору(2) Вони можуть бути використані для придушення основних і нових параметрів за даним вишення впливу ліганду FAS-R, TNF або родинного находом, тобто якщо він або зберігає, або посилює білка, опосередкованого білком RIP або незалежбіологічну активність білка RAP-2, або ж він може ного від RIP їх впливу, наприклад, у разах пошкобути розщеплений з утворенням білка або поліпедження тканин при септичному шоці, відторгнені птиду, що має біологічну активність білка RAP-2. тканин при реакції «трансплантат проти господаТаким чином, наприклад, даний винахід представря» або гострому гепатиті, при яких бажаним є ляє химерні білки, що включають білок RAP-2 і блокування лігандом FAS-R, що індукуються або інші амінокислоти або пептиди. TNF сигналів через рецептори FAS-R або p55-R, 37 76081 38 або їх незалежного від RIP впливу, або опосередтого ж самого класу, тобто тих білків, які зв'язукованого іншими білками впливу при одночасному ються з білком RIP або на функціонально родинпосиленні механізму виживання клітин. У такій них рецепторах або білках, що беруть участь у ситуації можливим є, наприклад, внесення в клітивнутрішньоклітинних сигнальних механізмах. У ни за допомогою стандартних процедур олігонуктакому застосуванні може бути використана згадулеотидів, що включають проти смислові кодуючи вана вище двохгібридна дріжджева система, або послідовності білка RAP-2, які б ефективно забломоже бути використана недавно розроблена сискували трансляцію мРНК, що кодують білок RAP-2, тема, заснована на нежорстких умовах Саузернтаким чином блокуючи його експресію і приводячи блот-гібридизації з подальшим ПЛР-клонуванням до придушення впливу ліганду FAS-R, TNF, RIP (Wilks et al., 1989). В публікації Уїлкса з співавт. або інших білків. Такі олігонуклеотиди можуть бути описується ідентифікація і клонування двох певнесені в клітини з використанням описаного вище редбачуваних тирозинкіназ із застосуванням непідходу, заснованого на рекомбінантних вірусах, жорсткої гібридизації по Саузерну з подальшим при тому, що другою послідовністю, що включаклонуванням на базі ПЛР, заснованих на відомій ється в такий вірус, є дана олігонуклеотидна поспослідовності кіназного мотиву - тобто «заданої лідовність. кіназної послідовності». Такий підхід може бути Подібно описаному вище чином, в залежності використаний відповідно до даного винаходу з від природи взаємодії між RAP-2 і RIP, із застосувикористанням послідовності білка RAP-2 з метою ванням описаних вище підходів (1) і (2) можливим ідентифікації і клонування родинних білків, RIPможе бути посилити або подавити клітинні механізв'язуючихся. зми запалення і виживання, якщо це є бажаним. (4) Ще один підхід до використання білка RAPІнша можливість визначається використанням 2 або його аналогів, фрагментів або похідних за антитіл, специфічних відносно білка RAP-2, з меданим винаходом пов'язаний з їх використанням в тою придушення його внутрішньоклітинної сигнаметодах афінної хроматографії, націлених на вильної активності. ділення і ідентифікацію інших білків або чинників, з Ще одним шляхом придушення RIPякими вони здатні зв'язуватися, наприклад, інших опосередкованих виявів або незалежних від RIP білків або чинників, залучених у внутрішньоклітинефектів є застосування недавно відкритого рибоні сигнальні механізми. У такому застосуванні бізимного підходу. Рибозими - це каталітично активлок RAP-2, його аналоги, фрагменти або похідні за ні молекули РНК, які специфічно розщеплюють даним винаходом можуть бути окремо приєднані інші РНК. Рибозими можуть бути вибудовані штучдо матриць для афінної хроматографії і потім проно так, щоб розщеплювати РНК-мішені на вибір, контактовани з клітинними екстрактами або ізонаприклад, мРНК, що кодують білок RAP-2 за дальованими білками або чинниками, які, як припусним винаходом. Такі рибозими повинні характерикається, залучені до внутрішньоклітинних зуватися послідовністю, специфічною відносно сигнальних механізмів. По завершенні процедури мРНК білка RAP-2, і повинні бути здатні взаємодіафінної хроматографії інші білки або чинники, які яти з нею (шляхом комплементарного зв'язування) зв'язуються з білком RAP-2 або з його аналогами, з подальшим розщепленням цієї мРНК, внаслідок фрагментами або похідними за даним винаходом, чого буде меншати (або повністю втрачатися) ексможуть бути елюйовані, виділені і охарактерипресія білка RAP-2, при тому, що міра такого змезовані. ншення експресії буде залежати від рівня експресії (5) Як відзначалося вище, білок RAP-2, його рибозиму в клітині-мішені. Для внесення рибозимів аналоги, фрагменти або похідні за даним винахоу вибрані клітини (наприклад, клітини, несучі рецедом також можуть бути використані в якості імуноптори FAS-R або p55-R) може бути використаний генів (антигенів) для цілей отримання специфічних будь-який відповідний вектор, наприклад, плазмівідносно них антитіл. Такі антитіла можуть бути да, вектори на основі вірусів тваринних (ретровівикористані для цілей очищення білка RAP-2 (нарусів), які звичайно використовуються для цих приклад самого RAP-2 або його ізоформ) або з цілей (див. також описаний вище п.(1), в якому клітинних екстрактів, або з трансформованих клівірус як друга послідовність буде включати кДНК, тинних ліній, що виробляють білок RAP-2 або його що кодує дану вибрану рибозимну послідовність). аналоги або фрагменти. Далі, ці антитіла можуть (Як огляди, що описують рибозимні методи, див. бути використані для діагностичних цілей в іденChen et al., 1992; Zhao & Pick, 1993; Shore et al., тифікації захворювань, пов'язаних з аномальним 1993; Joseph & Burke, 1993; Shimayama et al., функціонуванням RIP-опосередкованих систем 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et ліганду FAS-R або TNF незалежних від RIP активal., 1993; Koizumi et al., 1993). Такий підхід застоності, наприклад, знижених або підвищених клісуємо тоді, коли взаємодія RAP-2/RIP посилює тинних ефектів, що індукуються лігандом FAS-R цитотоксичність в ситуаціях, коли бажаним є заабо TNF, опосередкованих білком RIP або власноблокувати цю цитотоксичність, або коли взаємодія го впливу RIP на клітини. Таким чином, якщо такі RAP-2/RIP придушує активацію NF-KB в такій же захворювання пов'язані з порушеннями функціоситуації бажаності блокування такого придушення нування внутрішньоклітинних сигнальних шляхів, з метою інтенсифікації активації NF-KB, тобто в що залучають білок RIP або різні інші згадувані обох випадках бажаним є підвищення виживання білки, що вище RIP-зв'язуються або власне білок клітин, як це описувалося в п.(2). RAP-2, то такі антитіла будуть служити як ефекти(3) Білок RAP-2, його аналоги, фрагменти або вний діагностичний засіб. похідні також можуть бути використані для цілей Необхідно також зазначити, що виділення, виділення, ідентифікації і клонування інших білків ідентифікація і охарактеризування білка RAP-2 за 39 76081 40 даним винаходом можуть бути здійснені з викорижуть бути піддані скрінінгу з метою отримання станням будь-кого з відомих в даній області техніспецифічних лікарських засобів, які б були здатні ки стандартних процедур. Наприклад, одна з таких придушувати взаємодію RAP-2/RIP. процедур скрінінгу, а саме процедура на основі Не обмежуючи будь-яким чином приклад того, двохгібридної дріжджової системи, детально опияк пептидні інгібітори взаємодії RAP-2/RIP можуть сана нижче, була використана для ідентифікації бути сконструйовані і протестовані, заснований на білка RIP (див. Stanger et al., 1995) і потім - різних проведених дослідженнях пептидних інгібіторів білків RAP-2 за даним винаходом (крім ряду інших ICE або ІСЕ-подібних протеаз, субстратної специнових білків, що заявляються що згадуються тут фічності ICE і стратегій аналізу епітопів з викорисвище і далі тематично пов'язаними патентними танням методів пептидного синтезу. Мінімально заявками). Також, як це описувалося вище і буде необхідним для ефективного розщеплення пептирозглянуто далі, інші процедури, такі як афінна ду під дією протеази ICE було знаходження в ньохроматографія, методи гібридизації ДНК і т.п., дому чотирьох амінокислот від сайту такого розщепбре відома в даній області техніка, можуть бути лення при жорсткій перевазі залишку застосовані для виділення, ідентифікації і охаракаспарагінової кислоти в положенні Р1 і при достатеризування білка RAP-2 за даним винаходом або тності наявності метиламіну праворуч від сайта PI для виділення, ідентифікації і охарактеризування (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991; Thornberry додаткових білків, чинників, рецепторів і т.п., які et al., 1992). Більш того флуорогенний пептидний здатні зв'язуватися з білками RAP-2 за даним висубстрат, що є тетрапептидом, - ацетил-Аsр-Gluнаходом. Val-Аsр-а-(4-метилкумарил-7-амід), що скорочено Як зазначалось в даному тексті вище, білок позначається як Ac-DEVD-AMC, - відповідає посліRAP-2 може бути використаний для отримання довності полі-АДФ-рибозополімерази (ПРАП), роантитіл, специфічних відносно білків RAP-2, назщеплення якої виявляється в клітинах незабаром приклад, самого RAP-2 і його ізоформ. Такі антитіпісля стимуляції рецептора FAS-R нарівні з іншими ла або їх фрагменти можуть бути використані у процесами апоптозу (Kaufmann, 1989; Kaufmann et відповідності з детально описаним тут далі, і має al., 1993; Lazebnik et al., 1994), при тому, що це бути зрозумілим, що в таких застосуваннях антитірозщеплення ефективно здійснюється з участю ла або їх фрагменти - ті, що специфічні відносно СРР32 (представник родини протеаз CED3/ICE) і білків RAP-2. протеаз МАСH (а також, мабуть, і протеаз G1 Засновуючись на інформації, отриманій відподив., наприклад, тематично пов'язану ізраїльську відно до даного винаходу про те, що RAP-2 спепатентну заявку IL 120367). цифічно зв'язується з RIP і внаслідок цього є медіЗ урахуванням того, що положення Р1 має буатором/модулятором RIP, а, отже, може ти зайнято залишком аспарагінової кислоти, тетопосередковувати/модулювати активність білка рапептиди, що включають в 4-м положенні аспараRIP відносно механізмів запалень, загибелі клітин гінову кислоту і різні поєднання амінокислот в або виживання клітин, при тому, що RIP функціоперших трьох положеннях, можуть бути піддані нує сам по собі або у взаємодії з іншими білками оперативному тестуванню на зв'язування з актив(наприклад, FAS-R, p55-R, MORT-1, МАСИ, Mch4, ним сайтом протеаз із застосуванням, наприклад, G1 і TRADD в механізмах загибелі клітин або з методу, розробленого Гейзеном [Geysen, 1985; TRAF2 в механізмах виживання клітин), важливим Geysen et al., 1987], в якому велике число пептидів є створення лікарських засобів, які можуть посина твердих підкладках аналізують за специфічнилювати або придушувати взаємодію RAP-2/RIP ми взаємодіями з антитілами. Зв'язування протеаз відповідно до бажаного, в залежності від того, які з МАСН зі специфічними пептидами може бути вицих механізмів посилюються/придушують взаємоявлене за допомогою різних методів, добре відодією RAP-2/RIP. Відомо багато захворювань, при мих фахівцям в даній області техніки, таких як раяких такі ліки можуть надати істотну допомогу. діоактивне помічення протеаз G1 і т.п.В даному Серед інших захворювань це гострий гепатит, при методі Гейзена, як було показано, можливе протеякому гострі поразки тканини печінки, як представстувати принаймні 4 тисячі пептидів за один роболяється, відображають загибель печінкових клітин/ чий день. опосередковану лігандом рецептору FAS-R; індуСхожим чином точне положення дільниці зв'якована аутоімунітетом загибель клітин, така як зування або дільниці гомології, яка визначає взаєзагибель β-клітин острівців Лангергансу в підшлунмодію між RAP-2 і RIP, може бути встановлено, ковій залозі, як чинник діабету; загибель клітин при після чого ці пептиди можуть бути протестовані на відторгнені трансплантатів (наприклад, що перепотенційне блокування такої взаємодії, наприклад, саджуваних нирок, серця і печінки); загибель оліпептиди, які синтезовані таким чином, щоб їх посгодендроцитів в головному мозку при розсіяному лідовність характеризувалася схожістю з дільнисклерозі; і придушувана СНІДом, Т-клітинна суїцицею зв'язування або була йому комплементарна, дальність, яка зумовлює відтворення вірусу СНІД, так, щоб забезпечити конкуренцію нативному RAPа, отже, і сам синдром надбаного імунодефіциту. 2 по скріпленню з білком RIP. Можливо, що білок RAP-2 або одна або декіЛіки або пептидні інгібітори, які здатні придулька його ізоформ можуть служити як «природні» шувати запальну активність або активність RAP-2 інгібітори білку RIP в одному або декілька згадувапо загибелі клітин за рахунок придушення взаємоних вище механізмів, а це, отже, можна викорисдії між RAP-2 і RIP, можуть бути сполучені або тати для специфічного придушення RIP, про яке включені до комплексів з молекулами, які полегйшлося вище. Таким же чином інші субстанції, такі шують проникнення всередину клітин. як пептиди, органічні сполуки, антитіла і т.п., мо[У патенті США №5149782] заявляється спо 41 76081 42 лука молекули, яка призначена для перенесення фрагменти, отримані із застосуванням будь-якого через клітинну мембрану, з мембранометоду, такого як, не обмежуючись таким чином, проникаючим агентом, таким як фузогенні поліпекаталітичного розщеплення, пептидного синтезу птиди, поліпептиди, створюючі іонні канали, інші або рекомбінантних методологій. мембранні поліпептиди і жирні кислоти з довгими Поліклональні антитіла являють собою гетероланцюгами, наприклад, міристинова кислота і пагенні популяції молекул імуноглобулинів, похідних льмітинова кислота. Ці мембрано-проникаючі агевід сироватки тварин, імунізованних антигеном. нти вносять молекулярний кон'югат в ліпідний біМоноклональне антитіло включає в істотній мірі шар клітинних мембран і полегшують таким чином гомогенну популяцію антигенних-спепцифічних його попадання до цитоплазми. антитіл, при тому, що ця популяція несе в істотній [У патенті США №5108921, виданому Low et мірі схожі сайти зв'язування епітопа. Моноклонаal.,] узагальнені доступні способи трансмембранльні антитіла можуть бути отримані із застосуванної доставки молекул, таких як, таким чином не ням методів, відомих фахівцям в даній області вичерпуючись, білки і нуклеїнові кислоти, по мехатехніки: див., [наприклад, Kohler & Milstein, 1975, нізму опосередкованого рецепторами ендоцитоза. Nature, 256, 495-497; патент США №4376110; Такі рецепторні системи включають рецептори, що Ausubel et al., цит. вище; Harlow & Lane (eds.), розпізнають галактозу, маннозу, маннозо-61988, «Antibodies: A Laboratory Manual», Cold фосфат, трансферин, асиалогликопротеїн, трансSpring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY; Colligan кобаламін (вітамін В12), α2-макроглобуліни, інсулін і et al. (eds.), 1992-1996, «Current Protocols in інші пептидні чинники зростання, такий як епідерImmunology», Greene Publ. Assoc. and Wiley мальний чинник зростання (EGF). Авторами даноIntersci., NY]: їх повний зміст включений тут для го патенту вказується на те, що харчові рецептори, зведення у вигляді бібліографічних посилань. Такі такі як рецептори біотину і фолатів, можуть бути антитіла можуть бути представлені імуноглобулипереважно використані для інтенсифікації транснами будь-якого класу, включаючи IgG, IgM, IgE, порту через клітинну мембрану, завдяки наявності IgG, GILD або будь-якого їх підкласу. Гібридома, і численності біотинових і фолатних рецепторів на що виробляє mAb за даним винаходом, може куповерхні плазмалеми більшості типів клітин і існультивуватися in vitro, in situ або in vivo. Виробленванням пов'язаних з цими рецепторами трансмемня високих титрів mAb in vivo або in situ робить ці бранних транспортних процесів. Таким чином, варіанти переважними способами їх отримання. комплекс, утворений сполукою, яка призначена Химерні антитіла - це молекули, у яких різні для доставки до цитоплазми, і лігандом, таким як сегменти є похідними від різних видів тваринних, біотин або фолат, контактують з клітинною мемтакі як антитіла, що включають варіабельні домебраною, несучою біотинові або фолатні рецептори ни, похідну від мишачих МАТ, і константний домен з метою ініціації опосередкованого цими рецептоімуноглобуліну людини. Химерні антитіла, насамрами механізму трансмембранного перенесення, перед, використовуються з метою зниження імунотаким чином забезпечуючи проникнення бажаної генності у відповідь на їх застосування і з метою сполуки всередину такої клітини. підвищення рівня їх вироблення, наприклад, тоді, Крім того, в науці відомо, що сполучення баколи мишачі МАТ МАТ-стантний домен імуногложаної пептидної послідовності з лідером (сигнальбуліну людини. Химерні антитіла, насамперед, ним сегментом послідовності) з отриманням «хивикористовуються з метою зниження імуногенності мерного пептиду» зробить можливим у відповідь «мишачо-людські» моноклональні антранспортування такого «химерного пептиду» четитіла. Химерні антитіла і способи їх отримання рез клітинну мембрану з попаданням в цитовідомі в науці [Cabilly et al., 1984, Proc. Natl. Acad. плазму. Sci. USA, 81, 3273-3277; Morrison et al., 1984, Proc. Як має бути зрозумілим фахівцеві в даній обNatl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855; Boulianne et al., ласті техніки, пептидні інгібітори взаємодії RAP1984, Nature, 312, 643-646; Cabilly et al., європей2/RIP відповідно до даного винаходу включають в ська патентна заявка №125023, опублікована 14 себе ліки-пептидомиметики або інгібітори, які талистопада 1984p.; Neuberger et al., 1985, Nature, кож можуть бути оперативно протестовані по їх 314, 268-270; Taniguchi et al., європейська патентскріпленню з протеазою RAP-2/RIP з метою отрина заявка №171496, опублікована 19 лютого мання по можливості найбільш стабільних інгі1985p.: Morrison et al., європейська патентна заявбіторів. ка №173494, опублікована 5 березня 1986p.; Також має бути зрозумілим, що аналогічний Neuberger et al., патентна заявка РСТ 184187, спосіб полегшення або підвищення ефективності опублікована 13 березня 1986p.; Kudo et al., європеренесення пептидних інгібіторів через клітинні пейська патентна заявка №184187, опублікована мембрани відповідно до того, що обговорювався 11 червня 1986p.; Sahagan et al., 1986, J. Immunol, вище, також може застосовуватись відносно самих 137, 1066-1074; Robinson et al., міжнародна патенбілка RAP-2 або його ізоформ, рівно як і інших петна заявка №WO 87/02671, опублікована 7 травня птидів і білків, які виявляють свою дію всередині 1987p.; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA, клітин. 84, 3439-3443; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Що стосується антитіл, що згадуються в даній Sci. USA, 84, 214-218; Better et al., 1988, Science, заявці, то термін «антитіло» покликаний включити 240, 1041-1043; Harlow & Line, «Antibodies: A в себе поліклональні антитіла, моноклональні анLaboratory Manual», цит. Вище]. Повний зміст цих титіла (МАТ), химерні антитіла, антиідіотипіві анпублікацій включений тут для зведення у вигляді титіла до антитіл, які можуть бути помічені в розбібліографічних посилань. чинній або пов'язаній формі, рівно як і їх Антиідіотипове антитіло - антитіло, яке розпі 43 76081 44 знає унікальні епітопи, в принципі, асоційовані з зв'язуватися» з молекулою тоді, коли воно здатне антигенним-зв'язуючим сайтом антитіла. Антиідіоспецифічним чином реагувати з даною молекулою типове антитіло може бути отримане шляхом імутак, щоб зв'язувати цю молекулу і це антитіло. нізації тваринного того ж виду і генетичного типу Термін «епітоп» позначає ту дільницю будь-якої (наприклад, інбредної лінії мишей) по відношенню молекули, яка може бути пов'язана антитілом і яка до джерела даного моноклонального антитіла, до також може бути розпізнана таким антитілом. Епіякого має бути отримане антиідіотипове антитіло. топи, також звані «антигенними детермінантами», Імунізована тварина буде розпізнавати і реагувати звичайно включають хімічно активні поверхневі на ідіотипові детермінанти імунізуючого антитіла з угрупування молекул, таких як амінокислот або виробленням антитіла, специфічного у відношенні бічних ланцюгів вуглеводів, і характеризуються цих ідіотипів (тобто антиідіотипове антитіло): [див., специфічною просторовою структурою, рівно як наприклад, патент США №4699880], який включехарактерними параметрами електричного заряду. но тут для зведення у вигляді бібліографічного Термін «антиген» - це молекула або частина посилання. молекули, здатна бути пов'язаною антитілом, яка Саме антиідіотипове антитіло може бути викододатково здатна індукувати вироблення у тваристане в якості «імуногена» з метою індукції імуринного антитіла, здатного зв'язуватися з епітопом нної відповіді ще у однієї тварини з отриманням даного антигену. Антигенний може включати один т.з. «анти-антиідіотипівого антитіла». Антиабо більше одного епітопи. У зв'язку з названим антиідіотипіве антитіло може бути по епітопам вище «специфічне реагування» позначає те, що ідентично початковому МАТ, яке було індуктором антигенний буде реагувати у високо вибірковій антиідіотипівого антитіла. Отже, з використанням манері з відповідним антитілом, але не з безліччю антитіл до ідіотипівих детермінантів МАТ можлиінших антитіл, які можуть бути ініційовані іншими вим стає ідентифікувати інші клони, експресуючі антигенами. антитіла, що характеризуються ідентичною спеАнтитіла, включаючи фрагменти антитіл, зацифічністю. стосовні за даним винаходом, можуть бути викоТаким чином, моноклональні антитіла, сфорристані для якісної або кількісної детекції білка мовані до білків RAP-2, його аналогів, фрагментів RAP-2 в зразку або для виявлення присутності або похідних за даним винаходом, можуть бути клітин, яких експресують білок RAP-2 за даним використані для індукції антиідіотипівих антитіл у винаходом. Це може бути здійснено із застосуванвідповідних тваринах, таких як миші лінії BALB/c. ням імунофлуоресцентних методів, заснованих на Клітини селезінки таких імунізованих мишей викофлуоресцентному поміченні антитіл (див. далі) і ристовуються для вироблення антиідіотипівих гібметодах детекції на світловому мікроскопі, з допоридом, секретуючих антиідіотипіві МАТ. Далі, антимогою проточної цитометрії або флуорометрії. ідіотипіві моноклональні антитіла можуть бути Антитіла або їх фрагменти, застосовні відповісполучені з носієм, таким як гемоцианін молюска дно до даного винаходу, можуть бути використані (KLH), і використані для імунізації мишей BALB/c гістологічно при проведенні імунофлуоресцентної додатково. Сироватка таких мишей будуть містити або імуноелектронної мікроскопії для детекції in анти-антиідіотипіві антитіла, які характеризуються situ білка RAP-2 за даним винаходом. Детекція in зв'язуючими властивостями з початковими МАТ, situ може бути здійснена шляхом взяття гістологічспецифічними відносно епітопа названих вищим ної проби від пацієнта і накладення на отриманий за білок RAP-2 або його аналоги/ фрагментів і позразок поміченого антитіла за даним винаходом. хідних. Антитіло (або фрагмент) переважно наносять Таким чином, антиідіотипіві моноклональні аншляхом накриття біологічного зразка поміченим титіла мають свої власні ідіотипові епітопи - «ідіантитілом (або фрагментом). За допомогою викоотопи», - структурно схожі з епітопом, що оцінюристання такої процедури можливим є визначити ється, таким як GRB білка-А. не тільки присутність білка RAP-2, але і його розТермін «антитіло» також покликаний включити поділ в тканині, що аналізується. На основі даного і інтактні молекули, і їх фрагменти, такі як, напривинаходу фахівець в даній області техніки легко клад. Fab і F(ab')2, які здатні зв'язувати антигенний. зможе зрозуміти, що будь-який з широкого кола Фрагменти Fab і F(ab')2 позбавлені Fc-фрагмента гістологічних методів (таких як процедури фарбузі складу інтактного антитіла, легше виділяються з вання.) можуть бути модифіковані з метою забезкровотоку і можуть виявляти менший рівень непечення даної детекції in situ. специфічного зв'язування в порівнянні з інтактним Дані тести на виявлення білка RAP-2 за даним антитілом (Wahl et al., 1983, J.Nucl. Med., 24, 316винаходом звичайно включають інкубацію біологі325). чного зразка, такого як біологічна рідина, тканинМає бути зрозумілим, що Fab і F(ab')2, і інші ний екстракт, свіже зібрані клітини, такі як лімфофрагменти антитіл, застосовні відповідно до даноцити або лейкоцити, або клітини, які були го винаходу, можуть бути використані для детекції проінкубовані в культурі, в присутність виявляєтьі кількісного аналізу білка RAP-2 відповідно до меся поміченого антитіла, здатного ідентифікувати тодів, заявлених тут для інтактних молекул антибілок RAP-2, з подальшим виявленням даного антіл. Такі фрагменти звичайно отримують шляхом титіла із застосуванням будь-кого з методів, добре протеолітичного розщеплення із застосуванням відомих в даній області техніки. таких ферментів, як папаїн (для отримання фрагБіологічний зразок може бути оброблений ментів Fab) або пепсин (для отримання фрагментвердо фазною підкладкою або носієм, такою як тів F(ab')2. нітроцелюлоза, або іншими твердими підкладками Про антитіло говориться, що воно «здібно або носіями, які здатні іммобілізувати клітини, клі 45 76081 46 тинні частки або розчинні білки. Підкладка або могою колориметричних методів, в яких для даноносій можуть потім бути промиті відповідними буго ферменту використовується хромогенний субферами з подальшою обробкою виявляється пострат. Також детекція може бути здійснена шляміченим антитілом відповідно до даного винаходу, хом візуального порівняння міри каталітичної як це відзначалося вище. Твердо фазна підкладка реакції субстрату в порівнянні зі стандартами, приабо носій можуть бути потім промиті буфером у готованими аналогічним чином. другий раз з метою видалення незв'язаного антиДетекція може бути здійснена з використанням тіла. Кількість пов'язаної мітки на згаданій твердій будь-якого з інших імунологічний тестів. Наприпідкладці або носії потім може бути визначена із клад, за допомогою радіоактивного помічення анзастосуванням стандартних методів. титіл або фрагментів антитіл можливим є виявПід «твердо фазною підкладкою», «твердо лення RPTP-ази шляхом використання фазним носієм», «твердою підкладкою», «твердим радіоімунотестування (RIA). Докладний опис меносієм», «підкладкою» або «носієм» розуміється тоду RIA може бути знайдений в лабораторії будь-яка підкладка або носій, здатні зв'язувати Laboratory Techniques & Biochemistry in Molecular антигени або антитіла. Добре відомі підкладки або Biology, виконане T.S.Work et al., 1978, North носії включають скло, полістирен, поліпропилен, Holland Publ. Co. з конкретним відсиланням до поліетилен, декстрин, нілонамілазу, природну і розділу «An Introduction to Radioimmune Assay and модифіковану целюлозу, поліакриламіди, габро і Related Techniques», написаного T.Chard: включемагнетит. За своєю природою такий носій може но тут для зведення у вигляді бібліографічного бути розчинним в деякій мірі або нерозчинним посилання. Радіоактивний ізотоп може бути детекзовсім, виходячи з цілей даного винаходу. Матерітовано за допомогою таких способів, як викорисал підкладки віртуально може характеризуватися тання лічильнику сцинтиляцій, або авторадіограбудь-який структурної конфігурацією, лише б зв'яфічно. зана на ньому молекула була здатна зв'язуватися Також можливим є помічені антитіла відповідз антигеном або антитілом. Таким чином, форма но до даного винаходу з використанням флуореспідкладки або носія може бути сферичною, як у центної сполуки. Коли флуоресцентно помічене кульки, циліндричної, як внутрішня поверхня проантитіло опромінюють при необхідній довжині хвибірки або зовнішня поверхня палички. З іншого лі, то його присутність визначається завдяки флубоку, поверхня може бути плоскою, такою як у оресценції. Серед найчастіше застосовуваних пластинки, тест-смужки і т.п.Переважними підклафлуоресцентних мітячих сполук - флуоресцеїну дками або носіями є полістиролові кульки. Фахівізотіоцианат, родамін, фікоеритрин, пікоцианін, цеві в даній області техніки мають бути відомі і алофікоцианін, о-фталевийальдегід і флуорескаінші відповідні носії для зв'язування на них антитімін. ла або антигену або вони можуть підібрати їх за Також антитіло може бути виявлено помічено допомогою рутинних експериментів. з використанням емітуючих металів, таких як ізоАктивність по зв'язуванню даного набору антоп 125Ε або інші лантаноїди. Ці метали можуть титіл за даним винаходом, як вони описувалися бути приєднані до антитіла за допомогою групвище, може бути визначена відповідно до добре хелаторів таких металів, таких як диетилентриамівідомих процедур. Фахівці в даній області техніки нпентаоцтова кислота (ЕТРА). зможуть визначити оперативний і оптимальний Також антитіло може бути помічено шляхом тест для кожного такого тестування із застосуванйого сполучення з хемолюмінесцентною сполукою. ням рутинного експериментування. Присутність хемолюмінесцентно поміченого антиІнші етапи, такі як промивка, перемішування, тіла потім визначають по виявленню присутності струшування, фільтрування і подібне можуть бути люмінесценції, яка спостерігається в ході хімічної включені в дані тести в залежності від бажаності реакції. Прикладами конкретно застосовуваних або необхідності виходячи з конкретної ситуації. хелюмінесцируючих мітячих сполук є люмінол, Одним із шляхів, по якому антитіло за даним ізолюмінол, тероматичний ефір акридинію, імідавинаходом може бути, виявлено помічено, є зв'язол, солі акридинію і щавлевий ефір. зування його з ферментом із застосуванням його в Також біолюмінесцентна сполука може бути ферментному імунотестуванні (Е1А). У свою чергу, використана для помічення антитіла за даним виданий фермент, після того як він буде оброблений находом. Біолюмінесценція - це форма хемолюмівідповідним субстратом, буде реагувати з цим несценції, що має місце в біологічних системах, в субстратом таким чином, що утвориться хімічна яких маючи каталітичні властивості білки підвискладова, яка може бути детектована, наприклад, щують ефективність реакції хемолюмінесценції. спектрометрично, флуорометрично або візуально. Присутність біолюмінесцентного білку визначаєтьФерментами, які можуть бути використані для пося шляхом виявлення присутності люмінесценції. мічення, антитіл що виявляються, є, таким чином Важливими біолюмінесцентними сполуками, прине вичерпуючись, малатдегідрогеназа, нуклеаза датними для цілей помічення, є люциферин, люцифераза і екворин. стафілококку, ізомераза 5-стероїдів, алкогольдеМолекула антитіла за даним винаходом може гідрогеназа дріжджів, αбути адаптована для застосування в імунометричгліцерофосфатдегідрогеназа, триозофосфатізоному тесті, також відомому як «двохсайтовий мераза, пероксидаза хріну, лужна фосфатаза, астест» або «сендвічтест». У типовому імунометричпарагіназа, глюкозоксидаза, β-галактозидаза, риному тесті деяка кількість непоміченого антитіла бонуклеаза, уреаза, каталаза, глюкозо-6(або фрагмента антитіла) зв'язується з твердою фосфатдегідрогеназа, глюкоамілаза і ацетилхоліпідкладкою або носієм, а деяка кількість поміченонестераза. Детекція може бути здійснена за допо 47 76081 48 го розчинного антитіла, що виявляється додається ги і фрагменти даних білків, а трансформовані так, щоб забезпечити виявлення і (або) кількісне організми-господарі включають тих, які вироблявизначення потрійного комплексу, що утворюється ють такі аналоги і фрагменти. Похідні цих білків, твердо фазним антитілом, антигеном і поміченим що виробляються даними трансформованими орантитілом. ганізмами-господарями, є похідними, що отримуЗвичайні і в той же час переважні імунометриються за допомогою стандартних модифікацій чні тести включають «форвард-тести», в яких анбілків або їх аналогів або фрагментів. титіло, зв'язане на твердій підкладці, спочатку конТакож даний винахід стосується фармацевтитактують із зразком, що тестується на предмет чних композицій, що містять рекомбінантні вектори екстракції антигену з даного зразку шляхом утвона основі вірусів тварин, кодуючи білки RAP-2, при рення подвійного комплексу «антиген-антитіло» в тому, що такий вектор також кодує поверхневий твердій фазі. Після відповідного періоду інкубації вірусний білок, здатний зв'язуватися зі специфічтверду підкладку або носій промивають з метою ними поверхневими білками клітини-мішені (навидалення залишку рідкого зразка, що включає приклад, пухлинних клітин), що забезпечує вненепрореагувавший антиген, якщо він там є, і потім сення послідовностей білка RAP-2 всередину цих контактують з розчином, що містить невідому кільклітин. Додатково фармацевтичні композиції за кість поміченого антитіла (яке є «репортерною даним винаходом містять як активний компонент молекулою»). Після другого періоду інкубації, не(а) олігонуклеотидну послідовність, що кодує прообхідного для з'єднання поміченого антитіла з тисмислову послідовність по відношенню до поскомплексом з антигеном, пов'язаним на твердій лідовності гену RAP-2, або (b) лікарські засоби, які підкладці або носії через непомічене антитіло, блокують взаємодію RAP-2/RIP. тверду підкладку або носій промивають вдруге з Фармацевтичні композиції відповідно до данометою видалення непрореагувавшого поміченого го винаходу містять кількість активного компоненантитіла. ту, достатню для досягнення поставленої задачі. В іншому варіанті «сендвіч-тесту», який також Крім того, фармацевтичні композиції можуть місможе бути застосований з у відношенні антигенів тити відповідні фармацевтично прийнятні носії, за даним винаходом, використовуються так звані включаючи наповнювачі і добавки, які полегшують «одночасні» і «реверсні» тести. «Одночасний перетворення активних сполук в препарати, які тест» включає єдиний етап інкубації, в якому антиможуть бути використані фармацевтично, і які мотіло, пов'язане на твердій підкладці або носії, і жуть стабілізувати такі препарати з точки зору їх помічене антитіло додають до зразку, який має введення пацієнтові у разі необхідності цього, що бути протестовано, в один і той же час. По завердобре відомо фахівцям в даній області техніки. шенні інкубації тверду підкладку або носій промиБілок RAP-2 і його ізоформи або ізотипи, як вають з метою видалення залишку рідкого зразка і передбачається, експресуються в різних тканинах поміченого антитіла, що не ввійшло до комплексу. на рівні, що виразно розрізнюється і, мабуть, таПрисутність поміченого антитіла, асоційованого з кож з різним складом ізотипів аналогічно з паратвердою підкладкою або носієм, потім визначають, метрами експресії різних інших білків, що беруть як і в звичайному «форвард-сендвіч-тесті». участь у внутрішньоклітинних сигнальних механізУ «реверсному тесті» застосовується послідомах, що обговорюється в тематично пов'язаних вне додавання спочатку розчину поміченого антипатентних заявках, що називалися вище. Ці відтіла до рідкого зразка з подальшим додаванням мінності, як передбачається, можуть визначати непоміченого антитіла, пов'язаного з твердою підвідмінності у відповідях різних тканин на ліганд кладкою або носієм після відповідного часу інкуFas/APO1 і TNF. Як і у випадку з іншими бації. Після другої інкубації тверду фазу промиваCEDC/ICE-гомологами [Wang et al., 1994; Ainemri ють стандартним чином для звільнення її від et al., 1995], заявники даного винаходу раніше позалишку тестованого зразка і розчину непрореагуказали (в згадуваних вище патентних заявках), що вавшого поміченого антитіла. Потім визначення ізоформи МАСН, які включають сегменти неповної поміченого антитіла, асоційованого з твердою підгомології з CED3/ICE (наприклад, МАСНαС), як кладкою або носієм, проводять так само, як в «одбуло показано, мать інгібіторний вплив на активночасному» і «форвард» тестах. ність одночасно експресованих молекул МАСНα1 Білки RAP-2 за даним винаходом можуть бути або МАСНα2; також вони блокують загибель кліотримані за допомогою будь-якої стандартної метин, що індукується рецепторами Fas/-APO1 і p55тодики рекомбінантної ДНК [див., наприклад, R. Експресія таких ізоформ-інгібіторів в клітинах Sambrook et al., 1989 і Ausubel et al., 1987-1995, може брати участь в механізмі клітинного самозацит. Вище], в яких відповідні еукаріотичні або прохисту від цитотоксичності, опосередкованої каріотичні клітини-господарі, добре відомі, в даній Fas/APO1 і TNF. Схожий ефект інгібіювання приобласті техніки, трансформують з використанням наймні деяких ізоформ протеази G1 також передвідповідних еукаріотичних або прокаріотичних векбачається (G1 - недавно виділений новий Mch4- і торів, що включають послідовності, що кодують вірогідно МАСН-зв'язуючий білок, а також, MORT1білки. Відповідно, даний винахід також стосується зв'язуючийся білок, в складі якого є «MORTтаких експресуючих векторів і трансформованих домен» і протеазний домен: [див. тематично пов'яорганізмів-господарів для цілей вироблення білків зану ізраїльську патентну заявку IL 120367]). Значза даним винаходом. Як відзначалося вище, ці на різнорідність ізоформ МАСН, а також передбабілки також включають біологічно активні аналоги, чувана так же істотна гетерогенність ізоформ G1, фрагменти і похідні, а, отже, вектори, їх що кодуякі значною мірою перевершують такі, відомі для ють, також включають вектори, що кодують аналоінших представників протеазної родини CED3/ICE, 49 76081 50 повинна забезпечувати тонку настройку функцій 119133 і у Malinin et al., 1997]. активних ізоформ МАСН, а аналогічно - і активних Приклад 1 ізоформ G1. Отже, як відзначалося вище, білки Клонування і виділення білка RAP-2, який зв'яRAP-2 і його вірогідні ізоформи можуть мати дизується з білком RIP ференційовані ефекти в різних тканинах з точки Двохгібридний скрінінг, секвенування і попезору їх взаємодії з білком RIP і таким чином вплиредній аналіз вом на баланс між механізмами активації загибелі Із застосуванням двохгібридного скрінінгу з виклітин або виживання клітин, про які говорилося користанням як «наживки» білка RIP [див., напривище. клад. Fields & Song, 1989, міжнародна патентна Також є можливим, що деякі з вірогідних ізозаявка WO 96/18641] в бібліотеці В-лімфоцитів форм RAP-2 виконують відмінні функції. Наприбуло виділено клон розміром приблизно 1500 пар клад, сам білок RAP-2 або деякі ізоформи RAP-2 нуклеотидів. Цей 1500-нуклеотидний клон (див. також можуть виконувати роль «депо»-сайтів для стрілку на Фіг.1 і 2) використали для скрінінгу фамолекул, які беруть участь в інших, не пов'язаних з гової бібліотеки кДНК, отримавши в результаті цитотоксичністю, виявах рецепторів Fas/APO1 і клон довжиною приблизно 2000 пар нуклеотидів, TNF через взаємодію з білком RIP або навіть ненуклеотидна послідовність якого показана на Фіг.1. залежно від RIP. Шляхом зіставлення EST-маркерів з послідовЗавдяки унікальній здатності рецепторів ністю 1500-нуклеотидного клону було виділено Fas/APO1 і TNF зумовлювати запалення, загибель EST-фрагмент, який представляв 3'-кінець елеклітин, рівно як і здібності рецепторів TNF зумовмент I.M.A.G.E. клону №41072 (Research Genet. лювати іншу активність по пошкодженню тканин, Inst). Зі складу цього клону, що походить з бібліопорушення функцій цих рецепторів може, зокрема, теки плідного головного мозку, були опубліковані мати негативні наслідки для організму. Дійсно, і раніше тільки невеликі 3'- і 5'-кінцеві фрагменти надмірні, і дефектні функції цих рецепторів, як послідовностей. Після виділення цього клону його було показано, беруть участь в патогенезі різних було секвеновано, і було з'ясовано, що навіть незахворювань (Vassalli, 1992; Nagata & Golstein, великі опубліковані дільниці містили помилки. Як 1995). Ідентифікація молекул, які беруть участь в було встановлено, секвенований клон (Фіг.2) був сигнальній активності рецепторів і виявлення шляідентичним клону, показаному на Фіг.1, по його хів модулювання активності таких молекул може кодуючій дільниці, але характеризувався відміннодозволити знайти нові терапевтичні підходи. Інші стями по 5'-некодуючому сегменту. Таким чином, аспекти даного винаходу будуть зрозумілі з навебуло передбачено, що обидві ці кДНК являють дених нижче прикладів. собою продукти альтернативного сплайсінга транТепер даний винахід буде більш детально скрипту одного і того ж гену. охарактеризований за допомогою наведених нижАналіз даної нуклеотидної послідовності покаче прикладів, що не є обмежуючими в будь-чому, і зує, що, як і білок RAP, білок RAP-2, мабуть, не супроводжуючих креслень. має «домену загибелі» в своєму складі, не має т.з. Необхідно зазначити, що наступні процедури: «MORT-модулю», не має протеазного домену, (1) двохгібридний скрінінг і двохгібридний тест характерного для членів родини ICE, не має кіназна експресію β-галактозидази; (2) індукована ексного домену, а також не включає «TRAF-доменів» пресія, метаболічне помічення і імунопреципітація (див. тематично родинні патентні заявки, що прибілків; (3) зв'язування in vitro; (4) оцінка цитотоксиводилися вище і різні бібліографічні посилання, чності; і (5) Нозерн-блотинг і секвенування (див. зокрема, на роботу Malinin et al., 1997, в зв'язку з також Boldin et al., 1995b) 2, 3 (див. також Boldin et роллю різних доменів у внутрішньоклітинних сигal., 1996) і 4, див. нижче, по відношенню до MORTнальних механізмах). У складі даної послідовності 1 і MORT1-зв'язуючому білка (наприклад, білка не було виявлено будь-скільки значущих доменів, МАСН), рівно як і нового виділеного білка G1 [див. за винятком трьох мотивів типу «лейцинової блисзаявку IL 120367], - в однаковій мірі застосовні (з кавки» - подібні блоки рівномірно розподілені по невеликими модифікаціями) для відповідного видовжині кодуючої білок послідовності. Ці домени ділення, клонування і охарактеризування білка названі «подібними» «лейциновим блискавкам» RAP-2 і його вірогідних ізоформ за даним винахотому, що в двох з них є заміни лейцину на валін, дом. Отже, ці процедури можуть бути витлумачені, метіонін або ізолейцин. Оскільки звичайно ці дояк повне представлення таких процедур, що викомени високо консервативні, доки незрозуміло, чи ристовуються для виділення, клонування і охаракзберігають білку такі зміни в складі «лейцинових теризування RAP-2 відповідно до даного винахоблискавок» його функціональну активність, а саме ду, що детально описано, наприклад, в такій же зв'язування з іншими «лейциновими блискавкаабо еквівалентній формах в тематично пов'язаних ми». Аналіз на зв'язування показав, що RAP-2 в [ізраїльських патентних заявках №№114615, істотній мірі зв'язується з RIP, але RAP-2 не здат114986, 115319, 116588, 117932 і 120367, рівно як і ний зв'язуватися з білками TRADD, MORT-1, p55відповідній заявці РСТ №PCT/US 96/10521]. Далі, R, p74-R і МАСН (в об'ємі досліджень, проведених що стосується білка NIK і його ролі в активації до теперішнього часу). Отримані результати підтчинника NF-KB, а, отже, і виживання клітин, а таверджують той факт, що RAP-2, мабуть, позбавкож ролі TRAF2 в цьому механізмі виживання клілений «доменів загибелі» і «MORT-модулів». тин, наприклад, за рахунок взаємодії між TRAF2 і Отже, вважається, що RAP-2 є вузькоспецифіRIP і іншими білками, то вони детально описані чним RIP-зв'язуючим білком, який взаємозаявниками даного винаходу в тематично пов'язадіє/зв'язується з білком RIP дуже специфічним них [ізраїльських патентних заявках IL 117800 і IL чином. Таким чином, RAP-2, мабуть, є специфіч 51 76081 52 ним модулятором/медіатором внутрішньоклітинної кінцевої частини цих білків, досягаючи віртуальної активності RIP, що грає важливу роль в модуляідентичності по С-кінцевих 30 амінокислотах. Зації/опосередкуванні за участю RIP механізмів заслуговує уваги і те, що, крім, останньої дільниці, палень, загибелі клітин і виживання клітин. передбачуваний мотив типу «лейцинової блискавКоротко, клон RAP-2 було отримано в процеки» в складі FIP-2 в істотній мірі консервативний і в дурі двохгібридного скрінінгу бібліотеки кДНК ВRAP-2 (за винятком амінокислотної заміни ізолейклітин людини з використанням як «наживки» повцину на аланін). но розмірного білка RIP. Послідовність RIP була Додатково також, була ідентифікована більш взята з попередніх публікацій (наприклад, Stanger коротка кДНК RAP-2 довжиною 500 пар нуклеотиet al., 1995), як депонована в базу даних GenBank дів (ID 1469996), яка була позначена як Human під №U-25994, яка є послідовністю RIP людини shrt. Цей варіант включав в себе «блоки» кодуючої (також під №U-25995 присутня послідовність білка послідовності, що відбуваються від різних роз'єдRIP миші). На основі цієї інформації про послідовнаних дільниць «повною» кДНК довжиною 1500 ності затравки для ПЛР були сконструйовані за пар нуклеотидів, механізм виникнення яких, мадопомогою програмного продукту OLIG04™, а буть, пов'язаний з альтернативним сплайсінгном фрагмент ДНК, відповідний кодуючій частині гену одного і того ж гену. RIP, був отриманий з допомогою ПЛР з викорисАналіз методом Нозерн-блотингу з реактивами танням як матриці кДНК, отриманої на матеріалі Multiple Tissue Northern blot (Clontech) з BglIIтотальної РНК бібліотеки фібробластів людини (за фрагментом довжиною 900 пар нуклеотидів кДНК допомогою стандартних процедур). Ця кодуюча RAP-2 підтвердив комплексний характер мРНК дільниця RIP потім була клонована до складу векRAP-2. Принаймні 5 диференційованих мРНК довтору pGBT-9 (Clontech) і використана як «наживка» жиною від менше за 1000 нуклеотидів до більше відповідно до того, що відмічалося вище для двохніж 7 тисяч нуклеотидів були виявлені при більш гібридної тест-процедури. При такому двохгібридабо менш постійному домінуванні варіантів довному скрінінзі було виділено клон, що кодує, RIPжиною 2500 і 6500 нуклеотидів (Фіг.4А). зв'язуючийся білок, який взаємодіє з RIP. Приклад 2 Цей клон, як зазначено вище, був використаІдентифікація RAP-2 миші ний для скрінінга фагової бібліотеки кДНК і бази Схожий пошук в колекції маркерів EST, сфорданих по маркерах EST. Як можна бачити з Фіг.1 і мованій в TIGR, дозволив виділити часткову кДНК 2, кодуючи послідовності двох клонів ідентичні, в довжиною 1600 нуклеотидів (Mouse part, ID той час як 5'-некодуючі дільниці розрізнюються. 761011; Фіг.3), яка приблизно відповідає RAP-2 Таким чином, передбачається, що вони є формамиші, оскільки вона віртуально ідентична (95%) ми, що утворюються в результаті альтернативного гомологічній послідовності людини по кодуючому сплайсінгу. Довжина клонів становить приблизно сегменту (див. Фіг.3). 2000 пар нуклеотидів, на частку ORF (відкритої Проте відмінності між послідовностями RAP-2 і кодуючої рамки) доводиться приблизно 1500 пар NEMO людини і миші перевищують той рівень, нуклеотидів, а розрахункова молекулярна маса який може бути прийнятий для нормального міжбілка, що кодується ними становить приблизно видового диференціювання. Дійсно, проміжний 50кД. Розшифрована амінокислотна послідовність блок з 7 амінокислот (249-е положення в 20.4) в білка RAP-2 показана на Фіг.3. послідовності RAP-2 миші і в послідовності NEMO і Аналіз вказаних вище послідовностей клону вставка 3 амінокислот (KLE в 111-м положенні) в RAP-2 і послідовностей в базі даних «dbest», базі кодуючій рамці послідовності NEMO в порівнянні з даних проекту «Геном людини» (level 1) і базі даповно розмірним варіантом людини і з частковою них GenBank показав, що послідовність RAP-2 є послідовністю миші є лише найбільш виразними унікальною (новою) послідовністю, тому що жодна прикладами відмінностей (Фіг.3). Однак, це може з відомих послідовностей не виявила будь-якої бути результатом відображень функціональної істотної гомології з цією послідовністю RAP-2. Пісактивності даного білка. Функціональні властивосля подачі [ізраїльської патентної заявки IL 123758], ті, дійсно підтверджені для білка NEMO, мабуть, пріоритет якої підтримується справжньою заявкою, протилежні таким у RAP-2 людини, хоч повідомлеЯмаокой із співавт. (Yamaoka et al., 1998) було ні результати фракційного аналізу NEMO підтверповідомлено про характеристику мишачої кДНК, джують його локалізацію в зв'язку з «сигналосощо кодує білок з молекулярною масою 48кД, який мою». був позначений як NEMO (функціональний модуПриклад 3 лятор чинника NF-KB) (див. розділ «Передумови Зв'язування RIP з RAP-2 в клітинах ссавців для винаходу»). Подальше підтвердження фізіологічного знаДодаткові пошуки в базах даних (in silico) дочення взаємодії RAP-2/RIP було отримане в транзволили ідентифікувати білок FIP-2 - білок з невісіфкованих клітинах ліній НЕК-293Т і HeLa. Дійсно, домими функціями, початково клонований Лі із ці два білки можуть бути легко копреципітовани з співавт. [Y.Li et al., 1998: див. розділ «Передумови клітинних лізатів клітин НЕК-293Т (АТСС №CRLдля винаходу»]. 1573), трансіфкованих так, як це вказано нижче за Як можна бачити з повно розмірного зіставкожну доріжку на Фіг.4В, і імунопреципітованих з лення послідовностей RAP-2 і FIP-2 (Фіг.3В), міра анти-FLAG моноклональним антитілом (Kodak). загальної схожості вельми низька (тому не дивно, Потім імунокомплекси аналізували на присутність що ця послідовність не була знайдена при викорив них HIS/RAP-2 із застосуванням стандартного станні загальних алгоритмів такого скрінінгу). ГоВестерн-блотингу з використанням антитіла до мологія між RAP-2 і FIP-2 зростає у напрямі до Сгексагістидину (Sigma) (Фіг.4В, а також дані не 53 76081 54 включені). Однак, утворення такого комплексу не те, що принаймні частково активність даного білка зумовлює каталітичної активності RIP: в тій мірі, в повинна бути загальною для різних, іншими слоякій можна судити за даними тесту на кіназну аквами диверговавших, сигнальних механізмів (див. тивність імунокомплексів in vitro, над-експресія RIP далі). В той же час КВ-незалежна (раннім промоне призводить до фосфорилювання білка RAP-2 тором, що контролюється CaMV) транскрипція (дані не показані). люциферази не порушується (Фіг.5А): отже, можна Тести на зв'язування були проведені з метою вважати підтвердженою загальну неузгодженість визначення того, чи зв'язується RAP-2 з будь-яким базового механізму транскрипції/трансляції з учасз інших відомих внутрішньоклітинних сигнальних тю RAP-2. Ці результати були після цього підтвербілків. У цих тестах білки TRADD, MORT-1, p55-R, джені в аналізі на клітинах лінії HeLa (дані не p75-R, МАСH були протестовані на їх здатність включені). зв'язуватися з білком RAP-2. Однак, було встановОднак, в ході проведення подальших тестів лено, що RAP-2 не здатний зв'язуватися ні з одним було встановлено, що дане явище виявляється ще з цих білків. Також RAP-2 не зв'язується з будьбільш складним. Дійсно, коли TRAF2 був по типу, яким з тестованих контрольних білків, наприклад, з що перемежається, експресовано в клітинах HEKламіном і циклином-D. 293T нарівні з різною кількістю pcRAP-2, що відоВсі приведені вище результати, таким чином, бражено на Фіг.6, активність RAP-2 різко змінювавказують на те, що новий білок RAP-2, мабуть, лася при його низьких концентраціях (приблизно взаємодіє з RIP по високо специфічному типу, а 20нг на 1млн. клітин), посилюючи ефект TRAF2/раз так, то він є високо специфічним модулятоNF-KB- транскрипції (див. Фіг.6А). Більш того шляром/медіатором RIP. хом заміни початкової вставки на вставку в протиПриклад 4 лежній орієнтації був отриманий ефективний носій, Взаємодія RAP-2 з NIK і модуляція ним трансекспресуючий протисмислову послідовність RAPкрипції, Контрольованої NF-KB і c-Jun 2, і TRAF2 по типу, що перемежається трансфікоХоч при проведенні двохгібридних дріжджових вали в клітини НЕК-293Т нарівні з різними конкретестів не було взаємодії RAP-2/NIK (див. вище), тними кількостями конструкції pcRAP-2-a/s (протиексперименти по трансфекції клітин НЕК-293Т смислова): був проаналізований ефект ссавця показали стабільне утворення такого компрогресуючого зникнення RAP-2, на основі чого плексу. Взаємодія RAP-2/NIK була виявлена відбула вистроєна діаграма залежності від концентповідно до описаного в прикладі 3, за винятком рації. Загальна тенденція даного графіка вказує на того, що анти-FLAG антитіла були використані в те, що рівень реакції клітин, загалом, зворотно методі Вестерн-блотингу з подальшою імунопрепропорційний кількості трансфікованої ДНК RAP-2, ципітацією з антитілами до гексагістидину (Фіг.4С). за винятком характерної дільниці, яка знаходиться Така невідповідність між параметрами зв'язування в своєрідній «нульовій точці», відповідній номінав дріжджових клітинах і клітинах ссавця не була льному (базовому) ендогенному рівню даного білдивною, оскільки повно розмірна NIK має тенденка (Фіг.6). Треба зазначити, що негативна регуляцію втрачати свої зв'язуючі властивості у випадку ція експресії даного гену шляхом внесення експресування в клітинах дріжджів. протисмислової послідовності приблизно є більш З точки зору того факту, що in vivo і RIP, і NIK, тонкою, в протилежність смисловий надекспресії. як передбачається, є обов'язковими медіаторами Дійсно, протисмислова конструкція не зумовлює TNF-індукованої активації транскрипційного чинништучне вироблення якого-небудь чужорідного білка NF-KB, заявники вивчали те, чи здатна надмірка в даній клітині, а, отже, забезпечує виразну нена експресія RAP-2 в клітинній культурі взаємодіядолік інгібїторної здатності RAP-2, Проте, необхідти з цим конкретному сигнальним механізмом. но зазначити, що згадуваний вище «стрибок» Початковий набір експериментів був проведений низьких концентрацій відображений, не будучи на клітинах НЕК-293Т, по непостійному типу транрозгорненим, в «протисмисловій половині» графіку сіфкованих репортерними плазмідами,, що вклю(Фіг.6). чають ген люциферази, що знаходиться під контДля оцінки різноманітності транскрипциійних ролем мінімального промотору HIV-LTR. У систем, в які може бути залучений RAP-2, був проблизькому наборі, в якому було встановлено, що ведений аналіз чинника c-Jun - ядерного чинника, RAP-2 зазнає негативної регуляції, який повертароль якого в забезпеченні і підтримці адекватної ється майже на початковий рівень, активація ререакції на стреси, як підтверджується, виявляється портера зумовлювалась і надекспресією різних такий же, як і роль NF-KB. З використанням комвідомих індукторів NF-KB, залучених до сигнальпонентів комерційної системи «Path Detect» ного шляху TNF (NIK, TRAF2, RIP і інш.), і оброб(Stratagene) була підтверджена аналогічна «двохкою клітин зовнішніми стимулами (TNF і РМА: фазність» RAP-2 відносно деяких розпізнавальних Фіг.5А). Клітини НЕК-293Т були по непостійному активаторів АР-1 в клітинах НЕК-293Т і HeLa (див. типу трансфіковани репортерною плазмідою (акФіг.5У і 6В). тиваційний тести з HIV-LTR-Luc або CMV-Luc для Приклад 5 NF-KB - 5А; і GAL4-Luc для c-Jun - 5В) і експресуЗумовлення білком RAP-2 гіперфосфорилюючим вектором для конкретного індуктора, а також вання c-Jun без зміни активності JNK або пустим носієм (pcDNA3), або плазмідою, що Для аналізу механізму, що визначає даний іскодує повно розмірний білок RAP-2 (pcRAP-2). тотний вплив на транскрипцію важливим було виТреба зазначити, що той факт, що RAP-2 здатний значити точний рівень, на якому нормальний сигвиявляти свої ефекти на такому далекому етапі нальний шлях уривається. Відомо, що сигнального шляху, як чинник RelA, свідчить про трансактиваційний потенціал c-Jun регулюється 55 76081 56 позаклітинним, сигналом, що індукується фосфоної ролі фосфорилювання білка RAP-2 показав, рилюванням по двох залишках серину (в положенщо мутування одного конкретного залишку серину нях 63 і 73) в складі його N-кінцевого активаторно(в 148-м положенні) повністю запобігає активації го домену. Протеїнкінази JNK/SAPK, що контрольованого ним фосфорилювання Jun. Як відповідають за фосфорилювання, що відзначалопоказано на Фіг.13, хоч надмірна експресія RAP-2 ся вище, представляють відособлену групу родини дикого типу зумовлювала різке зростання фосфоМАР-кіназ, які здатні самоактивуватися в резульрилювання Jun, надмірна експресія мутантного таті фосфорилювання по треоніну-183 і тирозинуRAP2 (S148A) не придушує фосфорилювання Jun 185, опосередкованому додатковими біфункціонавзагалі. Однак, вплив RAP-2 на NF-KB не порушульними по специфічності кіназами. Отже, наяввався цією мутацією зовсім. Ці дані показують, що ність фосфорилювання по відповідних сайтах в фосфорилювання по серину-148 в послідовності послідовностях c-Jun і JNK може бути використана RAP-2 специфічним чином залучено у вплив цього як маркер, який відображає активований статус білка на фосфорилювання Jim. даного білка. Аналіз методом Вестерн-блотингу Приклад 6 лізатів клітин НЕК-293Т, трансіфкованих по непоВідсутність інгібіювання білком RAP-2 зв'язустійному типу, показав, що, незважаючи на порування c-Jun і RelA з ДНК шення c-Jun-опосередковуваної транскрипції, З точки зору того факту, що описані в прикладі RAP-2 в істотній мірі здатний забезпечувати фос5 експерименти не дозволили встановити цитофорилювання ендогенної кінази c-Jun по серинуплазматичної модуляції мішені надекспресії RAP-2 63, що індукується рядом стимулів (див. Фіг.7А). в сигнальних каскадах чинників NF-KB і АР-1, заяЗагальні клітинні лізати клітин НЕК-293Т, трансіфвники проаналізували цілісність ядерних процесів, кованих вказаними експресійними конструкціями необхідних для здійснення транскрипції. Тест на поряд або з плазмідою pcDNA3, відміченої на Фіг.7 зсув у величині електричної рухливості (EMSA) «мінусом» (-), або з плазмідою pcRAP-2, відмічебуло здійснено на матеріалі ядерного екстракту ною на тій же Фіг.«плюсом» (+), були протестовані трансіфкованих клітин НЕК-293Т: він однозначно методом електро-форезу в SDS-ΠΑΑΓ, перенесені продемонстрував, що RAP-2 не порушує зв'язуна ECL-мембрани і прогібридизовани з антитілами вання c-Jun і RelA з олігонуклеотидами, відповід(NEB), специфічними у відношенні фосфорилюними класичним сайтам пізнавання цих чинників ванної по серину-63 c-Jun. Отримана мембрана (Фіг.8). Дійсно, було виявлене посилення в декільзображена на нижній частині Фіг.7А - її повторно ка разів ефективності утворення комплексу ДНК з гібридизували з антитілами до загальної c-Jun, що АР-1 в клітинах, трансіфкованих білком RAP-2. служило контролем (NEB). Більш того не було виявлено взаємодії між RAP-2 і Однак, загальна кількість c-Jun залишається c-Jun/Re1A, що може бути зумовлено просторовим незмінною, за винятком підвищення рівнів с-Jun як порушенням структури активаційний доменів можливе джерело модифікацій. Антитіла, специостанніх чинників. Було підтверджено, що, якщо фічні у відношенні фосфорильованної форми він і існує, то ефект проникнення RAP-2 всередину JNK1/2, не дозволяють виявити будь-скільки істотядра опосередковується на декілька етапів пізніше ного збільшення кількості цих активованих кіназ у за етапи зв'язування енхансерів. відповідь на надекспресію білка RAP-2: це вказує Приклад 7 на те, що додаткове фосфорилювання c-Jun не Взаємодія RAP-2 in vivo з ацетилтрансферазумовлювалося ІІАР2-залежним бустингом активзою гістонів ТІР60 ності кіназ JNK (Фіг.7У). Активована JNK1/2 з кліNIP60 (GeneBank: №U-74667) відноситься до тин НЕК-293Т, трансфікованих або pcDNA3, або нещодавно описаної родини ядерних білків, зваpcRAP-2, оброблених hrTNFα з метою підвищення них ацетилтрансферазами гістонів (HAT). Каталіперіоду часу реакції, була виявлена в методі Вестична активність цих білків асоційована з певною терн-блотингу при аналізі повних лізатів з викориорганізацією хроматину в нуклеосомах. Часто фестанням антитіл до JNK, фосфорильованної по рменти HAT асоційовані з деякими елементами Thr-183/Tyr-185 (NED), що показано на Фіг.7. транскрипційного апарату і здатні модулювати Для подальшого підтвердження останнього швидкість транскрипції. HAT діють шляхом ослабфакту кіназний тест in vitro з імунопреципітованої лення упакованості хроматину поблизу сайтів ініJNK1 і очищеною химерою GST/c-Jun як субстрат ціації за рахунок перенесення ацильних груп на дозволив отримати принципово такі ж результати конкретні залишки лізину в послідовностях гісто(Фіг.7С). Клітини НЕК-293Т були котрансфіковани нів, таким чином зумовлюючи надмірність різних «порожнім» вектором, плазмідами pcRAP-2 і pcRIP ДНК-зв'язуючих чинників. Мабуть, він є одним з тих в різних сполученнях поряд з плазмідою, експредопоміжних ядерних білків, які покликані забезпесуючою химеру HA/JNK1. Потім JNK1 імунопрецичити зв'язок між енхансер-зв'язуючими чинниками і пітовали на основі її N-кінцевої НА-мітки, а її здатРНК-полімеразою II. У зв'язку з цим заявники досність фосфорилювати вироблений бактеріями ліджували, чи може ТІР60 утворювати комплекс з очищений GST-Jun визначали по включенню 32p в RAP-2. Імуно-преципітація з клітин HeLa з подакіназному тесті in vitro. Продукти реакції аналізульшими двохгібридними тестами виразно підтвервали методом електрофорезу в SDS-ΠΑΑΓ, що дила, що RAP-2 інтенсивно взаємодіє з ТІР60 в показано на Фіг.7. обох системах. Проте не вдалося виявити будьБілок RAP-2 стає фосфорильованим тоді, коли скільки істотних змін в опосередковуваному білком він є імунопреципітованим з трансіфкованих клітин RAP-2 впливі на NF-KB і c-Jun після коекспресії НЕК-293Т комплекс RAP-2/IKK1 інкубується в умоТІР60 в клітинах НЕК-293Т (дані не включені). Така вах фосфорилювання in vitro. Аналіз функціональж відсутність змін була встановлена в контроль 57 76081 58 ному експерименті, тобто при стимуляції ± ТІР60 однак, воно як і раніше залишається під питанням, без RAP-2, на основі чого робиться висновок про оскільки доки не було проведено досліджень того, те, що наявність досить короткого часу (20-30 гочи зумовлює даний конкретний білок яку-небудь дин після трансфекції) не дає шансу репортерній каталітичну активність у відношенні поліубіквітинів. ДНК конденсуватися, не залишаючи достатнього Більш того ряд моментів, як представляється, рочасу для активності НАТ-подібних ферментів. бить дане припущення вельми малоймовірним: Приклад 8 (а) амінокислотні залишки, які, як вважається, Клон №10 - новий білок, взаємодіючий з RAP-2 складають основу каталітичної дільниці в будьЗастосовуючи повно розмірний білок RAP-2 як якому з підкласів убіквітинпротеаз, не є консерва«наживку» в двохгібридному скрінінзі бібліотеки тивними ні в F40F12.5, ні в клоні №10; кДНК В-лімфоцитів, було виділено новий білок, (б) за винятком їх каталітичних сайтів, фермевзаємодіючий з RAP-2, який в даному тексті познти, що відносяться до контрольованих убіквітиначений як «клон №10» або «кодований клоном ном протеаз, що походять від різних видів (від бак№10 білок», або «RAT-зв'язуючийся білок №10», терій до людини), не виявляють будь-скільки або «RBP-10» (Фіг.10). Початковий клон (довжиістотної схожості послідовностей, в той час як ною приблизно 2200 пар нуклеотидів), як було F40F12.5 і клон №10 характеризуються наявністю встановлено, кодує передбачуваний поліпептид з певного рівня гомології. молекулярною масою 60 кД. Однак, передбачуваПриклад 9 ний старт-кодон ATG, мабуть, в цій послідовності Клон №84 - білок, взаємодіючий з RAP-2 відсутній. Незважаючи на досить значну довжину, Додатковий КАР2-зв'язуючий білок був іденвиділена кДНК, мабуть, повинна тягнутися далі в тифікований шляхом використання повно розмір5'-напрямі до завершення повної кодуючої рамки. ного білка RAP-2 як «наживки» в двохгібридній У двохгібридному тесті на репертуар зв'язупроцедурі відносно бібліотеки кДНК В-лімфоцитів: вання клону №10 було встановлено, що цей білок, він був позначений як «клон №84». крім RAP-2, має вельми істотну спорідненість відБуло встановлено, що клон №84 специфічно носно білка TRAF2. Однак, клон №10 не зв'язуєтьзв'язується з повно розмірним RAP-2, в той час як ся з RIP, TRADD, MORT1, МАСH, TNFR-1, TIP60 і не виявляє взаємодії з будь-яким з інших досліNIK, рівно як і з деякими контрольними білками джуваних білків, включаючи TRAF2, MORT-1, (наприклад, з ламіном і циклином). Однак, не можTRADD, RIP, NIK, TIP60 і ламін. Часткова 5'на виключати, що зв'язування клону №10 з NIK послідовність клону №84, як було показано, іденможе бути виявлене в клітинах ссавців, з урахутична послідовності раніше клонованої кДНК, що ванням властивостей NIK, що виявляються в клікодує білок «регуляції клітинного зростання» тинах дріжджів. Як було показано, клон №10 зв'я(CGR19), ідентифікований в якості транскрипту, зується з RAP-2 на 200-амінокислотній С-кінцевій який специфічно позитивно регулюється в клітидільниці NIK, тобто на дільниці, не обов'язково нах, що нагромаджують функціональний білок р53 асоційованій зі зв'язуванням RIP, TIP60, NIK і ΙΚΚβ. (S.Madden et al., 1996; депозитарний №U-66469). Коекспересія клону №10 і TRAF2 в клітинах Секвенування CGR19 дозволило ідентифікувати НЕК-293Т ссавця запобігає опосередковану білком мотив «цинкові пальці» цистеїнз-гістидин-цистеїнз TRAF2 активацію чинника NF-KB, в той час як кое(що також позначається як «RING-палець») - в кспересія клону №10 з NIK в істотній мірі посилює складі його С-кінцевого домену. Експресія CGR19, активацію NF-KB останньою. Ці дані можуть вказуяк було з'ясовано, придушує зростання деяких вати на важливу регуляторну функцію клону №10. клітинних ліній. Залучення білка CGR19 до регуВиявлені диференційовані модулюючі ефекти, ляції NF-KB за рахунок зв'язування з RAP-2, мамабуть, свідчать про існування різних неперекрибуть, вказує на модуляцію механізмів регуляції ваючихся сайтів, на які спрямована дія даного білклітинних циклів членами родини TNF-рецепторів. ка в клітині. Приклад 10 Декілька раундів пошуку в GenBank, зроблеСтруктурно-функціональні відносини RAP-2 них з метою ідентифікації гомологів клону №10, А. Дільниці зв'язування призвели до виявлення F40F12.5 (депозитарний Із застосуванням аналізу послідовних делецій №S-42834) - гіпотетичного білка нематоди в послідовності RAP-2 були картовані сайти зв'яC.elegans, для якого фізіологічна роль доки не зування і були ідентифіковані домени зв'язування встановлена. Цікаво, що для білка F404F12.5 була RIP, NIK і ТІР60, рівно як і домени самоассоціювстановлена певна схожість з деякими представвання (Фіг.11). никами значною мірою консервативної родини Сайт зв'язування з RIP був визначений на діконтрольованих убіквітином протеаз. Ці ферменти льниці білка RAP-2, яка починається між амінокиспротидіють деструктивних механізмам, що забезлотами 177-218 і закінчується на амінокислоті 264. печуються убіквітином, який, як відомо, бере Не було встановлено перекриття сайта зв'язуучасть в більшості процесів руйнування білків в вання з RIP в послідовності RAP-2 ні з сайтом зв'яклітині. При тому, що лігази убіквітину пов'язані з зування з ІKKр, ні з сайтом зв'язування NIK (відпоприкріпленням поліубіквітинових молекул до призвідно, амінокислоти 95-264 і амінокислоти 1-264) наченого для руйнування білка, протеази убіквіти(Фіг.11). на запобігають ефективному розгалуженню зросСайт зв'язування з ТІР60, мабуть, знаходиться таючої молекули («дерева») поліубіквітина. Таке на дільниці амінокислот 95-264. Відсутність взаєприпущення, що стосується функцій білка модії з делеційним фрагментом, що включає аміF40F12.5, засновується на схожості згадуваних нокислоти 95-309, найбільш ймовірно зумовлюєтьубіквітином протеаз, що вище контролюються, ся специфічним порушенням конформації білка, 59 76081 60 до якого призводить дана конкретна делеція. точно не визначений, однак представляється, що Схожа невідповідність в скріпленні з делеційцей сайт є специфічним для RIP і RAP-2 і відсутній ними фрагментами може бути відмічена по скріпв інших білках, для яких відома взаємодія з RIP, ленню клону №10 і для самоасоціації білка RAP-2. таких як MORT-1, TRADD, FAS-R і, мабуть, також В протилежність до білка ТІР60, однак, той факт, TRAF2 (див. Malinin et al., 1997). Також стає ясним що повно розмірний RAP-2 зв'язується з делецій(виходячи з даних секвенування і порівняння посним фрагментом, що включає амінокислоти 218лідовностей різних баз даних, що відзначалися 416, рівно як і з делеційним фрагментом, що вище), що RAP-2 в своєму складі не має «згубного включає амінокислоти 1-264, вказує на те, що дідомену», «MORT-модуля», протеазного домену льниця, залучена до процесу гомодимеризації, (наприклад, мотиву, характерного для протеаз знаходиться між амінокислотами 217-264. ICE/CED3), кіназного домену або мотиву або Білок, що кодується клоном №10, з урахуванTRAF-доменів. У зв'язку з цим аналіз біологічної ням згаданого вище винятку, мабуть, зв'язується в активності також підтвердив, що RAP-2, мабуть, сайті, що починається на дільниці, амінокислот характеризується наступним: 218-309 і що закінчується на дільниці амінокислоти (1) у випадку надекспресії RAP-2 жорстко при416, причому його сайт зв'язування може перекридушує активацію NK-KB, що зумовлюється TNF ватися з сайтами зв'язування RIP, NIK, ΙΚΚβ і або надекспресією TRADD, RIP, TRAF-2, NIK або ТІР60 (Фіг.11). р65-субодиницею NK-KB; Б. Функціональні дільниці (2) RAP-2 здатний забезпечувати гіперфосфоВ тій мірі, в якій це було вивчено до даного рилювання c-Jun без зміни активності кінази JNK; моменту, всі функціональні вияви білка RAP-2 (а (3) RAP-2, як було встановлено в делеційному саме придушення ΝΚ-ΚΒ і індукція гіперфосфорианалізі, не залежить ні від «домену загибелі» RIP, лювання c-Jun) картуються в одну і ту ж дільницю ні від кіназної активності RIP з точки зору зв'язу(Фіг.11). вання з RIP; Більш того можливо, що ця дільниця, істотна з (4) засновуючись на згаданому вище делеційточки зору ефективної модуляції передачі сигналу ному аналізі, сайт зв'язування RAP-2 з RIP був всіма індукторами, що використовувалися в прозвужений до N-кінцевої дільниці довжиною прибведених експериментах, знаходиться в Млизно в 200 амінокислот; кінцевому сегменті даного білка. (5) RAP-2 зв'язується з NIK в трансіфкованих Дільниця амінокислот 95-416 характеризуєтьклітинах ссавців, але не дріжджів. ся певним виявом, хоч воно виявляється істотно Таким чином, з точки зору перерахованого більш слабим в порівнянні з тим виявом, який хавище RAP-2, мабуть, є високо специфічним білрактерний для повно розмірного білка: отже, він ком, що RIP-зв'язується, а, отже, і модулятоможе бути наслідком посиленої агрегації ендогенром/медіатором RIP, тому він, певно, залучений в ного RAP-2. опосередковані чинником RIP внутрішньоклітинні Більш того за винятком Re1A, вплив всіх індуксигнальні механізми. торів, що використовувалися в проведених експеВ світлі зазначеного вище представляється, риментах, може бути опосередковано, як мінімум, що RAP-2 бере участь в модуляприблизно 100 N-кінцевими амінокислотами посліції/опосередкуванні активності RIP. Всередині клідовності RAP-2. Дійсно, навіть фрагмент, що склатин це пов'язано з участю RIP в механізмі контродається з амінокислот 1-102, опосередковує виралю здатності до виживання клітин (активація NKзний ефект, хоч і вельми середній по силі KB, можливо через взаємодію з TRAF2) і з механі(Фіг.12В). змах загибелі клітин і запалень (незалежно через З іншого боку, успішна індукція Re1A вимагає «згубну домен» цього білка або через взаємодію з участі більш довгого фрагменту білка RAP-2. Доки іншими білками, такими як MORT-1, TRADD, p55є можливість визначити кордони цієї дільниці між R, FAS-R і пов'язаними з ними протеазами, такими амінокислотами 1 і 264 в якому, мабуть, знахояк MACH, Mch4, G1 і подібними). Вірогідні шляхи, диться дільниця між амінокислотами 157 і 264, що по яким RAP-2 здатний модулюваволодіє певною мірою специфічними зв'язуючими ти/опосередковувати активність RIP, детально властивостями, асоційованими з Re1A. обговорювалися в даному тексті вище. Наприклад, В. Співвідношення функцій і зв'язування взаємодія RAP-2/RIP може зумовлювати посиленЗасновуючись на даних, показаних на Фіг.11 і ня механізмів або загибелі клітин, або виживання 12, передбачається, що: клітин, або ж воно може зумовлювати придушення (a) за винятком Re1A, зв'язування RAP-2 з механізмів або загибелі клітин, або виживання RIP, клоном №10 і, найбільш ймовірно, з NIK і клітин, при тому, що таке посилення або придуТІР60 не залежить від власне функцій даного білшення, мабуть, залежить від відносних рівнів актика, пов'язаних з придушенням надекспресії, індувності інших учасників цих двох протилежних по дії кованої NK-KB; клітинних механізмів. Також RAP-2 здатний вико(b) вплив RAP-2 на індуковану надекспресією нувати функції «депо»-білка, забезпечуючи агреRe1A активацію, очевидно, опосередковується, гації групи молекул RIP і інших RIP - або білків, що принаймні частково, різними процесами зв'язуванКАР2-зв'язуються, при тому, що така агрегація ня. Істотне те, що всі згадувані вище білки, як мопотім може функціонувати або в напрямку загибелі жна бачити, беруть участь в забезпеченні такої клітин, або виживання клітин (або в обох напряактивності, на що вказують дані проведених до мах) в залежності від співвідношення кількості і теперішнього часу експериментів. (або) активності інших учасників цих клітинних меТочний сайт взаємодії між RAP-2 і RIP доки ханізмів.

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Dna sequence coding rip-associated protein (rap-2), competent to replication, expressing vector, transformed host cell, protein rap-2, a method for obtaining thereof, antibody, pharmaceutical composition and methods for modelling of modulated or mediated by protein rip influence on cells

Назва патенту російською

Последовательность днк, которая кодирует rip-ассоциированный белок (rap-2), компетентный к репликации, экспрессирующий вектор, трансформированная клетка-хозяин, белок rap-2, способ его получения, антитело, фармацевтическая композиция и способы моделирования модулированного или опосредствованного белком rip влияния на клетки

МПК / Мітки

МПК: C07K 16/18, A61K 38/17, G01N 33/50, C12N 15/10, C12N 15/12, C07K 14/47

Мітки: білок, експресуючий, клітина-хазяїн, спосіб, компетентний, послідовність, днк, трансформована, кодує, композиція, отримання, антитіло, rip-асоційований, реплікації, вектор, rap-2, фармацевтична

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/34-76081-poslidovnist-dnk-shho-kodueh-rip-asocijjovanijj-bilok-rap-2-kompetentnijj-do-replikaci-ekspresuyuchijj-vektor-transformovana-klitina-khazyan-bilok-rap-2-sposib-jjogo-otrimannya-ant.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Послідовність днк, що кодує rip-асоційований білок (rap-2), компетентний до реплікації експресуючий вектор, трансформована клітина-хазяїн, білок rap-2, спосіб його отримання, антитіло, фармацевтична композиція</a>

Подібні патенти