Остеопротегеринзв’язуючі білки та рецептори

Даний винахід стосується поліпептидів, залучених до диференціації остеокластів. Зокрема, винахід стосується остеопротегерин-зв'язуючих білків, нуклеїнових кислот, що кодують такі білки, векторів експресії і клітин-хазяїнів для одержання таких білків, а також методів дослідження білків на спроможність зв'язування. Об'ємом винаходу також охоплюються композиції і способи лікування захворювань кісток, таких, як остеопороз, втрата кісткової тканини при артритах,хвороба Педжета і гіперкальціємія. Винахід також стосується рецепторів білків, що зв'язують остеопротегерин, способів і композицій для лікування захворювань кісток при використанні рецепторів. У життєздатних кісткових тканинах існує динамічна рівновага між їхнім утворенням і резорбцією. Ці процеси опосередковані, в першу чергу, двома типами клітин: остеобластами, які виділяють молекули, що формують органічний матрикс кістки, і остеокластами, які забезпечують розсмоктування кісткового матриксу і розчинення солей, що входять до складу кістки. У молодих індивідуумів із кістковою тканиною, що росте, швидкість утворення кісток перевищує швидкість їхньої резорбції, у той час як у більш дорослих індивідуумів швидкість резорбції кісток перевищує швидкість їхнього утворення. В останньому випадку збільшена частота руйнації кісткової тканини призводить до зменшення кісткової маси і міцності кісток, підвищеного ризику ушкоджень кісток і повільнішого, неповного відновлення зламаних кісток. Остеокласти являють собою великі фагоцитарні багатоядерні клітини, які утворюються з гематопоетичних клітин-попередників у кістковому мозку. Незважаючи на те, що процеси розвитку і формування зрілих, функціонально активних остеобластів вивчені недостатньо, вважається, що остеокласти дозрівають у межах моноцитарно/макрофагальної клітинної лінії у відповідь на вплив різноманітних активних остеокластів вивчені недостатньо, вважається, що остеокласти дозрівають у межах моноцитарно/макрофагальної клітинної лінії у відповідь на вплив різноманітних чинників, що посилюють ріст. Ранній розвиток клітин-попередників кісткового мозку з утворенням преостеокластів, очевидно, опосередкований розчинними факторами, такими, наприклад, як фактор некрозу пухлин a (TNF-a), фактор некрозу пухлин a (TNF-a), інтерлейкін 1 (ІЛ-1), інтерлейкін 4 (ІЛ-4), інтерлейкін 6 (ІЛ-6) і фактор інгібування лейкозу (ФІЛ). У культурі преостеокласти формуються при додаванні колонієстимулюючого макрофагального фактора (M-CSF). Зазначені фактори впливають, у першу чергу, на ранні етапи розвитку остеокластів. Публікації, присвячені залученню поліпептидних факторів у кінцеві стадії утворення остеокластів, практично відсутні. Проте, повідомлялося, що паратіреоїдний гормон стимулює утворення й активність остеокластів, а кальцитонін справляє протилежний ефект, хоча і меншою мірою виражений. Нещодавно був описаний новий поліпептидний фактор, названий остеопротегерином (OPG), який негативним чином регулює утворення остеокластів in vitro і in vivo [див. заявки тих же авторів, які одночасно розглядались в Патентному відомстві США, що подані під номерами 08/577,788 від 22.12.95., 08/706,945 від 03.09.96 і 08/771,777 від 20.12.96, і включені в даний опис у якості літературних джерел, а також заявку РСТ, опубліковану під номером WO 96/26271]. OPG істотно збільшує густину кісток у трансгенних мишей, експрессуючи OPG поліпептид, і зменшує втрату кісткової тканини при введенні оваріектомованим пацюкам. Аналіз ефективності впливу OPG на утворення остеокластів in vitro виявив, що OPG не задіяний у процесах росту і диференціації попередників моноцитів/макрофагів, але, швидше за все, блокують диференціацію остеокластів із попередників моноцитів/макрофагів. Таким чином, OPG, очевидно, є специфічним у регулюванні інтенсивності процесів формування остеокластів. OPG містить два поліпептидних домени, які мають різні структурні і функціональні особливості. Амінокінцевий домен містить залишки 22-194 повномірного поліпептиду (N-кінцевий метионін позначається, як залишок 1), виявляючи гомологію з іншими членами родини рецептора фактора некрозу пухлин (TNFR), особливо TNFR-2, для яких характерною є консервативність збагачених цистеїном доменів. Карбоксикінцевий домен містить залишки 194-401, не виявляючи істотної гомології з будь-якими відомими послідовностями. На відміну від інших численних членів родини TNFR, остеопротегерин є, очевидно, білком, що секретує винятково сильно і, швидше за все, не синтезується в мембранно-асоційованій формі. На підставі негативного регуляторного впливу OPG на формування остеокластів постульовано, що OPG може зв'язувати поліпептидний фактор, залучений до диференціації остеокластів і, таким чином, блокувати одну або більше кінцевих стадій утворення зрілих остеокластів. Відповідно до вищевикладеного, предмет даного винаходу полягає в тому, щоб ідентифікувати поліпептиди, що взаємодіють із OPG. Зазначені поліпептиди можуть грати певну роль у дозріванні остеокластів і бути корисними при терапії захворювань кісток. Новий член родини фактора некрозу пухлин був ідентифікований при використанні бібліотеки кДНК миші, експресованої в COS-клітинах, і скринінгу продуктів, що утворилися, за допомогою злитого білка OPG-Fc у якості афінної проби. . Новий поліпептид являє собою трансмембранний білок передбаченої довжини із 316 амінокислот, що зв'язує OPG і містить аміно-кінцевий цитоплазматичний домен, трансмембранний домен і карбокси-кінцевий позаклітинний домен. Заявлені білки, що зв'язують OPG, можуть знаходитися в мембранно-зв'язаній або розчинній формі. Винахід стосується нуклеїнових кислот, що кодують OPG-зв'язуючий білок векторів і клітин-хазяїнів, що експресують поліпептид, а також способу одержання рекомбінантного OPG-зв'язуючого білка. Антитіла або їх фрагменти, які специфічно зв'язують OPG-зв'язуючий білок, також включені в об'єм даного винаходу. OPG-зв'язуючі білки можуть бути використані для визначення кількості OPG в біологічних зразках, ідентифікації клітин і тканин, що експресують OPG-зв'язуючий білок і ідентифікації нових членів родини OPG і OPG-зв'язуючого білка. Способи ідентифікації сполук, що взаємодіють із OPG-зв'язуючим білком, також включені в об'єм даного винаходу. До таких сполук належать нуклеїнові кислоти, пептиди, білки, вуглеводи, ліпіди або органічні молекули невеликої молекулярної маси. Вони спроможні діяти як агоністи або антагоністи OPG-зв'язуючого білка. OPG-зв'язуючі білки залучені до диференціації остеокластів, а рівень активності остеокластів, у свою чергу, модулює резорбцію кісток. Агоністи й антагоністи OPG-зв'язуючого білка модулюють формування остеокластів і резорбцію кістки і можуть бути використані для лікування захворювання кісток, що характеризуються змінами в процесах резорбції кісток, таких, як остеопороз, гіперкальціємія, утрата кісткової тканини в результаті метастазного артриту, іммобілізація або захворювання періодонту,хвороба Педжета, остеопетроз, розхитування протезів і т.д. До об'єму винаходу також входять фармацевтичні композиції, що містять і агоністи й антагоністи OPG-зв'язуючи х білків. При використанні бібліотеки кДНК миші, отриманої з клітин кісткового мозку, були ідентифіковані рецептори OPG-зв'язуючих білків, які зв'язують флуоресцентно-мічений OPG-зв'язуючий білок. Рецептори можуть бути використані для ідентифікації агоністів і антагоністів, що взаємодіють із білком, який зв'язує OPG, що може виявитися корисним для лікування захворювань кісток. Опис малюнків Фіг.1. Показано структур у і послідовність вставки 32D-F3, що кодує OPG-зв'язуючий білок. Підкреслено трансмембранний домен і сайти аспарагін-зв'язаного глікозилювання. Фіг.2. Експресія OPG-зв'язуючого білка в клітинах COS-7, трансфікованих pcflHK/32D-F3. Клітини були ліпофектовані ДНК pcflHK/32D-F3 і досліджені на зв'язування з кон'югатом алкалінфосфатази й антитіл кози проти lgG1 людини (тільки другі антитіла), зі злитим білком OPG людини [22-201 ]-Fc і другими антитілами або химерним злитим білком позаклітинного домену ATAR із Fc (sATAR-Fc). ATAR являє собою новий білок суперродини TNFR, а злитий білок sATAR-Fc служить контрольною субстанцією для зв'язування Fc-домену lgG1 людини і звичайного білка, спорідненого з TNFR, що взаємодіє з маркером 32D на поверхні клітин. Фіг.3. Показано експресію OPG-зв'язуючого білка в тканинах людини. Наведено результати Нозернблотінгу мРНК із тканин людини (Clontech) при використанні радіоактивно міченої гібридизаційної проби на основі 32D-F3. Відносна молекулярна маса зазначена зліва і виражена в kb. Клиноподібні стрілки справа відзначають міграцію транскрипта мРНК із приблизною молекулярною масою 2,5 kb у лімфатичних вузлах. Дуже слабка смуга з тією ж самою молекулярною масою також виявляється в печінці плоду. Фіг.4. Показано структуру і послідовність вставки рсДНК/hu OPG bр 1.1, що кодує OPG-зв'язуючий білок людини. Підкреслено передбачений трансмембранний домен і сайт аспарагін-зв'язаного глікозилювання. Фіг.5. Стимуляція розвитку остеокластів in vitro із спільно культивованих макрофагів кісткового мозку і клітин ST2, оброблених рекомбінантним білком миші, що зв'язує OPG [158-316]. До культур вносили різноманітні концентрації білка миші, що зв'язує OPG, які складали від 1,6 до 500нг/мг. Через 8-10 днів культури лізували і визначали TRAP-активність. Крім того, деякі культури одночасно обробляли рекомбінантним білком OPG [22-401]-Fc миші в концентраціях 1, 10, 100, 500 і 1000нг/мл. OPG-зв'язуючий білок миші індукує дозо-залежну стимуляцію утворення остеокластів, у той час як OPG [22-401J-FC інгібує утворення остеокластів. Фіг.6. Стимуляція розвитку остеокластів із попередників кісткового мозку in vitro при наявності M-CSF і білка миші, що зв'язує OPG [158-316]. Кістковий мозок миші збирають і культивують при наявності 250, 500, 1000 і 2000Од./мл M-CSF. До зазначених культур добавляють різноманітні концентрації OPG-зв'язуючого білка [158-316], які варіюють від 1,6 до 500кг/мол. Розвиток остеокластів визначають за методом TRAPаналізу в розчині. Фіг.7. Остеокласти, що розвилися з кісткового мозку при наявності як M-CSF, так і OPG-зв'язуючого білка [158-316], забезпечують резорбцію кістки in vitro. Клітини кісткового мозку, оброблені M-CSF, OPGзв'язуючим білком, або обома факторами разом, поміщали на зрізи кістки в лунки культиваційних планшетів і залишали для розвитку в зрілі остеокласти. Отримані культури забарвлювали толуїдиновим блакитним (ліва колонка) або виявляли активність ферменту TR AP гістологічним шляхом (права колонка). У культурах, оброблених обома факторами, формувалися остеокласти, спроможні викликати ерозію кістки, що підтверджувалося виявленням блакитних плям на поверхні кістки. Ці спостереження корелювали з наявністю численних значних багатоядерних TRAP-позитивних клітин. Фіг.8. Наведено графіки загальних рівнів іонізованого кальцію (іСа) у крові мишей, яким були зроблені ін'єкції OPG-зв'язуючого білка через 51годину після першої ін'єкції, і мишей, що одержували конкурентний OPG. OPG-зв'язуючий білок у значній мірі і дозо-залежним чином збільшує рівень іСа. OPG (1 мг/кг/день) цілком блокує збільшення рівня іСа при уведенні OPG-зв'язуючого білка у дозі 5мкг/день і частково запобігає збільшенню рівня іСа при уведенні OPG-зв'язуючого білка у дозі 25мкг/день. (*), розходження з контрольною обробкою тварин (р