Людське нейтралізуюче антитіло проти в7rp1

Реферат: Винахід належить до антитіла, що взаємодіє із людським В7-спорідненим білком-1 (B7RP1) і, завдяки цьому, нейтралізує його функціонування, а також до фармацевтичних композицій для лікування імунних розладів шляхом введення фармацевтично ефективної кількості антитіл проти B7RP1. Пропонуються також способи виявлення кількості B7RP1 у зразку із застосуванням антитіл проти B7RP1. UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ця заявка претендує на пріоритет за тимчасовою заявкою на патент США № 60/700,265, яка була подана 18 липня 2005 року, зміст якої недвозначно включено до цього опису шляхом посилання. Галузь техніки, до якої належить винахід Цей винахід має відношення до людських моноклональних антитіл, що зв'язують В7споріднений білок-1 (B7RP1). Описуються також композиції та способи лікування захворювань та розладів, що мають відношення до імуносупресії та активації імунних механізмів. Передумови створення винаходу Т-клітини ініціюють імунну реакцію, опосередковують антигенспецифічні ефекторні функції і регулюють активність інших лейкоцитів шляхом секреції цитокінів. Для генерування відповідної Т-лімфоцитарної (Т-клітинної) імунної реакції Т-клітина повинна одержати два сигнали з боку антигенпрезентуючих клітин (APC). У разі явища, що визначає специфічність, антиген повинен бути представлений рецептору Т-клітини (TCR) через головний комплекс гістосумісності (MHC). Т-клітини можуть розпізнавати лише антиген, представлений на APC. Окрім антигенного рецептора, відповідна активація Т-клітин потребує також взаємодії інших поверхневоклітинних молекул як на Т-клітинах, так і на APC. До складу цих молекул, які називають костимуляторними молекулами, входить рецептор на імунореактивній клітині і ліганд, присутній на індукторній клітині. Цей незалежний від антигену костимуляторний сигнал повинен доставлятись шляхом взаємодії членів родини В7 на APC із своїми рецепторами на Т-клітинах. Наслідком інтенсивної імунної реакції є проліферація, диференціація, клональна експансія та ефекторна функція. У разі відсутності другого костимуляторного сигналу, Т-клітини переходять до стану тривалої антигенспецифічної імунологічної толерантності, який називають анергією. Клінічні експерименти Стадії II продемонстрували, що блокування одного костимуляторного шляху є ефективним при лікуванні псоріазу (Абрамс (Abrams) та інші, 2000, J. Exp. Med. 192:681-694; Абрамс (Abrams), 1999, J. Clin. Invest. 103:1243-1252) та ревматоїдного артриту (Кремер (Kremer) та інші, 2003, New England Journal of Medicine 349:1907-1915), що вказує на те, що ця загальна стратегія є доброю метою для імуномодуляторної терапії. Конкретною костимуляторною молекулою В7, В7-спорідненим білком-1 (B7RP1), є трансмембранний білок типу 1 із сигнальною послідовністю та позаклітинним доменом на амінокінці, де згаданий позаклітинний домен складається з двох Ig петльових фрагментів, трансмембранного домену та карбоксикінцевого внутрішньоклітинного домену (WO 00/46240). B7RP1 переважно зв'язується з ICOS (що означає "індуцибельний костимулятор"; Йошінага (Yoshinаga) та інші, 2000, Int. Immun. 12:1439-1447), що експресується на поверхні T-клітин. ICOS відіграє важливу роль у продукуванні цитокінів як типу 1, так і типу 2 активованими Тклітинами (Койл (Coyle) та інші, 2000, Immunity 13:95-105). B7RP1 є єдиним лігандом, який конститутивно експресується на антигенпрезентуючих клітинах (Йошінага (Yoshinаga) та інші, 1999, Nature. 402:827-832), у той час як ICOS експресується лише на активованих T-клітинах (Макадам (McAdam) та інші, 2000, Journal of Immunology 165:5035-5040). Залежне від B7RP1 передавання сигналу є необхідним для активування ефекторної (тобто повністю активованої) Т-клітини, а також її визрівання з "ненавченого" попередника (Донг (Dong) та інші, 2003, Journal of Autoimmunity. 21:255-260; Койл (Coyle) та інші, 2000, Immunity. 13:95-105). Унаслідок цього, взаємодія B7RP1/ICOS є необхідною для відповідних залежних від Т-клітин анамнестичних імунних реакцій (Донг (Dong) та інші, 2003, Journal of Autoimmunity. 21:255-260). Сучасні спроби втручання до костимуляторного Т-клітинного шляху зосереджуються, головним чином, на костимуляторних поліпептидах, що блокують лише активацію Т-клітин, але не зосереджуються на активації і визріванні. Унаслідок цього, ці лікарські засоби забезпечують загальне пригнічення функції Т-клітин. У протилежність до цього, блокування взаємодії B7RP1/ICOS забезпечує більш специфічне пригнічення функції Т-клітин шляхом впливання лише на зрілі ефекторні Т-клітини. Таким чином, блокування взаємодії B7RP1/ICOS за клінічних умов є надзвичайно бажаним, оскільки воно забезпечує більш обмежений профіль побічних ефектів порівняно із костимуляторними лікарськими засобами, які блокують активацію лише "ненавчених" Т-клітин. Суть винаходу Цей винахід пропонує моноклональні антитіла, що зв'язуються з В7-спорідненим білком-1 (B7RP1). За одним із варіантів здійснення згадані моноклональні антитіла є людськими моноклональними антитілами, що нейтралізують біологічні активності B7RP1 і є особливо придатними для повного або часткового пригнічення імунної костимуляторної активності B7RP1. Цей винахід пропонує також клітини, зокрема, клітини гібридом, що продукують моноклональні 1 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 антитіла за цим винаходом. За конкретними аспектами антитіла за цим винаходом, як описано у цьому винаході, специфічно зв'язуються з H- або D-сегментом B7RP1. Цей винахід додатково пропонує гібридні білки, що містять послідовність Fc-ділянки антитіла і одну або декілька послідовностей, позначених як ПОСЛІДОВНОСТІ № 1-40. Такі молекули можна одержати за допомогою способів, описаних, наприклад, у публікації міжнародної заявки WO 00/24782, яку включено до цього опису шляхом посилання. Такі молекули можуть експресуватись, наприклад, у клітинах ссавців (наприклад, у клітинах яєчника китайського хом'ячка) або бактеріальних клітинах (наприклад, у клітинах E. coli). За певними аспектами цей винахід пропонує антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, що включає константні ділянки важкого ланцюга IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA та IgE або будь-який їхній алельний варіант (як обговорюється у роботі Кабат (Kabat) та інших, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п'яте видання, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, що включена до цього опису шляхом посилання), а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену будьякою з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 7-14, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Антитіло за цим винаходом містить або амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга IgG2, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 41, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, або амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга IgG1, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 42, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними варіантами здійснення згадані антитіла є моноклональними антитілами, людськими антитілами або за варіантом, якому віддається перевага, людськими моноклональними антитілами. За певними аспектами цей винахід пропонує антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить константну ділянку, яка містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 43, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 1-6, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними варіантами здійснення антитілами є моноклональні антитіла, людські антитіла, або за варіантом, якому віддається перевага, людські моноклональні антитіла. За певними аспектами антитіла за цим винаходом містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 7 або ПОСЛІДОВНІСТЮ № 8, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За іншими аспектами варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 1, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За іншими аспектами антитіла за цим винаходом містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 9 або її антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом. За іншими аспектами варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 2 або її антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом. За додатковими аспектами важкий ланцюг містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (CDR), що має амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 27-40 або їхнім антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом. За іншими аспектами легкий ланцюг містить щонайменше одну гіперваріабельну ділянку (CDR), що має амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 15-26 або їхнім антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом. Цей винахід також пропонує антитіла, що специфічно зв'язуються з B7RP1, важкий ланцюг яких містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 7 чи ПОСЛІДОВНІСТЮ № 8 або їхнім антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом, а легкий ланцюг містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 1 або її антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом. 2 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На додаток до цього, цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з B7RP1, важкий ланцюг яких містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 9 або її антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом, а легкий ланцюг містить варіабельну ділянку, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 2 або її антигензв'язувальним чи імунологічно функціональним імуноглобуліновим фрагментом. За певними аспектами цей винахід пропонує також антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше приблизно 75 %, щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або щонайменше приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 714, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить послідовність, що має щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або щонайменше приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 1-6, де згадане антитіло специфічно зв'язується з B7RP1. Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з B7RP1, важкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 44 або ПОСЛІДОВНІСТЮ № 46, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 45, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід пропонує також антитіла, що специфічно зв'язуються з B7RP1, важкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 47, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 48, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами цей винахід пропонує антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить щонайменше одну CDR ділянку, яка містить послідовність, що має щонайменше приблизно 75 %, щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або щонайменше приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 27-40, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить щонайменше одну CDR ділянку, яка містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше приблизно 80 %, щонайменше приблизно 85 %, щонайменше приблизно 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або щонайменше приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 15-26, де згадане антитіло специфічно зв'язується з B7RP1. Цей винахід пропонує також одноланцюгові антитіла, одноланцюгові Fv антитіла, F(ab) антитіла, F(ab) антитіла і (Fab)2 антитіла. За конкретними аспектами цей винахід пропонує легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 15-26, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. На додаток до цього, цей винахід пропонує важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 27-40, або її антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід має також відношення до виділених людських антитіл, що специфічно зв'язують B7RP1, де згадане антитіло містить: (a) остовні ділянки людського важкого ланцюга, CDR1 ділянку людського важкого ланцюга, CDR2 ділянку людського важкого ланцюга та CDR3 ділянку людського важкого ланцюга; і (b) остовні ділянки людського легкого ланцюга, CDR1 ділянку людського легкого ланцюга, CDR2 ділянку людського легкого ланцюга та CDR3 ділянку людського легкого ланцюга. За певними аспектами CDR1 ділянка людського важкого ланцюга може бути CDR1 ділянкою важкого ланцюга, як показано будь-якою з ПОСЛІДОВНІСТЕЙ № 27, №30 або №35, а CDR1 ділянка людського легкого ланцюга може бути CDR1 ділянкою легкого ланцюга, як показано будь-якою з ПОСЛІДОВНІСТЕЙ №15, №18 або № 24. За іншими 3 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аспектами CDR2 ділянка людського важкого ланцюга може бути CDR2 ділянкою важкого ланцюга, як показано будь-якою з ПОСЛІДОВНІСТЕЙ № 28, №31, №33, №36 або №39, а CDR2 ділянка людського легкого ланцюга може бути CDR2 ділянкою легкого ланцюга, як показано будь-якою з ПОСЛІДОВНІСТЕЙ № 16, №19 або №21. За ще іншими аспектами CDR3 ділянка людського важкого ланцюга є CDR3 ділянкою важкого ланцюга, як показано будь-якою з ПОСЛІДОВНІСТЕЙ № 29, № 32, № 34, № 37, № 38 або № 40, а CDR3 ділянка людського легкого ланцюга є CDR3 ділянкою легкого ланцюга, як показано будь-якою з ПОСЛІДОВНІСТЕЙ № 17, № 20, № 22, № 23, № 25, або № 26. Антитіла за цим винаходом характеризуються здатністю до специфічного зв'язування з B7RP1. На додаток до цього, антитіла за цим винаходом мають здатність до антагонізування щонайменше однієї in vitro та/або in vivo активності, пов'язаної з B7RP1 поліпептидами. Цей винахід пропонує виділені людські антитіла проти людського B7RP1 із високою спорідненістю зв'язування з B7RP1 поліпептидами, де згадані антитіла зв'язуються з людським B7RP1 поліпептидом і відокремлюються від людського B7RP1 поліпептиду з константою дисоціації (K D) -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 приблизно 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M або менше, як визначається за допомогою KinExA, або які пригнічують B7RP1-індуковану виживаність у in vitro реакції -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 нейтралізації з EC50 приблизно 10 M, 10 M, 10 М, 10 М, 10 М, 10 М, 10 M або менше. Цей винахід пропонує також виділені людські антитіла або їх антигензв'язувальні чи імунологічно функціональні імуноглобулінові фрагменти, які специфічно зв'язуються з B7RP1, де згадані антитіла або фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDR1, CDR2 та CDR3 важкого ланцюга, де: a) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 27, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 28 і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 29; b) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 30, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 31 і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 32; c) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 27, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 33 і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 34; d) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 35, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 36 і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 37; e) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 27, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 33 і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 38; або f) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 35, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 39 і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 40. Цей винахід пропонує також виділене людське антитіло або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, які специфічно зв'язуються з B7RP1, де згадане антитіло або фрагмент містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDR1, CDR2 та CDR3 легкого ланцюга, де: a) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 15, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16 і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 17; b) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 18, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 19 і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 20; c) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 15, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ 4 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 № 21 і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 22; d) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 18, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 19 і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 23; e) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 24, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16 і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 25; або f) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 24, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 16 і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ № 26. Цей винахід також пропонує антитіла, які конкурують за зв'язування з B7RP1 з антитілами, опис яких наведено. За певними аспектами конкурентне антитіло за цим винаходом конкурує за зв'язування з людським B7RP1 з антитілом, що містить будь-яку з ПОСЛІДОВНОСТЕЙ № 1-40. Частиною цього винаходу є також полінуклеотидні послідовності, що кодують людські антитіла проти людського B7RP1, вектори, що містять полінуклеотидні послідовності, що кодують людські антитіла проти людського B7RP1, клітини-хазяї, трансформовані векторами, що містять полінуклеотиди, що кодують людські антитіла проти людського B7RP1, композиції, що містять людські антитіла проти людського B7RP1, та способи їх одержання та застосування. Цей винахід пропонує також способи визначення рівня B7RP1 у біологічній пробі, що включають стадію контактування згаданої проби з антитілом за цим винаходом або його антигензв'язувальним фрагментом. Антитіло проти B7RP1 за цим винаходом може застосовуватись у будь-якому відомому аналітичному методі, наприклад, реакціях конкурентного зв'язування, прямих та непрямих сендвіч-методах, методах імунопреципітації та твердофазному імуноферментному аналізі (ELISA) (дивись Сола (Sola), 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, стор. 147-158, CRC Press, Inc.) для виявлення та кількісного визначення B7RP1. Антитіла можуть зв'язувати B7RP1 із спорідненістю, що відповідає застосованому аналітичному методу. На додаток до цього, цей винахід пропонує способи лікування захворювання, пов'язаного з підвищеним продукуванням B7RP1, підвищеною чутливістю до B7RP1, та/або захворювань, пов'язаних із контролюванням Т-клітинних імунних реакцій, що включають стадію введення фармацевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше одне антитіло за цим винаходом або його антигензв'язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, індивіду, який цього потребує. Варіанти здійснення цього винаходу стануть очевидними з наведеного нижче докладного опису та формули винаходу. Стислий опис фігур На Фіг. 1А представлена послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7) варіабельної ділянки антитіла 16Н і відповідна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 8) варіабельної ділянки антитіла 16Н ембріонального типу (16Hg). На Фіг. 1В представлені результати аналізів костимуляції із застосуванням антитіла проти CD3 та гібридного білка hB7RP1-Fc, які показують, що 16Hg зберігає свої біологічні активності, порівняно з 16Н. На Фіг. 2 представлені результати аналізів зв'язування Biacore® з антитілами 16H, 16Hg та 5D. На Фіг. 3 представлені результати аналізу зв'язування KinExA з антитілом 5D. На Фіг. 4 представлені результати аналізу зв'язування KinExA з антитілом 2Н. На Фіг. 5 представлені результати аналізу зв'язування KinExA з антитілом 2Н ембріонального типу (2Hg). На Фіг. 6 представлені результати аналізів конкурентного зв'язування (засобами протокової цитометрії), які показують, що антитіло 16Н позбавляє ICOS-Fc можливості зв'язування з B7RP1. На Фіг. 7 представлені підсумовані результати аналізу поліморфізму окремих нуклеотидів (SNP) B7RP-1. На Фіг. 8 представлені підсумовані результати конкурентного твердофазного імуноферментного аналізу ряду моноклональних антитіл проти людського B7RP1. Наведені значення являють собою IC50 для пригнічення зв'язування гібридного білка ICOS-Fc. 5 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 9А представлено флуоресцентне забарвлення позаклітинного домену (ECD) B7RP1 міченими антитілами 16H, 5D та ICOS. На Фіг. 9В показана подібна зв'язувальна ефективність антитіл 16Н і 5D з SNP варіантом B7RP1. На Фіг. 9С представлені результати аналізів костимуляції з антитілами 16H або 5D і SNP варіантами. На Фіг. 10А показані результати аналізу костимуляції на планшетах із моноклональними антитілами 1B7v2 у порівнянні з рядом різних моноклональних антитіл проти мишачого B7RP1. На Фіг. 10B, Фіг. 10C і Фіг. 10D представлені результати експериментів з антигенною стимуляцією, аналізовані на антигенспецифічні сироваткові IgM (Фіг. 10B), IgG2a (Фіг. 10C) та IgG1 (Фіг. 10D). На Фіг. 11 представлені результати ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), які демонструють, що сироваткові рівні IL-5 пригнічуються антитілами 1B7v2. На Фіг. 12А показано, що антитіла 16H можуть зв'язуватись із B7RP1 макак-крабоїдів (правий графік) і людським B7RP1 (лівий графік). На Фіг. 12В показано, що антитіла 16H, 16Hg і 5D можуть пригнічувати B7RP1/ICOS-залежну активацію Т-клітин макак-крабоїдів. На Фіг. 13А представлені індивідуальні і групові значення середнього титру макак-крабоїдів на 53 день і 57 день після повторної стимуляції правцевим токсоїдом на 42 день у тварин, яким були введені антитіла 16H. На Фіг. 13В представлені індивідуальні і групові значення середнього титру макак-крабоїдів на 53 день і 57 день після повторної стимуляції правцевим токсоїдом на 42 день у тварин, яким були введені антитіла 5D. Докладний опис певних варіантів здійснення Назви розділів, що вживаються у цьому описі, переслідують лише організаційні цілі і не повинні розглядатись як такі, що обмежують об'єкт опису. Усі посилання, згадані у цьому описі, включено до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі. Визначення Для одержання рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культивування та трансформації тканин можна вдаватись до традиційних методів (наприклад, електропорації, ліпофекції). Ферментативні реакції та методи очищення можуть здійснюватись за специфікаціями виробника, за традиційними для цієї галузі методиками або за наведеним описом. Подальші методики та процедури можуть, у цілому, здійснюватись за способами, добре відомими у цій галузі, та за описами, наведеними у різноманітних загальних та спеціалізованих джерелах, які наводяться шляхом посилання та обговорюються у цьому описі. Дивись, наприклад, довідник Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A d LFBORATORY MANUAL, 3 ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., який включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. У разі відсутності конкретних визначень, у цьому описі у зв'язку з та по відношенню до лабораторних процедур та методів аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, медичної та фармацевтичної хімії застосовується номенклатура, що є добре відомою і традиційно застосовуваною у цій галузі. Подібним чином, для хімічного синтезу, хімічних аналізів, одержання фармацевтичних препаратів, композицій, їх доставки та лікування хворих можуть застосовуватись традиційні методи. Слід розуміти, що наведені нижче терміни, що вживаються у описі цього винаходу, у разі відсутності інших визначень, мають таке значення: Словосполучення "біологічна властивість", "біологічна характеристика" і термін "активність" відносно антитіла за цим винаходом вживаються у цьому описі взаємозамінно і означають (але не обмежуються) спорідненість і специфічність відносно антигенної детермінанти (наприклад, зв'язування людського антитіла проти людського B7RP1 з людським B7RP1), здатність до антагонізування активності цільового поліпептиду (наприклад, активності B7RP1), in vivo стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими біологічними властивостями або характеристиками антитіла, що піддаються визначенню і визнаються у цій галузі, є, наприклад, перехресна реактивність (тобто з гомологами нелюдського B7RP1 або, взагалі, з іншими білками або тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або вимірюватись за допомогою визнаних у цій галузі методів, у тому числі, але без обмеження, за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), конкурентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, in vitro та in vivo реакцій нейтралізації (наприклад, Приклад 2) та імуногістохімічних методів зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людей, приматів або з будь-якого іншого джерела, 6 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відповідно до потреб. Конкретні активності та біологічні властивості людських антитіл проти людського B7RP1 докладно описані у наведених нижче Прикладах. Словосполучення "виділений полінуклеотид", що вживається у цьому описі, означає полінуклеотид геномного ДНК, кДНК, РНК або синтетичного походження чи їх комбінації, причому, завдяки своєму походженню, згаданий виділений полінуклеотид (1) не є пов'язаним із цілим полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, у складі якого виділений полінуклеотид знаходиться за природних умов, (2) є зв'язаним із полінуклеотидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (3) не зустрічається за природних умов як частина більшої послідовності. Термін "полінуклеотид", що вживається у цьому описі, означає одноланцюгові або дволанцюгові нуклеїновокислотні полімери довжиною щонайменше 10 нуклеотидів. За певними варіантами здійснення нуклеотидами, що входять до складу полінуклеотиду, можуть бути рибонуклеотиди або дезоксирибонуклеотиди чи модифікована форма нуклеотиду будь-якого з цих типів. Згадані модифікації включають модифікації основ, наприклад, бромуридину, модифікації рибоз, наприклад, арабінозиду та 23-дидезоксирибози та модифікації внутрішньонуклеотидних зв'язків, наприклад, фосфоротіоату, фосфородитіоату, фосфороселеноату, фосфородиселеноату, фосфороанілотіоату, фосфороаніладату і фосфороамідату. Термін "полінуклеотид", зокрема, включає однониткові та двониткові форми ДНК або РНК. Термін "олігонуклеотид", що вживається у цьому описі, включає природні і модифіковані нуклеотиди, зв'язані природними та/або штучними олігонуклеотидними зв'язками. Олігонуклеотиди являють собою субпопуляцію полінуклеотидів, члени якої є, як правило, однонитковими і мають у довжину 200 або менше нуклеотидів. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають від 10 нуклеотидів до 60 нуклеотидів у довжину. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають 12 нуклеотидів, 13 нуклеотидів, 14 нуклеотидів, 15 нуклеотидів, 16 нуклеотидів, 17 нуклеотидів, 18 нуклеотидів, 19 нуклеотидів або від 20 нуклеотидів до 40 нуклеотидів у довжину. Олігонуклеотиди можуть бути однонитковими або двонитковими, наприклад, для застосування при конструюванні генетичного мутанту. Олігонуклеотиди за цим винаходом можуть бути смисловими або антисмисловими олігонуклеотидами відносно білок-кодувальної послідовності. Термін "природні нуклеотиди" означає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиди" означає нуклеотиди з модифікованими або заміненими цукровими групами тощо. Термін "олігонуклеотидні зв'язки" означає олігонуклеотидні зв'язки, наприклад, фосфоротіоат, фосфородитіоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фосфороаніладат, фосфороамідат тощо. Дивись, наприклад, Лапланш (LaPlanche) та інші, 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Стек (Stec) та інші, 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Стейн (Stein) та інші, 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Зон (Zon) та інші, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Зон (Zon) та інші, 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, стор. 87-108, (редактор Ф. Екстейн (F. Eckstein)), Oxford University Press, Oxford England; Стек (Stec) та інші, патент США № 5,151,510; Ульман (Uhlmann), Пейман (Peyman), 1990, Chemical Reviews, 90:543, розкриття яких наведено у цьому описі шляхом посилання для будь-якої мети. Олігонуклеотид може містити виявну мітку, яка надає можливість виявлення олігонуклеотиду або його гібридизації. Словосполучення "виділений білок", що згадується у цьому описі, означає, що цільовий білок (1) є вільним від принаймні деяких інших білків, з якими він знаходиться за нормальних умов, (2) є по суті вільним від інших білків з того самого джерела, наприклад, від того самого виду, (3) експресується клітиною іншого виду, (4) було відділено від щонайменше приблизно 50 % полінуклеотидів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він зв'язаний за природних умов, (5) не є зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з частинами білка, з якими згаданий "виділений білок" зв'язаний за природних умов, (6) є функціонально зв'язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з поліпептидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов або (7) не зустрічається за природних умов. Такий виділений білок може кодуватись геномною ДНК, кДНК,мРНК або іншою РНК синтетичного походження чи будьякою їх комбінацією. За одним із варіантів здійснення згаданий виділений білок є по суті вільним від білків або поліпептидів чи інших забруднювачів, що знаходяться у його природному оточенні, які могли б перешкоджати його застосуванню (терапевтичному, діагностичному, профілактичному, науково-дослідному тощо). "Виділеним" антитілом є антитіло, яке було ідентифіковане і відділене та/або виділене зі складової його природного оточення. Забруднювальними складовими його природного оточення є матеріали, які могли б перешкодити діагностичному або терапевтичному застосуванням антитіла, і вони можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або 7 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 небілкові розчинені речовини. За певним варіантомздійснення антитіло буде очищеним (1) до рівня, що перевищує 95 % (мас.) антитіла, або до рівня, що перевищує 99 % (мас.), що визначається за методом Лоурі, (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою секвенатора з центрифугальною чашкою, або (3) до однорідності за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) за відновних або невідновних умов із застосуванням барвника кумасі блакитного або срібла. Виділене антитіло включає антитіло in situ у межах рекомбінантних клітин, оскільки щонайменше одна складова природного середовища антитіла буде відсутньою. Терміни "поліпептид" або "білок" означають молекули, що мають послідовність нативних білків, тобто білків, продукованих природними клітинами та специфічними нерекомбінантними клітинами, генно-інженерними або рекомбінантними клітинами, і включають молекули, що мають амінокислотну послідовність нативного білка або молекули, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот нативної послідовності. Терміни "поліпептид" та "білок", зокрема, означають анти-B7RP1 антитіла або послідовності, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот анти-B7RP1 антитіла. Термін "фрагмент поліпептиду" означає поліпептид, що має делецію на амінокінці, делецію на карбоксильному кінці та/або внутрішню делецію. За певних варіантів здійснення довжина фрагментів становить від щонайменше 5 амінокислот до приблизно 500 амінокислот. Буде зрозуміло, що, за певними варіантами здійснення довжина фрагментів становить щонайменше 5 амінокислот, 6 амінокислот, 8 амінокислот, 10 амінокислот, 14 амінокислот, 20 амінокислот, 50 амінокислот, 70 амінокислот, 100 амінокислот, 110 амінокислот, 150 амінокислот, 200 амінокислот, 250 амінокислот, 300 амінокислот, 350 амінокислот, 400 амінокислот або 450 амінокислот. Особливо придатні фрагменти поліпептидів містять функціональні домени, у тому числі зв'язувальні домени, зокрема, антиген-зв'язувальні домени, особливо якщо антиген є антигенною детермінантою людського B7RP1. У разі анти-B7RP1 антитіла, придатні фрагменти містять (але не обмежуються) CDR (гіперваріабельну) ділянку, варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга, частину ланцюга антитіла або лише його варіабельну ділянку, що містить дві гіперваріабельні ділянки тощо. Термін "специфічний зв'язувальний агент" означає природну або штучну молекулу, яка специфічно зв'язується з мішенню. Прикладами специфічних зв'язувальних агентів є (але ними не обмежуються) білки, пептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи і ліпіди. За певними варіантами здійснення специфічним зв'язувальним агентом є антитіло. Термін "специфічний B7RP1-зв'язувальний агент" означає специфічний зв'язувальний агент, який специфічно зв'язує будь-яку частину B7RP1. За певними варіантами здійснення специфічним B7RP1-зв'язувальним агентом є антитіло, що специфічно зв'язується з B7RP1. Як приклад, антитіло "специфічно зв'язується" з мішенню, якщо антитіло, у разі його мічення, може позбавлятись доступу до своєї мішені відповідним неміченим антитілом. Термін "імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент", що вживається у цьому описі, означає фрагмент поліпептиду, що містить принаймні ділянки CDR важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну. Імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом здатний до зв'язування з антигеном. За певними варіантами здійснення антиген являє собою ліганд, що специфічно зв'язується з рецептором. За цими варіантами здійснення зв'язування імунологічно функціонального імуноглобулінового фрагмента за цим винаходом запобігає зв'язуванню ліганду з його рецептором, із перериванням біологічної реакції, що є наслідком зв'язування ліганду з рецептором. За одним варіантом здійснення імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом специфічно зв'язується з B7RP1. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, згаданий фрагмент специфічно зв'язується з людським B7RP1. Термін "природний" або "нативний", що вживається у цьому описі і стосується об'єкта, означає те, що цей об'єкт може бути знайдений у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, присутня у організмі (у тому числі вірусах), яка може бути виділена із природного джерела і навмисно людиною не модифікувалась, є природною. Термін "штучний (що не зустрічається за природних умов)” або "ненативний", що вживається у цьому описі, означає матеріал, відсутній у природі або структурно модифікований чи синтезований людиною. Наприклад, "штучний" може означати варіант, наприклад, варіант полінуклеотиду, який може продукуватись за допомогою відомих у цій галузі техніки методів мутагенезу, або варіант поліпептиду, продукований таким варіантом полінуклеотиду. До числа таких варіантів належать, наприклад, варіанти, продуковані замінами, делеціями або доданнями нуклеотидів, 8 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 які можуть включати один або декілька нуклеотидів. Варіанти полінуклеотидів можуть змінюватись на кодувальних або некодувальних чи обох ділянках. Наслідком змін на кодувальних ділянках можуть бути консервативні або неконсервативні амінокислотні заміни, делеції або додання. Зокрема, певні з них є прихованими замінами, доданнями, делеціями і консервативними замінами, які не змінюють властивості і активності антитіла проти B7RP1 за цим винаходом. Фахівець у цій галузі техніки може легко визначити, яким чином одержати такий варіант із застосуванням способів, добре відомих у цій галузі. Термін "функціонально зв'язаний" означає, що складові, до яких вживається цей термін, знаходяться у взаємозв'язку, який надає їм можливість здійснення притаманних їм функцій за відповідних умов. Наприклад, контрольна послідовність, "функціонально зв'язана" з кодувальною послідовністю білка, сполучена з нею таким чином, що експресія кодувальної послідовності білка відбувається за умов, сумісних із транскрипційною активністю контрольних послідовностей. Термін "контрольна послідовність", що вживається у цьому описі, означає полінуклеотидні послідовності, які можуть забезпечувати експресію, процесинг або внутрішньоклітинну локалізацію кодувальних послідовностей, з якими вони зв'язані. Природа таких контрольних послідовностей може залежати від організму-хазяїна. За конкретними варіантами здійснення контрольні послідовності для прокаріот можуть містити промотор, сайт зв'язування рибосом і термінатор транскрипції. За іншими конкретними варіантами здійснення контрольні послідовності для еукаріот можуть включати промотори, що містять один або множину сайтів упізнання факторів транскрипції, енхансерних послідовностей транскрипції, термінаторів транскрипції та послідовностей поліаденілування. За певними варіантами здійснення "контрольні послідовності" можуть включати лідерні послідовності та/або послідовності гібридизаційного партнера. Термін "вектор" означає нуклеїновокислотну молекулу, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв'язана. Вектором одного з типів є "плазміда", що являє собою кільцеву петлю двониткової ДНК, до якої можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Вектором іншого типу є вектор на основі вірусного геному, де додаткові сегменти ДНК можуть бути лігованими до вірусного геному. Певні вектори здатні до автономної реплікації у клітинихазяїні, до якої вони були введені (наприклад, вектори на основі бактеріального геному, що мають бактеріальний сайт ініціювання реплікації та вектори на основі епісом ссавців). Інші вектори (наприклад, вектори не на основі епісом ссавців) можуть бути інтегровані до геному клітини-хазяїна при введенні до згаданої клітини і, таким чином, розмножуватися разом із геномом хазяїна. Більш того, певні вектори є здатними до спрямування експресії генів, з якими вони є функціонально зв'язані. Такі вектори згадуються у цьому описі, як "рекомбінантні вектори експресії" (або просто "експресійні вектори"). Взагалі, експресійні вектори, придатні для методу рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У цьому описі терміни "плазміда" і "вектор" можуть вживатись взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найпоширенішу форму вектора. Цей винахід, однак, включає інші форми експресійних векторів, наприклад, вектори на основі вірусного геному (наприклад, реплікаційно-дефектні ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які здійснюють еквівалентні функції. Словосполучення "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн") означає клітину, до якої було введено рекомбінантний експресійний вектор. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що такі терміни, як мається на увазі, означають не лише конкретну клітину-об'єкт, але і потомство такої клітини. Оскільки у подальших генераціях можуть відбуватись певні модифікації унаслідок мутацій або впливу навколишнього середовища, таке потомство може по суті не бути ідентичним батьківській клітині, однак воно, як і до того, включається до обсягу терміну "клітина-хазяїн", який вживається у цьому описі. Для експресії антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші системи експресії в хазяїні, у тому числі бактеріальні, дріжджові, бакуловірусні системи експресії та системи експресії у ссавцях (а також системи експресії із фаговою індикацією). Прикладом придатного експресійного вектора на основі бактеріального геному є pUC19. Для рекомбінантної експресії антитіл, клітина-хазяїн трансфікується одним або декількома рекомбінантними експресійними векторами, що несуть фрагменти ДНК, що кодує легкі та важкі ланцюги антитіла таким чином, що згадані легкі та важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні і секретуються до живильного середовища, у якому культивуються клітини-хазяї, з якого згадані антитіла можуть виділятись. Стандартна методика рекомбінантних ДНК застосовується для одержання генів важких і легких ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів та введення цих векторів до клітин-хазяїв, описаних, наприклад, у довіднику Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, (під редакцією 9 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Осбел Ф.М. (Ausubel F.M.) та інших, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associaties, (1989)) та у патенті США № 4,816,397 на ім'я Босс (Boss) та інші. Термін "трансдукція" означає перенесення генів від однієї бактерії до іншої, як правило, за допомогою фага. "Трансдукція" означає також набуття та перенесення еукаріотних клітинних послідовностей ретровірусами. Термін "трансфекція" означає захоплення клітиною чужорідної або екзогенної ДНК, і клітина є "трансфікованою" у разі, коли екзогенна ДНК була введена досередини клітинної мембрани. У цій галузі добре відомі численні методи трансфекції, які розкриваються у цьому описі. Дивись, наприклад, Грехем (Graham) та інші, 1973, Virology 52:456; Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Девіс (Davis) та інші, 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; Чу (Chu) та інші, 1981, Gene, 13:197. Такі методи можуть застосовуватись для введення до придатних клітинхазяїв однієї або більше екзогенних ДНК. Термін "трансформація", що вживається у цьому описі, означає зміну генетичних характеристик клітини, і клітина є трансформованою у тому разі, коли вона була модифікована таким чином, що містить нову ДНК. Наприклад, клітина є трансформованою у тому разі, коли її піддали генетичній модифікації порівняно з її нативним станом. Після трансфекції або трансдукції, трансформуюча ДНК може рекомбінуватись із ДНК клітини шляхом фізичної інтеграції з хромосомою клітини або може тимчасово підтримуватись як епісомний елемент без реплікації або може реплікуватись незалежно як плазміда. Клітина вважається стабільно трансформованою, коли ДНК реплікується разом із поділом клітини. Термін "антиген" означає молекулу або частину молекули, здатну до зв'язування селективним зв'язувальним агентом, наприклад, антитілом, і додатково здатну до застосування у організмі тварини для продукування антитіл, здатних до зв'язування з антигенною детермінантою цього антигену. Антиген може мати одну або декілька антигенних детермінант. За певними варіантами здійснення варіанти антитіл включають глікозиловані варіанти, де кількість та/або тип сайта глікозилування була(був) змінена(-ий), порівняно з амінокислотними послідовностями вихідного поліпептиду. За певними варіантами здійснення білкові варіанти включають більшу або меншу кількість N-зв'язаних сайтів глікозилування, аніж нативний білок. N-зв'язаний сайт глікозилування характеризується послідовністю: Asn-Xaa-Ser або Asn-Xaa-Thr, де амінокислотним залишком, позначеним як Xаа, може бути будь-який амінокислотний залишок за виключенням проліну. Заміна амінокислотних залишків для одержання цієї послідовності забезпечує одержання потенційно нового сайта для додання N-зв'язаного вуглеводного ланцюга. За альтернативним варіантом заміни, які ліквідують цю послідовність, будуть видаляти існуючий N-зв'язаний вуглеводний ланцюг. Пропонується також реаранжування N-зв'язаних вуглеводних ланцюгів, де один або декілька N-зв'язаних сайтів глікозилування (як правило, природних) ліквідуються з одержанням одного або декількох нових N-зв'язаних сайтів. Додаткові варіанти антитіл включають цистеїнові варіанти, де, порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю, один або декілька цистеїнових залишків видаляють або замінюють на іншу амінокислоту (наприклад, серин). Цистеїнові варіанти можуть бути придатними у тому разі, коли антитіла повинні повторно укладатись до біологічно активної конформації, як, наприклад, після виділення нерозчинних тілець включення. Цистеїнові варіанти, взагалі, мають меншу кількість залишків цистеїну, аніж нативний білок і, як правило, мають парну їх кількість для зведення до мінімуму взаємодій, що є наслідком неспарованих залишків цистеїну. За додатковими варіантами здійснення варіанти антитіл можуть включати антитіла, що містять модифікований Fc-фрагмент або модифіковану константну ділянку важкого ланцюга. Fcфрагмент (де скорочення означає "фрагмент, що кристалізується") або константна ділянка важкого ланцюга можуть модифікуватись шляхом мутації для надання антитілу змінених характеристик зв'язування. Дивись, наприклад, Бартон (Burton), Вуф (Woof), 1992, Advances in Immunology 51:1-84; Равеч (Ravetch), Болланд (Bolland), 2001, Annu. Rev. Immunol. 19:275-290; Шілдс (Shields) та інші, 2001, Journal of Biol. Chem. 276:6591-6604; Теллман (Telleman), Джунханс (Junghans), 2000, Immunology 100:245-251; Медсан (Medesan) та інші, 1998, Eur. J. Immunol. 28:2092-2100; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання. Такі мутації можуть включати заміни, додання, делеції або будь-яку їх комбінацію, і здійснюються, як правило, сайт-спрямованим мутагенезом із застосуванням одного або декількох мутагенних олігонуклеотидів за методами, опис яких наведено у цьому описі, або за методами, відомими у цій галузі техніки (дивись, наприклад, Сембрук (Sambrook) та інші, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3 видання, 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. та Бергер (Berger), Кіммел (Kimmel), METHODS IN ENZYMOLOGY, том 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, 10 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Academic Press, Inc., San Diego, штат Каліфорнія, які включено до цього опису шляхом посилання). За певними варіантами здійснення амінокислотні заміни можуть (1) знижувати сприйнятливість до протеолізу, (2) знижувати сприйнятливість до окиснення, (3) змінювати зв'язувальну спорідненість та/або (4) надавати або модифікувати інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких поліпептидів. За певними варіантами здійснення одиночна амінокислотна заміна або численні амінокислотні заміни (за певними варіантами здійснення консервативні амінокислотні заміни) можуть здійснюватись у природній послідовності (за певними варіантами здійснення на ділянці поліпептиду за межами домену(-ів), що забезпечує(ють) міжмолекулярні контакти). За певними варіантами здійснення консервативна амінокислотна заміна, як правило, суттєво не змінює структурні характеристики вихідної послідовності (наприклад, замінна амінокислота не повинна руйнувати або мати схильності до руйнування вторинної структури, що відрізняє вихідну послідовність, наприклад, спіралі). Приклади визнаних у цій галузі вторинних та третинних структур поліпептидів описані у PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (редактор Крейтон (Creighton)), 1984, W.H. Freeman and Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (редактори К. Бренден (C. Branden), Дж. Туз (J. Tooze)), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; Торнтон (Thornton) та інші, 1991, Nature 354:105; кожну із цих робот включено до цього опису шляхом посилання. Термін "антитіло" або "антитіло-пептид(-и)” означає інтактне антитіло або його зв'язувальний фрагмент, що конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв'язування. За певними варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують методами рекомбінантних ДНК. За додатковими варіантами здійснення зв'язувальні фрагменти одержують шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Зв'язувальні фрагменти включають (але ними не обмежуються) F(ab), F(ab), F(ab)2, Fv та одноланцюгові антитіла. Цей винахід пропонує антитіла, що містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згадані важкий і легкий ланцюги спільно утворюють антигензв'язувальну структуру, здатну до специфічного зв'язування B7RP1. Непроцесований важкий ланцюг складається з варіабельної ділянки, VH, і трьох константних ділянок, CH1, CH2 і CH3. Варіабельна ділянка важкого ланцюга, VH, знаходиться на аміно-кінці поліпептиду, а константна ділянка важкого ланцюга, CH3, знаходиться на карбоксильному кінці. Термін "важкий ланцюг", що вживається у цьому описі, стосується непроцесованого важкого ланцюга і його фрагментів. Непроцесований легкий ланцюг складається з варіабельної ділянки, VL, та константної ділянки, CL. Подібно до важкого ланцюга, варіабельна ділянка легкого ланцюга знаходиться на аміно-кінці поліпептиду. Термін "легкий ланцюг", що вживається у цьому описі, стосується непроцесованого легкого ланцюга і його фрагментів. F(ab)-фрагмент складається з одного легкого ланцюга, CH1, і варіабельних ділянок одного важкого ланцюга. Молекула важкого ланцюга F(ab) не може утворювати дисульфідного зв'язку з іншою молекулою важкого ланцюга. F(ab)-фрагмент включає один легкий ланцюг і один важкий ланцюг, що містить більшу частину константної ділянки, між ділянками CH1 і CH2, завдяки чому між двома важкими ланцюгами може утворюватись міжланцюговий дисульфідний зв'язок з утворенням молекули F(ab)2. Fv-ділянка включає варіабельні ділянки як важкого, так і легкого ланцюгів, однак їй бракує константних ділянок. Одноланцюгові антитіла є молекулами Fv, у яких варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів з'єднуються гнучким лінкером з утворенням одного поліпептидного ланцюга, який являє собою антигензв'язувальну ділянку. Одноланцюгові антитіла докладно обговорюються у WO 88/01649 і патентах США № 4,946,778 і № 5,260,203. Слід розуміти, що двовалентне антитіло, окрім "мультиспецифічного" або "мультифункціонального" антитіла, за певними варіантами здійснення включає зв'язувальні сайти, що мають ідентичну антигенну специфічність. При визначенні зв'язування та специфічності антитіла за цим винаходом, антитіло по суті пригнічує адгезію ліганду до рецептора, коли надлишок антитіла зменшує кількість ліганду, зв'язаного з рецептором щонайменше приблизно на 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % або більше (що визначається, inter alia, із застосуванням in vitro реакції конкурентного зв'язування). Словосполучення "нейтралізуюче антитіло" означає молекулу антитіла, здатну блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію антигена-мішені, з яким вона зв'язується. Відповідно, "нейтралізуюче" анти-B7RP1 антитіло є здатним блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію B7RP1, наприклад, зв'язування з рецептором та/або викликання клітинної реакції. Словосполучення "суттєво знизити" означає щонайменше приблизно 60 %, щонайменше приблизно 70 %, щонайменше приблизно 75 %, щонайменше приблизно 80 %, щонайменше 11 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приблизно 85 % або щонайменше приблизно 90 % зниження ефекторної функції антигенамішені (наприклад, людського B7RP1). Термін "антигенна детермінанта" включає будь-яку детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або Т-клітинним рецептором. За певними варіантами здійснення антигенні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, наприклад, амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і за певними варіантами здійснення можуть мати специфічні об'ємні структурні характеристики та/або специфічні зарядні характеристики. Антигенна детермінанта являє собою ділянку антигену, яка зв'язується антитілом. За певними варіантами здійснення кажуть, що антитіло специфічно зв'язується з антигеном, коли воно переважно розпізнає свою антиген-мішень у складній суміші білків та/або макромолекул. За певними варіантами здійснення кажуть, що антитіло специфічно -6 -7 зв'язується з антигеном, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить 10 M, 10 M, 10 8 -9 -10 -11 -12 -12 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M або менше ніж приблизно 10 M. Антитіло зв'язує "по суті ту саму антигенну детермінанту", що і еталонне антитіло, коли два антитіла розпізнають ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються. Найширше застосовуваними і швидкими методами визначення того, чи зв'язують два антитіла ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються, є конкурентні реакції, які можуть розроблятись для здійснення у найрізноманітніших форматах, із застосуванням міченого антигену або міченого антитіла. Як правило, антиген іммобілізують на субстраті, і здатність немічених антитіл до блокування зв'язування мічених антитіл визначається за допомогою радіоактивних або ферментних міток. Термін "агент" вживають у цьому описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів. Терміни "мітка" або "мічений", що вживається у цьому описі, означають включення виявного маркера, наприклад, шляхом включення амінокислоти, міченої радіоактивним ізотопом, або приєднання до поліпептиду біотинових складових, які можуть бути виявлені міченим авідином (наприклад, стрептавідином, який містить виявний маркер, наприклад, флуоресцентний маркер, хемілюмінесцентний маркер, або який має ферментативну активність, що може бути виявлена оптичними або колориметричними методами). За певними варіантами здійснення згадана мітка може також бути терапевтичною. У цій галузі відомі різні методи мічення поліпептидів і глікопротеїнів, які можуть ефективно бути застосовані у методах, що розкриваються у цьому описі. Прикладами міток для поліпептидів є (але ними не обмежуються) наведені нижче: 3 14 15 35 90 99 111 125 радіоактивні ізотопи або радіоактивні нукліди (наприклад, H, C, N, S, Y, mTc, In, I, 131 I), флуоресцентні мітки (наприклад, флуоресцинізотіоціанат або FITC, родамін або лантаноїдні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза з хрону, галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні мітки, гаптенові мітки, наприклад, біотинільні групи, та попередньо визначені поліпептидні антигенні детермінанти, розпізнані вторинним репортером (наприклад послідовності зі зв'язаними парами залишків лейцину, зв'язувальні сайти вторинних антитіл, ділянки зв'язування металів або мітки антигенних детермінант). За певними варіантами здійснення мітки приєднуються спейсерними групами (наприклад (CH2)n, де n менше ніж приблизно 20) різної довжини для зменшення можливої стеричної невідповідності. Термін "біологічна проба", що вживається у цьому описі, означає (але не обмежується) будьяку кількість речовини від живої особини або раніше живої особини. Такі живі особини включають (але не обмежуються) людей, мишей, мавп, пацюків, кролів та інших тварин. Такі речовини включають (але не обмежуються) кров, сироватку, сечу, клітини, органи, тканини, кістку, кістковий мозок, лімфатичні вузли та шкіру. Термін "фармацевтичний агент або лікарський засіб", що вживається у цьому описі, означає хімічну сполуку або композицію, здатну спричинювати бажаний терапевтичний ефект у разі відповідного введення хворому. Слід розуміти, що словосполучення "фармацевтично ефективна кількість" у відношенні фармацевтичної композиції, що містить одне або декілька антитіл за цим винаходом, означає, за цим винаходом, кількість згаданої фармацевтичної композиції, що є здатною до запобігання, у згаданого хворого, зниження порогу чутливості до зовнішніх подразників із поверненням згаданого порогу чутливості до рівня, порівнянного з тим, що спостерігається у здорових суб'єктів. "Розладом" є будь-який стан, що поліпшується у разі лікування за цим винаходом. Терміни "розлад" та "хворобливий стан" вживаються у цьому описі взаємозамінно і включають хронічні та гострі розлади імунної системи або захворювання імунної системи, пов'язані з невідповідною імунною реакцією, у тому числі ті патологічні стани, які сприяють виникненню у ссавця згаданого розладу. Ряд станів та розладів, що поліпшуються у разі лікування за цим винаходом, описані, 12 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 наприклад, у міжнародній заявці PCT/US00/01871 (Публікація WO 00/46240), розкриття якої у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Словосполучення "хвороба імунної системи" та "хворобливий стан імунної системи" стосуються будь-якого медичного стану або розладу, пов'язаного з підвищеними рівнями B7RP1, підвищеною чутливістю до B7RP1 або захворюваннями, опосередкованими Тклітинами, у тому числі, але без обмеження, автоімунним захворюванням, строком життєздатності трансплантату, трансплантацією кісткового мозку та органів, алогенною сенсибілізацією унаслідок переливання крові, синдромом токсичного шоку, залежними від Тклітин, опосередкованими В-клітинами захворюваннями, хронічними запальними захворюваннями, пов'язаними із хронічною дисфункцією імунокомпетентних клітин, лімфопроліферативними розладами (наприклад, плазмаклітинною мієломою, макроглобулінемією Вальденстрьома та кріоглобулінемією) і раком. Необмежувальними прикладами автоімунних захворювань є системний червоний вовчак, ревматоїдний артрит, імунна тромбоцитопенічна пурпура (ITP), розсіяний склероз, діабет і псоріаз. Необмежувальними прикладами хронічних запальних захворювань є запальна хвороба кишечнику (наприклад, хвороба Крона та неспецифічний виразковий коліт), хвороба Грейвса, тиреоїдит Хашімото та цукровий діабет. Словосполучення "хвороба імунної системи" та "хворобливий стан імунної системи" стосуються також будь-якого клінічного стану, який поліпшився б у разі пригнічення продукування антитіл, наприклад, реакції підвищеної чутливості. Реакції підвищеної чутливості можуть бути спричинені, наприклад, полінозом, алергіями, астмою, атопічним захворюванням і гострим набряком. До числа необмежувальних прикладів захворювань, що спричинюють антитілоопосередковані реакції підвищеної чутливості, належать системний червоний вовчак, артрит (наприклад, ревматоїдний артрит, реактивний артрит, псоріатичний артрит), нефропатії (наприклад, гломерулонефрит, мембранозні, мезангіокапілярні, вогнищеві сегментні, вогнищеві некротизуючі, серпоподібні і проліферативні нефропатії, наприклад, тубулопатії), шкірні розлади (наприклад, звичайна пухирчатка та пемфігоїд, вузлувата еритема), ендокринопатії (наприклад, тиреоїдит, хвороба Грейвса, тиреоїдит Хашімото, інсулінозалежний цукровий діабет), різні пневмопатії (наприклад, невластивий альвеоліт), різні васкулопатії, захворювання черевної порожнини, захворювання з аберантним продукуванням IgA, багато анемій і тромбоцитопеній, гострий первинний ідіопатичний полірадикулоневрит та важка псевдопаралітична міастенія. Словосполучення "ефективна кількість" та "терапевтично ефективна кількість", що вживаються у цьому описі, у разі вживання відносно носія або фармацевтичної композиції, що містить одне або декілька людських антитіл проти людського B7RP1, означає кількість або дозу, достатню для викликання бажаного результату (тобто у разі лікування із застосуванням носія або фармацевтичної композиції, що містить людські антитіла проти людського B7RP1 за цим винаходом, бажаним результатом є, наприклад, бажана зміна реакції Т-клітин) або підтримання зменшення рівня однієї або декількох біологічних активностей B7RP1, що спостерігається. Конкретніше, терапевтично ефективною кількістю є кількість людського антитіла(-іл) проти людського B7RP1, достатня для пригнічення, впродовж деякого періоду часу, одного або декількох клінічно визначених патологічних процесів, що пов'язуються зі згаданим станом, наприклад, імунного захворювання або розладу, у суб'єкта, якого піддають in vivo лікуванню за допомогою згаданого засобу. За цим винаходом "ефективна кількість" анти-B7RP1 антитіла може змінювати реакції Т-клітин у пацієнта. У способах за цим винаходом термін "контроль" та його граматичні варіанти вживаються для позначення запобігання, часткового або повного пригнічення, зменшення, затримки або уповільнення небажаного явища, наприклад, імунної реакції. Ефективна кількість може різнитися у залежності від конкретного вибраного носія або людського антитіла(-іл) проти людського B7RP1, і залежить також від різноманітних факторів та станів, пов'язаних із суб'єктом, якого піддають лікуванню, а також тяжкості розладу. Наприклад, у разі, якщо носій або людське антитіло(-а) проти людського B7RP1 повинні вводитись in vivo, факторами, які повинні прийматись до уваги, є вік, маса та стан здоров'я хворого, а також криві залежності "доза-ефект" та дані щодо токсичності, одержані у передклінічних дослідах на тваринах. Якщо засіб має контактувати з клітинами in vitro, слід розробити також різноманітні передклінічні in vitro дослідження для визначення таких параметрів, як поглинання, час напіввиведення, доза, токсичність тощо. Визначення ефективної кількості або терапевтично ефективної кількості даного засобу знаходиться у межах здатності фахівців у цій галузі. Терміни "В7-споріднений білок-1" та "B7RP1", що вживаються у цьому описі, визначаються як нативна послідовність B7RP1 усіх видів ссавців, що описується у публікації міжнародної заявки WO 00/46240, яку включено до цього опису шляхом посилання. 13 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Словосполучення "по суті чистий" або "по суті очищений", що вживається у цьому описі, означає сполуку або різновид, представлений переважним різновидом (тобто на молярній основі, це різновид у складі композиції, кількісно переважаючий будь-який інший окремий різновид). За певними варіантами здійснення по суті очищеною фракцією є композиція, де згадані різновиди становлять щонайменше приблизно 50 % (на молярній основі) усіх присутніх макромолекулярних різновидів. За певними варіантами здійснення по суті чиста композиція буде містити більше ніж приблизно 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 99 % усіх макромолярних різновидів, присутніх у композиції. За певними варіантами здійснення різновид є очищеним по суті до однорідності (забруднювальні різновиди у складі композиції не можуть бути виявлені за допомогою традиційних методів виявлення), коли композиція містить по суті один макромолекулярний різновид. Термін "хворий" означає людей і тварин. "Лікування" або "лікувати" означає терапевтичне лікування, профілактичні або запобіжні заходи. До тих, що потребують лікування, належать ті, що вже мають захворювання, а також схильні до появи захворювання, або ті, появі захворювання у яких необхідно запобігти. Якщо контекстом не вимагається іншого, терміни у однині будуть включати множину, а терміни у множині будуть включати однину. За певними варіантами здійснення цього винаходу антитіла, спрямовані проти B7RP1, можуть застосовуватись для лікування захворювань та розладів імунної системи, у тому числі (але без обмеження) згаданих вище. За одним з аспектів цього винаходу пропонуються повністю людські моноклональні антитіла, які були одержані проти і які мають біологічну та імунологічну специфічність до зв'язування з людським B7RP1. За іншим аспектом винахід пропонує нуклеїнові кислоти, що містять нуклеотидні послідовності, що кодують амінокислотні послідовності важкого та легкого ланцюгів імуноглобулінових молекул, зокрема, послідовності, що відповідають їхнім варіабельним ділянкам. Конкретними варіантами здійснення цього аспекту винаходу є послідовності, що відповідають гіперваріабельним ділянкам (CDR), зокрема, CDR1-CDR3, важких і легких ланцюгів, що пропонуються цим винаходом. За ще іншим аспектом цей винахід пропонує клітини гібридом та лінії клітин, що експресують імуноглобулінові молекули та антитіла, такі як моноклональні антитіла за цим винаходом. Цей винахід пропонує також біологічно та імунологічно очищені препарати антитіл, таких як моноклональні антитіла, що були одержані проти і які мають біологічну та імунологічну специфічність до зв'язування з людським B7RP1. Можливість клонування та реконструювання людських локусів величиною у мільйони п.н. у дріжджових штучних хромосомах (YAC) та їх введення до мишачої зародкової лінії, надає вигідний підхід до встановлення функціональних складових дуже великих або приблизно картованих локусів, а також розробки корисних моделей людського захворювання. Окрім того, застосування такої методики для заміни мишачих локусів їхніми людськими еквівалентами надає унікальну можливість зрозуміння механізмів експресії та регуляції продуктів людського гена у процесі їх розвитку, їх зв'язку з іншими системами та їх залучення до індукування і розвитку захворювання. Важливим практичним варіантом застосування такої методики є "гуманізація" мишачої гуморальної імунної системи. Введення людських імуноглобулінових (Ig) локусів мишам, у яких ендогенні Ig гени були інактивовані, надає можливість вивчення механізмів, що лежать у основі програмованої експресії та складання антитіл, а також їх ролі у розвитку B-клітин. На додаток до цього, подібна методика забезпечує джерело продукування повністю людських моноклональних антитіл (MАb). Термін "людське антитіло" означає антитіла, що мають варіабельні і константні ділянки, які по суті відповідають імуноглобуліновим послідовностям людської зародкової лінії. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються ссавцями, окрім людини, у тому числі (але без обмеження) гризунами, наприклад, мишами та пацюками, і зайцеподібними, наприклад, кроликами. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються клітинами гібридоми. За певними варіантами здійснення людські антитіла продукуються рекомбінантним шляхом. Термін "рекомбінантний" у відношенні антитіла означає антитіла, які одержують, експресують, створюють або виділяють рекомбінантними способами. Репрезентативними прикладами є антитіла, експресовані за допомогою рекомбінантного експресійного вектора, трансфікованого до клітини-хазяїна, антитіла, виділені з бібліотеки рекомбінантних гібридних людських антитіл, антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), що є трансгенною за людськими імуноглобуліновими генами (дивись, наприклад, Тейлор Л.Д. (Taylor L.D.) та інші, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, (1992)) або антитіла, одержані, експресовані, створені або 14 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виділені будь-якими способами, що залучають розщеплення послідовностей людського імуноглобулінового гена на інші послідовності ДНК. Такі рекомбінантні людські антитіла мають варіабельні та константні ділянки, одержані з імуноглобулінових послідовностей людської зародкової лінії. Людські антитіла мають щонайменше три переваги над нелюдськими та гібридними антитілами для застосування при лікуванні людей: 1) оскільки ефекторна ділянка антитіла є людською, вона може краще взаємодіяти з іншими складовими частинами людської імунної системи (наприклад, ефективніше знищувати клітинимішені за допомогою комплементзалежної цитотоксичності (CDC) або антитілозалежної клітинної цитотоксичності (ADCC)); 2) людська імунна система не повинна розпізнавати людське антитіло як чужорідне і, завдяки цьому, гуморальна імунна відповідь проти такого введеного антитіла повинна бути слабкішою, аніж проти повністю чужорідного нелюдського антитіла або частково чужорідного гібридного антитіла; 3) повідомляли про те, що введені нелюдські антитіла мають набагато коротший час напіввиведення у системі кровообігу людини, аніж час напіввиведення людських антитіл. Час напіввиведення введених людських антитіл буде по суті ідентичним до часу напіввиведення природних людських антитіл, що надасть можливість рідшого введення менших доз. Очікується, таким чином, що повністю людські антитіла зведуть до мінімуму імуногенні та алергійні реакції, притаманні мишачим моноклональним антитілам та дериватизованим із мишачих моноклональних антитіл і, завдяки цьому, підвищать ефективність та безпечність введених антитіл. Повністю людські антитіла за цим винаходом, таким чином, можуть застосовуватись для лікування захворювань та розладів, пов'язаних із невідповідною імунною реакцією, лікування яких потребує повторного введення антитіл. Таким чином, одна з конкретних переваг анти-B7RP1 антитіл за цими винаходом полягає у тому, що згадані антитіла є повністю людськими і можуть вводитись хворим безболісним способом з одночасним зведенням до мінімального рівня негативних реакцій, які традиційно пов'язуються з людськими антимишачими антитілами або іншими раніше описаними частково людськими антитілами від інших видів, окрім людини. Фахівець у цій галузі може одержати лінії мишей, дефіцитних щодо продукування мишачих антитіл, із великими фрагментами людських Ig локусів, завдяки чому такі миші продукують людські антитіла за відсутності мишачих антитіл. Великі людські Ig фрагменти можуть зберігати велике розмаїття варіабельних генів, а також відповідну регуляцію продукування і експресії антитіл. Завдяки використанню мишачих клітинних механізмів для диверсифікації та добору антитіл і відсутності імунологічної толерантності до людських білків, спектр репродукованих людських антитіл у таких мишачих лініях надає високоспоріднені антитіла проти будь-якого антигену, що становить інтерес, у тому числі людських антигенів. За допомогою гібридомної технології можуть продукуватись і відбиратись антиген-специфічні людські моноклональні антитіла бажаної специфічності. Можуть застосовуватись трансгенні тварини (наприклад, миші), що є здатними, у разі імунізації, до продукування повного спектру людських антитіл за відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, наслідком перенесення сукупності людських зародкових імуноглобулінових генів до таких ембріональних мутантних мишей буде продукування людських антитіл у разі антигенної стимуляції (дивись, наприклад, Джейкобовіц (Jakobovits) та інші, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Джейкобовіц (Jakobovits) та інші, 1993, Nature 362:255-258; Бруггемен (Bruggemann) та інші, 1993, Year in Immun. 7:33, 1994, Nature 148:1547-1553) та 1996, Nature Biotechnology 14:826; Гросс (Gross) та інші, 2000, Nature 404:995-999; та патенти США № 5,877,397, № 5,874,299, № 5,814,318, № 5,789,650, № 5,770,429, № 5,661,016, № 5,633,425, № 5,625,126, № 5,569,825 та № 5,545,806 (кожен з яких включено до цього опису у повному обсязі шляхом посилання для будь-якої цілі)). Людські антитіла можуть також продукуватись у бібліотеках із проявленням у фагах (Хугенбум (Hoogenboom), Вінтер (Winter), J. Mol. Biol., 227:381 (1992); Маркс (Marks) та інші, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Доступними для одержання людських моноклональних антитіл є також методи Коул (Cole) та інших і Бернер (Boerner) та інших (Коул (Cole) та інші, Monoclonal Antibodies and Cancer Тherap., Alan R. Liss, стор. 77 (1985); Бернер (Boerner) та інші, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). Рекомбінантні людські антитіла можуть також бути піддані in vitro мутагенезу (або, у разі застосування тварин, трансгенних за людськими Ig послідовностями, in vivo соматичному мутагенезу) і, таким чином, амінокислотні послідовності VH та VL ділянок рекомбінантних антитіл являють собою послідовності, які, у разі одержання з послідовностей, пов'язаних із людськими 15 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зародковими VH та VL послідовностями, можуть не існувати за природних умов у межах зародкового спектру людських антитіл in vivo. За певними варіантами здійснення досвідчений фахівець для продукування гібридних антитіл такими мишами може застосовувати константні ділянки від інших видів, окрім людини, разом із людською(-ими) варіабельною(-ими) ділянкою(-ами). Біспецифічне або гетеровалентне антитіло, як правило, являє собою штучне гібридне антитіло, що має дві різні пари важкий ланцюг/легкий ланцюг та два різні зв'язувальні центри. Біспецифічні антитіла можна одержати різноманітними методами, у тому числі (але без обмеження) шляхом злиття гібридом або зв'язування F(ab)-фрагментів. Дивись, наприклад, Сонгсівілаї (Songsivilai), Лахман (Lachmann), 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Костелні (Kostelny) та інші, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Цей винахід пропонує антитіла, що зв'язуються з людським B7RP1. Ці антитіла можуть продукуватись шляхом імунізації повномірним B7RP1 або його фрагментами. Антитіла за цим винаходом можуть бути поліклональними або моноклоналними та/або можуть бути рекомбінантними антитілами. За варіантом, якому віддається перевага, антитілами за цим винаходом є людські антитіла, які одержують, наприклад, шляхом імунізації трансгенних тварин, здатних до продукування людських антитіл (дивись, наприклад, публікацію міжнародної заявки WO 93/12227). Гіперваріабельні ділянки (CDR) варіабельних ділянок легких і важких ланцюгів анти-B7RP1 антитіл за цим винаходом можуть пересаджуватись до остовних ділянок (FR) того самого або іншого виду. За певними варіантами здійснення гіперваріабельні ділянки варіабельних ділянок легкого і важкого ланцюгів анти-B7RP1 антитіла можуть пересаджуватись до консенсусних людських остовних ділянок. Для одержання консенсусних людських остовних ділянок, остовні ділянки амінокислотних послідовностей декількох людських важких або легких ланцюгів впорядковано розміщують для визначення консенсусних амінокислотних послідовностей. Остовні ділянки важкого або легкого ланцюга анти-B7RP1 антитіла можуть бути замінені основними ділянками іншого важкого або легкого ланцюга. Рідкі амінокислоти у остовних ділянках важких і легких ланцюгів анти-B7RP1 антитіла, як правило, не замінюються, у той час як решта амінокислот остовних ділянок можуть замінюватись. Рідкими амінокислотами є специфічні амінокислоти, які знаходяться у положеннях, які вони, як правило, у остовних ділянках не займають. Пересаджені варіабельні ділянки анти-B7RP1 антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись із константною ділянкою, що відрізняється від константної ділянки анти-B7RP1 антитіла. За альтернативним варіантом, пересаджені варіабельні ділянки є частиною одноланцюгового Fv-антитіла. Пересадження гіперваріабельної ділянки описують, наприклад, у патентах США № 6,180,370, № 5,693,762, № 5,693,761, № 5,585,089 та № 5,530,101, які включено до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі. Антитіла за цим винаходом можуть одержуватись за допомогою трансгенних мишей, до антитілопродукувальних клітин яких була введена значна частина людського антитілопродукувального локусу. Ці миші були також додатково піддані генно-інженерним заходам для того, щоб перетворитись на дефіцитних із продукування ендогенних мишачих антитіл. Такі миші є здатними до продукування людських імуноглобулінових молекул і антитіл, і не продукують мишачих імуноглобулінових молекул та антитіл або продукують їх у значно зменшеному обсязі. Методики досягнення такого результату розкриваються у патентах, заявках та посиланнях, які розкриваються у наведеному описі. За певними варіантами здійснення досвідчений фахівець може застосовувати методи, розкриті у публікації міжнародної заявки WO 98/24893, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. Дивись також роботу Мендес (Mendez) та інші, 1997, Nature Genetics 15:146-156, яку включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. Моноклональні антитіла (mAb) за цим винаходом можуть продукуватись різноманітними методами, у тому числі за традиційною методикою продукування моноклональних антитіл, наприклад, за стандартною методикою гібридизації соматичних клітин Колер (Kohler) та Мілстейн (Milstein) (1975, Nature 256:495). Можуть застосовуватись і інші методики продукування моноклональних антитіл, наприклад, вірусна або онкогенна трансформація Bлімфоцитів. Ілюстративною тваринною системою для одержання гібридом є миші. Спосіб продукування гібридом мишачим організмом відомий у цій галузі, а схеми імунізації та методи виділення імунізованих спленоцитів для злиття також відомі у цій галузі. Відомими є також клітини, що зливаються (наприклад, клітини мишачої мієломи), та методики злиття. За певним варіантом здійснення людські моноклональні антитіла, спрямовані проти B7RP1, можуть одержуватись за допомогою трансгенних мишей, які, замість мишачої імунної системи, 16 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 несуть складові частини людської імунної системи. Ці трансгенні миші, яких у цьому описі позначають як "HuMab" мишей, несуть в собі мінілокус людського імуноглобулінового гена, що кодує неаранжовані імуноглобулінові послідовності людського важкого ланцюга (типів  та ) і легкого ланцюга типу , разом із цільовими мутаціями, які інактивують локуси ендогенних ланцюгів типів  і  (Лонберг (Lonberg) та інші, 1994, Nature 368:856-859). Відповідно, миші демонструють знижену експресію мишачого IgM або  і, у відповідь на імунізацію, введені трансгени людського важкого ланцюга і легкого ланцюга зазнають зміну класу і соматичну мутацію з продукуванням високоспоріднених людських моноклональних антитіл IgG  (Лонберг (Lonberg) та інші (дивись вище); Лонберг (Lonberg), Гушар (Huszar), 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:69-93; Гардінг (Harding), Лонберг (Lonberg), 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Одержання HuMab мишей докладно описано у роботах Тейлор (Taylor) та інші, 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295; Чен (Chen) та інші, 1993, International Immunology, 5:647-656; Тайон (Tuaillon) та інші, 1994, J. Immunol. 152: 2912-2920; Лонберг (Lonberg) та інші, 1994, Nature 368:856-859; Лонберг (Lonberg), 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Тейлор (Taylor) та інші, 1994, International Immunology 6:579-591; Лонберг (Lonberg), Гушар (Huszar), 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Гардінг (Harding), Лонберг (Lonberg), 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci 764:536-546; Фішвайлд (Fishwild) та інші, 1996, Nature Biotechnology 14:845-851, які у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Дивись також патенти США № 5,545,806; № 5,569,825; № 5,625,126; № 5,633,425; № 5,789,650; № 5,877,397; № 5,661,016; № 5,814,318; № 5,874,299; та № 5,770,429 (усі на ім'я Лонберг (Lonberg) та Кей (Kay)), а також патент США № 5,545,807 (на ім'я Сурані (Surani) та інші); міжнародні заявки WO 93/1227 (опублікована 24 липня 1993 року); WO 92/22646 (опублікована 23 грудня 1992 року); та WO 92/03918 (опублікована 19 березня 1992 року), зміст яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. За альтернативним варіантом для одержання людських антиB7RP1 антитіл можуть застосовуватись трансгенні лінії мишей, опис яких представлено у наведених нижче Прикладах. Цей винахід пропонує людські моноклональні антитіла, які є специфічними до біологічно активних людських B7RP1 поліпептидів і нейтралізують їх. Цей винахід пропонує також амінокислотні послідовності важкого і легкого ланцюгів антитіла, які є високоспецифічними до B7RP1 поліпептидів і нейтралізують їх, у тому разі, коли вони зв'язуються з ними. Ця висока специфічність надає можливість людським антитілам проти людського B7RP1 та людським моноклональним антитілам із подібною специфічністю бути ефективним імунотерапевтичним засобом для лікування B7RP1-асоційованих захворювань. За одним з аспектів цей винахід пропонує виділені людські антитіла, що зв'язують ту саму або по суті ту саму антигенну детермінанту, що і антитіло 16Н, яке пропонується цим винаходом. За одним з аспектів цей винахід пропонує виділені людські антитіла, що містять щонайменше одну з амінокислотних послідовностей, представлених ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 1-40 або № 44-58, що зв'язують антигенну детермінанту B7RP1 поліпептидів із високою спорідненістю і є здатними до антагонізування активності B7RP1 поліпептидів. Ці антитіла можуть зв'язувати ту саму або по суті ту саму антигенну детермінанту, що і антитіла проти B7RP1, показані у наведених нижче Прикладах. За певними варіантами здійснення виділені антитіла зв'язуються з поліпептидом B7RP1 з -6 -7 -8 -9 -10 -11 константою дисоціації (KD) приблизно 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M або менше і пригнічують B7RP1-індуковану виживаність у in vitro реакції нейтралізації з EC50 приблизно 10 6 -7 -8 -9 M, 10 M, 10 М, 10 М або менше. Приклади людських антитіл проти людського B7RP1, які задовольняють вищезгаданим критеріям зв'язування та нейтралізації, наведені у цьому описі. За певними варіантами здійснення людські антитіла проти людського B7RP1 за цим винаходом у цьому описі називають 16H, 16Hg (ембріонального типу), 5D, 2H, 2Hg (ембріонального типу), 15H, 41H та 43H. Антитіло 16H містить поліпептидні послідовності V L та VH, які представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ № 7 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 1, відповідно. Антитіло 16Hg містить поліпептидні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга (V L) і варіабельної ділянки важкого ланцюга (VH), які представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ № 1 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 8, відповідно. Антитіло 5D містить поліпептидні послідовності VL і VH, які представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ № 2 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 9, відповідно. Антитіло 2H містить поліпептидні послідовності VL і VH, які представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ № 3 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 10, відповідно. Антитіло 2Hg містить поліпептидні послідовності VL і VH, які представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ № 3 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 11, відповідно. Антитіло 15H містить поліпептидні послідовності VL і VH, які представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ № 4 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 12, відповідно. Антитіло 41H містить поліпептидні послідовності VL і VH, які представлені 17 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПОСЛІДОВНІСТЮ № 5 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 13, відповідно. Антитіло 43H містить поліпептидні послідовності VL і VH, які представлені ПОСЛІДОВНІСТЮ № 6 і ПОСЛІДОВНІСТЮ № 14, відповідно. Властивості людських антитіл проти людського B7RP1 конкретно розкриваються у Прикладах. Слід звернути особливу увагу на високу спорідненість до поліпептиду B7RP1 і високу здатність до антагонізування активності поліпептиду B7RP1, які демонструються у цьому описі. Константа дисоціації (KD) людського антитіла проти людського B7RP1 може визначатись поверхневим плазмонним резонансом, як у цілому описано у наведених нижче Прикладах. Взагалі, аналізом поверхневого плазмонного резонансу (SPR) із застосуванням системи BIAcore® (Pharmacia Biosensor, Piscataway, штат Нью-Джерсі) у масштабі реального часу визначають зв'язувальні взаємодії між лігандом (рекомбінантний B7RP1 поліпептид, іммобілізований на біосенсорній матриці) та речовиною, яку піддають аналізу (антитіла у розчині). Аналіз поверхневого плазмонного резонансу може здійснюватись також шляхом іммобілізації речовини, яку піддають аналізу (антитіла на біосенсорній матриці), і представленням ліганду (рекомбінант V у розчині). Константа дисоціації (KD) людського антитіла проти людського B7RP1 може визначатись також за методикою KinExA. За певними варіантами здійснення цього винаходу антитіла зв'язуються з B7RP1 з KD, що становить -5 -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 приблизно 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M або 10 M. Термін "KD", що вживається у цьому описі, означає константу дисоціації конкретної взаємодії антитіла-антигена. Для цілей цього винаходу KD визначали як показано у наведених нижче Прикладах. За певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом належать до ізотипів IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Згадані антитіла можуть належати до ізотипу IgG2 або IgG1. За іншими варіантами здійснення антитіла за цим винаходом належать до ізотипів IgM, IgA, IgE або IgD. За певними варіантами здійснення цього винаходу згадані антитіла містять людський легкий ланцюг типу каппа та людський важкий ланцюг IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. Експресію антитіл за цим винаходом, що містять константну ділянку важкого ланцюга IgG1 або IgG2, описують у наведених нижче Прикладах. За конкретними варіантами здійснення варіабельні ділянки згаданих антитіл лігуються до іншої константної ділянки, окрім константної ділянки ізотипів IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. За певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом клонували для експресії у клітинах ссавців. За певними варіантами здійснення наслідком консервативних модифікацій важких ланцюгів і легких ланцюгів анти-B7RP1 антитіл (і відповідних модифікацій кодувальних нуклеотидів) буде одержання анти-B7RP1 антитіл, що мають функціональні і хімічні характеристики, подібні до відповідних характеристик анти-B7RP1 антитіл, розкритих у цьому описі. У протилежність до цього, значні модифікації функціональних та/або хімічних характеристик анти-B7RP1 антитіл можуть здійснюватись шляхом вибору замін у амінокислотній послідовності важких і легких ланцюгів, що значно відрізняються за їх ефектом на підтримання (a) структури молекулярного остову на ділянці заміни, наприклад, листової або спіральної конформації, (b) заряду або гідрофобності молекули на цільовій ділянці, або (c) об'єму бічного ланцюга. Наприклад, "консервативна амінокислотна заміна" може включати заміну нативного амінокислотного залишку ненативним залишком, що незначно або зовсім не впливає на полярність або заряд амінокислотного залишку у цьому положенні. Окрім того, будь-який нативний залишок поліпептиду може також бути замінений на аланін, як описувалось раніше для "мутагенезу методом ідентифікування аланіну". Амінокислотні заміни (консервативні або неконсервативні) можуть визначатись фахівцями у цій галузі під час виникнення необхідності у таких замінах. За певними варіантами здійснення амінокислотні заміни можуть застосовуватись для ідентифікування тих амінокислотних залишків антитіла проти B7RP1, які є залученими до зв'язувальної специфічності або спорідненості згаданого антитіла до B7RP1 (наприклад, залишків, які є залученими до зв'язування згаданого антитіла з конкретною антигенною детермінантою), наприклад, амінокислотних залишків на ділянках CDR1, CDR2 та/або CDR3 легкого або важкого ланцюгів, як представлено у цьому описі. Такі амінокислотні заміни можуть підвищувати або зменшувати спорідненість антитіл проти B7RP1, опис яких наведено. Наслідком незначних замін у амінокислотній послідовності, наприклад, видалення, додання або заміни однієї, декількох або навіть декількох десятків амінокислот, може бути одержання алельної форми вихідного білка, яка має по суті ідентичні властивості. Таким чином, на додаток до антитіл, опис яких наведено, інші "по суті гомологічні" антитіла можуть легко розроблятись і одержуватись із застосуванням різноманітних методів рекомбінантних ДНК, добре відомих фахівцям у цій галузі. Взагалі, модифікації генів можуть легко здійснюватись різноманітними добре відомими методами, наприклад, сайт-спрямованим мутагенезом. Таким чином, цей 18 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винахід передбачає "варіантні" або "мутантні" людські антитіла проти B7RP1, що мають характеристики по суті подібні характеристикам людських антитіл проти B7RP1, які розкриваються у цьому описі. (Дивись, наприклад, WO 00/56772, яку у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання). Таким чином, згаданий термін "варіантне" або "мутантне" у відношенні до людського антитіла проти B7RP1 означає будь-яку зв'язувальну молекулу (молекулу X) (i) гіперваріабельні ділянки CDR1, CDR2 і CDR3 важкого ланцюга або гіперваріабельні ділянки CDR1, CDR2 і CDR3 легкого ланцюга якої, взяті у цілому, є щонайменше на приблизно 80 % гомологічними, щонайменше на приблизно 90 % гомологічними або щонайменше на приблизно 95 % гомологічними гіперваріабельним ділянкам, представленим ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 15-26, або ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 27-40, відповідно, і (ii) варіант або мутант якої є здатним до пригнічення активності людського B7RP1 такою самою мірою, що і еталонне людське антитіло проти B7RP1, яке має остовні ділянки, ідентичні остовним ділянкам молекули X. Такі антитіла можуть зв'язуватись з людським B7RP1 або мишачим B7RP1 чи з обома з них. Послідовність мишачого B7RP1 описується у WO 00/46240, яку включено до цього опису шляхом посилання. За звичайних умов варіант людського антитіла проти B7RP1 буде мати гіперваріабельні ділянки легкого та/або важкого ланцюга, які, взяті у цілому, мають щонайменше приблизно 80 % ідентичність амінокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 85 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 90 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 91 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 92 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 93 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 94 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 95 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 96 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 97 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 98 % ідентичність послідовностей або щонайменше приблизно 99 % ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 15-26 та/або ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 27-40, відповідно. Такі антитіла можуть зв'язуватись з людським B7RP1 або мишачим B7RP1 чи з обома з них. Варіант людського антитіла проти B7RP1 буде мати варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка, взята у цілому, має щонайменше приблизно 80 % ідентичність амінокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 81 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 82 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 83 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 84 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 85 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 86 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 87 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 88 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 89 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 90 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 91 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 92 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 93 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 94 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 95 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 96 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 97 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 98 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 99 % ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 1-6, та/або варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка, взята у цілому, має щонайменше приблизно 70 % ідентичність амінокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 75 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 80 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 81 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 82 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 83 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 84 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 85 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 86 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 87 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 88 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 89 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 90 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 91 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 92 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 93 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 94 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 95 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 96 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 97 % ідентичність послідовностей, щонайменше приблизно 98 % ідентичність послідовностей або щонайменше приблизно 99 % ідентичність послідовностей з амінокислотними послідовностями, представленими 19 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 7-14. Такі антитіла можуть зв'язуватись із людським B7RP1 та/або мишачим B7RP1. Як буде зрозуміло фахівцям у цій галузі техніки, багато з потенційно CDR-контактуючих залишків піддаються заміні на інші амінокислоти і, незважаючи на це, дозволяють антитілу зберегти значний ступінь спорідненості до антигену. Таким самим чином, багато каркасних залишків, які не контактують із гіперваріабельними ділянками важких і легких ланцюгів, можуть містити заміни на амінокислоти з відповідних положень інших людських антитіл, людські консенсусні амінокислоти або з інших мишачих антитіл без значної втрати спорідненості або неімуногенності людським антитілом. Вибір різних альтернативних амінокислот може застосовуватись для продукування варіантів розкритих антитіл проти B7RP1 та їхніх фрагментів, що мають різні комбінації спорідненості, специфічності, неімуногенності, легкості виготовлення та інших бажаних властивостей. Термін "варіант" відносно полінуклеотиду означає нуклеїновокислотну молекулу, що має щонайменше приблизно 75 % ідентичність нуклеїновокислотної послідовності з полінуклеотидною послідовністю за цим винаходом. За звичайних умов полінуклеотидний варіант буде мати щонайменше приблизно 75 % ідентичність нуклеїновокислотної послідовності, щонайменше приблизно 80 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 81 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 82 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 83 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 84 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 85 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 86 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 87 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 88 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 89 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 90 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 91 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 92 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 93 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 94 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 95 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 96 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 97 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей, щонайменше приблизно 98 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей або щонайменше приблизно 99 % ідентичність нуклеїновокислотних послідовностей з новою амінокислотною послідовністю, що розкривається у цьому описі. За альтернативними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть експресуватись у інших лініях клітин, окрім ліній клітин гібридом. За цими варіантами здійснення для трансформації відповідних клітин-хазяїв ссавців можуть застосовуватись послідовності, що кодують конкретні антитіла.За цими варіантами здійснення трансформація може здійснюватись за допомогою будь-якого відомого способу введення полінуклеотидів до клітини-хазяїна, у тому числі, наприклад, шляхом пакування полінуклеотиду до вірусу (або до вектора на основі вірусного геному) і трансдукції клітини-хазяїна згаданим вірусом (або вектором) чи за допомогою методів трансфекції, відомих у цій галузі, як описано у патентах США № 4,399,216, № 4,912,040, № 4,740,461 та № 4,959,455 (усі з яких включені до цього опису шляхом посилання для будь-якої цілі). Взагалі, застосована методика трансформації може залежати від хазяїна, що піддається трансформації. Методи введення гетерологічних полінуклеотидів до клітин ссавців є добре відомими у цій галузі і включають (але без обмеження) декстранопосередковану трансфекцію, осадження фосфатом кальцію, полібрен-опосередковану трансфекцію, злиття протопластів, електропорацію, пакування полінуклеотиду(-ів) до ліпосом та пряму мікроін'єкцію ДНК до ядер. Нуклеїновокислотну молекулу, що кодує амінокислотну послідовність константної ділянки важкого ланцюга, варіабельної ділянки важкого ланцюга, константної ділянки легкого ланцюга або варіабельної ділянки легкого ланцюга B7RP1-антитіла за цим винаходом, вводять до відповідного експресійного вектора за допомогою стандартного методу лігування. За одним варіантом здійснення константна ділянка важкого ланцюга або легкого ланцюга анти-B7RP1 антитіла додається до C-кінця відповідної варіабельної ділянки і лігується до експресійного вектора. Згаданий вектор, як правило, вибирають таким чином, щоб він був функціональним у конкретній застосованій клітині-хазяїні (тобто згаданий вектор є сумісним із механізмами 20 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітини-хазяїна такою мірою, що може відбуватись ампліфікація та/або експресія гена). Огляд експресійних векторів дивись у роботі METH. ENZ. 185 (редактор Геддел (Goeddel)), 1990, Academic Press. За типовим варіантом, експресійні вектори, що застосовуються у будь-якій з клітин-хазяїв, будуть містити послідовності для підтримання плазмід та для клонування і експресії екзогенних нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності, які за певними варіантами здійснення у сукупності називають "фланкуючими послідовностями", будуть, як правило, включати одну або декілька з наведених нижче нуклеотидних послідовностей: промотор, одну або декілька енхансерних послідовностей, сайт ініціації реплікації, термінатор транскрипції, повну інтронну послідовність, що містить донорну та акцепторну точку сплайсингу, послідовність, що кодує лідерну послідовність для секреції поліпептиду, сайт зв'язування рибосоми, послідовність поліаденілування, полілінкерну ділянку для введення нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид для експресії та селективний маркерний елемент. Кожна із цих послідовностей обговорюється нижче. За факультативним варіантом, згаданий вектор може містити послідовність кодування "мітки", тобто олігонуклеотидну молекулу, розміщену на 5 або 3 кінці поліпептидної кодувальної послідовності анти-B7RP1 антитіла; згадана олігонуклеотидна послідовність кодує поліHis (наприклад, гексаHis) або іншу "мітку", наприклад, FLAG, HA (гемаглютинін вірусу грипу) або myc, для яких існують комерційно доступні антитіла. Ця мітка, як правило, зливається з поліпептидом при його експресії, і може правити за засіб афінного очищення або виявлення B7RP1 антитіла у клітині-хазяїні. Афінне очищення може здійснюватись, наприклад, шляхом хроматографування на колонках із застосуванням антитіл проти згаданої мітки, як афінної матриці. За факультативним варіантом, згадана мітка може у подальшому видалятись з очищеного анти-B7RP1 антитіла різними способами, наприклад, шляхом застосування певних пептидаз для розщеплення. Фланкуючі послідовності можуть бути гомологічними (тобто від того самого виду та/або штаму, що і клітина-хазяїн), гетерологічними (тобто від інших видів, окрім виду клітини-хазяїна або штаму), гібридними (тобто комбінація фланкуючих послідовностей з більше ніж одного джерела), синтетичними або нативними. Як таким, джерелом фланкуючої послідовності може бути будь-який прокаріотний або еукаріотний організм, будь-який хребетний або безхребетний організм або будь-яка рослина, за умови, що згадана фланкуюча послідовність є функціональною у клітинних механізмах клітини-хазяїна і може бути активованою клітинними механізмами клітини-хазяїна. Фланкуючі послідовності, придатні для згаданих векторів за цим винаходом, можна одержати за допомогою будь-якого з декількох способів, добре відомих у цій галузі. За типовим варіантом, фланкуючі послідовності, придатні для цього винаходу, будуть попередньо ідентифікуватись шляхом картування та/або рестриктазного розщеплення і можуть, таким чином, виділятись з відповідного тканинного джерела за допомогою відповідних рестриктаз. У деяких випадках, повна нуклеотидна послідовність фланкуючої послідовності може бути відомою. У такому разі, фланкуюча послідовність може бути синтезована за допомогою наведених у цьому описі методів синтезу або клонування нуклеїнових кислот. Незалежно від того, чи є відомою уся або лише частина фланкуючої послідовності, цю фланкуючу послідовність можна одержати за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (PCR) та/або шляхом скринінгу геномної бібліотеки за допомогою відповідного зонда, наприклад. олігонуклеотиду та/або фрагмента фланкуючої послідовності від того самого або іншого виду. У разі, коли фланкуюча послідовність є невідомою, фрагмент ДНК, що містить фланкуючу послідовність, може бути виділений із більшого відрізку ДНК, що може містити, наприклад, кодувальну послідовність або навіть інший ген або гени. Виділення може здійснюватись шляхом рестриктазного розщеплення з одержанням відповідного фрагмента ДНК із подальшим виділенням шляхом очищення на лунках із гелем агарози, хроматографування на колонках Qiagen® (Chatsworth, штат Каліфорнія) або за допомогою інших методів, відомих досвідченому фахівцю. Вибір відповідних ферментів для досягнення згаданої мети буде очевидним для пересічного фахівця у цій галузі. Сайт ініціації реплікації являє собою, як правило, частину тих прокаріотних експресійних векторів, які одержують із комерційних джерел, і згаданий сайт допомагає у разі ампліфікації вектора у клітині-хазяїні. Якщо обраний вектор не містить сайта ініціації реплікації, його можна синтезувати хімічним шляхом, виходячи з відомої послідовності, та лігувати до вектора. Наприклад, сайт ініціації реплікації з плазміди pBR322 (фірма New England Biolabs, Beverly, штат Массачусетс) є придатним для більшості грамнегативних бактерій, а різноманітні вірусні сайти (наприклад, SV40, вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу везикулярного стоматиту (VSV) або 21 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вірусу папіломи, наприклад, вірусу папіломи людини (HPV) або вірусу папіломи великої рогатої худоби (BPV)) є придатними для клонування векторів у клітинах ссавців. Взагалі, така складова, як сайт ініціації реплікації не є необхідною для експресійних векторів ссавців (наприклад, сайт ініціації реплікації SV40 часто застосовують лише тому, що він містить також ранній промотор вірусу). Термінатор транскрипції, як правило, знаходиться у прямому (3) напрямку відносно кінця поліпептидної кодувальної ділянки і призначений для закінчення транскрипції. Термінатор у клітинах-прокаріотах являє собою, як правило, G-C-збагачений фрагмент, за яким іде полі(T)послідовність. Незважаючи на те, що термінатор легко клонується з бібліотеки або навіть одержується з комерційних джерел як частина вектора, він може бути легко синтезований за допомогою методів синтезу нуклеїнових кислоти, наприклад, наведених у цьому описі. Селектований маркерний ген кодує білок, необхідний для виживання та росту клітинихазяїна, яка вирощується на селективному культуральному середовищі. Типові селектовані маркерні гени кодують білки, які (a) забезпечують стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, тетрацикліну або канаміцину у разі прокаріотних клітин-хазяїв; (b) доповнюють ауксотрофні дефіцити клітини; або (c) постачають критичні поживні речовини, недоступні із живильних середовищ повного або певного складу. Ілюстративними селектованими маркерними генами є ген стійкості до канаміцину, ген стійкості до ампіциліну та ген стійкості до тетрацикліну. Перевага полягає у тому, що ген стійкості до неоміцину може також застосовуватись для вибору як прокаріотних, так і еукаріотних клітин-хазяїв. Для ампліфікації гена, який буде експресуватись, можуть застосовуватись інші селектовані гени. Ампліфікація являє собою процес, під час якого гени, необхідні для продукування білка, критичного для росту або виживання клітини, послідовно повторюються у хромосомах наступних генерацій рекомбінантних клітин. Прикладами придатних селектованих маркерів для клітин ссавців є дигідрофолатредуктаза (DHFR) та безпромоторні гени тимідинкінази. Клітинитрансформанти ссавців піддаються селекційному тиску, у разі якого лише трансформанти виявляються специфічно пристосованими для виживання завдяки присутності у векторі селектованого гена. Селекційний тиск накладається шляхом культивування трансформованих клітин за умов, при яких концентрація селекційного засобу у живильному середовищі поступово збільшується, наслідком чого є ампліфікація як селектованого гена, так і ДНК, що кодує інший ген, наприклад, антитіло, що зв'язується з B7RP1 поліпептидом. Як наслідок, з ампліфікованої ДНК синтезуються підвищені кількості поліпептиду, наприклад, анти-B7RP1 антитіла. Сайт зв'язування рибосоми є, як правило, необхідним для ініціювання трансляції мРНК і характеризується присутністю послідовності Шайна-Делгарно (прокаріоти) або послідовності Козака (еукаріоти). Згаданий елемент знаходиться, як правило, у прямому (3) напрямку відносно промотору і зворотному (5) напрямку відносно кодувальної послідовності поліпептиду, що буде експресуватись. У деяких випадках, наприклад, коли бажаним є глікозилування експресійної системи, представленої еукаріотною клітиною-хазяїном, для поліпшення глікозилування або виходу можна здійснювати маніпуляції з різними пре- або пропослідовностями. Наприклад, можна змінити сайт пептидазного розщеплення конкретного сигнального пептиду або додати пропослідовності, які також можуть вплинути на глікозилування. Кінцевий білковий продукт може мати у -1 положенні (відносно першої амінокислоти зрілого білка) одну або декілька додаткових амінокислот, зв'язаних з експресією, які могли бути неповністю видаленими. Наприклад, кінцевий білковий продукт може мати один або два амінокислотні залишки на сайті пептидазного розщеплення, приєднані до амінокінця. За альтернативним варіантом, наслідком застосування деяких сайтів ферментативного розщеплення може буде дещо укорочена форма бажаного поліпептиду, якщо фермент виявляє свою дію на такій ділянці у межах зрілого поліпептиду. Вектори експресії та клонування за цим винаходом будуть, як правило, містити промотор, який розпізнається організмом-хазяїном і є функціонально зв'язаним із молекулою, що кодує анти-B7RP1 антитіло. Промоторами є нетранскрибовані послідовності, які знаходяться у зворотному напрямку (тобто 5) відносно стартового кодону структурного гена (як правило, приблизно у межах від 100 п.н. до 1000 п.н.), що контролюють транскрипцію структурного гена. Промотори, за традицією, об'єднують одним або двома класами: індуцибельні промотори і конститутивні промотори. Індуцибельні промотори ініціюють підвищені рівні транскрипції з ДНК під своїм контролем у відповідь на деяку зміну умов культивування, наприклад, присутність або відсутність поживної речовини або зміну температури. Конститутивні промотори, з іншого боку, одностайно транскрибують ген, з яким вони є функціонально зв'язаними, тобто з незначним або повною відсутністю контролю за експресією гена. Добре відомою є велика кількість промоторів, 22 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 що розпізнаються різноманітними потенційними клітинами-хазяями. Придатний промотор функціонально зв'язується з ДНК, що кодує важкий ланцюг або легкий ланцюг, що містить антиB7RP1 антитіло за цим винаходом, шляхом видалення згаданого промотору з ДНК-джерела рестриктазним розщепленням і введенням бажаної промоторної послідовності до вектора. У цій галузі добре відомими є також придатні промотори для застосування з дріжджовими клітинами-хазяями. Дріжджові енхансери застосовуються переважно з дріжджовими промоторами. Придатні промотори для застосування з клітинами-хазяями ссавців є добре відомими і включають (але без обмеження) промотори, одержані з геномів таких вірусів, як вірус поліоми, вірус віспи птиці, аденовірус (наприклад, аденовірус 2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птиці, вірус цитомегалії людини, ретровіруси, вірус гепатиту В і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, мавпячий вірус 40 (SV40). До інших придатних промоторів ссавців належать гетерологічні промотори ссавців, наприклад, промотори теплового шоку та промотор актину. Додаткові промотори, що можуть становити інтерес, включають (але не обмежуються): ранній промотор SV 40 (Бернуа (Bernoist), Шамбон (Chambon), 1981, Nature 290:304-310); промотор CMV (Томсен (Thomsen) та інші, 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81:659-663); промотор, що міститься у 3 довгому кінцевому повторі вірусу саркоми Рауса (Ямамото (Yamamoto) та інші, 1980, Cell 22:787-797); промотор тимідинкінази вірусу герпесу (Вагнер (Wagner) та інші, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); промотор та регуляторні послідовності гена металотіоніну (Брінстер (Brinster) та інші, 1982, Nature 296:39-42); та промотори прокаріот, наприклад, промотор бета-лактамази (Вілла-Камароф (Villa-Kamaroff) та інші, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-3731); або tac промотор (Дебер (DeBoer) та інші, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:21-25). Інтерес становлять також наведені нижче ділянки транскрипційного контролю тварин, які демонструють тканинну специфічність і застосовуються у трансгенних тварин: контрольна ділянка гена еластази I, що є активною у ацинарних клітинах підшлункової залози (Свіфт (Swift) та інші, 1984, Cell 38:639-646; Орніц (Ornitz) та інші, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); Макдоналд (MacDonald), 1987, Hepatology 7:425515); контрольна ділянка інсулінового гена, що є активною у бета-клітинах підшлункової залози (Ханахан (Hanahan), 1985, Nature 315:115-122); контрольна ділянка імуноглобулінового гена, що є активною у лімфоїдних клітинах (Гросшедл (Grosschedl) та інші, 1984, Cell 38:647-658; Адамес (Adames) та інші, 1985, Nature 318:533-538; Александер (Alexander) та інші, 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444); контрольна ділянка вірусу пухлин молочної залози мишей, що є активною у тестикулярних клітинах, клітинах молочної залози, лімфоїдних клітинах та тканинних базофільних гранулоцитах (Ледер (Leder) та інші, 1986, Cell 45:485-495); контрольна ділянка альбумінового гена, що є активною у печінці (Пінкерт (Pinkert) та інші, 1987, Genes and Devel. 1:268-276); контрольна ділянка гена альфа-фетобілка, що є активною у печінці (Крумлауф (Krumlauf) та інші, 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648; Хаммер (Hammer) та інші, 1987, Science 235:53-58); контрольна ділянка гена альфа 1-антитрипсину, що є активною у печінці (Келсі (Kelsey) та інші, 1987, Genes and Devel. 1:161-171); контрольна ділянка гена бета-глобіну, що є активною у мієлоїдних клітинах (Могрем (Mogram) та інші, 1985, Nature 315:338-340; Колліас (Kollias) та інші, 1986, Cell 46:89-94); контрольна ділянка основного мієлінового білка, що є активною у олігодендроцитах головного мозку (Рідхед (Readhead) та інші, 1987, Cell 48:703712); контрольна ділянка гена легкого ланцюга-2 міозину, що є активною у скелетних м'язах (Сані (Sani), 1985, Nature 314:283-286); та контрольна ділянка гена гонадотропінвивільнювального гормону, що є активною у гіпоталамусі (Мейсон (Mason) та інші, 1986, Science 234:1372-1378). Енхансерна послідовність може вводитись до вектора для підсилення транскрипції ДНК, що кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг, що містить анти-B7RP1 антитіло за цим винаходом, вищими еукаріотами. Енхансери є цис-діючими елементами ДНК, довжиною, як правило, приблизно 10-300 п.н., які діють на промотор для підсилення транскрипції. Енхансери є відносно орієнтаційно та позиційно незалежними, оскільки їх знаходили як у 5-, так і у 3-положеннях відносно транскрипційної одиниці. Відомими є декілька енхансерних послідовностей, доступних із генів ссавців (наприклад, глобін, еластаза, альбумін, альфа-фетопротеїн та інсулін). Типово, однак, застосовують енхансер із вірусу. Зразковими енхансерними елементами для активації еукаріотних промоторів є такі відомі у цій галузі, як енхансер SV 40, енхансер раннього промотору вірусу цитомегалії людини, енхансер вірусу поліоми та енхансери аденовірусу. Незважаючи на те, що енхансер може займати у векторі 5- або 3-положення відносно кодувальної послідовності, він, як правило, розміщується на ділянці у зворотному напрямку (5) відносно промотора. 23 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Експресійні вектори за цим винаходом можуть конструюватись із вихідного вектора, наприклад, комерційно доступного вектора. Такі вектори можуть містити або можуть не містити усі бажані фланкуючі послідовності. У разі, якщо у згаданому векторі немає однієї або декількох фланкуючих послідовностей, опис яких наведено, вони можуть бути одержані у індивідуальному порядку і ліговані до вектора. Методи, що застосовуються для одержання кожної зі згаданих фланкуючих послідовностей, є добре відомими фахівцю у цій галузі. Після завершення конструювання вектора і введення нуклеїновокислотної молекули, що кодує легкий ланцюг, важкий ланцюг або легкий ланцюг і важкий ланцюг, що містить антиB7RP1 антитіло, на відповідну ділянку вектора, готовий вектор може вводитись до відповідної клітини-хазяїна для ампліфікації та/або експресії поліпептиду. Трансформація експресійного вектора для анти-B7RP1 антитіла у вибраній клітині-хазяїні може здійснюватись добре відомими методами, у тому числі шляхом трансфекції, інфекції, копреципітації фосфатом кальцію, електропорації, мікроін'єкції, ліпофекції, трансфекції, опосередкованої ДЕАЕдекстраном або інших відомих методів. Вибраний метод буде частково залежати від типу застосованої клітини-хазяїна. Ці методи та інші придатні методи є добре відомими досвідченому фахівцю і наведені, наприклад, у довіднику Сембрук (Sambrook) та інших (дивись вище). Клітина-хазяїн, культивована за відповідних умов, синтезує анти-B7RP1 антитіло, яке у подальшому може виділятись із культурального середовища (якщо клітина-хазяїн секретує його до живильного середовища) або безпосередньо з клітини-хазяїна, що його продукує (якщо воно не секретується). Вибір придатної клітини-хазяїна буде залежати від різних факторів, у тому числі бажаних рівнів експресії, модифікацій поліпептиду, що є бажаними або необхідними для активності (наприклад, глікозилування або фосфорилування) та легкості укладання у біологічно активну молекулу. Лінії клітин ссавців, доступні як хазяї для експресії, є добре відомими у цій галузі і включають (але без обмеження) імморталізовані лінії клітин, доступні від Американської колекції типових культур (ATCC), у тому числі (але без обмеження), клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO), клітини HeLa, клітини нирок хом'ячка (BHK), клітини нирок мавпи (COS), клітини злоякісної гепатоми людини (наприклад, Hep G2) та ряд інших клітинних ліній. За певними варіантами здійснення лінії клітин можуть бути вибрані шляхом визначення, яка з клітинних ліній має високі рівні експресії і конститутивно продукує антитіла з B7RP1-зв'язувальними властивостями. За іншими варіантами здійснення може бути вибрана лінія клітин В-клітинної лінії диференціювання, яка не продукує свого власного антитіла, але є здатною до продукування та секреції гетерологічного антитіла. Антитіла за цим винаходом є придатними для виявлення B7RP1 у біологічних пробах та ідентифікування клітин або тканин, що продукують B7RP1 білок. Антитіла за цим винаходом, які специфічно зв'язуються з B7RP1, можуть бути придатними для лікування B7RP1опосередкованих захворювань. Згадані антитіла можуть застосовуватись у реакціях зв'язування для виявлення B7RP1 та пригнічення утворення комплексу B7RP1 із рецепторами B7RP1. Згадані антитіла, що зв'язуються з B7RP1 і блокують взаємодію з іншими зв'язувальними сполуками, можуть мати терапевтичне застосування при модулюванні B7RP1-опосередкованих захворювань. За певними варіантами здійснення антитіла проти B7RP1 можуть блокувати зв'язування B7RP1 з його рецептором, наслідком чого може бути руйнування шляху трансдукції B7RP1-індукованого сигналу. Цей винахід має також відношення до застосування одного або декількох антитіл за цим винаходом для виготовлення лікарського засобу для лікування розладу або стану, що спричинюється підвищеною експресією B7RP1 або підвищеною чутливістю до B7RP1 у хворого, наприклад, будь-якого з розладів або хворобливих станів, розкритих у цьому описі. За певними варіантами здійснення цей винахід пропонує фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість одного або декількох антитіл за цим винаходом спільно із фармацевтично прийнятним розріджувачем, носієм, солюбілізатором, емульгатором, консервантом та/або ад'ювантом. Матеріали, придатні для композицій, є нетоксичними для реципієнтів у застосованих дозах та концентраціях. За варіантами, яким віддають перевагу, пропонуються фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість антиB7RP1 антитіл. За певними варіантами здійснення матеріали, придатні для композицій, є нетоксичними для реципієнтів у застосованих дозах та концентраціях. За певними варіантами здійснення фармацевтична композиція може містити матеріали для модифікування, підтримання або збереження, наприклад, рН, осмотичного тиску, в'язкості, прозорості, кольору, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, швидкості розчинення або виділення, поглинання або проникнення згаданої композиції. За такими варіантами здійснення 24 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до придатних для одержання композицій матеріалів належать (але ними не обмежуються) амінокислоти (наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин); протимікробні засоби; антиоксиданти (наприклад, аскорбінова кислота, сульфіт натрію або гідросульфіт натрію); буфери (наприклад, борат, бікарбонат, трис-HCl, цитрати, фосфати або інші органічні кислоти); наповнювачі (наприклад, маніт або гліцин); хелатоутворювачі (наприклад, етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA)); комплексоутворювачі (наприклад, кофеїн, полівінілпіролідон, бета-циклодекстрин або гідроксипропіл-бета-циклодекстрин); заповнювачі; моносахариди; дисахариди; та інші вуглеводи (наприклад, глюкоза, маноза або декстрини); білки (наприклад, сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни); барвники, коригенти та розріджувачі; емульгатори; гідрофільні полімери (наприклад, полівінілпіролідон); поліпептиди низької молекулярної маси; солетворні протиіони (наприклад, натрій); консерванти (наприклад, хлорид бензалконію, бензойна кислота, саліцилова кислота, тімеросаль, фенетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидин, сорбінова кислота або пероксид водню); розчинники (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь або поліетиленгліколь); спирти з цукру (наприклад, маніт або сорбіт); суспендувальні засоби; поверхнево-активні або змочувальні речовини (наприклад, плуроніки, поліетиленгліколь, складні ефіри сорбітану, полісорбати, наприклад, полісорбат 20, полісорбат 80, тритон, трометамін, лецитин, холестерин, тилоксапал); речовини, що сприяють підвищенню стійкості (наприклад, цукроза або сорбіт); засоби, що сприяють підвищенню ізотонічності (наприклад, галогеніди лужних металів, за варіантом, якому віддається перевага, хлорид натрію або калію, маніт, сорбіт); носії; розчинники; наповнювачі та/або фармацевтичні ад'юванти. Дивись REMINGRTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 видання, (редактор А.Р. Геннаро (A.R. Gennaro)), 1990, Mack Publishing Company. За певними варіантами здійснення оптимальна фармацевтична композиція буде визначатись фахівцем у цій галузі у залежності від, наприклад, передбачуваного шляху введення, формату доставки та бажаної дози. Дивись, наприклад, REMINGRTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (дивись вище). За певними варіантами здійснення такі композиції можуть впливати на фізичний стан, стійкість, швидкість виділення in vivo та швидкість виведення in vivo антитіл за цим винаходом. За певними варіантами здійснення головний розчинник або носій фармацевтичної композиції може бути за своєю природою водним або неводним. Наприклад, прийнятним розчинником або носієм може бути вода для ін'єкцій, фізіологічний розчин або штучна цереброспінальна рідина, можливо, доповнена іншими матеріалами, що традиційно застосовуються у композиціях для парентерального введення. Додатковими зразковими носіями є нейтральний буферний розчин або фізіологічний розчин у суміші із сироватковим альбуміном. За певними варіантами здійснення фармацевтичні композиції за цим винаходом містять трис-буфер із приблизним рН 7,0-8,5 або ацетатний буфер із приблизним рН 4,0-5,5 і можуть додатково містити сорбіт, цукрозу, твін-20 та/або їхні придатні замісники. За певними варіантами здійснення цього винаходу композиції анти-B7RP1 антитіла можуть готуватись для збереження шляхом змішування вибраної композиції, що має бажаний ступінь чистоти, з факультативними речовинами для виготовлення композицій (REMINGRTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (дивись вище)) у вигляді ліофілізованого брикету або водного розчину. На додаток до цього, за певними варіантами здійснення анти-B7RP1 антитіло може вводитись до складу композиції як ліофілізат із застосуванням придатних наповнювачів, наприклад, цукрози. Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть вибиратись для парентерального введення. За альтернативним варіантом, композиції можуть вибиратись для інгаляції або доставки через травний тракт, наприклад, пероральним шляхом. Виготовлення таких фармацевтично прийнятних композицій знаходиться у межах можливостей цієї галузі. Компоненти композиції, за варіантом, якому віддається перевага, надаються у концентраціях, які є прийнятними для місця введення. За певними варіантами здійснення буфери застосовуються для підтримання композиції у межах фізіологічного або дещо нижчого рН, як правило, у діапазоні рН від приблизно 5 до приблизно 8. У разі, коли передбачається парентеральне введення, терапевтичні композиції для застосування за цим винаходом можуть надаватись у формі апірогенного, парентерально прийнятного водного розчину, що містить бажане анти-B7RP1 антитіло у фармацевтично прийнятному розчиннику. Особливо прийнятним розчинником для парентеральної ін'єкції є стерильна дистильована вода, до якої анти-B7RP1 антитіло вводять у вигляді стерильного, відповідним чином консервованого ізотонічного розчину. За певними варіантами здійснення виготовлення композиції може включати введення до її складу бажаної молекули з агентом, 25 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, придатними для ін'єкцій мікросферами, частинками, що піддаються біорозкладу, полімерними сполуками (наприклад, полімером молочної кислоти або полігліколевою кислотою), кульками або ліпосомами, який може забезпечити пролонговане вивільнення згаданого продукту, який може доставлятись шляхом ін'єкції речовин уповільненого всмоктування. За певними варіантами здійснення може застосовуватись також гіалуронова кислота, що має ефект збільшення часу перебування у системі кровообігу. За певними варіантами здійснення для введення бажаної молекули антитіла можуть застосовуватись засоби доставки лікарського препарату, що імплантуються. Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть виготовлятись у формі, придатній для інгаляції. За цими варіантами здійснення композиціям, до складу яких входять анти-B7RP1 антитіла, надається форма сухого порошку для інгаляцій. За певними варіантами здійснення до складу інгаляційних розчинів анти-B7RP1 антитіла може вводитись пропелент для аерозольної доставки. За певними варіантами здійснення розчини можуть розпилюватись. Внутрішньолегеневе введення і способи одержання таких композицій додатково описані у міжнародній заявці PCT/US94/001875, яка включена до цього опису шляхом посилання і описує внутрішньолегеневу доставку хімічно модифікованих білків. Передбачається також, що композиції можуть вводитись пероральним шляхом. Анти-B7RP1 антитіла, що вводяться подібним чином, можуть вводитись до складу композицій з носіями або без носіїв, які традиційно застосовуються при виготовленні твердих лікарських форм, наприклад, таблеток та капсул. За певними варіантами здійснення капсула може конструюватись таким чином, щоб вивільнення активної складової композиції відбувалось на ділянці шлунково-кишкового тракту, коли біодоступність є максимальною, а передсистемний розклад є мінімальним. Для полегшення поглинання анти-B7RP1 антитіла можуть включатись додаткові агенти. Можуть застосовуватись також розріджувачі, коригенти, смоли з низькою температурою розплавлення, рослинні олії, змащувальні речовини, суспендувальні речовини, речовини, що сприяють розпаду таблетки, і в'яжучі речовини. Фармацевтична композиція за цим винаходом, за варіантом, якому віддається перевага, надається таким чином, щоб вона містила ефективну кількість одного або декількох анти-B7RP1 антитіл у суміші з нетоксичними наповнювачами, придатними для виготовлення таблеток. Шляхом розчинення таблеток у стерильній воді або іншому прийнятному носії можуть бути одержані розчини у однодозовій формі. До прийнятних наповнювачів належать (але без обмеження) інертні розріджувачі, наприклад, карбонат кальцію, карбонат або бікарбонат натрію, лактоза або фосфат кальцію; або зв'язувальні речовини, наприклад, крохмаль, желатин або аравійська камедь; або змащувальні речовини, наприклад, стеарат магнію, стеаринова кислота або тальк. Фахівцям у цій галузі будуть очевидні додаткові фармацевтичні композиції, у тому числі композиції, що містять анти-B7RP1 антитіла для пролонгованого вивільнення. Фахівцям у цій галузі відомі також інші способи виготовлення різноманітних інших засобів доставки пролонгованої дії, наприклад, ліпосомних носіїв, мікрочастинок або пористих кульок, що піддаються біорозкладу і ін'єкцій речовин уповільненого всмоктування. Дивись, наприклад, міжнародну заявку PCT/US93/00829, яку включено до цього опису шляхом посилання і яка описує пролонговане вивільнення пористих полімерних мікрочастинок для доставки фармацевтичних композицій. Препарати пролонгованої дії можуть включати напівпроникні полімерні матриці у формі виробів певної форми, наприклад, плівок або мікрокапсул. Матриці пролонгованої дії можуть включати складні поліефіри, гідрогелі, полімери молочної кислоти (як розкривається у патенті США № 3,773,919 та публікації заявки на європатент EP 058481, які включено до цього опису шляхом посилання), співполімери L-глутамінової кислоти та гаммаетил-L-глутамату (Сідмен (Sidman) та інші, 1983, Biopolymers 22:547-556), полі-(2гідроксіетилметакрилат) (Лангер (Langer) та інші, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, Лангер (Langer), 1982, Chem. Tech. 12:98-105), етиленвінілацетат (Лангер (Langer) та інші (дивись вище)) або полі-(D)-(-)-3-гідроксимасляну кислоту (публікація заявки на європатент EP 133,988). Композиції пролонгованої дії можуть включати також ліпосоми, які можуть бути одержані за будь-яким із декількох способів, відомих у цій галузі. Дивись, наприклад, Еппстейн (Eppstein) та інші, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; публікація заявок на європатент EP 036,676; EP 088,046 та EP 143,949, які включено до цього опису шляхом посилання. Фармацевтичні композиції, що застосовуються для введення in vivo, надаються, як правило, у вигляді стерильних препаратів. Стерилізування може здійснюватись шляхом фільтрування через стерильні фільтрувальні мембрани. Коли композиція ліофілізується, стерилізування за цим способом може здійснюватись перед або після ліофілізування та відновлення. Композиції для парентерального введення можуть зберігатись у ліофілізованій формі абоу вигляді 26 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розчину. Парентеральні композиції, як правило, вміщують до контейнера, що має отвір для стерильного доступу, наприклад, до мішечка для зберігання внутрішньовенних розчинів або до флакона з пробкою, яка може проколюватись голкою шприца для ін'єкцій. Після виготовлення фармацевтичної композиції, вона може збірігатись у стерильних флаконах у вигляді розчину, суспензії, гелю, емульсії, твердої речовини або зневодненого чи ліофілізованого порошку. Такі композиції можуть зберігатись у готовій до застосування формі або у формі (наприклад, ліофілізованій), що відновлюється перед введенням. Цей винахід пропонує також набори для введення разової дози. Кожен зі згаданих наборів за цим винаходом може включати перший контейнер, що містить сухий білок, і другий контейнер, що містить водну композицію. За певними варіантами здійснення цього винаходу пропонуються набори, що включають одно- та багатокамерні заздалегідь заповнені шприци (наприклад, шприци для рідини та шприци для введення ліофілізованої речовини). Ефективна кількість фармацевтичної композиції, що містить анти-B7RP1 антитіло, призначеної для терапевтичного застосування, буде залежати, наприклад, від терапевтичного контексту та цілей. Фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, що придатна доза для лікування буде залежати, частково, від молекули, що доставляється, показання, за яким застосовується антиB7RP1 антитіло, шляху введення і розміру (маса тіла, поверхня тіла або розмір органа) та/або стану (вік та загальний стан здоров'я) хворого. За певними варіантами здійснення лікар може титрувати дозу і модифікувати шлях введення для одержання оптимального терапевтичного ефекту. Типова доза може коливатись у межах від приблизно 0,1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг або більше, у залежності від згаданих вище факторів. За певними варіантами здійснення доза може коливатись у межах від 0,1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг; від 1 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг; або від 5 мкг/кг до приблизно 30 мг/кг. Частота введення доз буде залежати від фармакокінетичних параметрів конкретного антиB7RP1 антитіла, що застосовується у композиції. За типовим варіантом, лікар вводить композицію до досягнення дози, що забезпечує одержання бажаного ефекту. Згадана композиція може, таким чином, вводитись разовою дозою або двома чи більше дозами (які можуть містити або можуть не містити однакову кількість бажаної речовини) впродовж певного періоду часу або шляхом безперервного вливання через імплантований засіб або катетер. Додаткове точніше визначення придатної дози здійснюється фахівцями у цій галузі звичайним шляхом і входить до обсягу завдань, які традиційно здійснюються ними. Прийнятність дози може підтверджуватись за допомогою відповідних даних залежності реакції від дози. За певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть вводитись хворим впродовж тривалих періодів часу. Постійне введення антитіла за цим винаходом зводить до мінімального рівня негативні імунні та алергічні реакції, які традиційно пов'язують з антитілами, які одержують проти людського антигену у тваринах, окрім людини, наприклад, із неповним людським антитілом, одержаним у видах, окрім людини. Спосіб введення фармацевтичної композиції відповідає відомим методам, наприклад, пероральним шляхом, шляхом ін'єкцій внутрішньовенним, внутрішньоочеревинним, інтрацеребральним (внутрішньопаренхіматозним), інтрацеребровентрикулярним, внутрішньом'язовим, внутрішньоочним, внутрішньоартеріальним, інтрапортальним шляхами або шляхом введення до середини місця ураження; системами пролонгованого вивільнення або засобами, що імплантуються. За певними варіантами здійснення композиції можуть вводитись шляхом ін'єкції болюса або безперервно шляхом вливання чи засобом, що імплантується. Композиція може також вводитись місцево шляхом імплантування мембрани, губки або іншого відповідного матеріалу, яким бажана молекула була абсорбована або до якого її було включено. За певними варіантами здійснення у разі застосування засобу, що імплантується, засіб може бути імплантованим до будь-якої відповідної тканини або органа, і доставка бажаної молекули може здійснюватись шляхом дифузії, шляхом застосування болюса пролонгованої дії або шляхом безперервного введення. Бажаним може також бути ex vivo застосування фармацевтичних композицій, що містять анти-B7RP1 антитіло за цим винаходом. У подібних випадках, клітини, тканини або органи, видалені у хворого, обробляють фармацевтичними композиціями, що містять анти-B7RP1 антитіло, після чого згадані клітини, тканини та/або органи знову імплантують хворому. Зокрема, анти-B7RP1 антитіла можуть доставлятись шляхом імплантування певних клітин, які були піддані генно-інженерним маніпуляціям із застосуванням таких, наприклад, способів, які наводяться у цьому описі, для експресії та секреції поліпептиду. За певними варіантами здійснення такими клітинами можуть бути клітини тварин або людей, і ці клітини можуть бути автологічними, гетерологічними або ксеногенними. За певними варіантами здійснення згадані 27 UA 102667 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітини можуть бути імморталізовані. За певними варіантами здійснення для зменшення ймовірності імунологічної реакції, клітини можуть бути включені до капсул для запобігання інфільтрації навколишніх тканин. За додатковими варіантами здійснення матеріали для виготовлення згаданих капсул є, як правило, біосумісними, напівпроникними полімерними матеріалами або мембранами, які забезпечують можливість вивільнення білка(-ів), але запобігають знищенню клітин імунною системою хворого або іншими шкідливими факторами з навколишніх тканин. ПРИКЛАДИ Наведені нижче приклади, що включають проведені експерименти і одержані результати, подані виключно з ілюстративною метою, і не повинні розглядатись як такі, що обмежують цей винахід. Приклад 1 Продукування людських моноклональних антитіл проти В7-спорідненого білка-1 (B7RP1) Антиген Очищений рекомбінантний людський B7RP-1 (hB7RP-1), який одержали, як описано у публікації міжнародної заявки WO 00/46240, яку включено до цього опису шляхом посилання, або клітини CHO (клітини яєчника китайського хом'ячка), трансфіковані для експресії hB7RP-1, застосовували як антиген. Зрілий людський B7RP-1 має амінокислотну послідовність від залишку X до залишку 302 у послідовності, наведеній у WO 00/46240 як ПОСЛІДОВНІСТЬ № 17, де X може бути 19, 20, 21, 22, 24 або 28. Трансгенні HuMab миші Повністю людські моноклональні антитіла проти B7RP-1 одержали за допомогою ліній HCo7 та HCo12 HuMab трансгенних мишей, обидві з яких експресують людські гени антитіл. У обох згаданих лініях мишей ендогенний мишачий ген легкого ланцюга каппа був гомозиготно зруйнований, як описано у Чен (Chen) та інші, (1993), EMBO J. 12:811-820, а ендогенний мишачий ген важкого ланцюга був гомозиготно зруйнований, як описано у Прикладі 1 Публікації PCT WO 01/09187. Кожна із цих мишачих ліній несе людський трансген легкого ланцюга каппа, KCo5, як описано у Фішвайлд (Fishwild) та інші, (1996), Nature Biotechnology 14:845-851. Лінія HCo7 несе людський трансген важкого ланцюга HCo7, як описано у патентах США № 5,545,806; № 5,625,825 та № 5,545,807. Лінія HCo12 несе людський трансген важкого ланцюга HCo12, як описано у Прикладі 2 Публікації PCT WO 01/09187. Iмунізації HuMab: Для одержання повністю людських моноклональних антитіл проти B7RP-1, HuMab мишей лінії HCo7 або HCo12 імунізували очищеним рекомбінантним B7RP-1 або клітинами CHO, трансфікованими для експресії B7RP-1. Опис загальних схем імунізації для HuMab мишей наведено у Лонберг (Lonberg) та інші, (1994), Nature 368(6474): 856-859; Фішвайлд (Fishwild) та інші, (1996), Nature Biotechnology 14: 845-851 та Публікації PCT WO 98/24884. Під час першого вливання антигену вік мишей дорівнював 6-16 тижням. Очищений рекомбінантний препарат антигену B7RP-1 (50 мкг) або препарат трансфікованих клітин CHO (3,5106-1107 клітин) застосовували для імунізації HuMab мишей внутрішньоочеревинним шляхом. Трансгенних мишей двічі імунізували очищеним антигеном у повному ад'юванті Фрейнда внутрішньоочеревинним шляхом, після чого, через 2-4 тижні, здійснювали повторні імунізації (у цілому до 8 імунізацій) внутрішньоочеревинним шляхом очищеним антигеном у неповному ад'юванті Фрейнда. Імунізацію клітинами CHO, трансфікованими для експресії B7RP-1, здійснювали таким самим чином, за виключенням того, що повний ад'ювант Фрейнда і неповний ад'ювант Фрейнда з клітинами не застосовували. Імунну реакцію контролювали шляхом ретроорбітальних кровопускань. Плазму перевіряли за допомогою ELISA (як описано нижче), і мишей з достатніми титрами людського імуноглобуліну проти B7RP-1 застосовували для злиття. Миші одержували бустер-ін'єкцію антигену внутрішньовенним шляхом за 3 дні і 2 дні перед умертвінням і видаленням селезінки. Як правило, для кожного антигену здійснювали 1020 злиттів. Кожним антигеном вакцинували декілька десятків мишей. У загальній кількості 28 мишей ліній HCo7 та HCo12 були вакциновані за допомогою B7RP-1. Відбирання HuMab мишей, що продукують антитіла проти B7RP-1: Для відбирання HuMab мишей, що продукують антитіла, які зв'язують B7RP-1, сироватку вакцинованих мишей перевіряли за допомогою ELISA, як описано у Фішвайлд (Fishwild) та інші, (1996). Стисло, титраційні мікропланшети сенсибілізували очищеним рекомбінантним B7RP-1 (розчин 1-2 мкг/мл у PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин), 50 мкл/лунка), інкубували впродовж ночі при температурі 4 C, після чого блокували (200 мкл/лунка) 5 % розчином курячої сироватки у PBS/Твін (0,05 %). До кожної лунки додавали розведення плазми від B7RP-1-вакцинованих мишей і інкубували впродовж 1-2 год. при температурі навколишнього 28