Біспецифічні антитіла, що заміщують функціональні білки

Формула / Реферат | Подібні патенти | МПК / Мітки | Додаткова інформація | Код посилання

Номер патенту: 95438

Опубліковано: 10.08.2011

Автори: Мійазакі Таро, Коджима Тецуо, Хатторі Куніхіро, Соєда Тецухіро

Є ще 97 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

(А) амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (CDR) H-ланцюга антитіла до фактора згортання крові ІХа одного з наступних (а1) - (а3) та гіперваріабельних ділянок (CDR) L-ланцюга наступного (b1) або (b2) та

(B) амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (CDR) H-ланцюга антитіла до фактора згортання крові Х одного з наступних (c1) - (c10) та гіперваріабельних ділянок (CDR) L-ланцюга наступного (d1) або (d2):

(а1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 14, 15 та 16, відповідно;

(a2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 18, 19 та 20, відповідно;

(a3) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 86, 87 та 88, відповідно;

(b1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 206, 207 та 208, відповідно;

(b2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 214, 215 та 216, відповідно;

(c1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 22, 23 та 24, відповідно;

(c2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 26, 27 та 28, відповідно;

(c3) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 30, 31 та 32, відповідно;

(c4) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 34, 35 та 36, відповідно;

(c5) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 38, 39 та 40, відповідно;

(c6) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 42, 43 та 44, відповідно;

(c7) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 46, 47 та 48, відповідно;

(c8) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 50, 51 та 52, відповідно;

(c9) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 54, 55 та 56, відповідно;

(c10) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 162, 163 та 164, відповідно;

(d1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 210, 211 та 212, відповідно;

(d2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 218, 219 та 220, відповідно;

при цьому антитіло має активність фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII.

2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить:

(a) варіабельну ділянку антитіла до фактора згортання крові ІХа, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13, 17, 85, 205 або 213, та

(b) варіабельну ділянку антитіла до фактора згортання крові Х, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 161, 209 або 217.

3. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга щодо фактора згортання крові ІХа, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з вказаних нижче (а1) та (а2), та варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга щодо фактора згортання крові Х, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з вказаних нижче (b1) та (b2):

(а1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 14, 15 та 16, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 214, 215 та 216, відповідно;

(а2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 86, 87 та 88, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 206, 207 та 208, відповідно;

(b1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 22, 23 та 24, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 218, 219 та 220, відповідно;

(b2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 162, 163 та 164, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 210, 211 та 212, відповідно.

4. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить:

(А) варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга антитіла до фактора згортання крові ІХа, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з (і) та (іі):

(і) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 14, 15 та 16, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 214, 215 та 216, відповідно;

(іі) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 86, 87 та 88, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 206, 207 та 208, відповідно, та

(В) варіабельні домени антитіла до фактора згортання крові Х, які містять амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 161, 209 або 217.

5. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить:

(А) варіабельні домени антитіла до фактора згортання крові ІХа, які містять амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13, 17, 85, 205 або 213, та

(В) варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга антитіла до фактора згортання крові Х, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з (і) та (іі):

(і) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 22, 23 та 24, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 218, 219 та 220, відповідно;

(іі) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 H-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 162, 163 та 164, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 210, 211 та 212, відповідно.

6. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить варіабельний домен антитіла до фактора згортання крові ІХа, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13, 17, 85, 205 або 213.

7. Біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з активованим фактором згортання крові ІХа та фактором згортання крові Х, однак не нейтралізує їх активності, причому епітопами, з якими воно зв'язується, є ті ж самі епітопи, з якими зв'язується антитіло у відповідності з будь-яким з пп. 1-6.

8. Композиція, яка містить антитіло у відповідності з п. 1 або п. 7 та фармацевтично прийнятний носій.

9. Композиція за п. 8, де згадана композиція - це фармацевтична композиція для профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею.

10. Композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що кровотеча, розлад, що супроводжується кровотечею, або розлад, що спричиняється кровотечею, - це розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII.

11. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це гемофілія А.

12. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це розлад, при якому генерується інгібітор фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII.

13. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це набута гемофілія.

14. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це ангіогемофілія.

15. Спосіб профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею, де згаданий спосіб включає етап введення антитіла у відповідності з п. 1 або п. 7 або композиції у відповідності з будь-яким з пп. 8-14.

16. Застосування антитіла у відповідності з п. 1 для приготування композиції для профілактики та/або лікування кровотечі або розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею.

17. Застосування антитіла у відповідності з п. 7 для приготування композиції для профілактики та/або лікування кровотечі або розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею.

18. Набір, що використовується у способі профілактики та/або лікування розладів у відповідності з п. 15, де згаданий набір містить принаймні антитіло у відповідності з п. 1 або п. 7 або композицію у відповідності з п. 8.

19. Спосіб профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею, де згаданий спосіб включає етап введення антитіла у відповідності з п. 1 або п. 7 або композиції у відповідності з будь-яким з пп. 8-14 у комбінації з фактором згортання крові VIII.

20. Набір, що використовується у способі профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею, у відповідності з п. 19, де згаданий набір містить принаймні антитіло у відповідності з п. 1 або п. 7 або композицію за п. 8, а також фактор згортання крові VIII.

Текст

1. Біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з активованим фактором згортання крові ІХа та фактором згортання крові Х, однак не нейтралізує їх активності, яке містить гіперваріабельні ділянки (CDR), що включають: (А) амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (CDR) H-ланцюга антитіла до фактора згортання крові ІХа одного з наступних (а1) - (а3) та гіперваріабельних ділянок (CDR) L-ланцюга наступного (b1) або (b2) та (B) амінокислотні послідовності гіперваріабельних ділянок (CDR) H-ланцюга антитіла до фактора згортання крові Х одного з наступних (c1) - (c10) та 2 (19) 1 3 (c10) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 162, 163 та 164, відповідно; (d1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Lланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 210, 211 та 212, відповідно; (d2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Lланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 218, 219 та 220, відповідно; при цьому антитіло має активність фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII. 2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить: (a) варіабельну ділянку антитіла до фактора згортання крові ІХа, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13, 17, 85, 205 або 213, та (b) варіабельну ділянку антитіла до фактора згортання крові Х, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 161, 209 або 217. 3. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга щодо фактора згортання крові ІХа, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з вказаних нижче (а1) та (а2), та варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга щодо фактора згортання крові Х, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з вказаних нижче (b1) та (b2): (а1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 14, 15 та 16, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 214, 215 та 216, відповідно; (а2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 86, 87 та 88, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 206, 207 та 208, відповідно; (b1) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 22, 23 та 24, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 218, 219 та 220, відповідно; (b2) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 162, 163 та 164, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 210, 211 та 212, відповідно. 4. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить: (А) варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга антитіла до фактора згортання крові ІХа, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з (і) та (іі): (і) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 14, 15 та 16, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 214, 215 та 216, відповідно; (іі) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 86, 87 та 88, відповідно, та амінокислотні послідовно 95438 4 сті CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 206, 207 та 208, відповідно, та (В) варіабельні домени антитіла до фактора згортання крові Х, які містять амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 161, 209 або 217. 5. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить: (А) варіабельні домени антитіла до фактора згортання крові ІХа, які містять амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13, 17, 85, 205 або 213, та (В) варіабельні домени H-ланцюга та L-ланцюга антитіла до фактора згортання крові Х, які містять сукупність з шести послідовностей CDR, вибрану з (і) та (іі): (і) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 22, 23 та 24, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 218, 219 та 220, відповідно; (іі) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Hланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 162, 163 та 164, відповідно, та амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 L-ланцюга, описані у послідовностях SEQ ID NO: 210, 211 та 212, відповідно. 6. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить варіабельний домен антитіла до фактора згортання крові ІХа, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 13, 17, 85, 205 або 213. 7. Біспецифічне антитіло, яке специфічно зв'язується з активованим фактором згортання крові ІХа та фактором згортання крові Х, однак не нейтралізує їх активності, причому епітопами, з якими воно зв'язується, є ті ж самі епітопи, з якими зв'язується антитіло у відповідності з будь-яким з пп. 1-6. 8. Композиція, яка містить антитіло у відповідності з п. 1 або п. 7 та фармацевтично прийнятний носій. 9. Композиція за п. 8, де згадана композиція - це фармацевтична композиція для профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею. 10. Композиція за п. 9, яка відрізняється тим, що кровотеча, розлад, що супроводжується кровотечею, або розлад, що спричиняється кровотечею, це розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII. 11. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це гемофілія А. 12. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це розлад, при якому генерується інгібітор фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII. 5 95438 6 13. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це набута гемофілія. 14. Композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це ангіогемофілія. 15. Спосіб профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею, де згаданий спосіб включає етап введення антитіла у відповідності з п. 1 або п. 7 або композиції у відповідності з будь-яким з пп. 8-14. 16. Застосування антитіла у відповідності з п. 1 для приготування композиції для профілактики та/або лікування кровотечі або розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею. 17. Застосування антитіла у відповідності з п. 7 для приготування композиції для профілактики та/або лікування кровотечі або розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею. 18. Набір, що використовується у способі профілактики та/або лікування розладів у відповідності з п. 15, де згаданий набір містить принаймні антитіло у відповідності з п. 1 або п. 7 або композицію у відповідності з п. 8. 19. Спосіб профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею, де згаданий спосіб включає етап введення антитіла у відповідності з п. 1 або п. 7 або композиції у відповідності з будь-яким з пп. 8-14 у комбінації з фактором згортання крові VIII. 20. Набір, що використовується у способі профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею, у відповідності з п. 19, де згаданий набір містить принаймні антитіло у відповідності з п. 1 або п. 7 або композицію за п. 8, а також фактор згортання крові VIII. Цей винахід стосується біспецифічних антитіл, які функціонально заміщують кофактори, які підсилюють ферментативну реакцію, та фармацевтичних композицій, які містять антитіло як активний інгредієнт. Попередній рівень техніки Антитіла привернули багато уваги як ліки завдяки їх високій стійкості у крові та низькій антигенності. Серед них є біспецифічні антитіла, які можуть одночасно розпізнавати два типи антигенів. Біспецифічні антитіла були запропоновані деякий час тому; проте, повідомлялося лише про антитіла, які просто з'єднують два типи антигенів, такі, які спроможні перенацілювати природні клітини-кілери (NK-клітини), макрофаги та Т-клітини (дивись непатентний документ 7). Наприклад, MDX-210, що у цей час проходить клінічні дослідження, є біспецифічним антитілом, яке просто перенацілює моноцити, що експерсують FcRI, і таким чином до ракових клітин, які експресують HER-2/neu. Отже, досі не існує прикладу застосування біспецифічного антитіла як альтернативного засобу функціонального заміщення кофактору, який підсилює ферментативну реакцію. Прикладами кофакторів є фактор тканини (TF), фактор згортання крові V (F.V.), активований фактор згортання крові V (F.Va.), фактор згортання крові VIII (F.VIII), активований фактор згортання крові VIII (F. VIlla), тромбомодулін (TM), білок S (PS), білок Z (PZ), гепарин, фрагмент С4b комплементу, регуляторний фактор .H комплементу, мембранний білок-кофактор (MCP) та рецептор 1 (CR1) комплементу. З вище переліченого F.VIII/F.VIIIa є кофактором, необхідним для експресії достатньої активності активованого фактора згортання крові IX (F.IXa). F. Scheiflinger зі співавторами визначили, що певне антитіло до F.IX/F.IXa діє, сприяючи ак тивації фактора згортання крові X (F.X) завдяки F.IXa у ххромогенному аналізі (патентами Документ 1). Однак, під час аналізу, у якому досліджували спроможність до відновлення згортання у плазмі, позбавленій F.VIII, спроможність до відновлення згортання спостерігали тільки, коли ззовні додавали F.ІХa, а не тоді, коли застосовували лише це антитіло. Відомо, що F.VІІIa взаємодіє не тільки з F.IXa, але також з F.X (дивись непатентні документи 5 та 6). Стосовно цього не можна сказати, що антитіло F. Scheiflinger'a зі співавторами суттєво заміщує функцію F.VIII/F.Villa, а також здається, що його активність є недостатньою. Завдяки навмисному спрямованому дослідженню авторам цього винаходу вдалося отримати біспецифічні антитіла, які функціонально заміщують кофактори, які підсилюють ферментативну активність, та тим самим виконали цей винахід. Патентний документ 1: WO 01/19992. Патентний документ 2: патент США № 4,474,893. Патентний документ 3: EP 404,097. Патентний документ 4: WO 93/11161. Патентний документ 5: японська патентна заявка № 2002-112369. Патентний документ 6: японська патентна заявка № 2003-012648. Патентний документ 7: викладена японська патентна заявка № (JP-A) Н5-304992 (опублікована японська патентна заявка, яка не пройшла експертизу). Патентний документ 8: JP-A Н2-145187. Патентний документ 9: JP-A Н5-213775. Патентний документ 10: JP-A H10-165184. Патентний документ 11: JP-A Hl 1-71288. Патентний документ 12: JP-A 2002-518041. Патентний документ 13: JP-A Hl 1-506310. 7 Патентний документ 14: JP-A Н5-199894. Патентний документ 15: JP-A Н10-511085. Патентний документ 16: JP-A Н5-184383. Непатентний документ 1: Nilsson IM et al., "J. Intern. Med." 1992, Vol.235, р.25-32 Непатентний документ 2: Löfqvist T et al. "J. Intern. Med" 1997, Vol.241, p.395-400. th Непатентний документ 3:24 Meeting of The Japanese Society on Thrombosis and Hematosis, Special Committee on Examining Hemophilia Standardization, Mini-symposium, 2001, http://www.jsth.org. Непатентний документ 4: Medical Bulletin #193 1994. Непатентний документ 5: Mertens K et.al., "Thromb. Haemost." 1999, Vol.82, р.209-217 Непатентгійй документ 6: Lapan KA et al., "Thromb. Haemost." 1998, Vol.80, р.418-422. Непатентний документ 7: Segal DM et al., "Journal of Immunological Methods" 2001, Vol.248, p. 1-6. Непатентний документ 8: Bos R and Nieuwenhuitzen W, "Hybridoma" 1992, Vol.11, No.1,p.41-51. Непатентгійй документ 9: Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, No. 1708, p.81-3 Непатентний документ 10: Karpovsky B et al., "J. Exp. Med." 1984, Vol.160, No.6, p. 1686-701. Непатентний документ 11: Suresh MR et al., "Methods Erazymol." 1986, Vol.121, p. 210-28. Непатентний документ 12: Massimo YS et al., "J. Immunol. Methods" 1997, Vol.201, p.57-66. Непатентний документ 13: Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, p. 81. Непатентний документ 14: Shalaby MR et al., "J. Exp. Med." 1992, Vol.175, p.217-25. Непатентний документ 15: Holliner P et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1993, Vol.90, p. 6444-8. Непатентний документ 16: Ridgway JB et al., "Protein Eng." 1996, Vol.9, p. 617-21. Непатентний документ 17: Hammerling U et al., "J. Exp. Med." 1968, Vol.128, p. 1461-73. Непатентний документ 18: Kurokawa T et al., "Bio/Technology" 1989, Vol.7, p.1163. Непатентний документ 19: Link BK et al., "Blood" 1993, Vol.81, p.3343. Непатентний документ 20: Nitta T et al., "Lancet" 1990, Vol.335, p.368-71. Непатентний документ 21: deLeij L et al., "Foundation Nationale de Transfusion Sanguine, Les Ulis France" 1990, p.249-53. Непатентний документ 22: Le Doussal JM et al., "J. Nucl. Med." 1993, Vol.34, p. 1662-71. Непатентний документ 23: Stickney DR et al., "Cancer Res." 1991, Vo.1.51, p.6650-5. Непатентний документ 24: Weiner LM et al., "Cancer Res." 1993, Vol.53, p.94-100. Непатентний документ 25: Kroesen BJ et al., "Br. J. Cancer" 1994, Vol.70, p.652-61. Непатентний документ 26: Weiner GJ et al., "J. Immunol." 1994, Vol.152, p.2385. Непатентний документ 27: Suresh MRet al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1986, Vol.83, р.7989-93. Непатентний документ 28: Milstein C and Cuello AC, "Nature" 1983, Vol.305, р.537. 95438 8 Непатентний документ 29: Xiang J et al., "Мої. Immunol." 1990, Vol.27, р.809. Непатентний документ 30: Bebbington CR et al., "Biotechnology" 1992, Vol.10, p.169. Непатентний документ 31: Huse WD et al., "Science" 1989, Vol. 246, p. 1275. Непатентний документ 32: McCafferty J et al., "Nature" 1990, Vol.348, р.552. Непатентний документ 33: Kang AS et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1991, Vol.88, p.4363. СУТЬ винаходу Завданням цього винаходу є отримання біспецифічних антитіл, що функціонально заміщують кофактори, які підсилюють ферментативну реакцію. Завдяки цілеспрямованому дослідженню авторам цього винаходу вдалося відкрити біспецифічні антитіла, які специфічно зв'язуються як з F.IX/F.IXa, так і з F.X, та зшіщують функцію кофактору F. VIIIa (тобто, функцію, що сприяє активації F.X за допомогою F.FXa). А саме, авторам цього винаходу вдалося отримати біспецифічні антитіла, що розпізнають як фермент, так і його субстрат, та функціонально заміщують кофактори ферменту. Цей винахід стосується біспецифічних антитіл, які функціонально заміщують кофактори, які підсилюють ферментативну реакцію, та більш докладно він стосується: 1). Антитіла, яке розпинає як фермент, так і його субстрат, де згадане антитіло є біспецифічним антитілом, що функціонально заміщує кофактор, який підсилює ферментативну реакцію; 2). Антитіла згідно з 1), де згаданий фермент це протеолітичний фермент; 3). Антитіла згідно з 2), де згадані протеолітичний фермент, субстрат та кофактор -це фактори, пов'язані зі згортанням крові/фібринолізом; 4). Антитіла згідно з 3), де фермент фактора, пов'язаного зі згортанням крові/фібринолізом, - це фактор згортання крові IX та/або активований фактор згортання крові IX; субстрат - це фактор згортання крові X; а кофактор - це фактор згортання крові VIlI та/або активований фактор згортання крові VIII; 5). Антитіла згідно з будь-яким від 1) до 4), де згадане антитіло містить гіперваріабельну ділянку, яка включає амінокислотну послідовність CDR3 антитіла до фактора згортання крові ГХЛХа наступного (a1) або (а2) або гіперваріабельну ділянку, яка є функціонально еквівалентною до щойно згаданої, та гіперваріабельну ділянку, яка включає амінокислотну послідовність CDR3 антитіла до фактора згортання крові X, описану у будь-якому з наступних від (b1) до (b9), або гіперваріабельну ділянку, що є функціонально еквівалентною до щойно згаданої: (a1) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 16; (а2) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 20; (b1) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 24; (b2) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 28; (b3) амінокислотна послідовність CDR 3 Н 9 ланцюга, описана у послідовності № 32; (b4) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 36; (b5) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 40; (b6) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 44; (b7) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 48; (b8) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 52; (b9) амінокислотна послідовність CDR 3 Нланцюга, описана у послідовності № 56; 6). Антитіла згідно з будь-яким від 1) до 4), де згадане антитіло містить гіперваріабельну ділянку, яка включає амінокислотну послідовність CDR антитіла до фактора згортання крові DC/DCa наступного (a1) або (а2) або гіперваріабельну ділянку, що є функціонально еквівалентною до щойно згаданої, та гіперваріабельну ділянку, яка включає амінокислотну послідовність CDR антитіла до фактора згортання крові X, описану в будь-якому з наступних від (b1) до (b9), або гіперваріабельну ділянку, що є функціонально еквівалентною до щойно згаданої: (a1) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 14,15, та 16, відповідно; (а2) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 18,19 та 20, відповідно; (b1) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 22,23 та 24, відповідно; (b2) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 26,27 та 28, відповідно; (b3) амінокислотні послідовності CDR1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 30,31 та 32, відповідно; (b4) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 34,35 та 36, відповідно; (b5) амінокислотні послідовності CDR 1, 2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 38,39 та 40, відповідно; (b6) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 42,43 та 44, відповідно; (b7) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 46,47 та 48, відповідно; (b8) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 50,51 та 52, відповідно; (b9) амінокислотні послідовності CDR 1,2 та 3 Н-ланцюга, описані у послідовностях №№ 54,55 та 56, відповідно; 7). Композиції, яка містить антитіло згідно з будь-яким від 1) до 6) та фармацевтично прийнятний носій; 8). Композищї згідно з 7), де згадана композиція - це фармацевтична композиція, що використовується для профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, 95438 10 або розладу, що спричиняється кровотечею; 9). Композиції згідно з 8), де кровотеча, розлад, що супроводжується кровотечею, або розлад, що спричиняється кровотечею, - це розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII; 10). Композиції згідно з 9), де згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це гемофілія А; 11). Композиції згідно з 9), де згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це розлад, при якому генерується інгібітор фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII; 12). Композиції згідно з 9), де згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення або дефіциту активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, - це набута гемофілія; 13). Композиції згідно з 9), де згаданий розлад, який виникає та/або прогресує внаслідок зменшення активності фактора згортання крові VIII та/або активованого фактора згортання крові VIII, це ангіогемофілія; 14). Способу профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею;, або розладу, що спричиняється кровотечею, де згаданий спосіб включає етап введення антитіла згідно з будь-яким від 1) до 6) або композиції згідно з будь-якою від 7) до 13); 15). Застосування антитіла згідно з будь-яким від 1) до 6) для приготування композиції згідно з будь-якою від 7) до 13); 16). Набору, що використовується у способі профілактики та/або лікування розладів згідно з 14), де згаданий набір містить принаймні антитіло згідно з будь-яким від 1) до 6) або композицію згідно з 7); 17). Способу профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, щоіспричиняється кровотечею, де згаданий спосіб включає етап введення антитіла згідно з будь-яким від 4) до 6) або композиції згідно з будь-якою від 7) до 13) у комбінації з фактором згортання крові VIII; 18). Набору, що використовується у способі профілактики та/або лікування кровотечі, розладу, що супроводжується кровотечею, або розладу, що спричиняється кровотечею, згідно з 17), де згаданий набір містить принаймні антитіло згідно з будьяким від 4) до 6) або композицію згідно з 7), а також фактор згортання крові VIII. Стислий опис ілюстративного матеріалу Фігура 1 зображує інсерційну ділянку pcDNA4g4H. Фігура 2 зображує інсерційні ділянки pcDNA4g4L та pIND-g4L. Фігура 3 зображує інсерційну ділянку pINDg4H. 11 Фігура 4 зображує результати вимірювання F.VIIIa-міметичної активності біспецифічного антитіла до FIXa/F.X, генерованого з антитіла XB12 до F.IXa та антитіла SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 або SB34 до F.X. Концентрація розчинів антитіла становила 10 мкг/мл (кінцева концентрація 1 мкг/мл). Результат для дев'яти типів біспецифічних антитіл, який продемонстрував збільшення F.VIIIa-міметичної активності: XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 та XB12/SB34, у порядку сили активності. Фігура 5 зображує результати вимірювання F.VIIIa-міметичної активності біспецифічного антитіла до F.IXa/F.X, генерованого з антитіла ХТ04 до F.IXa та антитіла SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 або SB34 до F.X. Концентрація розчинів антитіла становила 10 мкг/мл (кінцева концентрація 1 мкг/мл). Внаслідок цього XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 та XT04/SB34 показали збільшення F.VIIIa-міметичної активності. Фігура 6 зображує результати вимірювання F.VIIIa-міметичної активності різних концентрацій XB12/SB04, що показало найвищу активність на фігурі 4. Внаслідок цього, XB12/SB04 показало залежне від концентрації збільшення F.VIIIaміметичної активності. Фігура 7 зображує результати вимірювання часу згортання плазми (активований частковий тршбопластиновий час (APTT)) у присутності XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 або XB12/SB34. Концентрація розчинів антитіла, змішаних з плазмою, позбавленою F.VIII,, становила 1,7 мкг/мл для XB12/SB06 та 10 мкг/мл для решти. Внаслідок цього XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 та XB12/SB34 продемонстрували ефект скорочення часу згортання порівняно з випадком, якщо антитіла є відсутніми. Фігура 8 зображує результати вимірювання часу згортання плазми (APTT) у присутності XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 та XT04/SB34. Концентрація розчинів антитіла, змішаних з плазмою, позбавленою F.VIII,, становила 5 мкг/мл для XT04/SB06 та 10 мкг/мл для решти. Внаслідок цього XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05 та XT04/SB06 продемонстрували ефект скорочення часу згортання порівняно з випадком, якщо антитіла є відсутніми. XT04/SB34 не продемонструвало ефекту скорочення часу згортання. Фігура 9 зображує результати вимірювання часу згортання крові з різними концентраціями XB12/SB04, яке показало найвищий ефект скорочення часу згортання (APTT) на фігурах 7 та 8. Внаслідок цього XB12/SB04 показало залежний від концентрації ефект скорочення часу згортання. Концентрація антитіла на фігурі демонструє значення для розчину антитіла, змішаного з плазмою, позбавленою F.VIII. 95438 12 Фігура 10 зображує результати вестернблотингу GST-AP SB04 або SB04, де 1), 2) та 3) є результатами реащії транскрибованого GST-AP з SB04, SB06 та зразком, що не містив антитіла, відповідно. Результати демонструють виявлення лише зв'язувальної реакції SB04 з GST-AP. Фігура 11 зображує вектор pELBGlacI. CoIEІоrі - ділянка початку реплікації серій плазмід CoIEl; flori - ділянка початку реплікації фага fl; ІасІ - кодувальна ділянка репресорного білка лактози; Рlac промотор лактози; pelBss - сигнальна послідовність білка E соlі PelB; scFv - кодувальна ділянка одноланцюгової молекули антитіла; gene III (gene3) (ген III (ген3)) - кодувальна ділянка білка r гена III фага fl; Amp - стійкий до ампіциліну ген та Sfi І - сайт розщеплення Sfi І ферментом рестрикції. Фігура 12 зображує результати вимірювання F.VIII-міметичної активності із застосуванням культуральних надосадових рідин експресованих біспецифічних антитіл, які є комбінаціями антитіла до F.IXa (А19, А25, АЗІ, А38, А39, А40, А41, А44, А50, А69 або ХВ12) та антитіла до F.X (В2, В5, В9, B10, B11, В12, В13, В14, В15, В16, В18, В19, В20, В21, В23, В25, В26, В27, В31, В34-1, В34-2, В35, В36, В38, В42, SB04, SB15 або SB27)."+" позначає випадки, коли F.VIIIa-міметична активність становить 0,1 або більше. Фігура 13 зображує результати аналізу згортання плазми, який виконувався із застосуванням очищених препаратів експресованих біспецифічних антитіл, які є результатом комбінації антитіла до F.IXa (А19, А25, А31, А38, А39, А40, А41, А44, А50, А69 або ХВ12) та антитіла до F.X (В2, В5, В9, B10, B11, В12, В13, В14, В15, В16, В18, В19, В20, В21, В23, В25, В26, В27, В31, В34-1, В34-2, В35, В36, В38, В42, SB04, SB15 або SB27). Завдяки додаванню антитіл час згортання скоротився на 10 - 20 секунд ("+"), 20 -40 секунд ("++"), 40 - 50 секунд ("+++") або 50 секунд ("++++") або більше порівняно з випадком, коли антитіла не додавалися. Фігура 14 зображує результати вимірювання часу згортання при різних концентраціях антитіла А44/В26, яке мало великий ефект скорочення часу згортання (APTT) на фігурі 13. Час згортання становив 113 секунд, коли антитіло не додавали. Внаслідок цього, А44/В26 продемонструвало залежний від концентрації ефект скорочення часу згортання. Концентрація антитіла на фігурі демонструє значення для розчину антитіла, змішаного з плазмою, позбавленою F.VIII. Фігура 15 зображує результати вимірювання часу згортання при різних концентраціях антитіла А69/В26, яке мало великий ефект скорочення часу згортання (APTT) на фігурі 13. Час згортання становив 109,6 секунд, коли антитіло не додавали. Внаслідок цього, А69/В26 продемонструвало залежний від концентрації ефект скорочення часу згортання. Концентрація антитіла на фігурі демонструє значення для розчину антитіла, змішаного з плазмою, позбавленою F.VIII. Фігура 16 зображує результати вимірювання часу згортання (APTT) при сумісному існуванні А44/В26 або XB12/SB04 з F.VIII. Внаслідок цього, 13 порівнюючи з присутністю лише F.VIII, змішаний розчин А44/В26 або XB12/SB04 з F.VIII продемонстрував ефект скорочення часу згортання. Фігура 17 зображує результати вимірювання часу згортання (APTT) у плазмі з інгібітором у присутності А44/В26 або XB12/SB04. Внаслідок цього, А44/В26 або XB12/SB04 продемонстрували ефект скорочення часу згортання порівняно з випадком, коли антитіла були відсутніми. Фігура 18 зображує результати вимірювання часу згортання при різних концентраціях XB12/SB04 та людиноподібного ХВ12/людиноподібного SB04. Час згортання становив 111,3 секунди, коли не додавали жодних антитіл. Внаслідок цього вимірювання людиноподібне ХВ12/людиноподібне SB04 продемонструвало ефект скорочення часу згортання подібно до XB12/SB04. Концентрація антитіла на фігурі демонструє значення для розчинів антитіла, змішаних з плазмою, позбавленою F.VIII. Найкоаший варіант здійснення винаходу Біспецифічне антитіло згідно з цим винаходом - це молекула, яка містить два типи антитіл або фрагменти антитіл, які мають специфічність до різних антигенів. Біспецифічне антитіло є, особливо не обмежуючись цим, проте переважно, моноклональним. Біспецифічні антитіла цього винаходу - це переважно рекомбінантні антитіла, генеровані із застосуванням способів генної рекомбінації (дивись, наприклад, Borrebaeck САК and Larrick JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, опубліковано в Сполученому Королівстві MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Рекомбінантне антитіло можна отримати шляхом клонування ДНК, що кодує антитіло, з клітин, що виробляють антитіло, таких як гібридоми або сенсибілізовані лімфоцити, шляхом включення ДНК у відповідний вектор та введення вектора в хазяїна для виробництва антитіла. Крім того, антитіла цього винаходу можуть бути фрагментами антитіла або модифікованими антитілами. Фрагменти антитіла включають діатіло (Db), лінійне антитіло, одноланцюгові молекули антитіла (далі також позначаються як scFv) тощо. У цьому описі фрагмент "Fv" представляє найбільш дрібний фрагмент антитіла, який включає сайт розпізнавання та сайт зв'язування повного антигену. Фрагмент "Fv" - це димер (VH-VL димер), у якому варіабельна область (VH) одного важкого (H) ланцюга та варіабельна область (VL) одного легкого (L) ланцюга є міцно з'єднаними шляхом нековалентного зв'язку. Три гіперваріабельні ділянки (CDR) кожної варіабельної області взаємодіють, утворюючи антиген-зв'язувальний сайт на поверхні димеру VH-VL. Шість CDR утворюють антиген-зв'язувальний сайт на антитілі. Проте, навіть одна варіабельна область (або половина Fv, що містить лише три антиген-специфічні CDR) здатна розпізнавати антиген та зв'язуватися з ним, хоча її афінітет є більш низьким порівняно з афінітетом усього зв'язувального сайта. Крім того, фрагмент Fab (також позначається як "F(ab)") далі містить константну область Lланцюга та константну область Н-ланцюга (СН1). 95438 14 Фрагмент Fab' відрізняється від фрагмента Fab тим, що попередній фрагмент містить декілька додаткових залишків, що походять з карбоксильного кінця ділянки CH1 Н-ланцюга, що включає один або більше цистеїнів з шарнірної ділянки антитіла. Fab'-SH позначає Fab', що має три тіолові групи в одному або більше цистеїнових залишках константної області. Фрагменти F(ab') генеруються шляхом розщеплення дисульфідного зв'язку в цистеїнах шарнірної частини перетравленого пепсином F(ab')2. Інші фрагменти антитіл з хімічним зв'язком також відомі фахівцям у цій галузі. Діатіло позначає двовалентний фрагмент антитіла, побудований шляхом злиття генів (Holliger P et al., Ртос. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); EP 404,097; WO 93/11161 тощо). Діатіло це димер, який включає два пептидні ланцюги; у кожному пептидному ланцюгу варіабельна область (VL) L-ланцюга з'єднана з варіабельною областю (VH) Н-ланцюга на одному й тому ж ланцюгу за допомогою лінкера, який є дуже коротким (наприклад, приблизно 5 залишків), щоб дозволити утворити пару двом областям. VL та VH, закодовані на одному й тому ж поліпептидному ланцюгу, утворюють димер, оскільки вони не можуть утворити одноланцюговий фрагмент варіабельної області через короткий лінкер між ними. Отже, діатіло закінчується двома антиген-зв'язувальними сайтами. Одноланцюгове антитіло або фрагмент scFv містить області VH та VL антитіла, та ці області існують у єдиному поліпептидному ланцюгу. Взагалі, поліпептид Fv далі містить поліпептидний лінкер між областями VH та VL, так що scFv є здатним утворювати структуру, яка є необхідною для зв'язування антигену (дивись Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp. 269-315,1994 для загальної інформації щодо scFv). Лінкери цього винаходу не є особливо обмеженими, доки вони не інгібують експресію варіабельних областей антитіла, зв'язаних з двома кінцями лінкера. Біспецифічне антитіло типу IgG можна виділити за допомогою гібридної гібридоми (квадроми), утвореної шляхом злиття двох типів гібридом, які виробляють антитіла IgG (Milstein C et al., Nature 1983, 305: 537-540). Його також можна виділити шляхом введення у клітини генів L-ланцюга та Нланцюга, які складають два IgG, що нас цікавлять (усього чотири типи генів), для ко-експресії. Проте, теоретично існує десять комбінацій Нланцюгів та L-ланцюгів у IgG, які можна отримати цими способами. Важко очистити IgG, яке включає бажану комбінацію H- та L-ланцюгів з десяти різних типів IgG. Крім того, теоретично кількість комбінації, які представляє інтерес, суттєво зменшується, і внаслідок цього необхідно багато клітинної культури, що, у свою чергу, приведе до подальшого зростання витрат на виробництво. У цьому випадку шляхом відповідного заміщення амінокислоти (амінокислот) у ділянці СН3 Н-ланцюга можна переважно виділити IgG, що мають гетеро логічну комбінацію Н-ланцюгів (Ridgway, JB et al. Protein Engineering 1996,9:617 15 621, Merchant, AM et al. Nature Biotechnology 1998,16: 677-681). Щодо L-ланцюгів, варіабельна область Lланцюга є менш різноманітною порівняно з варіабельною областю Н-ланцюга; завдяки цьому можна очікувати отримання загального L-ланцюга, який має зв'язувальну активність з двома Нланцюгами. Ефективна експресія біспецифічного IgG стає можливою завдяки введенню генів цього загального L-ланцюга та обох Н-ланцюгів у клітину для експресії IgG (Nature Biotechnology. 1998, 16, 677-681). Однак, ймовірність двох випадково вибраних типів антитіл, що містять однаковий Lланцюг, низька; отже, важко втілити вищезгадану ідею на практиці. У цьому відношенні було запропоновано спосіб відбору загального L-ланцюга, який адаптує довільно різні Н-ланцюги, щоб продемонструвати високу зв'язувальну активність (WO 2004/065611). Н-ланцюг, що має вищеописаний варіант СНЗ (Nature Biotechnology. 1998, 16,677-681) рідко виділяється у відсутності іншого Н-ланцюга. Застосовуючи цю характеристику, щоб, по-перше, індукувати експресію на правому L-ланцюгу та H-ланцюгу та припинити експресію, а потім індукувати експресію на лівому L-ланцюгу та H-ланцюгу, пропорцію IgG, що експресуються у комбінації, яка представляє інтерес, можна збільшити (PCT/JP2004/008585). Біспецифічне антитіло можна також приготувати шляхом хімічного перехресного зшивання Fab's. Біспецифічний F(ab’)2 можна приготувати, наприклад, шляхом малеімідування Fab', приготованого з одного антитіла, O-PDM'OM (ортофеніленеді-малеімідом) та реакції продукту з Fab', приготованого з іншого антитіла, так щоб перехресно зшити Fab', що походять з різних антитіл (Keler T et al. Cancer Research 1997, 57:4008-4014). Крім того, є також відомим спосіб хімічного з'єднання фрагментів антитіла, таких як похідне Fab'тіонітробензойної кислоти (TNB) та Fab'-тіол (SH) (Brennan M et al. Science 1985,229: 81-83). Замість перехресного зшивання можна застосовувати лейцинову "застіжку-блискавку", що походить з Fos та Jun або їм подібних. Хоча Fos та Jun також утворюють гомодимер, застосовується їх переважне гетеродимерне утворення. Для приготування експресуються Fab', доповнений лейциновою "блискавкою" Fos, та другий Fab', доповнений лейциновою "блискавкою" Jun. Шляхом змішування та реакції мономерних Fab'-Fos та Fab'-Jun, які були відновлені у помірних умовах, можна утворити біспецифічни|і F(ab')2 (Kostelny SA et al. J. of Immunology, 1992,148:1547-53). Цей спосіб не обмежується Fab', та його можна застосовувати також для scFv, Fv тощо. Біспецифічне антитіло можна також приготувати у формі діатіла. Біспецифічне діатіло - це гетеродимер, що включає два фрагменти scFv, що перехрещуються внапусток. Отже, біспецифічне діатіло можна приготувати шляхом побудови гетеродимеру, застосовуючи VH(A)-VL(B) та VH(B)VL(A), що утворили шляхом з'єднання VH та VL, ЯКІ походять з двох типів антитіл: А та В, з відносно коротким лінкером з приблизно 5 амінокислотних залишків (Holliger P et al. Proc. of the National 95438 16 Academy of Sciences of the USA 1993,90:64446448). У цьому випадку побудові біспецифічного діатіла, що представляє інтерес, можна сприяти шляхом здійснення відповідних амінокислотних заміщень (виступи-в-отвори: Zhu Z et al. Protein Science. 1997,6: 781-788), так щоб зшити два типи scFv’ з гнучким та відносно довгим лінкером з приблизно 15 амінокислотних залишків (одноланцюгове діатіло: Kipriyanov SM et al. J. of Molecular Biology. 1999,293:41-56). sc(Fv)2, що можна приготувати шляхом зшивання двох типів scFv’ з гнучким та відносно довгим лінкером з приблизно 15 амінокислотних залишків, може також стати біспецифічним антитілом (Mallender WD et al. J. of Biological Chemistry, 1994,269: 199-206). Модифіковане антитіло може бути, наприклад, антитілом, що зв'язується з різними молекулами, такими як поліетиленгліколь (ПЕГ). У модифікованих антитілах цього винаходу речовини, які слід зв'язувати, не обмежуються. Такі модифіковані антитіла можна отримати шляхом хімічної модифікації вже отриманих антитіл. Ці способи вже застосовувалися у цій галузі. Антитіла цього винаходу включають антитіло людини, антитіло миші, антитіло щура та їм подібні, в жодному разі не обмежуючись їх походженням, та антитіла цього винаходу можуть бути генетично модифікованими антитілами, такими як химерне антитіло та людиноподібне антитіло. Способи отримання антитіл людини є відомими, та антитіла людини, що представляють інтерес, можна отримати, наприклад, шляхом імунізації трансгенної тварини, що має спектри генів антитіла людини, антигеном, що представляє інтерес (дивись WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735). Генетично модифіковані антитіла можна отримати за відомими способами. Більш конкретно, наприклад, химерне антитіло включає варіабельні області від H- та L-ланцюгів антитіла з імунізованої тварини та константні області з H- та L-ланцюгів антитіла людини. Химерне антитіло можна отримати шляхом зшивання ДНК, що кодує варіабельну область антитіла, яке походить з імунізованої тварини, з ДНК, що кодує константну область антитіла людини, шляхом вставки отриманої ДНК у вектор експресії, та введення рекомбінантного вектора в хазяїна для виробництва. Людиноподібне антитіло - це модифіковане антитіло, яке також позначається як антитіло людини зі зміненою формою. Людиноподібне антитіло будується шляхом трансплантації гіперваріабельної ділянки антитіла (CDR), що походить з імунізованих тварин, у CDR антитіла людини. Загальні технології генної інженерії є також відомими. Більш конкретно, послідовність ДНК, побудована для зшивання CDR антитіла миші з каркасною ділянкою (FR) антитіла людини, синтезується шляхом полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) із застосуванням декількох олігонуклеотидів, які були приготовані так, щоб вони містили перекриваю 17 чі частини на їх кінцевих ділянках. Після зшивання отриманої ДНК з ДНК, що кодує константну область антитіла людини, отриману ДНК включають у вектор експресії та вводять хазяїну, щоб отримати людиноподібне антитіло (дивись EP 239400 та WO 96/02576). Коли каркасна ділянка антитіла людини зв'язується за допомогою CDR, вибирається одна область, що є спроможною утворювати антиген-зв'язувальний сайт з належною гіперваріабельною ділянкою. Амінокислоти каркасної ділянки у варіабельній області антитіла за необхідністю можна замістити, так щоб гіперваріабельна ділянка антитіла людини зі зміненою формою утворювала відповідний антиген-зв'язувальний сайт (Sato K et al, Cancer Research 1993, 53: 851856). Цю каркасну ділянку можна заміщувати каркасними ділянками, що походять з різних антитіл людини (дивись WO 99/51743). Цим винаходом пропонуються біспецифічні антитіла, які функціонально заміщують кофактори, що розпізнають як фермент, так і його субстрат. Кофактори цього винаходу особливо не обмежуються, доки вони спроможні діяти на фермент з метою підсилення ферментативної реакції. Кофактор цього винаходу - це, наприклад, кофактор протеолітичного ферменту. Специфічні приклади кофактору протеолітичного ферменту це кофактори для згортання крові та пов'язані з фібринолізом фактори (F.vm/F.VIIIa, F.V/F.Va, PZ, TM, ТМ/PS система), кофактори для реакцій комплементу (C4b, МСР, CRl, H фактор) та їм подібні. Наступні комбінації можна перелічити як специфічні приклади ферменту та субстрату ферменту, а також як кофактори ферментів. (а) Кофактор для згортання крові та фактор, пов'язаний з фібринолізом (Приклад 1). Фермент: F.IXa Субстрат: F.X Кофактор: F.VIII/F.VIIIa Кофактор F.VIIIa зв'язується як з F.IXa, так і з F.X та підсилює активацію F.X за допомогою F.IXa. Серед біспецифічних антитіл, що розпізнають як вищеописаний фермент F.IXa, так і субстрат F.X, деякі мають підсилюючий ефект на активацію F.X. Вважають, що деякі з цих антитіл мають ефект заміщення функції кофактора F.VIII/F.VIIIa. (b) Кофактор для згортання крові та фактор, пов'язаний з фібринолізом (Приклад 2). Фермент: ZPI Субстрат: F.X/F.Xa Кофактор: PZ Кофактор PZ зв'язується з ZPI родини серпіну та активованим фактором згортання крові X (F.Xa), підсилюючи F.Xa-інгібуючу активність ZPI Більш конкретно, вважають, що деякі біспецифічні антитіла, що розпізнають як ZPI, так і F.X/F.Xa, мають ефект заміщення функції PZ. (c) Кофактор для згортання крові та фактор, пов'язаний з фібринолізом (Приклад 3). Фермент: тромбін Субстрат: TAFI Кофактор: TM Кофактор TM підсилює активацію TAFI тромбіном. Більш конкретно, вважають, що деякі біспецифічні антитіла, що розпізнають як тромбін, так і TAFI, мають ефект заміщення функції TM. (d) Кофактор для згортання крові та фактор, 95438 18 пов'язаний з фібринолізом (Приклад 4). Фермент: тромбін Субстрат: PC Кофактори: TM/PS Система TM/PS підсилює активацію PC тромбіном. Більш конкретно, вважають, що деякі біспецифічні антитіла, що розпинають як тромбін, так і PC, функціонально заміщують систему TM/PS. (e) Кофактор для згортання крові та фактор, пов'язаний з фібринолізом (Приклад 5). Фермент: F.Xa Субстрат: протромбін Кофактор: F.V/F.Va Кофактор F.Va зв'язується як з F.Xa, так і з протромбіном, підсилюючи активацію протромбіну за допомогою F.Xa. Серед біспецифічних антитіл, що розпізнають як вищеописаний фермент F.Xa, так і його субстрат протромбін, деякі мають підсилюючий ефект на активацію протромбіну. Вважають, що деякі з цих антитіл мають функцію, що заміщує фушсцію кофактора F.V/F.Va. (f) Кофактор для реакції комплементу (Приклад 1). Фермент: C1s Субстрат: С2 Кофактор: С4b С4b має вплив на C1s', що сприяє деструкції С2. Більш конкретно, вважають, що деякі біспецифічні антитіла, що розпізнають як C1s, так і С2, функціонально заміщують С4b. (g) Кофактори для реакції комплементу (Приклад 2) Фермент: Регуляторний фактор І комплементу Субстрат: С3b Кофактори: Регуляторний фактор H комплементу, Мембранний білок-кофактор (MCP) та Рецептор 1 (CR1) комплементу. Регуляторні фактори Н, MCP та CR1 комплементу мають вплив на регуляторний фактор 1 комплементу, сприяючий деградації С3b. Більш конкретно, вважають, що серед біспецифічних антитіл, що розпізнають як регуляторний фактор 1 комплементу, так і С3b, деякі функціонально замилують регуляторні фактори Н, MCP та CR1 комплементу. Серед вищеописаних кофакторів F.VIII/F. VIIIa є особливо переважним. Незважаючи на те, що F.VIII/F.Vina зазнає обмеженого протеолізу від протеолітичних ферментів, таких як тромбін, його форма не має значення, доки він має активність F.VIII/F.VIIIa. Крім того, варіанти F.VIII/F.VIIIa та F.VIII/F.VIIIa, які були штучно модифіковані за способами рекомбінації генів, також включаються у F.VIII/F.VIIIa, доки вони зберігають активність кофактору F.VIII/F.VIIIa. Способи отримання біспецифічних антитіл, які функціонально заміщують кофактори, цього винаходу особливо не обмежуються, та їх можна отримати будь-якими способами. Наприклад, коли необхідно отримати біспецифічне антитіло, яке функціонально заміщує фермент А та субстрат В, фермент А та субстрат В вводять тварині для імунізації, щоб отримати антитіло до ферменту А та антитіло до субстрату В. Внаслідок цього виробляється біспецифічне антитіло, яке включає H- та 19 L-ланцюги антитіла до ферменту А та H- та L- ланцюги антитіла до субстрату В. У цьому описі бажано отримати декілька типів кожного з антитіл до ферменту А та антитіл до субстрату В, так щоб ці антитіла можна було б переважно застосовувати для виробництва як можна більшої кількості комбінацій біспецифічних антитіл. Після виробництва біспецифічних антитіл вибираються антитіла з активністю, яка замішує функцію кофактору. Антитіла проти ферменту або субстрату можна отримати за способами, відомими фахівцям у цій галузі. Наприклад, антитіла можна приготувати шляхом імунізації тварин антигенами. Антигени для імунізації тварин - це, наприклад, повні антигени, що мають імуногенність, та неповні антигени (включаючи гаптен) без імуногенності. У цьому винаході фермент, чий кофактор можна функціонально замістити антитілом цього винаходу, яке діє як кофактор, або субстрат ферменту застосовується як вищеописаний антиген (імуноген). Як тварин для імунізації можна застосовувати, наприклад, мишей, щурів, хом'ячків, морських свинок, кролів, курчат, макаку-резус та їм подібних. Імунізацію цих тварин антигенами можна виконувати за способами, відомими фахівцям у цій галузі. У цьому винаході варіабельні області L- ланцюга та Нланцюга антитіла переважно беруться від імунізованих тварин або їх клітин. Цю процедуру може виконати фахівець у галузі, застосовуючи загально відомі способи. Імунізовані антигеном тварини експресують антитіла проти цього антигену, особливо у клітинах селезінки. Завдяки цьому, наприклад, можна приготувати мРНК з клітин селезінки імунізованої тварини, та варіабельні області Lланцюга та Н-ланцюга можна одержати шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (RT-PCR), застосовуючи праймери до варіабельних областей тварини. Більш конкретно, тварин імунізують ферментом або субстратом. Фермент та субстрат, які застосовуються як імуногени, можуть бути цілими білками або їхніми частковими пептидами. Крім того, залежно від обставин, антиген-кандидат, зв'язаний з іншою молекулою, утворюючи розчинний антиген, або його фрагмент можна застосовувати як імуноген для імунізації тварин. Клітини селезінки видаляють з селезінок імунізованих мишей та зливають з клітинами мієломи мишей, утворюючи гібридоми. Після відбору гібридом, які зв'язуються з відповідними антигенами, варіабельні області L-ланцюга та Н-ланцюга одержують шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою, застосовуючи, наприклад, праймери, що відповідають варіабельним областям. Можна також застосовувати праймери до CDR, праймери до каркасних ділянок, які є менш різноманітними порівняно з CDR, або праймери до сигнальних послідовностей та CH1 або константної області L-ланцюга (CL). Альтернативно, мРНК екстрагують з клітин селезінки імунізованих тварин та кДНК варіабельних областей L-ланцюга та Н-ланцюга одержують шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотньою транскриптазою, застосовуючи праймери до сусідніх ділянок варіабельних областей. Крім того, 95438 20 лімфоцити можна також імунізувати in vitro та використати їх для побудови бібліотек, що презентують scFv або Fab. Варіабельні області можна отримати шляхом концентрування та клонування клону антиген-зв'язувального антитіла шляхом пенінгу. У цьому випадку можна також здійснити скринінг, застосовуючи подібні бібліотеки, побудовані з мРНК, що походять з таких матеріалів, як моноцити периферійної крові, селезінка, мигдалина та їм подібні органи людини та неімунізованих тварин. Варіабельні області потім використовують для приготування векторів експресії антитіла. Біспецифічне антитіло можна отримати шляхом введення вектора експресії антитіла до ферменту та вектора експресії антитіла до субстрату в одну й ту ж клітину та експресування антитіл. Антитіла, що мають активність заміщення функції кофактору, можна відбирати, наприклад, за способами, описаними нижче. 1). У реакційній системі, що включає фермент та субстрат, відбір виконують, використовуючи як показник підвищення ферментативної активності (спроможність до деградації субстрату), де підвищення ферментативної активності є результатом додавання антитіла. 2). У системі для вимірювання або симуляції біологічних функцій, у які залучаються фермент, субстрат та кофактор (наприклад, система для вимірювання згортання плазми), відбір виконують, використовуючи як показник активність функціонального відновлення, де активність функціонального відновлення є результатом додавання антитіла у відсутності кофактору. Антитіло, отримане таким способом, можна очистити до гомогенності. Виділення та очищення антитіла можна виконувати, застосовуючи способи виділення та очищення, які використовуються для загальних білків. Наприклад, антитіла можна виділяти та очищувати шляхом відповідного відбору та комбінування хроматографічних колонок, так як, наприклад, шляхом афінної хроматографії, фільтрації, ультрафільтрації, знесолювання, діалізу, електрофорезу на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію, ізоелектричного електрофорезу тощо (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), проте, ними методи не обмежуються. Колонка, що застосовується під час афінної хроматографії - це, наприклад, колонка з білком А, колонка з білком G тощо. Наприклад, коли F.VIII/F.VIIIa - це кофактор заміщення, тобто, коли комбінація ферменту та субстрату - це фактори F.IXa та F.X, пов'язані зі згортанням плазми та фібринолізом, біспецифічне антитіло цього винаходу переважно має структуру, яка включає варіабельну область антитіла до F.IXa та варіабельну область антитіла до F.X. Біспецифічні антитіла цього винаходу, які функціонально заміщують F.VIII/F.VIIIa, генерували наступним способом. Мишей підшкірно імунізували комерційно доступними F.IXa або F.X. Клітини селезінки виділили з селезінок імунізованих мишей з підвищеним титром антитіла та злили з клітинами мієломи мишей, утворивши гібридоми. Гібридоми, 21 що зв'язуються з антигеном F.IXa або F.X, відібрали та варіабельні області L-ланцюга та Н-ланцюга одержали шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (RT-PCR), застосовуючи праймери до варіабельних областей. Варіабельну область L-ланцюга включили у вектор експресії L-ланцюга, який містив CL, а варіабельну область Н-ланцюга вставили у вектор експресії Нланцюга, який містив константну область Нланцюга. Крім того, мРНК екстрагували з селезінок імунізованих мишей та кожну кДНК варіабельних областей L-ланцюга та Н-ланцюга одержали шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (RT-PCR), застосовуючи праймери до відповідної варіабельної області. Застосовуючи ці варіабельні області, побудували бібліотеку фатів з присутнім scFv. Клони антигензв'язувальних антитіл концентрували та клонували шляхом пенінгу і утворили вектори експресії антитіла, використовуючи їх варіабельну область. Вектори експресії (Н-ланцюг, L-ланцюг) антитіла до F.IXa та вектори експресії (Н-ланцюг, L-ланцюг) антитіла до F.X ввели в однакові клітини для експресії антитіла і таким чином отримали біспецифічні антитіла. Біспецифічні антитіла, отримані таким чином, проаналізували щодо їх ефекту функціонального заміщення F.VIII/F.VIIIa (кофактори активації F.X за допомогою F.IXa) в аналітичній системі, яка включала F.XIa (фермент, що активує F.IX), F.IX, F.X, синтетичний субстрат (S-2222) для F.Xa та фосфоліпід. По суті, як біспецифічне антитіло, що має активність функціонально заміщувати F.VIII/F.VIIIa, відбирали на основі результатів аналізу ті біспецифічні антитіла, що демонстрували F. VIIIa-міметичну активність 0,1 або більше у цій аналітичній системі. F.VIIIa-міметична активність, на яку посилаються у цьому описі, - це значення, яке отримано протягом 30 або 60 хвилин, шляхом віднімання значення зміни поглинання розчинника або культурадьної надосадової рідини, що не експресує антитіло, від значення зміни поглинання розчину антитіла або культуральної надосадової рідини, що експресує антитіло. У вибраних вище біспецифічних антитіл або біспецифічних антитіл, тісно пов'язаних з ними, вимірювали спроможність відновляти згортання в аналітичній системі часу згортання, яка застосовує плазму людини, позбавлену F.VIII. Як наслідок, отримали біспецифічні антитіла, спроможні скорочувати час згортання порівняно з випадками, коли їх не додають. Час згортання, на який посилаються у цьому описі, - це, як зображено на фігурі 7, активований частковий тромбопластиновий час (АРТТ), який вимірювали, застосовуючи плазму людини, позбавлену F.VIII. Серед цих біспецифічних антитіл переважні біспецифічні антитіла мають спроможність скорочувати час згортання на 10 секунд або більше, більш переважно - на 20 секунд або більше, іще більш переважно - на 40 секунд або більше, та найбільш переважно - на 50 секунд або більше. CDR3 Н-ланцюга антитіл цього винаходу особливо не обмежуються, проте вони специфічно мають гіперваріабельну ділянку, яка включає амі 95438 22 нокислотну послідовність, описану у будь-якій послідовності CDR3 Н-ланцюга (послідовності №№16,20,60,64,68,72,76,80,84,88,92 та 96) ХВ12, ХТ04, А19, А25, А31, А38, А39, А40, А41, А44, А50 та А69, описані у прикладах, наведених нижче, або послідовності, функціонально еквівалентні до них, та гіперваріабельну ділянку, яка включає амінокислотну послідовність, описану у будь-якій послідовності CDR3 Н-ланцюга (послідовності №№ 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200 та 204) у SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, В2, В5, В9, В10, B11, В12, В13, В14, В15, В16, В18, В19, В20, В21, В23, В25, В26, В27, В31, В34-1, В34-2, В35, В36, В38, В42, SB15 та SB27, відповідно, або послідовності, функціонально еквівалентні до них. Крім того, специфічний приклад вищеописаних антитіл переважно комбінується з антитіла, що має гіперваріабельну ділянку, яка включає одну з амінокислотних послідовностей CDR Н-ланцюга ХВ12, ХТ04, А19, А25, А31, А38, А39, А40, А41, А44, А50 та А69 (послідовності №№ 14-16, 18-20, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 8688, 90-92 та 94-96) або функціонально еквівалентну до неї гіперваріабельну ділянку, та антитіла, що має гіперваріабельну ділянку, яка включає будьяку з амінокислотних послідовностей CDR Нланцюга (послідовності №№ 22-24, 26-28, 30-32, 34-36, 38-40, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 98-100, 102-104, 106-108, 110-112, 114-116, 118-120, 122124, 126-128, 130-132, 134-136, 138-140, 142-144, 146-148, 150-152, 154-156, 158-160, 162-164, 166168, 170-172, 174-176, 178-180, 182-184, 186-188, 190-192, 194-196, 198-200 та 202-204) у SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, В2, В5, В9, В10, B11, В12, В13, В14, В15, В16, В18, В19; В20, В21, В23, В25, В26, В27, В31, В34-1, В34-2, В35, В36, В38, В42, SB15 та SB27) або функціонально еквівалентну до неї гіперваріабельну ділянку. Амінокислотні послідовності варіабельних областей Н-ланцюга XB12, ХТ04, А19, А25, А31, А38, А39, А40, А41, А44, А50, А69, SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, В2, В5, В9, B10, B11, В12, ВІЗ, В14, В15, В16, В18, В19, В20, В21, В23, В25, В26, В27, В31, В34-1, В34-2, В35, В36, В38, В42, SB15 та SB27, описані у цьому винаході, зображено як послідовності №№ 13, 17, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197 та 201. Амінокислотні послідовності варіабельних областей L-ланцюга А44, В26, XB12 та SB04, описані у цьому винаході, зображено як послідовності №№ 205,209,213 та 217. Послідовності CDR L-ланцюга А44, В26, XB12 та SB04 зображено як послідовності №№ 206-208, 210-212, 214-216 та 218-220. Нуклеотидні послідовності CDR Н-ланцюга ХВ12, SB04, А44 та В26 зображено як послідовності №№ 221 (222), 223 (224), 225 (226), 233 (234), 235 (236), 237 (238), 245 (246), 247 (248), 249 (250), 257 (258), 259 (260) та 261 (262) (послідовності у дужках - це 23 амінокислотні послідовності, що кодуються відповідними нуклеїновими кислотами), а їх нуклеотидні послідовності CDR L-ланцюга зображено як послідовності №№ 227 (228), 229 (230), 231 (232), 239 (240), 241 (242), 243 (244), 251 (252), 253 (254), 255 (256), 263 (264), 265 (266) та 267 (268). Послідовності №№ 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258 та 264 репрезентують CDR1. Послідовності №№ 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103,107, 111, 115,119, 123, 127,131, 135, 139, 143, 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187,191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260 та 266 репрезентують CDR2. Послідовності №№ 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262 та 268 ретрезентують CDR3. Антитіла цього винаходу особливо не обмежуються, проте вони є переважно біспецифічними антитілами, комбінованими з антитіла до фактора IXa та антитіла до фактора X, які мають такі ж самі епітопи, як вищезгадані антитіла, або епітопи, тісно споріднені з ними. Антитіла, що мають однаковий або тісно споріднений епітоп, у цьому описі позначають, наприклад, антитіла, які конкурують один з одним щодо зв'язування антигену у конкурентному ЕЛАЙЗА тощо. Не обмежуючись ним, у цьому способі конкурентного ЕЛАЙЗА фактор IX/IXa або фактор X іммобілізують на планшеті Micro Well з 96 лунками, одночасно додають відповідним чином мічене антитіло та антитіло, яке слід аналізувати, та, застосовуючи мітку, виявляють зв'язане антитіло. Ця мітка особливо не обмежується, та вона включає мітку лужної фосфатази, мітку пероксидази, фермент, що зв'язує стрептавідин, мічений біотином (лужна фосфатаза, пероксидаза тощо), FTTC та їм подібні. Спостерігається епітопне перекривання, якщо спостерігається принаймні 50% конкуренція, коли антитіло є присутнім у концентрації, надмірній у 100000 разів відносно антитіла, яке слід аналізувати. При приготуванні антитіла з повною довжиною, застосовуючи варіабельні області, описані у цьому винаході, константні області антитіла особливо не обмежуються, та області, відомі фахівцям у галузі, наприклад, можна застосовувати області, описані у "Sequences of proteins of immunological interest, (1991), U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service National Institutes of Health" та "An efficient route to human bispecific IgG, (1998). Nature Biotechnology vol. 16,677-681", таїм подібні. В одному варіанті здійснення антитіл цього винаходу антитіла мають ефект функціонально заміщувати кофактори, та завдяки цьому очікується, що вони стануть ефективними ліками проти хвороб, які спричиняються зменшенням активності 95438 24 (функції) цих кофакторів. У випадках, кож кофактор, що функціонально заміщується антитілом цього винаходу, - це фактор, пов'язаний зі згортанням крові та фібринолізом, вищеописані хвороби - це, наприклад, кровотеча, хвороби, що супроводжуються кровотечею, хвороби, що спричиняються кровотечею, та їм подібні. Зокрема відомо, що функціональне зменшення та дефіцит F.VIII/F.VIIIa, F.DC/F.Ka та F.XI/F.XIa спричиняють патологічну кровотечу, яка називається гемофілією. Серед різновидів гемофілії патологічна кровотеча, яка є наслідком природженої гіпофункції F.VIII/F.VIIIa або дефіциту F.VIII/F.VIIIa, називається гемофілія А. Коли у пацієнта з гемофілією А відбувається кровотеча, здійснюється замісна терапія фармацевтичною композицією з F.VIII. Крім того, профілактичне введення композиції з F.VIII можна здійснювати (дивись непатентні документи 1 та 2) у день інтенсивного фізичного навантаження або під час пішої подорожі, коли виникають часті внутрисуглобні кровотечі, або коли пацієнту ставлять діагноз гострої гемофілії. Оскільки це профілактичне введення композиції з F.VIII помітно зменшує епізоди кровотечі у пацієнтів з гемофілією А, за останні часи воно стало популярним. Зменшення епізодів кровотечі не тільки зменшує ризик летальної та нелегальної кровотечі та .агонії, що її супроводжує, але також запобігає гемофільній артропатії, яка є наслідком частої внутрисуглобної кровотечі. Як наслідок, він суттєво впливає на покращення якості життя пацієнтів з гемофілією А. Період напіврозпаду композиції з F.VIII у кровотоці є коротким та становить від приблизно 12 до приблизно 16 годин. Отже, для тривалої профілактики необхідно вводити композицію з F.VIII приблизно тричі на тиждень. Це еквівалентно підтриманню приблизно 1% активності F.VIII або більше (дивись непатентні документи 3 та 4). Крім того, під час замісної терапії при кровотечі необхідно періодично вводити склади, що підсилюють F.VIII, протягом певного періоду часу за виключенням, коли кровотеча є помірною, з метою запобігти повторній кровотечі та встановити повний гемостаз. Крім того, композиції з F.VIII вводяться внутрівенно. Існують технічні труднощі щодо виконання внутрівенного введення, та воно стає навіть більш складним особливо, коли введення здійснюється молодим пацієнтам, вени яких є тонкими. Під час вищеописаного профілактичного введення складу з F.VIII та його введення у невідкладних випадках кровотечі, у більшості випадків застосовується лікування вдома та самоін'єкції. Необхідність частого введення та технічні труднощі не лише спричиняють біль пацієнтам, але також стають тією причиною, яка не сприяє популярності лікування вдома та самоін'єкції. Отже, беручи до уваги сучасні композиції з фактором згортання крові F.VIII, існує невідкладна потреба у ліках, які мають триваліші інтервали введення, та у ліках, які можна легко вводити. Крім того, антитіла до F.VIII, які називаються інгібіторами, можна генерувати у пацієнтів з гемо 25 філією А, особливо у пацієнтів з гострою формою гемофілії А. Якщо інгібітор генерується, дія композиції з F. VIII затримується інгібітором. Як наслідок, для пацієнтів стає дуже складним контролювати гемостаз. Коли відбувається кровотеча у такого пацієнта з гемофілією А з інгібітором, звичайно виконують нейтралізуючу терапію, застосовуючи велику дозу композиції з F.VIII, або обхідну терапію, застосовуючи складний концентрат або композицію з F.VIII. Проте, під час нейтралізуючої терапії введення великої дози композиції з F.VIII може шкідливо підвищити титр інгібітору (антитіла до F.VIII). Крім того, при обхідній терапії відносно короткі періоди напіврозпаду (приблизно від 2 до 8 годин) складних концентратів та композиції з F.VIIIa становлять проблему. Крім того, оскільки механізми їх дії не залежать від функції F.VIII/F.VIIIa, тобто функції каталізувати активацію F.X за допомогою FIXa, механізм гемостазу може не функціонувати належним чином, та він може не реагувати. Отже, у багатьох випадках у пацієнтів з гемофілією А з інгібітором неможливо отримати достатнього гемостатичного ефекту порівняно з пацієнтами без інгібітору гемофілії А. Отже, існує сильна потреба у ліках, на які не впливає присутність інгібіторів, та які можуть функціонально заміщувати F.VIII/F.VIIIa. Окрім гемофілії та набутої гемофілії, що спричиняється аутоантатілом до F.VIII, хвороба Віллебранда (ангіогемофілія), яка спричиняється функціональною патологією або дефіцитом vWF, відома як розлад патологічної кровотечі, пов'язаний з F.VIII/F.VIIIa. vWF є необхідним не тільки для нормальної адгезії тромбоцитів з субендотеліальними тканинами на ділянках пошкодження судинних стінок, але також для утворення комплексів з F.VIII для щцтримки нормального рівня F.VIII у плазмі. У пацієнтів з хворобою Віллебранда ці функції послаблені, та виникає функціональна патологія гемостазу. Стосовно вищеописаного, способи, які застосовують антитіла, можна розглядати для створення ліків, які (і) мають тривалі інтервали введення, (іі) легко вводити, та (ііі) на які не впливає присутність інгібіторів, та (iv) можуть суттєво заміщати F.VIII/F.VIIIa способом, незалежним від F.VIII/F.VIIIa. Взагалі, періоди напіврозпаду антитіл у кровотоці є відносно тривалими - від декількох днів до декількох тижнів. Крім того, відомо, що антитіла мігрують у кровотоці після підшкірного введення. Тобто, ліки антитіл взагалі відповідають вищеописаним вимогам (і) та (іі). Цим винаходом пропонуються фармацевтичні композиції, які включають антитіло цього винаходу як активний інгредієнт. Наприклад, коли антитіло цього винаходу є одним з антитіл, що розпізнають як F.IX/F.IXa, так і F.X, та можуть функціонально заміщувати F. VIlla, очікується, що це антитіло стане фармацевтичним препаратом (фармацевтичною композицією) або ліками для профілактики або лікування кровотечі, розладів, що супроводжуються кровотечею, або розладів, що спричиняються кровотечею. Крім того, коли антитіло цього винаходу є одним з антитіл, що розпізнають як 95438 26 F.X/F.Xa, так і протромбін, та можуть функціонально заміщувати F.Va, очікується, що це антитіло стане фармацевтичним препаратом (фармацевтичною композицією) або ліками для профілактики або лікування кровотечі, розладів, що супроводжуються кровотечею, або розладів, що спричиняються кровотечею. Разом з цим очікується, що антитіло, яке зв'язується з ZPI та F.X та функціонально заміщує PZ, стане фармацевтичним препаратом (фармацевтичною композицією) або ліками з дією проти утворення тромбів; антитіло, яке зв'язується з тромбіном та TAFI та функціонально заміщує TM, стане фармацевтичним препаратом (фармацевтичною композицією) або ліками з ефектом, що сприяє гемостазу, а антитіло, яке зв'язується з тромбіном та PC та функціонально заміщує систему PS/TM, стане фармацевтичним препаратом; (фармацевтичною композицією) або ліками з ефектом модуляції згортання. Окрім того, оскільки дефіцит комплементу С4 спричиняє системний червоний вовчак (SLE), очікується, що антитіло, яке функціонально заміщує С4b, стане фармацевтичним препаратом (фармацевтичною композицією) або ліками з ефектом, що пригнічує виникнення системного червоного вовчака. Оскільки дефіцит фактора H спричиняє плину інфекцію та аутоімунний гломерулонефрит, очікується, що антитіло, яке функціонально заміщує фактор Н, стане фармацевтичним препаратом (фармацевтичною композицією) або ліками з ефектом пригнічення початку цих хвороб. Для приготування фармацевтичних препаратів, включаючи фармацевтичні композиції, антитіло цього винаходу, що застосовується для лікування або профілактики як активний інгредієнт, можна, за необхідністю, змішати з відповідним фармацевтично придатним носієм, середовищем та такими речовинами, які є інертними до нього. Наприклад, можна перелічити стерильну воду або фізіологічний розчин, стабілізатор, ексципієнт, антиоксидант (аскорбінова кислота тощо), буфер (фосфорна кислота, лимонна кислота, інші органічні кислоти тощо), антисептик, поверхнево-активну речовину (ПЕГ, Tween тощо), хелатоутворювальний агент (ЕДТК тощо), зв'язувальний агент та їм подібні. Фармацевтичні композиції можуть також містити інші низькомолекулярні поліпептиди, білки, такі як сироватковий альбумін, желатин та імуноглобулін, амінокислоти, такі як гліцин, глютамін, аспарагін, аргінін та лізин, цукри, такі як полісахариди та моносахариди, та вуглеводні, та цукрові спирти, такі як маніт та сорбіт. При приготуванні водних розчинів для ін'єкції, наприклад, солюбілізувальні агенти включають фізіологічний сольовий розчин, ізотонічні розчини, що містять глюкозу та інші допоміжні агенти, такі як D-сорбіт, D-маноза, D-маніт та хлорид натрію, та їх можна застосовувати у комбінації з відповідними солюбілізувальними агентами, такими як спирт (етанол тощо), поліспирт (пропіленгліколь, ПЕГ тощо), та неіонними поверхнево-активними речовинами (полісорбат 80, НСО-50 тощо). Крім того, якщо необхідно, антитіла цього винаходу можна помістити у мікрокапсули (мікрокап 27 сули, виготовлені з гідроксиметилцелюлози, желатину, полі(метилметакрилату) тощо), або їх можна включити у колоїдну систему доставки ліків (ліпосома, альбумінова мікросфера, мікроемульсія, нано-частинка та нано-капсула тощо) (дивись "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980) тощо). Відомі також способи виготовлення фармацевтичних складів ліків з уповільненим вивільненням, та їх можна застосовувати до антитіл цього винаходу (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); патент США № 3,773,919; Європейська заявка на патент (ЕР): 58,481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983); ЕР133,988). Антитіла або фармацевтичні композиції цього винаходу можна застосовувати у комбінації з фактором згортання крові VIII. Антитіла або фармацевтичні композиції цього винаходу можна вводити з фактором згортання крові VIII одночасно або з деяким інтервалом між ними. Введення можна виконувати у наборі, який поєднує антитіло або фармацевтичну композицію цього винаходу з фактором згортання крові VIII. Коли антитіло або фармацевтична композиція цього винаходу застосовується у комбінації з фактором згортання крові VIII, за бажанням також можна застосовувати дози нижчі, порівняно з дозами, коли їх застосовують окремо. Незважаючи на те, що дозування фармацевтичних композицій цього винаходу відповідним чином визначається, враховуючи тип фармацевтичного складу, спосіб введення, вік та вагу тіла пацієнта, симптоми пацієнта, тип та стан розвитку хвороби тощо, та, зрештою, лікарями, взагалі, дози від 0,1 до 2000 мг/день можна розподілити на від одного до декількох введень для дорослих. Дозування становить переважно від 1 до 1000 мг/день, більш переважно від 5 до 500 мг/день та найбільш переважно від 100 до 300 мг/день. Незважаючи на те, що дозування різниться залежно від ваги тіла та віку пацієнтів, способів введення та тому подібного, фахівець у галузі зможе вибрати відповідне дозування. Переважно, період дозування також відповідним чином визначається згідно з, наприклад, процесом одужування пацієнтів. Крім того, також можливо здійснювати генну терапію шляхом вставки гена, що кодує антитіло цього винаходу у вектори генної терапії. Як спосіб введення за виключенням прямого введення голих плазмід, гени можна вводити запакованими у ліпосому або їй подібне або шляхом вставки у різні вірусні вектори, такі як вектор ретровірусу, вектори аденовірусу, вектори вірусу коров'ячої віспи, вектори поксвірусу, вектори аденоасоцийованого вірусу та вектори HVJ (дивись Adolph "Virus Genome Method" CRC Press, Florid (1996)), або шляхом нанесення на гранули-носії, такі як колоїдна частинка золота (WO93/17706 тощо). Проте, ген можна вводити будь-якими способами, доки антитіло може експресуватися in vivo, виявляючи свою дію. Переважно, достатня доза вводиться відповідним парентеральним способом, таким як внутрівенна, інтраперитоніальна, шдшжірна, ввуфішньошкірна ін'єкція або інфузія, ін'єкція або інфузія крізь жирову тканину, інтрамамарна та внутрішньом'язова 95438 28 ін'єкція або інфузія, інгаляція, спосіб індуковного газом бомбардування частинками (електронною пушкою або подібним) або крізь слизисту оболонку, застосовуючи носові краплі. Гени, що кодують антитіло цього винаходу, можна вводити шляхом введення гена у кров'яні клітини, клітини, що походять з кісткового мозку таїм подібні, застосовуючи ліпосомну трансфекцію ex vivo, спосіб бомбардування частинками (патент США № 4,945,050) або вірусну інфекцію, та повторного введення цих клітин тваринам. Під час генної терапії можна застосовувати будь-який ген, що кодує антитіло цього винаходу, наприклад, гени, які включають нуклеотидні послідовності CDR вищеописаних XB12, SB04, А44 та В26. Цим винаходом також пропонуються способи профілактики та/або лікування кровотечі, розладів, що супроводжуються кровотечею, або розладів, що спричиняються кровотечею, при цьому спосіб включає етапи введення антитіла або композиції цього винаходу. Антитіла або композиції можна вводити, наприклад, за допомогою вищезгаданих способів. Цей винахід також стосується застосування антитіл цього винаходу для виробництва (фармацевтичних) композицій цього винаходу. Крім того, цим винаходом пропонуються набори, які включають принаймні антитіло або композицію цього винаходу, які слід застосовувати у вищеописаних способах. Скляний шприць, голку для ін'єкцій, фармацевтично прийнятне середовище, спиртову вату, бинт, інструкцію, яка описує застосування, тощо можна також необов'язково запакувати у набори. Усі документи з попереднього рівня, які згадані у цьому описі, включено до нього шляхом посилання. Далі цей винахід буде більш докладно описано з посиланням на Приклади, проте їх не слід вважати обмежувальними. Приклад 1. Приготування не нейтралізуючого антитіла проти фактора IXa (F.IXa). 1-1. Імунізація та приготування гібридом. Вісім мишей BALB/c (самці, віком б тижнів на початку імунізації (Charles River, Japan)) та п'ять мишей MRL/lpr (самці, віком 6 тижнів на початку імунізації (Charles River, Japan)) імунізували фактором IXa людини (Еnzуmе Research Laboratories, Inc.) нижчеописаним способом. Як початкову імунізацію, фактор ІХа (40 мг/тварину), емульсований в FCA (повний ад'ювант Фрейнда Н37 Ra (Difco laboratories)), ввели шляхом підшкірної ін'єкції. За два тижні фактор IXa (40 мг/тварину), емульсований в FIA (неповний ад'ювант Фрейнда (Difco laboratories)), ввели шляхом підшкірної ін'єкції. Після цього здійснювали від трьох до семи підсилюючих імунізацій з інтервалом в один тиждень. Після того, як ЕЛАЙЗА (ELISA - твердофазний імуноферментний аналіз), описаний у 1-2, підтвердив, що титр антитіла у плазмі проти фактора LXa підвищився, фактор IXa (40 мг/тварину), розведений у PBS(-) (сольовому розчині з фосфатним буфером, вільному від іону кальцію та іону магнію), ввели шляхом підшкірної ін'єкції як кінцеву імуноацію. Через три дні після кінцевої імунізації у 29 мишей видалили селезінки. У той час, коли частина їх застосовувалася у Прикладі 10-2, решту клітин селезінки злили з клітинами мієломи мишей P3X63Ag8U.1 (позначаються як P3U1, ATCC CRL1597) за стандартним способом, застосовуючи PEG1500 (Roche Diagnosticb). Злиті клітини, суспендовані у середовищі RPMI1640 (Invitrogen), що містило 10% FBS (Invitrogen) (далі позначатиметься як 10% FBS/RPMI1640), висіяли в культуральний планшет з 96 лунками та через 1, 2, 3 та 5 днів після злиття середовище замістили елективним ГАТ-середовищем (HAT) (10% FBS/RPMI1640/2% HAT 50х концентрат (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd)/ 5% BM-Condimed H1 (Roche Diagnostics), щоб селективно культивувати гібридоми. Застосовуючи надосадові рідини, зібрані на 8-ий або 9-ий день після злиття, зв'язувальну активність фактора IXa вимірювали шляхом ЕЛАЙЗА, описаному у 1-2, щоб відібрати гібридоми, що мають зв'язувальну активність фактора IXa. Послідовно, активність нейтралізації ферментативної активності фактора IXa вимірювали за способами, описаними у 1-3, щоб відібрати гібридоми, які не мають активності щодо нейтралізації фактора IXa. Гібридоми клонували двічі, виконуючи обмежувальні розведення, при яких одна клітина висівається у кожну лунку культурального планшета з 96 лунками. Клітини єдиної колонії, визначенні шляхом спостереження під мікроскопом, зазнали ЕЛАЙЗА, та для відбору клонів виконували аналіз нейтралізувальної активності, описаний у 1-2 та 1-3. Асцитну рідину, що містила клоноване антитіло, одержали за способом, описаним в 1-4, та це антитіло очистили від асцитної рідини. Очищене антитіло було неспроможним подовжувати активований частковий тромбопластиновий час (АРТТ), та це було підтверджено за способом, описаним в 1-5. 1-2. ЕЛАЙЗА фактора IXa Фактор IXa розвели до 1 мг/мл буфером покриття (100 мМ бікарбонату натрію, рН 9,6,0,02% азиду натрію) та розподілили на планшеті NuncImmuno (Nunc-Immuno™ 96 Micro Well™ plates TM MaxiSorp (NaIge Nunc International)) no 100 мкл/лунку. Потім планшет інкубували при 4C протягом ночі. Після триразового промивання план® шета PBS(-), що містив Tween 20, його блокували буфером-розріджувачем (50 мМ Tris-HCl, рН 8,1,1% альбумін бичачої сироватки, 1 мМ MgCl2, ® 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% азид ртрію) при кімнатній температурі протягом 2 годин. Після видалення буфера розведену буферомрозріджувачем антисироватку миші або культуральну надосадову рідину гібрчдоми додали по 100 мкл/лунку та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання планшета додали антимишачий IgG (H+L) козла, мічений лужною фосфатазою (Zymed Laboratories), який розвели до 1/2000 буферомрозріджувачем, по 100 мкл/лунку та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після промивання планшета шість разів колориметричний субстрат Blue-Phos™ Phosphate Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories) додали по 100 мкл/лунку та інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. Після додавання Blue-Phos™ 95438 30 Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratories) (100 мкл/лунку) вимірювали поглинання при 595 нм за допомогою Model 3550 Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories). 1-3. Вимірювання нейтралізуючої активності фактора IXa Фосфоліпід (Sigma-Aldrich) розчинили у дистильованій воді для ін'єкцій, а потім піддали ультразвуковому опромінюванню, щоб приготувати фосфоліпідний розчин (400 мкг/мл). Tris-забуферений сольовий розчин, що містив 0,1% альбуміну бичачої сироватки (далі застосовується скорочення TBSB) (40 мкл), 30 нг/мл фактора IХа (Enzyme Research Laboratories) (10 мкл), 400 мкг/мл фосфоліпідного розчину (5 мкл), TBSB, що містив 100 мМ CaCl2 та 20 мМ MgCl2 (5 мкл), та культуральну надосадову рідину гібридоми (10 мкл), змішали у планшеті з 96 лунками та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. У цей змішаний розчин додали 50 мкг/мл фактора X (Enzyme Research Laboratories) (20 мкл) та 3 одиниці/мл фактора Villa (American diagnostica) (10 мкл) та залишили реакційну суміш при кімнатній температурі на 30 хвилин. Реакцію припинили шляхом додавання 0,5 M ЕДТК (10 мкл). Після додавання розчину S-2222 (50 мкл; Chromogenix) та інкубації при кімнатній температурі протягом 30 хвилин виміряли поглинання при довжині хвилі вимірювання 405 нм та контрольній довжині хвилі 655 нм на Model 3550 Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories, Inc.). 1-4. Одержання асцитної рідини та очищення антитіла Асцитну рідину, утворення якої викликають отримані гібридоми, одержали згідно зі стандартними процедурами. А саме, гібридоми культивува6 ли in vitro (2 х 10 ) та трансплантували у черевну порожнину мишей ВALB/c (самці, віком від 5 до 7 тижнів на початку експерименту, Japan Charles River) або "голих" мишей BALB/c (самки, віком від 5 до 6 тижнів на початку експерименту, Japan Charles River and Japan CLEA), яким до початку двічі вводили інтраперитонеальним способом пристан (2,6,10,14г тетраметилпентадекан, WAKO Pure Chemical Industries). Через 1 - 4 тижні після трансплантації асцитну рідину зібрали від миші з роздутим животом. Антитіло очистили від асцитної рідини, застоTM совуючи колонку Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences). Асцитну рідину двічі розвели зв'язувальним буфером (20 мМ ацетат натрію, рН 5,0) та перенесли до колонки, яку промили 10 об'ємами колонки зв'язувального буфера. Антитіло елюювали 5 об'ємами колонки буфера елюювання (0,1 M гліцин-НСІ, рН 2,5) та нейтралізували буфером нейтралізації (1 M Tris-HCl, рН 9,0). Отриманий розчин концентрували, застосовуючи Centriprep™ 10 (Millipore) та розчинник замістили TBS (50 мМ сольовий розчин з Trisбуфером). Концентрацію антитіла підрахували за поглинанням при 280 нм з А (1%, 1 см) = 13,5. Поглинання вимірювали на приладі DU-650 (Beckman Coulter). 1-5. Вимірювання активованого часткового тромбопластинового часу (APTT) 31 Активований частковий тромбопластиновий час вимірювали CR-A (Amelung)-з'єднаним КС10А (Amelung). Суміш розчину антитіла, розведеного TBSB (50 мкл), стандартної плазми людини (Dade Bebring) (50 мкл) та реагенту APTT (активованого часткового тромбопластинового часу) (Dade Behring) (50 мкл) нагрівали при температурі 37°С протягом 3 хвилин. У цю суміш додали 20 мМ CaCl2 (Dade Behring) (50 мкл), щоб розпочати реакцію згортання, та вимірювали час згортання. Приклад 2. Приготування антитіла, що нейтралізує не-фактор X (F.X) 2-1. Імунізація та приготування гібридоми Вісім мишей BALB/c (самці, віком 6 тижнів на початку імунізації (Japan Charles River)) та п'ять мишей MRL/Ipr (самці, віком 6 тижнів на початку імунізації (Japan Charles River)) імунізували фактором X людини (Enzyme Research Laboratories, Inc.) за нижчеописаним способом. Як початкову імунізацію, фактор X (40 мг/тварину), емульсований в FCA (повний ад'ювант Фрейнда) ввели шляхом підшкірної ін'єкції. Через два тижні фактор X (20 або 40 мг/тварину), емульсований в FIA (неповний ад'ювант Фрейнда), ввели шляхом підшкірної ін'єкції. Після цього здійснювали від трьох до семи підсилюючих імунізацій з інтервалом в один тиждень. Після того, як ЕЛАЙЗА (твердофазний імуноферментяий аналіз), описаний у 2-2, підтвердив, що титр антитіла у плазмі проти фактора X підвищився, фактор X (20 або 40 мг/тварину), розведений у PBS(-), ввели шляхом підшкірної ін'єкції як кінцеву імунізацію. Через три дні після кінцевої імунізації у мишей видалили селезінки. У той час, коли частина їх застосовувалася у Прикладі 10-2, решту клітин селезінки злили з клітинами мієломи мишей P3U1 за стандартним способом, застосовуючи PEG 1500. Злиті клітини, суспендовані у середовищі 10%FBS/RPMI1640, висіяли в культуральний планшет з 96 лунками та гібридоми селективно культивували шляхом заміщення середовища елективним ГАТ-середовшцем через 1,2,3 та 5 днів після злиття. Застосовуючи надосадові рідини, зібрані на 8-ий або 9-ий день після злиття, зв'язувальну активність стосовно фактора X вимірювали шляхом ЕЛАЙЗА, описаному у 2-2. Гібридоми, що мали зв'язувальну активність фактора X, відбирали, та їх активність до нейтралізації ферментативної активності фактора Xa вимірювали способом, описаним у 2-3. Гібридоми, що не мали нейтралізуючої активності до фактора Xa, клонували шляхом здійснення; обмежувального розведення двічі. Асцитну рідину, що містила клоноване антитіло, одержали за способом, описаним в 1-4, та це антитіло очистили від асцитної рідини. Очищене антитіло було неспроможним подовжувати активований частковий тромбопластиновий час (АРТТ), та це було підтверджено способом, описаним в 15. 2-2. ЕЛАЙЗА фактора X. Фактор X розвели до 1 мг/мл буфером покриття та розподілили на планшеті Nunc-Immuno по 100 мкл/лунку. Потім планшет інкубували при 4°С протягом ночі. Після триразового промивання (R) планшета PBS(-), що містив Tween 20, його бло 95438 32 кували буфером-розріджувачем при кімнатній температурі протягом 2 годин. Після видалення буфера розведену буфером-розріджувачем антисироватку миші або культуральну надосадову рідину гібридоми додали у планшет та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після триразового промивання планшета додали антимишачий IgG (H+L) козла, мічений лужною фосфатазою, який розвели до 1/2000 буферомрозріджувачем, та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. Після промивання планшета шість разів колориметричний субстрат Blue-Phos™ Phosphate Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories) додали по 100 мкл/лунку та інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хвилин. Після додавання Blue-Phos™ Stop Solution (Kirkegaad & Perry Laboratories) (100 мкл/лунку) вимірювали поглинання при 595 нм за допомогою Model 3550 Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories). 2-3. Вимірювання активності нейтралізації фактора IXa Культуральну надосадову рідину гібридоми, розведену до 1/5 TBSB (10 мкл), змішали з 40 мкл TBCP (TBSB, що містив 2,78 мМ CaCl2 та 22,2 мкМ фосфоліпідів (фосфатидилхолш:фосфатидилсерин = 75:25, Sigma-Aldrich), що містив 250 пг/мл фактора Xa (Enzyme Research Laboratories), та інкубували при кімнатній температурі протягом 1 години. У цей змішаний розчин додали TBCP (50 мкл), що містив протромбін (Enzyme Research Laboratories) (20 мкг/мл) та 100 нг/мл активованого фактора згортання V (фактор Va (Haematologic Technologies)), та реакційну суміш залишили при кімнатній температурі на 10 хвилин. Реакцію припинили шляхом додавання 0,5 M ЕДТК (10 мкл). У цей реакційний розчин додали 1 мМ розчину S-2238 (Chromogenix) (50 мкл), а після інкубації при кімнатній температурі протягом 30 хвилин вимірювали поглинання при 405 нм за допомогою Model 3550 Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories). Приклад 3. Побудова вектору експресії химерного біспецифічного антитіла. 3-1. Приготування фрагментів ДНК, що кодують варіабельну область антитіла, з гібридом. Загальну PHK гібридом, які виробляють антитіло до F.IXa або антитіло до F.X, екстрагували, ® ® застосовуючи QIAGEN Rneasy Mini Kit (QIAGEN) згідно зі способом, описаним в інструкції. Загальну PHK розчинили у стерильній воді (40 мкл). Одноланцюгову кДНК синтезували шляхом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскриптазою (RT-PCR), застосовуючи систему синтезу кДНК Superscript (Invitrogen) з очищеною PHK (від 1 до 2 мкг) як матриці згідно зі способом, описаним в інструкції. 3-2. Ампліфікація шляхом полімеразної ланцюгової реакції (PCR) варіабельної області Нланцюга антитіла та аналіз послідовності. Як праймери для ампліфікації кДНК варіабельної області Н-ланцюга (VH) антитіла миші приготували праймерну суміш HB та праймерну суміш HF, які описані у статті КгеЬЬег'азі співавторами (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55). Застосовуючи 33 по 0,5 мкл кожної з 100 мкМ праймерної суміші HB та 100 мкМ праймерної суміші HF, приготували реакційний розчин (25 мкл) (розчин кДНК, одержаний у 3-1 (2,5 мкл), KOD плюс буфер (TOYOBO), 0,2 мМ dNTP, 1,5 мМ MgCl2,0,75 одиниці ДНКполімерази KOD плюс (TOYOBO)). Застосовуючи систему 9700 PCR термолунки GeneAmp (Parkin Elmer), PCR виконували згідно з ефективністю ампліфікації фрагментів кДНК в умовах А (нагрівання протягом 3 хвилин при 98C з наступними 32 циклами реакції (98°С, 20 секунд, 58C, 20 секунд, та 72C, 30 секунд, в одному циклі)) або умовах В (нагрівання протятрм 3 хвилин при температурі 94°С з наступними 5 циклами реакції (94°С, 20 секунд, 46C, 20 секунд, та 68°С, 30 секунд, в одному циклі) та 30 циклами реакції (94C, 20 секунд, 58C, 20 секунд, та 72C, 30 секунд, в одному циклі)). Після PCR реакційний розчин піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі. Ампліфіковані фрагменти бажаного розміру (приблизно 400 п. н.) очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) згідно зі способами, описаними в інструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Нуклеотидні послідовності фрагментів ДНК визначили із застосуванням набору BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) на секвенаторі ДНК ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) згідно зі способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Групи послідовностей, визначені цим способом, піддали порівняльному аналізу із застосуванням аналітичного програмного забезпечення GENETYX-SV/RC Version 6.1 (Genetyx) та відбирали ДНК з різними послідовностями. 3-3. Приготування фрагментів ДНК варіабельної області антитіла для клонування. Наступну процедуру виконували, щоб додати сайти розщеплення Sfi І ферментом рестрикції до обох кінців фрагментів ампліфікації варіабельної області антитіла для клонування. Для того, щоб ампліфікувати фрагменти VH, доповнені сайтом розщеплення SfIi І (Sfi I-VH), приготували праймер (праймер УН-5'-кінця), у якому послідовність лінкера (Gly4Ser)2 праймера HB замістили послідовністю, що містить сайт розщеплення Sfi І (послідовність № 5). Застосовуючи 0,5 мкл кожного з 10 мкМ праймеру УН-5'-кінця, специфічного для послідовності, та 10 мкМ праймеру scfor (J. Immunol. Methods 1997; 201: 35-55), приготували реакційний розчин (20 мкл) (очищений розчин фрагмента ампліфікації кДНК VH, одержаного у 3-2 (1 мкл), KOD плюс буфер (TOYOBO), 0,2 мМ dNTPs, 1,5 мМ MgCl2,0,5 одиниць ДНК-полімерази KOD плюс (TOYOBO)). Застосовуючи систему 9700 PCR термолунки GeneAmp (Parkin Elmer), PCR виконували згідно з ефективністю ампліфікації фрагментів кДНК в умовах А (нагрівання протягом З хвилин при 98°С з наступними 32 циклами реакції (98°С, 20 секунд, 58°С, 20 секунд, та 72°С, 30 секунд, в одному циклі)) або в умовах В (нагрівання протягом 3 хвилин при температурі 94C з наступними 5 циклами реакції (94°С, 20 секунд, 46C, 20 секунд, та 68C, 30 секунд, в одному циклі) та 30 циклами реакції 95438 34 (94°С, 20 секунд, 58°С, 20 секунд, та 72°С, 30 секунд, в одному циклі)). Після PCR реакційний розчин піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі. Ампліфіковані фрагменти бажаного розміру (приблизно 400 п. н.) очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) згідно зі способами, описаними в інструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Для того, щоб ампліфікувати фрагменти кДНК варіабельної області L-ланцюга (VL) антитіла миші, по-перше, застосовували по 0,5 мкл кожної з 100 мкМ праймерної суміші LB та 100 мкМ праймерної суміші LF, які описані у статті Krebber'a зі співавторами (J. Immunol. Methods 1997; 201: 3555), та приготували реакційний розчин (25 мкл) (розчин кДНК, одержаний у 3-1, KOD плюс буфер (TOYOBO), 0,2 мМ dNTP, 1,5 мМ MgCl2,0,75 одиниці ДНК-полімерази KOD плюс (TOYOBO)). Застосовуючи систему 9700 PCR термолунки GeneAmp (Parkin Elmer), PCR виконували згідно з ефективністю ампліфікації фрагментів в умовах нагрівання протягом 3 хвилин при 94C з наступними 5 циклами реакції (94°С, 20 секунд, 46°С, 20 секунд, та 68°С, 30 секунд, в одному циклі) та 30 циклами реакції (94°С, 20 секунд, 58°С, 20 секунд, та 72°С, 30 секунд, в одному циклі). Після PCR реакційний розчин піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі. Ампліфіковані фрагменти бажаного розміру (приблизно 400 п. н.) очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) згідно зі способами, описаними в інструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Фрагменти знаходяться у стані, при якому послідовність лінкеру (Gly4Ser)3, що походить від праймеру LF, додається до їх Скінців. Для того, щоб додати сайт розщеплення Sfi І до С-кінців фрагментів, приготували праймер (праймер VL-3'-кінця), у якому послідовність лінкеру (Gly4Ser)3 праймеру LF замістили послідовністю, що має сайт розщеплення Sfi I (послідовність № 6). Для того, щоб ампліфікувати фрагменти VL, доповнені сайтом розщеплення Sfi I (Sfi I-VL), застосовували по 0,5 мкл кожної з 10 мкМ праймерної суміші VL-3'-кінця та 10 мкМ праймеру scback та приготували реакційну суміш (20 мкл) (очищений розчин фрагмента ампліфікації кДНК VL (1 мкл) KOD плюс буфер (TOYOBO), 0,2 мМ dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 0,5 одиниці ДНК-полімерази KOD плюс (TOYOBO)). PCR виконували, застосовуючи систему 9700 PCR термолунки GeneAmp (Parkin Elmer), в умовах нагрівання протягом 3 хвилин при 94°С з наступними 5 циклами реакції (94°С, 20 секунд, 46°С, 20 секунд, та 68°С, 30 секунд, в одному циклі) та 30 циклами реакції (94°С, 20 секунд, 58C, 20 секунд, та 72C, 30 секунд, в одному циклі). Після PCR реакційний розчин піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі. Ампліфіковані фрагменти бажаного розміру (приблизно 400 п. н.) очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) згідно зі способами, описаними в інструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Очищені фрагменти Sfi I-VH та Sfi I-VL перетравлювали Sfi I (Takara Віо) при 50C протягом 35 ночі у реакційному розчині, приготованому згідно зі способом, описаним в доданій інструкції. Далі реакційний розчин очистили, застосовуючи набір QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та елюювали буфером Buffer EB (30 мкл), який включено у набір. 3-4. Плазміда експресії біспецифічного антитіла IgG. При виробництві біспецифічного антитіла IgG, яке представляє інтерес, посилалися на спосіб "виступи-в-отвори" IgG1 (Ridgway et al., Protein Eng. 1996; 9: 617-621), коли готували IgG4 з частиною СН3, заміщеною амінокислотою, для утворення гетеромолекул для кожного Н-ланцюга. Тип a (IgG4a) заміщується Y349C та T366W, а тип b (IgG4b) заміщується Е356С, T366S, L368A та Y407V. Крім того, також вводили заміщення (ppcpScp- -> -ррсрРср-) на шарнірних ділянках обох типів. Майже усі Н-ланцюги стали гетеромолекулами завдяки цьому способу; проте, це необов'язково застосовувати до L-ланцюгів, а утворення необов'язкових молекул антитіла може впливати на подальші вимірювання активності. Отже, для того, щоб окремо експресувати гілки кожної молекули антитіла (далі називається "молекула HL"), які мають різну специфічність, та ефективно утворювати тип біспецифічного антитіла IgG, яке представляє інтерес, усередині клітин, ті, які можна індукувати різними ліками, застосовувалися як вектори експресії для кожної молекули HL. Як вектор експресії для гілки молекули антитіла (для зручності називається права гілка молекули HL) приготували pcDNA4-g4H або pcDNA4-g4L (фігура 1 або фігура 2), у яких відповідна область Н-ланцюга або L-ланцюга, тобто відповідна варіабельна область антитіла миші (VH або VL) та константна область IgG4a людини (послідовність № 7) або константна область к (послідовність № 8), були включені в індуковний тетрацикліном вектор pcDNA4 (Invitrogen) після сигнальної послідовності (IL3ss) для тваринних клітин (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81:1075). По-перше, Eco RV та Not I (Takara Bio) застосовували для перетравлення pcDNА4 на сайтах розщеплення ферментом рестрикції, які існують у Його багато-клонувальному сайті. Одиницю експресії Н-ланцюга або Lланцюга правої гілки (приблизно 1,6 т. п. н. або приблизно 1,0 т. п. н, відповідно) химерного біспецифічного антитіла, що має відповідні варіабельні області антитіла, перетравлювали Xho I (Takara Віо). Потім її очистили із застосуванням набору QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та виконали її реакцію з ДНК-полімеразою KOD (TOYOBO) при 72°С протягом 10 хвилин у композиції реакційного розчину, описаному в інструкції, що додається, щоб "затупити" кінці. Фрагменти з тупими кінцями очистили із застосуванням набору QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та перетравилц Not I (Takara Віо). Перетравлені Not І фрагменти з тупими кінцями (приблизно 1,6 т. п. н. або 1,0 т. п. н., відповідно) та pcDNA4, перетравлений Есо RV/Not I, піддали реакції зшивання, застосовуючи Ligation High (TOYOBO) згідно зі 95438 36 способом, описаним в інструкції, що додається. Штам Е. coli DH5 (компетентний високий DH5 (TOYOBO)) трансформували вищеописаним реакційним розчином. Зі стійких до ампіциліну клонів, отриманих таким способом, виділили відповідні плазмідні ДНК, застосовуючи набір QIAptep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Як вектор експресії для іншої гілки молекули антитіла (для зручності називається ліва гілка молекули HL) приготували pIND-g4H або pIND-g4L (фігура 2 або фігура 3) згідно з вищеописаним способом, у яких відповідна область Н-ланцюга або L-ланцюга, тобто відповідна варіабельна область антитіла миші (VH або VL) та константна область IgG4b людини (послідовність № 9) або константна область к (послідовність № 8), були включені в індуковний вектор pIND аналогу екдизону (Invitrogen) після сигнальної послідовності (IL3ss) для тваринних клітин (ЕМВО. J. 1987; 6:2939), та виділили відповідні плазмідні ДНК. 3-5. Побудова вектора експресії біспецифічного антитіла Плазміду експресії такого типу, що індукується тетрацикліном, приготовану у 3-4 (pcDNA4-g4H або pcDNA4-g4L), перетравлювали Sfi І та її піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі. Фрагменти (приблизно 5 т. п. н.), що не мали внутрішньої частини варіабельної області антитіла (VH або VL (дивись фігуру 1 або фігуру 2), очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), за способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Фрагменти та відповідний фрагмент Sfi I-VH або Sfi-VL, що походить з антитіла до F.ІXa, перетравленого Sfi І, приготованого в 3-3, піддали реакції зшивання, застосовуючи набір Quick Ligation Kit (New England Biolabs), за способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Штам Е. coli DH5 (компетентний високий DH5 (TOYOBO)) трансформували вищеописаним реакційним розчином. Далі, подібним способом включили фрагменти, отримані шляхом видалення частини варіабельної області антитіла подібним способом, як описано вище (VH або VL (дивись фігуру 2 або 3)), з перетравленої Sfi І плазміди експресії (pIND-g4H або pIND-4GL) такого типу, що індукується аналогом екдизону, приготованої у 3-4, та відповідний перетравлений Sfi І фрагмент Sfi I-VH або Sfi I-VL, що походить з антитіла до F.X. У кожному стійкому до ампіциліну трансформанті, отриманому таким чином, вставку фрагмента, який представляє інтерес, підтвердили методом PCR колонії, застосовуючи праймери, які утворюють "сандвіч" з інсерційного фрагмента. Поперше, для химерного вектора експресії Нланцюга або L-ланцюга антитіла до F.ІXa синтезували 21-мерний праймер CMVF (послідовність № 10), який гібридизується з переднім сайтом приміювання CMV перед сайтом існерції, та 18-мерний праймер BGHR (послідовність № 11), який гібридизується зі зворотним сайтом приміювання BGH після сайта інсерції (Sigma Genosys). Для химерного вектора експресії Н-ланцюга або L-ланцюга антитіла до F.X синтезували 24-мерннй праймер EcdF (послідовність № 12), який гібридизується 37 перед сайтом інсерції, та 18-мерний праймер BGHR (послідовність № 11), який гібридизується зі зворотним сайтом приміювання BGH після сайта інсерції (Sigma Genosys). Для PCR колонії приготували реакційний розчин (20 мкл) (0,2 мкл праймеру (10 мкМ), штрих-буфер KOD (TOYOBO), 0,2 мМ dNTPs та 0,75 одиниці ДНК-полімерази штрих KOD) (TOYOBO)). У цей реакційний розчин додали клітини штаму трансформанту у відповідній кількості та виконували PCR. PCR виконували, застосовуючи систему 9700 PCR термолунки GeneAmp (Parkin Elmer) в умовах нагрівання протягом 1 хвилини при 96°С з наступними 30 циклами реакції (96°С, 10 секунд, 55°С, 10 секунд, та 72°С, 30 секунд, в одному циклі). Після PCR реакційний розчин піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі та після цього відібрали клони, з яких отримали фрагменти ампліфікації бажаного розміру. Продукт PCR обробили ExoSAP-IT (Amersham Biosciences), щоб дезактивувати надлишок праймерів та dNTPs згідно з інструкцією, що додається. Нуклеотидні послідовності фрагментів ДНК визначили, застосовуючи набір BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), на секвенаторі ДНК ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) згідно зі способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Групи послідовностей, визначені цим способом, проаналізували за допомогою аналітичного програмного забезпечення GENETYX-SV/RC Version 6.1 (Genetyx). Для VH відібрали клони, які представляють інтерес та які не мали інсерції, делеції або мутації. Для VL, відмінної від псевдогена VL, що походить з P3U1 та застосовується в гібридомах, відібрали клони, які представляють інтерес та які не мали інсерції, делеції або мутації. З клонів, що представляють інтерес, виділили відповідну плазмідну ДНК, застосовуючи набір QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), а потім розчинили у стерильній воді (100 мкл). Химерний вектор експресії Н-ланцюга антитіла до F.IXa, химерний вектор експресії L-ланцюга антитіла до F.IXa, химерний вектор експресії Н-ланцюга антитіла до F.X та химерний вектор експресії L-ланцюга антитіла до F.X назвали pcDNA4-g4IXaHn, pcDNA4g4IXaLn, pIND-g4XHn та pIND-g4XLn, відповідно. Кожний плазмідний розчин зберігали при 4°С до застосування. Приклад 4. Експресія химерних біспецифічних антитіл у тваринних клітинах. 4-1. Приготування розчинів ДНК. Експресію векторів експресії правої гілки молекули HL антитіла (pcDNA4-g4IXaHn та pcDNA4g4IXaLn) індукували тетрацикліном. У відсутності тетрацикліну для повної супресії їх експресії необхідна плазміда, що кодує Tet-peпpecop, рсDNA6/TR (Invitrogen). Далі експресію векторів експресії лівої гілки молекули HL антитіла (pINDg4XHn та pIND-g4XLn) індукували аналогом гормону екдизону комах (понастерон А). Для цього потрібна плазміда pVgRXR (Invitrogen), яка кодує рецептор екдизону та ретиноїдний рецептор X, які реагують з понастероном А та індукують експресію. Отже, для тансфекції тваринних клітин приготували суміш шести типів плазмідних ДНК. Для 1 95438 38 мл клітинної культури застосовували pcDNA4g4IXaHn, pcDNA4-g4IXaLn, pIND-g4XHn та pINDg4XLn (218,8 нг кожної), а також pcDNA6/TR та pVgRXR (1312,5 нг кожної). 4-2. Трансфекція тваринних клітин Штам НЕК293Н (Invitrogen), що походить з зародкових клітин карциноми нирок людини, суспендували у культуральному модифікованому за способом Дульбеко середовищі Ігла (Invitrogen), яке містило 10% FCS (MOREGATE), та його 1 мл висі5 яли з щільністю клітин 5 х 10 клітин/мл у кожну лунку 12-лункового планшета для адгезивних клітин (CORNING) та культивували в інкубаторі з CO2 (37C, 5% CO2). Суміш плазмідних ДНК, приготовану у 4-1, додали до суміші реагентів трансфекції, Lipofectaine 2000 (Invitrogen) (7 мкл) та середовища Opti-MEM I (Invitrogen) (250 мкл), та залишили при кімнатній температурі на 20 хвилин. Отриману суміш додали до клітин у кожну лунку та інкубували протягом 4-5 годин в інкубаторі з CO2 (37C, 5% CO2). 4-3. Індукція експресії біспецифічного антитіла IgG Культуральне середовище видалили шляхом відсмоктування з культури трансфектованих клітин, описаній вище, а потім додали 1 мл середовища CHO-S-SFM-II (Invitrogen), що містило 1 мкг/мл тетрацикліну (Wako Pure Chemical Industries). Отриману суміш інкубували протягом одного дня в інкубаторі з CO2 (37°С, 5% CO2), щоб індукувати первинну експресію правої гілки молекули HL антитіла. Потім, після видалення середовища шляхом відсмоктування, промивання 1 мл середовища CHO-S-SFM-II та додавання 1 мл середовища CHO-S-SFM-II, що містило 5 мкМ понастерону A (Invitrogen), суміш інкубували в інкубаторі з CO2 (37C, 5% CO2) протягом 2 - 3 днів, та так індукували вторинну експресію лівої гілки молекули HL антитіла, щоб біспецифічне антитіло IgG вивільнююся у середовище. Культуральну надосадову рідину відновили та центрифугували (приблизно 200 г, 5 хвилин, при кімнатній температурі), щоб видалити клітини, та концентрували, застосо(R) вуючи Microcon YM-50 (Millipore) за необхідністю. Зразок зберігали при 4°С до застосування. Приклад 5. Кількісний аналіз концентрації IgG людини Очищене афінне антитіло козла до IgG Fc (Сарреl) людини довели до 1 мкг/мл за допомогою буфера покриття та імобілізували на планшеті Nunc-Immuno. Після блокування буфером розведення (D.B.) додали зразок культуральної надосадової рідини, розведеної придатним чином D.B. Далі, як стандартний зразок для рахування концентрації антитіла, подібним чином додали IgG4 людини (людиноподібне антитіло до TF, дивись WO 99/51743), розведене D.B. удвічі у серіях розведення до 11 стадій, починаючи з 1000 нг/мл. Після трьох промивань здійснили реакцію міченого лужною фосфатазою антилюдського IgG козла (Biosource International). Після п'яти промивань планшет забарвили, застосовуючи субстрат фос(R) фатази Sigma 104 (Sigma-Aldrich) як хромогенний субстрат та вимірювали поглинання при 405 нм на планшет-ридері поглинання Model 3550 (Bio 39 Rad Laboratories) з контрольною довжиною хвилі 655 нм. Застосовуючи програмне забезпечення Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), концентрацію IgG людини у культуральній надосадовій рідині підрахували від стандартної кривої. Приклад 6. Аналіз F.VIIIa-міметичної активності (активованого фактора згортання VIII) F.VIIIa-міметичну активність біспецифічного антитіла проаналізували шляхом наступного ферментного аналізу. Усі наступні реакції виконувалися при кімнатній температурі. Суміш 40 мкл фактора IX (3,75 мкг/мл; Enzyme Research Laboratories) та 10 Мкл розчину антитіла інкубували у 96-лунковому планшеті протягом 1 години. Потім для того, щоб ініціювати ферментативну реакцію, додали 10 мкл фактора XIa (10 нг/мл; Enzyme Research Laboratories), 20 мкл фактора X (50 мкг/мл; Enzyme Research Laboratories), 5 мкл фосфоліпіду (400 мкг/мл; дивись Приклади 1-3) та 15 мкл TBSB, що містило 5 мМ СаСl2 та 1 мМ MgCb (далі скорочено позначається TBSB-S). Через 30 хвилин реакцію припинили шляхом додавання 10 мкл 0,5 ЕДТК. Після додавання розчину колориметричного субстрату (50 мкл) у кожну лунку вимірювали поглинання при 405 нм (контрольна довжина хвилі 655 нм) одразу та протягом 30 хвилин за допомогою Model 3550 Microplate Reader (Віо Rad Laboratories). F.VIIIa-міметичну активність представили як значення, отримане шляхом віднімання значення зміни поглинання за 30 хвилин без додавання антитіла від такого ж значення, але з додаванням антитіла (дивись фігуру 4 та фігуру 5). TBSB застосовували як розчинник для фосфоліпідів, тоді як TBSB-S застосовували як розчинник для фактора XIa, фактора IX та фактора X. Розчин колориметричного субстрату був сумішшю 1:1 колориметричного субстрату "Tesutochimu'' S2222 (Chromogenix), розчиненого згідно з інструкцією, що додається, та розчину полібрену (0,6 мг/л гексадиметринброміду (Sigma)). Далі виміряли залежність концентрації F.VIIIaміметичної активності XB12/SB04, яка була найвищою серед усіх (фігура 6). Приклад 7. Аналіз згортання плазми Для того, щоб визначити, чи корегує біспецифічне антитіло спроможність крові згортатися при гемофілії А, досліджували вплив біспецифічного антитіла на активований частковий тромбопластиновий час (АРТТ), застосовуючи плазму, позбавлену F.VIII. Змішаний розчин, що включав розчин антитіла при різних концентраціях (50 мкл), плазму, позбавлену F.VIII (50 мкл; Biomerieux), та реагент APTT (50 мкл; Dade Behring), нагрівали при 37°С протягом 3 хвилин. Реакцію згортання ініціювали шляхом додавання 20 мМ CaCl2 (50 мкл; Dade Behring) до вищевказаної суміші. Час, потрібний для згортання, вимірювали КС10А (Amelimg), з'єднаним з CR-A (Amelung) (фігура 7 та фігура 8). Далі XB12/SB04, що демонструвало найвищу активність до скорочення часу згортання, вимірювали щодо його залежності від концентрації (фігура 9). Приклад 8. Очищення антитіла Культуральну надосадову рідину (10 мл), 95438 40 отриману за способом, описаним у Прикладі 4, (R) концентрували до 1 мл за допомогою Centricon YM-50 (Millipore). У цей концентрат додали 10% (R) BSA (10 мкл), 1% Tween 20 (10 мкл), та rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) (100 мкл) та розчин змішували шляхом перевертання при 4°С протягом ночі. Розчин перенесли у (R) чашку з фільтром 0,22 мкм Ultrafree -MC (Millipore) та після триразового промивання TBS, (R) що містив 0,01% Tween 20 (500 мкл), смолу rProtein A Sepharose™ суспендували у 100 мкл 10 (R) мМ HCl/0,01% Tween 20 (рН 2,0) та залишили настоюватися протягом 3 хвилин. Потім антитіло елюювали та елюат негайно нейтралізували шляхом додавання 5 мкл 1 M Tris-HCl, рН 8,0. Застосовуючи програмне забезпечення Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), підрахували концентрацію IgG людини зі стандартної кривої. Кількісний аналіз концентрації антитіла здійснювали згідно з Прикладом 5. Приклад 9. Вестерн-блотинг GST-AP антитіла до F.X Побудували злитий рекомбшантний білок, що експресує K Соlі, активованого пептиду (АР) F.X з глутатіон S-трансферазою (GST). кДНК, що покриває ділянку трансляції повної довжини F.X людини ампліфікували шляхом PCR з кДНК печінки людини Marathon-Ready (Clontech). Цю кДНК потім застосовували як матрицю для ампліфікації ділянки, що кодує ділянку AP шляхом PCG (Leytus«t al., Biochemistry 1986; 25: 5098), яку субклонували у вектор pGEM-T (Promega), щоб отримати GST-APкодуючий pGEX-F10AP. E coli, трансформовану цією плазмідою, культивували та при оптичній щільності, яка дорівнювала 0,8, додали 1 мМ IPTG, щоб індукувати експресію GST-АР. Після центрифугування культурального розчину (3000 х g, 30 хвилин, 4°С) клітини зібрали та зберігали при -20C до застосування. Після ресуспендування клітинного осаду у 1/20 об'єму культури фосфатно-сольового буферного розчину (PBS) додали 2,4 мл буфера зразка SDSPAGE (IWAKI) до кожного 0,1 мл суспензії, а отриману суміш кип'ятили при 95C протягом 5 хвилин. Цей реакційний розчин (10 мкл) додали до кожної лунки з мінігелем 14% SDS-PAGE (Asahi Technoglass) та його піддали електрофорезу. Гель після електрофорезу перенесли на мембрану Immobilon-P™ Transfer Membrane (MILLIPORE), застосовуючи напівсухий блотер (BIO-RAD), та блокували BT-PBS (PBS, що містив 2% BSA (аль(R) бумін бичачої сироватки) та 0,05% Tween 20). Після того, як блокування завершилося, він реагував протягом 1 години з антитілом SB04 або SB06 миші до F.X, очищеним у Прикладі 1-4 та розведеним BT-PBS до 3 мкг/мл. Після промивання фосфатно-сольовим буферним розчином (PBS), що містив O^/oTween^O, протягом 1 години виконували реакцію мембрани з міченим лужною фосфатазою антимишачим IgG козла (H+L) (Zymed Laboratories), розведеним у 2000 разів BT-PBS. (R) Після промивання PBS, що містив 0,05% Tween 20, мембрану забарвили колориметричним субстратом BCIP/NBT Phosphatase Substrate (Kirkegaad & Perry Laboratories) (дивись фігуру 10). 41 Приклад 10. Отримання біспецифічного антитіла з бібліотеки scFv, яка походить з імунізованої мишачої селезінки 10-1. Антиген та імунізація Трьох мишей BALB/c (самці, віком 6 тижнів на початку імунізації (Japan Charles River)), 3 мишей MRL/lpr (самці, віком 6 тижнів на початку імунізації (Japan Charles River)) та 3 мишей C57BL/6N (самці, віком 6 тижнів на початку імунізації (Japan Charles River)) імунізували антигенним фактором IXa (Enzyme Research Laboratories, Inc.) або фактором X (Enzyme Research Laboratories, Inc.), як описано нижче. Як початкову імунізацію підшкірно вводили антиген (40 мкг/тварину), емульсований в FCA (повний ад'ювант Фрейнда Н37 Ra (Difco laboratories)). Через два тижні підшкірно ввели антиген (40 мкг/тварину), емульсований в FIA (неповний ад'ювант Фрейнда, Difco laboratories). Після цього здійснювали три підсилюючі імунізації з інтервалами в 1 тиждень та на 8-ий день після кінцевої імунізації у мишей видалили селезінки. 10-2. Побудова бібліотеки фатів Частину селезінок, які видалили у імунізованих мишей, приготованих у Прикладі 1 -1 та 2-1, та селезінок, які видалили у імунізованих мишей, приготованих у Прикладі 10-1, помістили у реагент Trizol Reagent (Invitrogen) (50 мг селезінки/мл реагенту) та гомогенізували, застосовуючи скляний гомогенізатор. Потім загальну PHK екстрагували згідно зі способом, описаним в інструкції, що додається. З розчину екстракту екстрагували polyA(+)PHK, застосовуючи набір PolyATract System 1000 (Promega) згідно зі способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Синтезували кДНК методом RT-PCR (система Superscript Ш First-Strand Synthesis System для RT-PCR, Invitrogen) та зберігали при -20C до застосування. Як праймери для ампліфікації кДНК варіабельної області важкого ланцюга (VH) та варіабельної області легкого ланцюга (VL) антитіла миші, приготували праймерну суміш HB, праймерну суміш HF, праймерну суміш LB та праймерну суміш LF, які застосовували у Прикладах 3-2 та 3-3. Для ампліфікації VH приготували 50 мкл реакційного розчину (2,5 мкл розчину кДНК, KOD плюс буфер (TOYOBO), 0,2 мМ dNTP, 1,5 мМ MgCl2,3,75 одиниці ДНК-полімерази KOD плюс (TOYOBO)), застосовуючи 1 мкл 100 мкМ праймерної суміші HB та 100 мкМ праймерної суміші HF. Далі для ампліфікації VL приготували 50 мкл реакційного розчину такого ж складу, як описано вище, застосовуючи 1 мкл 100 мкМ праймерної суміші LB та 100 мкМ праймерної суміші LF. PCR виконували, застосовуючи систему 9700 PCR термолунки GeneAmp (Parkin Elmer) при нагріванні протягом 3 хвилин при 98°С з наступними 32 циклами реакції (98°С, 20 секунд, 58°С, 20 секунд, та 72°С, 30 секунд, в одному циклі). Після PCR реакційний розчин піддали електрофорезу на 2% агарозному гелі. Ампліфіковані фрагменти такого розміру, який представляє інтерес, (приблизно 400 п. н.) очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та елюювали 95438 42 стерильною водою (50 мкл). Далі, для ампліфікації фрагмента scFv приготували 10 пробірок з 100 мкл реакційного розчину. (3 мкл розчину фрагмента VH, 3 мкл розчину фрагмента VL, KOD плюс буфер (TOYOBO), 0,2 мМ dNTP, 1 мМ MgCl2,5 одиниць ДНК-полімерази KOD плюс (TOYOBO)). Після першої PCR (нагрівання протягом 3 хвилин при 94C з наступними 7 циклами реакції (94C, 1 хвилина, та 63°С, 4 хвилини, в одному циклі)), додали 10 мкМ праймера scfor та 10 мкМ праймера scback (по 2,5 мкл кожного) до кожної пробірки, що були витримані при 63C, а потім виконували другу PCR (нагрівання протягом 35 секунд при 94C з наступними 30 циклами реакції (94C, 2 хвилини, та 63C, 2 хвилини, в одному циклі)). Після PCR реакційний розчин очистиш, застосовуючи набір для очищення QIAquick PCR (QIAGEN), а очищені продукти перетравлювали ферментом рестрикції Sfi I (Takara Віо) при 50C протягом ночі. Після того, як продукти перетравлення піддали електрофорезу на 2% агарозному гелі, ампліфіковані фрагменти розміром, який представляє інтерес (приблизно 800 п. н.), очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та елюювали відповідною кількістю стерильної води. Для того, щоб scFv був присутнім на білку гена III фага, застосовували pELBGlacI (дивись фігуру 11) як фагемідний вектор. Після перетравлювання вектора (10 мкг) ферментом рестрикції Sfi І (Takara Віо) при 50C протягом ночі, очистили фрагменти розщеплення розміром, який представляє інтерес (приблизно 5 п.н.), застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та елюювали відповідною кількістю стерильної води. Очищений продукт PCR та очищений фрагмент вектора піддали реакції зшивання при 16°С протягом ночі, застосовуючи Ligation High (TOYOBO) за способом, описаним в інструкції, що додається. Електрокомпетентні клітини Е. coli XL1 Blue cells (Stratagene) або електромаксимальні DH12s (Invitrogen) трансформували, застосовуючи реакційний розчин, шляхом способу електропорації згідно зі способом, описаним в інструкції, що додається. Усі стійкі до ампіциліну трансформанти, отримані таким чином, зібрали та зберігали як рекомбінантну бібліотеку при -20C до застосування. 9 Бібліотеку Е. coli (2х10 КУО (колонієутворюючих одиниць)) інокулювали у 50 мл 2 х YTAG (2х TY, що містив 100 мкг/мл ампіциліну та 2% глюкози) та культивували при 37°С, доки OD 600 не до11 сягла 0,4 - 0,5.4 х 10 фага-помічника VCSM13 (Stratagene) додали до культури, яку залишили стояти при 37°С протягом 15 хвилин для інфікування клітин. Інфіковані клітини культивували при 30C протягом 10 годин, а потім додали 450 мл 2х YTAK (2х TY, що містив 100 мкг/мл ампіциліну та 25 мкг/мл канаміцину) та 25 мкл 1 моль/л IPTG. Культуральну надосадову рідину зібрали шляхом центрифугування, змішали з 100 мл розчину PEGNaCl (10% поліетиленгліколь 8000,2,5 моль/л NaCl) та залишили настоюватися при 4C протягом 60 хвилин. Фат осадили шляхом центрифугування при 10800 х g протягом 30 хвилин та осад 43 суспендували у 40 мл води, змішали з 8 мл розчину PEG-NaCl та залишили настоюватися при 4C протягом 1 години. Фат осадили шляхом центрифугування при 10800 х g протягом 30 хвилин та суспендували у 5 мл PBS, щоб отримати бібліоте0 ку фата. Фат зберігали при 4 C до застосування. 10-3. Ковдентращя зв'язаного фага шляхом пенінгу Фактор DCa або фактор X помітили біотином, застосовуючи No-Weigh Premeasured NHS-PEO4Biotin Microtubes (Pierce). Мічені біотином фактор IXa або фактор X (100 пмоль) додали до розчину бібліотеки фата, приготованої у 10-2 (600 мкл) та залишили контактувати з антигеном протягом 60 хвилин. Dynabeads М-280 Streptavidin (600 мкл; DYNAL) промили 5% M-PBS (PBS, що містив 5%, маса/об'єм, знятого молока) та додали для зв'язування протягом 15 хвилин. Зв'язаний з гранулами фат промили декілька разів PBST (PBS, що містив 0,1% Tween 20; 1 мл), а потім PBS. Гранули суспендували у 0,8 мл 0,1 моль/л гліцину /HCl (рН 2,2) протягом 5 хвилин, щоб елюювати фаг. Альтернативно, бібліотеку фата (80 мкл/лунку х 5), яку інкубували з 2,5%, маса/об'єм, знятого молока протягом 15 хвилин, додали до фактора Кар або фактора X (10 мкг/лунку х 5), іммобілізованого на імунопланшеті (MaxiSorp, Nunc), а потім концентрували антигеном протягом 60 хвилин. Зв'язаний з антигеном фат промили декілька разів PBST (PBS, що містив 0,1% Tween-20; 1 мл), а потім PBS. Зв'язаний фат інкубували з 0,8 мл 0,1 мл гліцин/НСІ (рН 2,2) протягом 5 хвилин, щоб елюювати фаг. Зібраний таким чином розчин фата нейтралізували шляхом додавання 2 моль/л Tris (45 мкл), додали до 10 мл клітин XL1-Blue у фазі логарифмічного росту (OD 600 = 0,4 -0,5) та залишили настоюватися на 30 хвилин при 37C для інфікування клітин. Суміш розташували на планшеті 2х YTAG та культивували при 30C Колонії зібрали, інокулювали у 2х YTAG та культивували при 37C до OD 600 = 0,4 - 0,5. IPTG (1 моль/л; 5 мкл) та 11 фаг-помічник VCSM13 (10 одиниць фата) додали до культурального розчину (10 мл) та суміш залишили настоюватися при 37°С протягом 30 хвилин. Клітини зібрали шляхом центрифугування, рееуспендували у 2х YTAK (100 мл) та культивували при 30C протягом 10 годин. Культуральну надосадову рідину відновили шляхом центрифугування, змішали з 10% розчином PEG-5 моль/л NaCl (20 мл) та залишили настоюватися при 4°С протягом 20 хвилин. Фат осадили шляхом центрифугування при 10800 х g протягом 30 хвилин та суспендували у PBS (2 мл) та потім здійснили пенінг. 10-4. ЕЛАЙЗА фата Вищеописану єдину колонію інокулювали у 2х YTAG (100 мкл) та культивували при 30C протягом ночі. Після того, як 5 мкл цієї культури інокулювали у 2х YTAG (500 мкл) та культивували при 37C протягом 5 годин, додали фаг-помічник (2 х 8 10 одиниць фата) та культуру потім залишили настоюватися при 37°С протягом 30 хвилин. Далі, після культивації протягом 30 хвилин шляхом збовтування при 37C додали 2х YTAK, що містив 0,5 95438 44 мМ IPTG (120 мкл). Після культивування протягом ночі при 30C центрифуговану надосадову рідину піддали ЕЛАЙЗА. Для ЕЛАЙЗА клонів, отриманих шляхом пенінгу мічених біотином антигенів, застосовували титраційний мікропланшет StreptaWell 96 (Roche), покритий 1,0 мкг/мл міченим біотином антигеном. Далі для ЕЛАЙЗА клонів, отриманих шляхом пенінгу природних антигенів, застосовували імунопланшет (MaxiSorp, Nunc), імобілізований 1,0 мкг/мл природного антигену. Після промивання PBST для видалення антигену реакцію блокували 200 мкл 2% M-PBS або 2% BSA-PBS (PBS, що містив 2% (маса/об'єм) альбуміну бичачої сироватки), що використовували як блокувальний буфер протягом 1 години при кімнатній температурі. Після видалення буфера культуральну надосадову рідину додали до планшета та залишили настоюватися протягом 60 хвилин для зв'язування фата. Після промивання зв'язаний фаг виявили за допомогою HRP-зв'язаного антитіла до Ml 3 (Amersham Pharmacia Biotech) та субстрату TMB (Zymed). Реакцію припинили шляхом додавання 1 моль/л H2SO4, та значення А450 вимірювали за допомогою планшет-ридера. 10-5. Визначення послідовності та відбір клонів Застосовуючи культуральне середовище 2х YTAG ЕЛАЙЗА-позитивного рекомбінантного клону Е. CoIi, нуклеотидну послідовність ділянки scFv визначили шляхом PCR ампліфікації праймерами PBG3-F1 (5'-CAGCTATGAAATACCTATTGCC3'/послідовність № 1) та PBG3-R1 (5'CTTTTCATAATCAAAATCACCGG -3'/послідовність № 2). 15 мкл розчину PCR, що містив 1 мкл культурального середовища, 1,5 мкл буфера 10x KOD Dash, 0,2 мкл кожного з праймерів 10 мкмоль/л та 0,3 мкл полімерази KOD Dash (TOYOBO, 2,5 одиниці/мкл), піддали 30 циклам ампліфікації (96C, 10 секунд, 55°С, 10 секунд, та 72C, 30 секунд), застосовуючи PCR систему 9700 термолунки GeneAmp (Parkin Elmer). Після PCR додали 3 мкл ExoSAP-IT (Amersham) до 5 мкл реакційного розчину та суміш витримували теплою при 37C протягом 15 хвилин, а потім при 80C протягом 15 хвилин. Реакцію цього зразка виконували, застосовуючи набір BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems) за допомогою PBG3-F2 (5'ATTGCCTACGGCAGCCGCT -3'/послідовність № 3) або PBG3-R2 (5'-AAATCACCGGAACCAGAGCC 3'/послідовність № 4) як праймер, та продукти піддали електрофорезу за допомогою секвенатора ДНК Applied Biosystems PRISM 3700 DNA Sequencer. Внаслідок цього клони, що мали різні амінокислотні послідовності CDR3, передбачені з нуклеотидних послідовностей, відбирали для 52 клонів як анти-фактор IX або 33 клонів як антифактор X. 10-6. Побудова вектора експресії біспецифічного антитіла IgG Для того, щоб експресувати антитіло scFv як тип IgG, варіабельні області (VH, VL) антитіла клонували у вектори експресії індуковного типу за способами, подібними тим, які наведено у Прикладах 3-3,3-4 та 3-5. Варіабельні області (VH та VL) антитіла до F.IXa, кожну окрему, включили у век 45 тор такого типу, що індукується тетрацикліном (pcDNA4-g4H та pcDNA4-g4L, відповідно). Варіабельні області (VH та VL) антитіла до F.X, кожну окрему, включили у вектор такого типу, що індукується аналогом екдизону (pIND-g4H та pcDNA4g4L, відповідно). З клонів, що представляють інтерес, виділили відповідні плазмідні ДНК, застосовуючи набір QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) та розчинили у стерильній воді (100 мкл). 10-7. Експресія химерного біспецифічного антитіла у тваринних клітинах Застосовуючи розчин ДНК, приготований за способом, подібним до способу, наведеного у Прикладі 4-1, ДНК експресували у тваринних клітинах за способом, подібним до способу, наведеного у Прикладах 4-2 та 4-3, та зібрали культуральну надсосадову рідину. Зразок зберігали при 4 C до застосування. Приклад 11. Очищення антитіла До 10 мл культуральної надосадової рідини, отриманої за способом, описаним у Прикладі 10-7, додали 100 мкл rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) та змішували шляхом перевертання при 4C протягом ночі. Розчин пере(R) несли до чашки з фільтром 0,22 мкм Ultrafree MC (Millipore) та після триразового промивання (R) 500 мкл TBS, що містив 0,01% Tween 20, смолу rProtein A Sepharose™ суспендували у 100 мкл 10 w мМ НСІ/0,01% Tween 20 (рН 2,0) та залишили настоюватися протягом 3 хвилин. Антитіло потім елюювали та елюат негайно нейтралізували шляхом додавання 5 мкл 1 M Tris-HCl, рН 8,0. Застосовуючи програмне забезпечення Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), концентрацію IgG людини підрахували зі стандартної кривої IgG4 людини (людиноподібне антитіло до TF, дивись WO 99/51743). Кількісний аналіз концентрації антитіла виконали згідно з Прикладом 5. Приклад 12. Аналіз VIIIа-міметичної активності (активованого фактора згортання VIII) F.VIIIa-міметичну активність біспецифічного антитіла проаналізували, застосовуючи ферментний аналіз. Усі наступні реакції виконували при кімнатній температурі. Перемішаний розчин 10 мкл фактора IX (15 мкг/мл; Enzyme Research Laboratories), 5 мкл TBSB, що містив 100 мМ CaCl 2 та 20 мМ MgCb, та 50 мкл культуральної надосадової рідини, отриманої за способом, описаним у Прикладі 10-7, інкубували у 96-лунковому планшеті протягом 1 години. Потім 10 мкл фактора XIa (10 нг/мл; Enzyme Research Laboratories), 20 мкл фактора X (50 мкг/мл; Enzyme Research Laboratories) та 5 мкл фосфоліпідів (400 мкг/мл) додали, щоб ініціювати ферментативну реакцію. Через 30 хвилин після цього реакцію припинили шляхом додавання 10 мкл 0,5 M ЕДТК. Після додавання до кожної лунки 50 мл розчину колориметричного субстрату вимірювали поглинання при 405 нм (контрольна довжина хвилі 655 нм) через 0 та 60 хвилин за допомогою Model 3550 Microplate Reader (Віо Rad Laboratories). F. VIIIa-міметичну активність представили як значення, отримане шляхом віднімання значення зміни поглинання у культуральній надосадовій рідині, яка не експресувала жодного антитіла, від значен 95438 46 ня поглинання у культуральній надосадовій рідині, що експресувала антитіло (дивись фігуру 12). TBSB застосовували як розчинник для фосфоліпіду, фактора XIa, фактора IX та фактора X. Розчин колориметричного субстрату був сумішшю 1:1 колориметричного субстрату “Tesutochimu” S2222 (Chromogenix), розчиненого згідно з інструкцією, що додається, та розчину полібрену (0,6 мг/л гексадиметринброміду; Sigma). Приклад 13. Аналіз згортання плазми Для того, щоб визначити, чи відновлює біспецифічне антитіло, приготоване згідно зі способом Прикладу 11, спроможність згортання крові при гемофілії А, проаналізували вплив антитіла на активований частковий тромбопластиновий час (АРТТ), застосовуючи плазму, позбавлену F. VIII, за способом, подібним до способу, наданому у Прикладі 7 (дивись фігуру 13). Далі А44/В26 та А69/В26, які є надзвичайно ефективними щодо скорочення часу згортання, вимірювали щодо їх залежності від концентрації (дивись фігури 14 та 15). Приклад 14. Оцінка сумісного застосування біспецифічного антитіла та F.VIII Сумісне застосування біспецифічного антитіла та F.VIII оцінювали у наступних умовах аналізу згортання крові. Суміш 40 мкл розчину антитіла (25 мкг/мл) та 50 мкл плазми, позбавленої F.VIII (Biomerieux), інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. У цю суміш додали 10 мкл складу рекомбінантного (R) фактора згортання крові VIJJ Kogenate FS (BAYER) та 50 мкл реагентів APTT (Dade Behring) та нагрівали при 37°С протягом 3 хвилин. Реакцію згортання ініціювали шляхом додавання 50 мкл 20 мМ CaCl2 (Dade Behring). Час, необхідний для згортання, вимірювали, застосовуючи CR-A (Аmelung)-з'єднаний КС10А (Amelung) (дивись фігуру 16). Приклад 15. Вплив біспецифічного антитіла IgG на інгібіторну плазму Вплив біспецифічного антитіла IgG на інгібіторну плазму проаналізували у наступних умовах аналізу згортання плазми. Суміш 50 мкл плазми, позбавленої F.VIII, (Biomerieux) та 10 мкл нейтралізуючого антитіла до людського F.VIII (100 мкг/мл; номер за каталогом: МАВ3440, CHEMICON) інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Плазму застосовували як інгібіторну плазму. У цю інгібіторну плазму додали 40 мкл розчину антитіла (25 мкг/мл) та 50 мкл реагенту APTT (Dade Behring) та нагрівали при 37°С протягом 3 хвилин. Реакцію згортання ініціювали шляхом додавання до цієї суміші 50 мкл 20 мМ CaCl2 (Dade Behring). Час, необхідний для згортання вимірювали, застосовуючи CR-A (Amelung)-3' єднаний КС10А (Amelung) (дивись фігуру 17). Приклад 16. Гуманізація біспецифічного антитіла Серед біспецифічних антитіл, отриманих у Прикладах 1 - 7, XB12 (антитіло до фактора DCa Mmni)/SB04 (антитіло до фактора X миші), яке було найбільш ефективним у скороченні часу згортання крові, піддали гуманізації наступним способом. 16-1. Пошук гомології антитіл людини 47 Базу даних побудували на основі даних амінокислотних послідовностей антитіл людини, отриманих від Kabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/) та IMGT Database (http://imgt.cines.fr/), доступних для громадськості, та пошук гомології здійснювали окремо для варіабельної області XB12-Н-ланцюга миші, варіабельної області ХВ12-Ь-ланцюга миші, варіабельної області 8В04-Н-ланцюга мипгі та варіабельної області SB04-L-Aamnora миші. Результати підтвердили, що вони мають високу гомологію до послідовностей антитіл людини, наданих далі, та завдяки цьому вирішили, що їх будуть застосовувати як каркасну ділянку (далі позначається скорочено FR) гуманізованих антитіл: (1) варіабельна область ХВ12-Н-ланцюга: КАВАТID-020619 (Kabat Database) (Mariette et al., Arthritis Rheum. 1993; 36:1315-1324); (2) варіабельна область ХВ12-L-ланцюга: EMBL Accession No. Х61642 (IMGT Database) (Mark et al., J Мої Biol. 1991; 222: 581-597); (3) варіабельна область SВ04-Н-ланцюга: KABATID-025255 (Kabat Database) (Demaison et al., Immunogetetics 1995; 42: 342-352); (4) варіабельна область SB04-L-ланцюга: EMBL Accession No. АВ064111 (IMGT Database) (Неопубліковані дані). Для приготування гуманізованих антитіл гіперваріабельні ділянки (у цьому описі скорочено позначаються CDR) кожного антитіла миші трансплантували у каркасні ділянки антитіл людини (1)-(4). Також доступний для громадськості веб-сайт NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/) використовували для пошуку секреторних сигнальних послідовностей антитіла людини, які є надзвичайно гомологічними з антитілами людини (1)-(4). Застосовували наступні секреторні сигнальні послідовності, отримані внаслідок пошуку гомології: (1) варіабельна область ХВ12-Н-ланцюга: GenBank Accession No. AF062120; (2) варіабельна область ХВ12-L-ланцюга: GenBank Accession No. М74019; (3) варіабельна область SВ04-Н-ланцюга: GenBank Accession No. BCOl9337; (4) варіабельна область SВ04-Ь-ланцюга: GenBank Accession No. AY204756. 16-2. Побудова вектора генної експресії гуманізованого антитіла Дванадцять синтетичних олігонуклеотидів з приблизно 50 основ приготували з нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність з секреторної сигнальної послідовності до варіабельної області антитіла, так щоб приблизно 20 основ їх 3'-кінців гібридизувалися одна з одною. Далі приготували праймер, що гібридизується до 5'-кінця гена варіабельної області антитіла та має послідовність розщеплення Xhol, та праймер, що гібридизується до 3'-кінця гена варіабельної області антитіла та має послідовність розщеплення Sfi І. Приготовані синтетичні олігонуклеотиди (2,5 мкМ, 1 мкл кожного) змішали та додали буфер 1x TaKaRa Ex Taq Buffer, 0,4 мМ dNTPs та 0,5 одиниці TaKaRa Ex Taq (усі від Takara Shuzo), щоб скласти 48 мкл реакційного розчину. Після промивання 95438 48 суміші при 94°С протягом 5 хвилин здійснили 2 цикли реакції (94°С, 2 хвилини, 55°С, 2 хвилини, та 72C, 2 хвилини), щоб зібрати та подовжити кожну з синтетичних оліго-ДНК. Потім додали праймер, що гібридизується до 5'-кінця гена антитіла, та праймер, що гібридизується до 3'-кінця гена антитіла, 10 мкМ, 1 мкл кожного, та гени варіабельної області антитіла ампліфікували шляхом виконання 35 циклів реакції (94°С, 30 секунд, 55°С, 30 секунд, та 72C, 1 хвилина) та реакції протягом 5 хвилин при 75C Після PCR увесь реакційний розчин піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі. Ампліфіковані фрагменти очікуваного розміру (приблизно 400 п. н.) очистили за допомогою набору QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Фрагменти клонували, застосовуючи pGEM-T Easy Vector System (Promega) за способом, описаним в інструкції, що додається. Нуклеотидні послідовності фрагментів ДНК визначили, застосовуючи набір BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) на секвенаторі ДНК ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Після перетравлювання плазміда, щодо якої підтвердилося, що вона включає правильну послідовність генів варіабельної області гуманізованого антитіла з Xhol та SfiI, реакційний розчин піддали електрофорезу на 1% агарозному гелі. Фрагменти ДНК очікуваного розміру (приблизно 400 п.н.) очистили, застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) за способом, описаним в шструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Далі, після перетравлювання плазмід (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) експресії такого типу, що індукується тетрацикліном, та плазмід (pIND-g4H, pIND-g4L) експресії такого типу, що індукується аналогом екдизону, одержаних у Прикладі 3-4 з Xhol та SfiI, очистили фрагменти, що включали константну область антитіла (приблизно 5 т. п. н.), застосовуючи набір QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього, та елюювали стерильною водою (30 мкл). Фрагмент гена гуманізованого антитіла XB12 (варіабельна область Нланцюга (у цьому описі позначається VH) або варіабельна область L-ланцюга (у цьому описі позначається VL), перетравлений Xhol та Sfil, та плазміду (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) експресії того типу, що індукується тетрацикліном, перетравлена Xhol та SfiI, піддали реакції зшивання, застосовуючи набір Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Крім того, фрагмент гена гуманізованого антитіла SB04 (варіабельна область Н-ланцюга або варіабельна область L-ланцюга), перетравлений Xhol та Sfil, та плазміду експресії такого типу, що індукується аналогом екдизону, перетравлена Xhol та SfII (pIND-g4H, pIND-g4L), піддали реакції зшивання, використовуючи набір Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics) за способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Частину кожної реакційної суміші застосовували для трансформації штаму Е. CoIi DH5 (TOYOBO). 49 16-3. Приготування гуманізованого біспецифічного антитіла Гени трансфектували та експресували у НЕК293Н за способами, описаними у Прикладах 42 та 4-3, застосовуючи чотири типи векторів експресії гуманізованого антитіла, а також pcDNA6/TR та pVgRXR. Далі виконували очищення антитіла та кількісний аналіз антитіла за способами, наведеними у Прикладах 8 та 5. 16-4. Оцінка активності гуманізованого біспецифічного антитіла та модифікація послідовності антитіла Для того, щоб оцінити спроможність до згортання крові приготованих таким чином гуманізованих біспецифічних антитіл та химерного біспецифічного антитіла XB12/SB04, досліджували вплив антитіл на АРТТ, використовуючи плазму, позбавлену F.VIII. Амінокислоти каркасної ділянки антитіла людини модифікували так, щоб підвищити активність гуманізованих біспецифічних антитіл, здатність згортання крові яких знизилася. Крім того, цистеїнові залишки у CDR3 VH антитіла XB12 95438 50 модифікували до аланіну, враховуючи можливе зниження його термостійкості. Більш докладно, мутації ввели у вектор експресії гуманізованого антитіла, застосовуючи набір QuikChange SiteDirected Mutagenesis Kit (Stratagene) згідно зі способом, описаним в інструкції, що додається до нього. Шляхом повторення амінокислотної модифікації послідовності каркасної ділянки та оцінки здатності згортання крові отримали гуманізоване біспецифічне антитіло (гуманізоване антитіло XB12 (VH:hXB12f-A, VL:hXBVL)/гуманізоване антитіло SB04 (VH:hSB04e, VL:hSBVL-F3f)) (фігура 18). Промислова придатність Цим винаходом пропонуються біспецифічні антитіла, що розпізнають як фермент, так і його субстрат, та функціонально заміщують кофактор, який підсилює ферментативну активність. Вважають, що біспецифічні антитіла згідно з цим винаходом мають високу стійкість у крові та низьку антигенність. Отже, очікується, що вони стануть фармацевтичними препаратами. 51 95438 52 53 95438 54 55 95438 56 57 95438 58 59 95438 60

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Bispecific antibodies substituting for functional proteins

Автори англійською

Hattori Kunihiro, Kojima Tetsuo, Miyazaki Taro, Soeda Tetsuhiro

Назва патенту російською

Биспецифические антитела, которые замещают функциональные белки

Автори російською

Хаттори Кунихиро, Коджима Тецуо, Мийазаки Таро, Соеда Тецухиро

МПК / Мітки

МПК: C07K 16/46, A61K 39/395, C12N 15/09, A61P 7/04

Мітки: функціональні, заміщують, антитіла, білки, біспецифічні

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/105-95438-bispecifichni-antitila-shho-zamishhuyut-funkcionalni-bilki.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Біспецифічні антитіла, що заміщують функціональні білки</a>

Подібні патенти