Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)

1. Антитіло до нейропіліну-1 (NRP1), що специфічно зв'язується з NRP1, де антитіло включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить CDRL1, що включає амінокислотну послідовність RASQYFSSYLA (SEQ ID NO:129), CDRL2, що включає амінокислотну послідовність GASSRAS (SEQ ID NO:130), і CDRL3, що включає амінокислотну послідовність QQYLGSPPT (SEQ ID NO:131), та варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить CDRH1, що включає амінокислотну послідовність GFTFSSYAMS (SEQ ID NO:132), CDRH2, що включає амінокислотну послідовність SQISPAGGYTNYADSVKG (SEQ ID NO:133), і CDRH3, що включає амінокислотну послідовність ELPYYRMSKVMDV (SEQ ID NO:134). 2. Антитіло до нейропіліну-1 (NRP1), що специфічно зв'язується з NRP1, за п. 1, що включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:5, і варіабельну UA (21) a200807262 (22) 08.11.2006 (24) 10.10.2011 (86) PCT/US2006/043516, 08.11.2006 (31) 60/734,798 (32) 08.11.2005 (33) US (31) 60/820,561 (32) 27.07.2006 (33) US (46) 10.10.2011, Бюл.№ 19, 2011 р. (72) ВОТТС РАЙАН ДЖ., US, У ЯНЬ, US (73) ДЖЕНЕНТЕК, ІНК., US (56) POZAS ESTHER ET AL: "Age-dependent effects of secreted semaphorins 3A, 3F, and 3E on developing hippocampal axons: In vitro effects and phenotype of Semaphorin 3A (-/-) mice" MOLECULAR AND CELLULAR NEUROSCIENCE, vol. 18, no. 1, July 2001 (2001-07), pages 26-43, XP002435741 ISSN: 1044-7431. NASARRE PATRICK ET AL: "Semaphorin SEMA3F and VEGF have opposing effects on cell attachment and spreading." NEOPLASIA (NEW YORK), vol. 5, no. 1, January 2003 (2003-01), pages 83-92, XP002435742 ISSN: 1522-8002. STEPHENSON JOHN M ET AL: "Neuropilin-1 is differentially expressed in myoepithelial cells and vascular smooth muscle cells in preneoplastic and neoplastic human breast: A possible marker for the progression of breast cancer" INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 101, no. 5, 10 October 2002 (2002-10-10), pages 409-414, XP002435743 ISSN: 0020-7136. LI MIN ET AL: "Pancreatic carcinoma cells express neuropilins and vascular endothelial growth factor, but not vascular endothelial growth factor receptors" CANCER, vol. 101, no. 10, 15 November 2004 (200411-15), pages 2341-2350, XP002435744 ISSN: 0008543X. 2 (19) 1 3 96139 4 ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSQ ISPAGGYTNY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCARGEL PYYRMSKVMD VWGQGTLVTVSS. 3. Антитіло за п. 2, що являє собою антитіло YW107.4.87. 4. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло має здатність зв'язуватися як з мишачим NRP1, так і з людським NRP1. 5. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло являє собою моноклональне антитіло. 6. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло являє собою біспецифічне антитіло. 7. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло являє собою гуманізоване антитіло. 8. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло являє собою людське антитіло. 9. Антитіло за будь-яким з пп. 1-3, де антитіло являє собою синтетичне антитіло. 10. Застосування антитіла до NRP1 за будь-яким з пп. 1-9 для приготування лікарського засобу, призначеного для лікування або попередження порушення, асоційованого з патологічним ангіогенезом у ссавця. 11. Застосування за п. 10, де порушення являє собою рак. 12. Застосування за п. 11, де рак вибирають із групи, що включає рак молочної залози, колоректальний рак, недрібноклітинний рак легені, неходжкінську лімфому (NHL), нирковий рак, рак передміхурової залози, рак печінки, рак голови та шиї, меланому, рак яєчника, мезотеліому, множинну мієлому і гліобластому. 13. Застосування за п. 12, де лікування додатково включає застосування другого терапевтичного агента. 14. Застосування за п. 13, де другий терапевтичний агент являє собою агент, вибраний із групи, що включає антиангіогенний агент, антинеопластичну композицію, хіміотерапевтичний агент і цитотоксичний агент. 15. Застосування за п. 14, у якому антиангіогенний агент являє собою антагоніст VEGF. 16. Застосування за п. 15, у якому антагоніст VEGF являє собою антитіло до hVEGF. 17. Застосування за п. 16, у якому антитіло до hVEGF має здатність зв'язуватися з тим же самим епітопом VEGF, що і антитіло A4.6.1. 18. Застосування за п. 17, у якому антитіло до hVEGF являє собою бевасизумаб або ранібізумаб. 19. Застосування за п. 13, у якому другий терапевтичний агент являє собою інгібітор рецептора тирозинкінази, вибраний із групи, що включає вата® ланіб (PTK787), ерлотиніб (TARCEVA ), OSI-7904, ® ZD6474 (ZACTIMA ), ZD6126 (ANG453), ZD1839, ® сунітиніб (SUTENT ), семаксаніб (SU5416), ® AMG706, AG013736, іматиніб (GLEEVEC ), MLN518, CEP-701, PKC-412, лапатиніб (GSK572016), ® ® VELCADE , AZD2171, сорафеніб (NEXAVAR ), XL880 і CHIR-265. 20. Полінуклеотид, що кодує антитіло до NRP1 за будь-яким з пп. 1-9. 21. Спосіб одержання антитіла до NRP1, що включає експресування вектора, що забезпечує експресію антитіла до NRP1, що включає полінуклеотид за п. 20, в придатній клітині-хазяїні. 22. Спосіб за п. 21, що додатково включає вилучення антитіла до NRP1. 23. Фармацевтична композиція, призначена для лікування порушень, асоційованих з патологічним ангіогенезом, що містить фармацевтично ефективну кількість антитіла до NRP1 за будь-яким з пп. 1-9 і фармацевтично прийнятні допоміжні речовини. 24. Набір для діагностування та лікування порушень, асоційованих з патологічним ангіогенезом, що містить фармацевтично ефективну кількість антитіла до NRP1 за будь-яким з пп. 1-9 і фармацевтично прийнятні допоміжні речовини. 25. Спосіб інгібування зв’язування NRP1 із VEGF у суб’єкта, що включає введення фармацевтично ефективної кількості антитіла до NRP1 за будьяким з пп. 1-9, внаслідок чого антитіло до NRP1 інгібує зв’язування NRP1 із VEGF. 26. Спосіб за п. 25, де суб’єктом є пацієнт, у якого діагностовано порушення, асоційоване з патологічним ангіогенезом. 27. Спосіб виявлення білка NRP1 в зразку, що включає стадії введення в контакт зразка з антитілом до NRP1 за будь-яким з пп. 1-9, і виявлення зв’язування антитіла до NRP1 з білком NRP1. 28. Спосіб за п. 27, в якому порушення являє собою рак. Дана заявка являє собою непопередню заявку, що згідно 35 U.S.C. 119(е) посягає на пріоритет попередніх заявок сер. № 60/734798, поданої 8 листопада 2005 p., і сер. № 60/820561, поданої 27 липня 2006 p., повний зміст яких включено в даний опис як посилання. Галузь техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься в цілому до композицій і способів, які впливають на різні види активності нейропіліну (NRP). Більше конкретно винахід відноситься до композицій і способів модуляції утворення й підтримки судин, опосередковуваної рецептором нейропіліну-1 (NRP1). Даний винахід відноситься також до способів скринінгу терапевтичних субстанций, які можна застосовувати для попередження або лікування станів і захворювань, асоційованих з ангіогенезом. Передумови створення винаходу Розвиток судинної системи є основною умовою для багатьох фізіологічних і патологічних процесів. Для активно зростаючих тканин, таких як тканини ембріонів і пухлин, потрібне відповідне постачання кров'ю. Для задоволення цієї потреби в них продукуються проангіогенні фактори, які підсилюють формування й підтримку нових судин за допомогою процесу, що звичайно називають ангіо 5 генезом. Формування судин являє собою складний, але впорядкований біологічний процес, що включає всі або деякі з наступних стадій: а) проліферацію ендотеліальних клітин (ЕК) на основі існуючих ЕК або їх диференцировка із клітинпопередників; б) міграцію й злипання ЕК з утворенням структур, що мають форму тяжів; в) наступне утворення трубок (тубулогенез) із судинних струн з формуванням судин, що мають центральну порожнину, г) утворення відростків від існуючих тяжів або судин з формуванням вторинних судин; д) додаткове ремоделювання й реструктурування первинного судинного сплетіння; і e) рекрутмент пери-ендотеліальних клітин для оточення зовні (упакування) ендотеліальних трубок, що забезпечує підтримку судин і їхні модуляторні функції; такими клітинами є перицити для невеликих капілярів, гладеньком'язові клітини для великих судин і міокардіальні клітини у серці (Hanahan D. Science 277, 1997, cc. 48-50; Hogan В. L. I Kolodziej P. A. Nature Reviews Genetics. 3, 2002, cc. 513-523; Lubarsky В. і Krasnow M. A. Cell. 112, 2003, cc. 1928). У цей час установлено, що ангіогенез бере участь у патогенезі різних порушень. До них відносяться щільні пухлини й метастази, атеросклероз, ретролентальна фіброплазія, гемангіоми, хронічне запалення, внутріочні неоваскулярні хвороби, такі як проліферативні ретинопатії, наприклад, пов'язана з діабетом ретинопатія, пов'язана з віком дегенерація жовтої плями (AMD), неоваскулярна глаукома, імунне відторгнення трансплантованої рогівкової тканини й інших тканин, ревматоїдний артрит і псоріаз (Folkman і ін., J. Biol. Chem., 267, 1992, cc. 10931-10934; Klagsbran і ін., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, cc. 217-239 і Garner Α., «Vascular diseases», в: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, під ред. Garner Α., Klintworth GK., 2-oi изд., з Marcel Dekker, NY, 1994, cc. 16251710). У випадку росту пухлини ангіогенез, імовірно, має вирішальне значення для переходу від гіперплазії до неоплазії й для забезпечення харчування, необхідного для росту й метастазування пухлини (Folkman і ін., Nature 339, 1989, с. 58). Неоваскуляризація дозволяє здобувати пухлини перевагу з позицій росту й проліферативну автономію в порівнянні зі здоровими клітинами. Пухлина, як правило, починається з однієї аномальної клітини й у результаті проліферації може збільшуватися в розмірі тільки до декількох кубічних міліметрів через далекість від доступного капілярного ложа й може залишатися «дрімаючою» без подальшого росту й дисемінації протягом тривалого періоду часу. Деякі пухлинні клітини потім перемикається на ангіогенний фенотип, що приводить до активації ендотеліальних клітин, які розростаються й дозрівають із утворенням нових капілярних кровоносних судин. Ці кровоносні судини, що знову утворилися, не тільки забезпечують продовження росту первинної пухлини, але також і дисемінацію, і повторну колонізацію метастатичних пухлинних клітин. Так, виявлена кореляція між щільністю мікросудин у зрізах пухлини молочної залози й виживанням пацієнтів, що страждають зазначеним ви 96139 6 дом раку, а також деякими іншими пухлинами (Weidner і ін., N. Engl. J. Med 324, 1991, cc. 1-6; Horak і ін., Lancet 340, 1992, cc. 1120-1124; Macchiarini і ін., Lancet 340, 1992, cc.145-146). Точний механізм, що контролює перемикання ангіогенезу, поки недостатньо вивчений, але можна припустити, що неоваскуляризація маси пухлини є результатом чистого балансу безлічі стимуляторів і інгібіторів ангіогенезу (Folkman, Nat Med 1(1), 1995, cc. 27-31). Процес розвитку судини чітко регулюється. До теперішнього часу виявлений цілий ряд молекул, більшість із яких являють собою секретуємі фактори, продуковані навколишніми клітинами, які беруть участь у регуляції диференцировки, проліферації, міграції й злипанні ЕК з утворенням структур, що мають форму тяжів. Наприклад, установлено, що судинний ендотеліальний фактор росту (VEGF) є фактором, що має вирішальне значення, що бере участь у стимуляції ангіогенезу й в індукції проникності судин (Ferrara і ін., Endocr. Rev. 18, 1997, cc. 4-25). Дані про те, що втрата навіть одного алеля VEGF приводить до загибелі ембріонів, свідчать про ту незамінну роль, що грає цей фактор в розвитку й диференціюванні судинної системи. Крім того, установлено, що VEGF є ключовим медіатором неоваскуляризації, асоційованої з пухлинами й внутріочними порушеннями (Ferrara і ін., Endocr. Rev., вище). Для мРНК VEGF характерна надекспресія в більшості вивчених типів пухлин людини (Berkman і ін., J Сііп Invest 91, 1993, сс. 153-159; Brown і ін., Human Pathol. 26, 1995, cc. 8691; Brown і ін., Cancer Res. 53, 1993, сс. 4727-4735; Mattern і ін., Brit. J. Cancer. 73, 1996, cc. 931-934; і Dvorak і ін., Am J. Pathol. 146, 1995, cc. 1029-1039). Крім того, концентрація VEGF у рідинах ока добре корелює з наявністю активної проліферації кровоносних судин у пацієнтів, що страждають діабетом і іншими пов'язаними з ішемією ретинопатіями (Aiello і ін., N. Engl. J. Med. 331, 1994, сс. 1480-1487). Крім того, у сучасних дослідженнях установлено, що VEGF локалізовано в хороїдальних неоваскулярних мембранах пацієнтів, що страждають AMD (Lopez і ін., Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37, 1996, cc. 855-868). Нейтралізуючі антитіла до VEGF придушують ріст різних людських ліній пухлинних клітин у безтимусних мишей (Kіm і ін., Nature 362, 1993, сс. 841-844; Warren J. Clin. Invest. 95, 1995, cc. 17891797; Borgström і ін., Cancer Res. 56, 1996, cc. 4032-4039; і Melnyk і ін., Cancer Res. 56, 1996, cc. 921-924), а також інгібують внутріочний ангіогенез на моделях ішемічних порушень сітківки (Adamis і ін., Arch. Ophthalmol. 114, 1996, сс. 66-71). Таким чином, моноклональні антитіла до VEGF або інші інгібітори дії VEGF є перспективними кандидатами для лікування пухлин і різних внутріочних пов'язаних з неоваскуляризацією порушень. Такі антитіла описані, наприклад, в ЕР 817648, опублікованої 14 січня 1998 р. і в WO 98/45331 і WO 98/45332, опублікованих 15 жовтня 1998 р. Одне з антитіл до VEGF, бевасизумаб, дозволено FDA для застосування в сполученні з хіміотерапевтичною обробкою для лікування метастатичного колоректального раку (CRC) і недрібноклітинного раку легеней 7 (NSCLC). Бевасизумаб проходить вивчення в багатьох, що проводяться в цей час клінічних дослідах з погляду лікування різних пов'язаних з раком показань. У процесі розвитку нервової системи від нейронів відходять ниткоподібні аксони, які мігрують на більші відстані для досягнення своїх мішеней (див. огляд Carmeliet і Tessier-Lavigne, Nature 436, 2005, cc. 193-200). На провідній верхівці зростаючого аксона перебуває сенсорна структура, що володіє великою рухливістю, що називають точкою росту. Завдяки динамічним циклам розпрямлення й стиску філоподіальних виростів точка росту постійно сприймає й оцінює безліч забезпечуючих спрямованість (керівних) сигналів у навколишньому просторі й точно вибирає правильний шлях поширення до кінцевої мішені. В останні десятиліття досягнуто помітний прогрес у розумінні механізмів, що забезпечують спрямованість аксонів (див. огляд Dickson, Science 298, 2002, cc. 1959-1964). Сигнали, що забезпечують спрямованість, можна розділяти на 4 типи: атрактанти й репеленти; вони можуть діяти або в невеликому діапазоні (тобто в межах клітини або матрикса), або в більше широкому діапазоні (тобто мають здатність до поширення). До теперішнього часу ідентифіковано 4 основних класи молекул аксонів, що забезпечують спрямованість: нетрини, семафорний, ефріни й «слити» (slit) (див. огляд Huber і ін., Annu Rev Neurosci 26, 2003, cc. 509563). Семафорний (Sema), які називають також колапсинами, належать до великого сімейства філогенетично консервативних секретованих і асоційованих з мембраною білків. Представники сімейства семафоринів мають здатність опосередковувати зв'язані як з відштовхуванням, так і із залученням (атрактивністю) процесів, що забезпечують спрямованість, при розвиткові нейрона (Raper, Curr Opin Neurobiol 10, 2000, cc. 88-94). До теперішнього часу ідентифіковано більше 30 семафоринів, які всі характеризуються наявністю консервативного N-кінцевого домена Sema, що складається приблизно з 500 амінокислот. Представників семафоринів розділяють на 8 підродин залежно від їхньої структурної подібності й видів, з яких вони отримані. Більше докладну інформацію про уніфіковану номенклатуру семафоринів можна знайти в: Semaphorin Nomenclature Committee, Cell 97, 1999, cc. 551-552. Сімейство нейропіліну (NRP) складається із двох гомологічних білків нейропіліну-1 (NRP1) і нейропіліну-2 (NRP2). NRP1 був уперше ідентифікований як трансмембранний глікопротеїн типу І масою 130 кДа, що експресується в точках росту зростаючих аксонів. Потім за допомогою експресійного клонування був ідентифікований NRP2 (Fujisawa і Kitsukawa, Curr Opin Neurobiol 8, 1998, cc. 587-592). Установлено, що NRP являють собою рецептори для підгрупи семафоринів, а саме класу 3 семафоринів. Існує припущення про те, що NRP функціонують у якості не передавальних сигнали корецепторів поряд з іншим сімейством семафоринових рецепторів, таких як плексини. 96139 8 Хоча NRP уперше описані як медіатори, що забезпечують спрямованість аксонів, установлено також, що вони відіграють основну роль у розвитку судин (Carmeliet і Tessier-Lavigne, 2005). Вони ідентифіковані в якості специфічного для конкретної ізоформи рецептора VEGF, що експресується на пухлинні й ендотеліальних клітинах, що обумовлює проведення великих досліджень, спрямованих на з'ясування ролі NRP у біології судин і пухлин (Soker і ін., Cell 92, 1998, сс. 735-745; Klagsbrun і ін., Adv Exp Med Biol 515, 2002, сс. 33-48). Генетичні дослідження дозволили точно довести, що Nrp1 необхідно для судинного морфогенезу. Втрата функції Nrp1 приводить до прояву пов'язаних з ремоделюванням і розгалуженістю дефектів судин, до фенотипу, що може додатково підсилюватися в результаті втрати функції Nrp2 (Kawasaki і ін., Development 126, 1999, сс. 4895-4902; Takashima і ін., Proc Nail Acad Sci USA 99, 2002, сс. 3657-3662). Ці результати дозволили припустити, що на ранній стадії розвитку Nrp1 і Nrp2 можуть мати функції, що перекриваються. Однак на більше пізніх стадіях розвитку локалізація експресії кожного Nrp стає різною, так, Nrp1 експресується, насамперед в артеріях, a Nrp2 у венах і лімфатичних судинах (Yuan і ін., Development 129, 2002, сс. 4797-4806; Herzog і ін., Mech Dev 109, 2001, сс. 115-119). Слід зазначити, що втрата тільки функції Nrp2 специфічно порушує розвиток лімфатичної системи. Оскільки під час розвитку Nrp1 експресується в багатьох інших типах клітин, роль судинного Nrp1 проявляється за допомогою створення ЕКспецифічного «вимикання» (knock-out, КО), що приводить до судинних дефектів, аналогічним виявленим при алелі, що мовчить (Gu і ін., Dev Cell 5, 2003, cc. 45-57). Важливо відзначити, що в цьому дослідженні встановлено також, що для розвитку судин не потрібне зв'язування Sema3A з NRP1. В іншім дослідженні були виявлені дефекти в забезпеченні спрямованості ендотеліальних верхівкових клітин при розвитку ромбоподібного мозку в Nrp1- КО-ембріонів (Gerhardt і ін., Dev Dyn 231,2004, cc. 503-509). Не дивлячись на широке вивчення ролі NRP1 у розвитку судин, залишається неясним чи проявляє NRP1 свою функцію в судинах тільки через шлях VEGF-рецептор 2 VEGF (VEGFR2) як підсилювач зв'язування VEGF з VEGFR2, і тим самим, підсилюючи передачу VEGFR2-сигналу, або через шлях передачі сигналу, що не залежить від VEGFR2, або шляхом сполучення зазначених шляхів. Моноклональні антитіла можна одержувати на основі технології рекомбінантної ДНК. Широке застосування одержали створені моноклональні антитіла, зокрема, отримані з організму гризунів, однак антитіла з організму, крім людини, часто є антигенними для людини. У даній галузі були початі спроби перебороти цю проблему шляхом конструювання «химерних» антитіл, у яких антигензв'язуючий центр антитіла з організму крім людини зшивають із людською константною ділянкою (Cabilly і ін., US 4816567). Ізотип людської константної ділянки можна вибирати з метою зміни здатності антитіла брати участь в антитіло 9 обумовленій клітиннозалежної цитотоксичности (ADCC) і комплементзалежної цитотоксичности. Ще однією спробою зниження антигензв'язуючих функцій антитіл і мінімізації застосування гетерологічних послідовностей у людських антитілах, було створення гуманізованих антитіл до різних антигенів, у яких ділянки, що значно уступають по розміру інтактної людської варіабельної ділянки, були замінені на відповідну послідовність із організмів крім людини. Наприклад, залишки з організму гризунів були замінені на відповідні сегменти людського антитіла. На практиці гуманізовані антитіла, як правило, являють собою людські антитіла, у яких деякі залишки гіперваріабельних ділянок (CDR) і можливо деякі залишки каркасної ділянки (FR) замінені залишками аналогічних доменів антитіл гризунів (Jones і ін., Nature 321, 1986, cc. 522525; Riechmann і ін., Nature 332, 1988, се. 323-32; Verhoeyen і ін., Science 239, 1988, cc. 1534-1536). Перед введенням людині терапевтичного антитіла, як правило, проводять доклінічні досліди на ссавцях крім людини для оцінки ефективності й/або токсичності антитіла. В ідеальному варіанті антитіла, які піддають таким дослідженням, мають здатність розпізнавати й взаємодіяти з високою ефективністю з антигеном-мішенню, що є ендогенним для тварини-хазяїна, такого як миша або примат, крім людини. Фагова дисплейна технологія являє собою ефективний інструмент створення й відбору нових білків, які зв'язуються з лігандом, таким як антиген. За допомогою методу фагової презентації можна створювати великі бібліотеки варіантів білків і швидко вибирати в них ті послідовності, які зв'язуються з високою аффінністю з антигеноммішенню. Нуклеїнові кислоти, що кодують варіанти поліпептидів, зливають із нуклеотидною послідовністю, що кодує вірусний оболонковий білок, такий як білок, кодуємий геном III, або білок, кодуємий геном VIII. Створені моновалентні фагові дисплейні системи, у яких нуклеотидну послідовність, що кодує білок або поліпептид, зливають із нуклеотидною послідовністю, що кодує частину білка, кодуємого геном III (Bas, S., Proteins 8, 1990, с. 309; Lowman i Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3, 1991, c. 205). При використанні моновалентної фагової дисплейної системи здійснюють експресію з невисокими рівнями генного злиття й експресують також білки, кодуємі геном III дикого типу, у результаті чого зберігається інфективність часток. Методи створення пептидних бібліотек і скринінгу зазначених бібліотек описані в цілому ряді патентів (див., наприклад, U.S. 5723286, U.S. 5432018, U.S. 5580717, U.S. 5427908 і U.S. 5498530). Важливою для створення фагових дисплейних бібліотек антитіл є демонстрація експресії пептидів на поверхні ниткового фага й експресія функціонально активних фрагментів антитіл у периплазмі Е. coli (Smith і ін., Science 228, 1985, с. 1315; Skerra і Pluckthun, Science 240, 1988, с. 1038). Бібліотеки антитіл або антигензв'язуючих поліпептидів створювали численними шляхами, у тому числі шляхом зміни індивідуального гена шляхом вбудовування довільних послідовностей ДНК або шляхом 96139 10 клонування сімейства родинних генів. Методи презентації антитіл або антигензв'язуючих фрагментів з використанням фагової дисплейної бібліотеки описані в U.S. 5750373, 5733743, 5837242, 5969108, 6172197, 5580717 і 5658727. Потім бібліотеку піддають скринінгу відносно експресії антитіл або антигензв'язуючих білків з необхідними характеристиками. Фагова дисплейна технологія має кілька переваг у порівнянні із загальноприйнятими методами одержання антитіл з необхідними характеристиками на основі гібридом або рекомбінантної ДНК. Ця технологія дозволяє створювати великі бібліотеки антитіл із широкою розмаїтістю послідовностей у більше короткий час і без використання тварин. Для одержання гібридом або одержання гуманізованих антитіл може знадобитися навіть кілька місяців. Крім того, оскільки для створення фагових дисплейних бібліотек не потрібна імунізація, їх можна створювати для антигенів, які є токсичними або мають низку антигенність (Hogenboom, Immunotechniques 4, 1988, cc. 1-20). Фагові бібліотеки антитіл можна застосовувати також для створення й ідентифікації нових терапевтичних антитіл. Фагові дисплейні бібліотеки застосовували для створення людських антитіл з імунізованих, неімунізованих людей, послідовностей зародкової лінії або популяції Ig інтактних (несенсибілізованих) В-клітин (Barbas і Burton, Trends Biotech 14, 1996, с. 230; Griffiths і ін., ЕМВО J. 13, 1994, c. 3245; Vaughan і ін., Nat. Biotech. 14, 1996, с. 309; Winter, ЕР 0368684В1). Були створені інтактні або неімунні антигензв'язуючі бібліотеки з використанням різних лімфоїдних тканин. Деякі з таких бібліотек надходять у продаж, наприклад, створені на фірмі Cambridge Antibody Technology and Morphosys (Vaughan і ін., Nature Biotech 14, 1996, c. 309; Knappik і ін., J. Mol. Biol. 296, 1999, с. 57). Однак багато які із зазначених бібліотек мають обмежену розмаїтість. Можливість ідентифікувати й виділяти високоафінні антитіла з фагової дисплейної бібліотеки є важливою для виділення нових антитіл, призначених для терапевтичного застосування. Виділення високоафінних антитіл з бібліотеки залежить від розміру бібліотеки, ефективності їхнього одержання в бактеріальних клітинах і розмаїтості бібліотеки (див, наприклад, Knappik і ін., J. Mol. Biol. 296, 1999, c. 57). Розмір бібліотеки зменшується в результаті неефективного виробництва через неправильне укладання антитіла або антигензв'язуючого білка й присутності стоп-кодонів. Експресія в бактеріальних клітинах може інгібуватися при неправильному укладанні антитіла або антигензв'язуючого центра. Експресію можна підвищувати шляхом заміни залишків у вигинах поверхні розділу варіабельної/константної ділянки або відібраних залишків в CDR (Deng і ін., J. Biol. Chem. 269, 1994, с. 9533, Ulrich і ін., PNAS, 92, 1995, сс. 11907-11911; Forsberg і ін., J. Biol. Chem. 272, 1997, с. 12430). Послідовність каркасної ділянки являє собою фактор, що бере участь у забезпеченні правильного укладання, коли фагові бібліотеки антитіл продукують у бактеріальних клітинах. 11 Для виділення високоафінних антитіл важливо також створення бібліотеки антитіл або антигензв'язуючих білків з високою розмаїтістю. Бібліотеки з розмаїтістю в обмежених CDR були створені з використанням різних підходів (див., наприклад, Tomlinson, Nature Biotech. 18, 2000, сс. 989-994). CDR3-ділянки становлять інтерес у цьому плані, оскільки вони часто беруть участь у зв'язуванні антигену. CDR3-ділянки важкого ланцюга значно варіюються по розмірі, послідовності й структурній конформації. Інші підходи урізноманітнення передбачають рандомізацію CDR-ділянок варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів з використанням всіх 20 амінокислот у кожному положенні. Установлено, що застосування всіх 20 амінокислот може приводити до широкої розмаїтості послідовностей варіантів антитіл і підвищувати шанс ідентифікації нових антитіл (Barbas, PNAS 91, 1994, с. 3809; Yelton D.E, J. Immunology 155, 1995, c. 1994; Jackson J.R., J. Immunology 154, 1995, c. 3310 і Hawkins RE, J. Mol. Biology 226, 1992, c. 889). Короткий виклад суті винаходу Даний винахід відноситься до нових антитіл до NRP1, що володіє здатністю модулювати щонайменше один опосередковуваний нейропіліном вид біологічної активності. Переважно антитіла до NRP1 являють собою антагоністичні антитіла, які мають здатність інгібувати щонайменше один опосередковуваний нейропіліном вид біологічної активності. Більш конкретно, у даному винаході запропоновані способи одержання антитіл до NRP1 зі створеної фагової бібліотеки людських синтетичних антитіл і додання антитілам до NRP1 нової функції, що блокує. Антитіла до NRP1, пропоновані у винаході, можна розділяти на два класи залежно від типу їхнього зв'язування з NRP1: антитіла A до NRP1 (включаючи YW64.3 і його варіанти), які зв'язуються з CUB-доменами (a1a2) NRP1; і антиB тіла до NRP1 (включаючи YW 107.4 і його варіанти), які зв'язуються з доменами фактора коагуляції V/VIII (b1b2) NRP1. Згідно одному з об'єктів винаходу антитіла до A NRP1 , пропоновані у винаході, можна вибирати із клонів антитіла «YW64», представлених у таблиці III, які мають ідентифіковані часткові послідовності CDR і афінність до зв'язування з мишачими й A людськими NRP1. Антитіло до NRP1 , пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRL1 (RASQSISSYLA; SEQ ID NO:123), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID NO:124) і CDRL3 (QQYMSVPIT; SEQ ID NO:125). A Наприклад, антитіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що A представлена в SEQ ID NO:3. Антитіло до NRP1 , пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRH1 (GFSFSSEPIS; SEQ ID NO:126), CDRH2 (SSITGKNGYTYYADSVKG; SEQ ID NO:127) і CDRH3 (WGKKVYGMDV; SEQ ID NO:128). НаприA клад, антитіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:4. Більше краще антитіло 96139 12 A до NRP1 , пропоноване у винаході, являє собою антитіло YW64.3, що містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:3, і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:4. Відповідно до наступного об'єкта винаходу анB титіла до NRP1 , пропоновані у винаході, можна вибирати із клонів антитіла «YW107.4», представлених у таблиці IV, які мають ідентифіковані часткові послідовності CDR і афінність до зв'язування з B мишачими й людськими NRP1. Антитіло до NRP1 , пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRL1 (RASQYFSSYLA; SEQ ID NO:129), CDRL2 (GASSRAS; SEQ ID NO:130) і CDRL3 (QQYLGSPPT; SEQ ID NO:131). Наприклад, антиB тіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що представлена в SEQ B ID NO:5. Антитіло до NRP1 , пропоноване у винаході, переважно містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що несе наступні амінокислотні послідовності CDR: CDRH1 (GFTFSSYAMS; SEQ ID NO:132), CDRH2 (SQISPAGGYTNYADSVKG; SEQ ID NO:133) і CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV; SEQ ID B NO:134). Наприклад, антитіло до NRP1 містить послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:6. Більше B краще антитіло до NRP1 , пропоноване у винаході, являє собою антитіло YW107.4.87, що містить послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:5, і послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, що представлена в SEQ ID NO:6. У даному винаході запропоноване також застосування антитіл до NRP1 для лікування асоційованих з ангіогенезом порушень, таких як рак. В одному із кращих варіантів здійснення винаходу антитіла до NRP1, пропоновані у винаході, застосовують у сполученні з антитілом до VEGF. Краще антитіло до VEGF має здатність до зв'язування з тим же епітопом VEGF, що й антитіло А4.6.1. Більше краще антитіло до VEGF являє собою бевасизумаб або ранибизумаб. Короткий опис креслень На кресленнях показано: на Фіг. 1 - специфічність до зв'язування антитіл до NRP1. (1А) Антитіла до NRP1 зв'язуються специфічно з людським і мишачим NRP1. Специфічність до зв'язування антитіл до NRP1 YW64.3 і YW107.4 у вигляді Ig (10 мкг/мл) оцінювали по зв'язуванню з лунками, сенсибілізованими hNRP1, mNRP1, hNRP2, mNRP2, Erb2-ECD або БСА, і зв'язані Ig виявляли за допомогою кон'югатів антитіла до людського Ig з HRP. (1Б) Результати FACSаналізу антитіл до NRP1 YW64.3 і YW 107.4 у вигляді Ig, що свідчать про здатності антитіл зв'язуватися з білком, що перебуває на клітинній поверхні, NRP1 (HUVEC); на Фіг. 2 - дані про здатності до зв'язування антитіла до NRP1 YW 107.4 і його варіанти з доB зрілою аффінністю YW107.4.87 (анти-NRP1 ). (2A) Результати кінетичного BIAcore-аналізу варіанта з дозрілою аффінністю YW107.4.87. (2Б) Результати 13 FACS-аналізу YW 107.4 і YW 107.4.87 у вигляді Ig, що свідчать про підвищену здатність до зв'язування варіанта з дозрілою аффінністю YW107.4.87 з білком, що перебуває на клітинній поверхні, NRP1 (HUVEC); на Фіг. 3 - послідовності варіабельних ділянок A B YW 64.3 (анти-NRP1 ) і YW107.4.87 (анти-NRP1 ) і послідовності h4D5, наведені для порівняння. Нумерація основ проведена по базі даних Кебота. Послідовності CDR перебувають у позначеної прямокутником ділянці. (3A) Послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга h4D5 (SEQ ID NO:1), YW 64.3 (SEQ ID NO:3) і YW107.4.87 (SEQ ID NO:5). (3Б) Послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга h4D5 (SEQ ID NO:2), YW 64.3 (SEQ ID NO:4) і YW107.4.87 (SEQ ID NO:6); на Фіг. 4 - дані, що свідчать про блокування антитілами до NRP1 зв'язування VEGF165 з NRP1; на Фіг. 5 - результати кількісної оцінки індукованого Sema3A колапси DRG (ганглії спинного корінця) (5А) і індукованого Sema3F-колапси гіпоA кампа (5Б). Показано, що анти-NRP1 специфічно блокує індукований Sema3A колапс точки росту нейрона DRG, але не блокує індукований Sema3F колапс точки росту нейрона гіпокампа; на Фіг. 6 - дані, що свідчать про те, що антитіла до NRP1 мають здатність інгібувати індуковану VEGF міграцію клітин лінії HUVEC і утворення відростків in vitro. (6A) Результати кількісного аналізу міграції (n=6 для кожного варіанта). *р=0,00003; -11 **p=9,910 ; критерій Ст'юдента. (6Б) Результати кількісного аналізу утворення відростків від гранули, n = 12-14 гранул на кожний варіант; на Фіг. 7 - дані, що свідчать про інгібуючу дію in vivo антитіл до NRP1 на ремоделювання судин у сітківці, що розвивається, мишей. (7А) - Проілюстрований розвиток судин, починаючи від дня 5 після народження (Р5) до Р8. Судини подовжуються за концентричною схемою до краю сітківки. Диск зорового нерва (ONH) локалізований у центрі сітківки; (7Б) - проілюстровано, що ремоделювання судин поблизу ONH відбувається між Р5 і Р8; (7B) - проілюстроване проникнення судинних відростків у більше глибокі шари сітківки. Відростки від судин простираються в зовнішній плексиформний шар (OPL) і утворюють сплетіння. Пізніше відростки проникають у шари між NFL (шари нервового волокна) і OPL шарами, досягаючи зрештою внутрішнього плексиформного шару (IPL); (7Г) - результати кількісної оцінки щільності судин; загальна кількість елементів зображення одержують на основі 12 репрезентативних зображень, отриманих для кожного варіанта для 4 оброблених ситківок, *р=0,006; **р