Нові антитіла до тканинного фактора як антикоагулянти

1. Антикоагулювальне антитіло, яке є антитілом до тканинного фактора (ТФ) і яке зв'язується з більшою афінністю з комплексом фактор VIIa/тканинний фактор (ТФ), ніж з вільним тканинним фактором (ТФ), і яке має амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. 2. Антитіло за п. 1, де антитіло має принаймні в 2 рази більш високу афінність до зв'язування з комплексом FVIIa/ТФ, ніж з вільним ТФ при 2 (19) 1 3 81114 4 9. Антитіло за п. 8, де фактори згортання являють собою FVII й FX. 10. Антитіло за п. 1, де антитіло є глікозильованим. 11. Антитіло за п. 1, де антитіло модифікують шляхом додавання поліетиленгліколю. 12. Антитіло за п. 1, де антитіло біотинілюють для зв'язування із стрептавідином. 13. Антикоагулювальна фармацевтична композиція, яка містить антитіло за п. 1, де композиція включає фармацевтично прийнятний ексципієнт і терапевтично ефективну кількість антитіла. 14. Спосіб запобігання утворенню тромбу, який полягає в тому, що вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1, де антитіло інгібує утворення тромбіну, безпосередньо не впливаючи на інші параметри згортання, такі як активація й агрегація тромбоцитів. 15. Спосіб за п. 14, де спосіб призначений для захисту від утворення тромбу при ішемічному ударі, тромботичних ускладненнях після пластичної операції на судинах або мікросудинній хірургії. 16. Спосіб зниження й лікування тромбозу глибоких вен (ТГВ), дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові (ДВЗ), гострого коронарного тромбозу або раку з ознаками коагулопатії в пацієнта, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1. 17. Спосіб регуляції запальної відповіді в пацієнта, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1. 18. Спосіб за п. 17, де запальну відповідь вибирають із ряду, який включає сепсис, трансплантати шкіри й вен і трансплантати органів. 19. Антитіло за п. 1, де антитіло можна застосовувати для формування нетромбогенного покриття на поверхні медичного пристрою, де медичний пристрій контактує із кров'ю. 20. Антикоагулювальний набір, який містить антитіло за п. 1 та звичайні допоміжні речовини. 21. Антикоагулювальний набір, який містить послідовності ДНК, які кодують антитіло за п. 1, та звичайні допоміжні речовини. 22. Композиція для генної терапії, яка містить полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4, яка кодує антитіло, амінокислотна послідовність якого представлена в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, причому дана полінуклеотидна послідовність вбудована в придатний вектор таким чином, що здатна експресувати протеїни з амінокислотними послідовностями SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. 23. Антикоагулювальне антитіло, яке є антитілом до тканинного фактора (ТФ) і являє собою одноланцюгове антитіло, яке зв'язується з більшою афінністю з комплексом FVIIa/ТФ, ніж з вільним ТФ, і де антитіло не конкурує за зв'язування із ТФ із FVII й FX, і яке містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. 24. Полінуклеотидна послідовність, яка кодує антитіло за п. 23, де полінуклеотидна послідовність містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4. Для нормального гемостазу важливу роль відіграє підтримання необхідного балансу між прокоагулювальною й антикоагулювальною активністю у кровоносних судинах [Davie E.W., Biochemistry, 30(43), 1991, cтop.10363-10370]. Зсув балансу у бік коагуляції приводить до тромбозу, який може приводити до серцевого приступу, «удару», легеневої емболії та венозного тромбозу. У зв'язку з вищевказаним існує потреба в більш ефективних і безпечних антикоагулянтах, призначених для лікування специфічних пов'язаних із тромбозом захворювань. Тканинний фактор («ТФ») являє собою трансмембранний глікопротеїн, який є основним ініціатором каскаду коагуляції [Nemerson Y., Thromb. Haemost., 74(1), 1995, стор.180-184]. У нормальних фізіологічних умовах ТФ не має контакту із кров'ю. При пошкодженні судини потрапляння в кров субендотеліального ТФ і колагену приводить до активації факторів згортання й тромбоцитів й, як наслідок, до утворення гемостатичної пробки. ТФ, який потрапив у кров, діє як кофактор для фактора Vlla («FVlIa»), який каталізує активацію фактора IX («FIX») і фактора X («FX»), які являють собою компоненти, що мають вирішальне значення, властивих організму комплексів тенази й протромбінази відповідно. Це приводить до швидкого формування FXa і тромбіну. Потім тромбін розщеплює фібриноген з утворенням фібрину, що, у свою чергу, полімеризується з утворенням фібринового згустку. Невідповідна індукція експресії ТФ при різних клінічних симптомах може приводити до тромбозу, який загрожує життю, та/або викликати патологічні ускладнення. Потрапляння в кров ТФ після руйнування бляшки, імовірно, приводить до тромботичної оклюзії, яка є причиною гострого інфаркту міокарда й «удару». У цих випадках активація факторами згортання шляхів сигналів прозапалення також приводить до утворення набряку й збільшенню розміру інфаркту. Пошкодження судини, зв'язане із пластичною операцією на судині, приводить до підвищувальної регуляції ТФ на поверхні клітин гладенької мускулатури (SMC), яка, імовірно, індукує шляхи клітинних сигналів, зв'язаних з рестенозом. Понадекспресія ТФ у пухлині й при зв'язаному із грамнегативними бактеріями сепсисі приводить до 5 тромбозу, який загрожує життю, й активації запальних шляхів. Комплекс FVIIa/ΤΦ бере участь у механізмі патогенезу при різних тромботичних захворюваннях і наявність у кровотоці певної концентрації ТФ є чинником ризику для деяких типів пацієнтів. FVIIa і ТФ відіграють унікальну роль у порушенні функції судин у підтриманні гемостазу й ініціації тромбозу при ушкодженні судин. ТФ у нормі експресується в адвентиції, але при захворюванні судин відбувається підвищувальна регуляція й не властива організму у нормі експресія ТФ у медії й неоінтимі. Експресія ТФ в атеросклеротичних бляшках підвищується й при контакті із ТФ захист крові, що здійснюється за допомогою тонкої фіброзної оболонки («шапочки»), може порушуватися. Хірургічні втручання, такі як пластична операція на судинах з використанням балонів, введення стентів або ендартеректомія, пошкоджують стінки судин і приводить до контакту з ТФ, який знаходиться в більш глибоких шарах. Спонтанне руйнування або ендотеліальна. ерозія атеросклеротичної багатої ліпідами тонкостінної бляшки приводить до контакту із ТФ і тромбозу, який викликає нестабільну стенокардію й інфаркт міокарда. ТФ може знаходитися в кровотоці в мікрочастинках клітинного походження, і рівні ТФ у кровотоці підвищуються при нестабільній стенокардії, що дозволяє припустити, що ТФ, який знаходиться в кровотоці, може брати участь в утворенні тромбу [Soejima Η. і ін. Circulation, 99(22), 1999, cтop.29082913]. Рак часто пов'язаний із станом гіперкоагуляції, зумовленої понадекспресією ТФ на поверхні пухлинних клітин. Це приводить до схильності пацієнта до тромбозу глибоких вен, емболії легенів і до ДВЗ-синдрому (дисеміноване внутрішньосудинне згортання крові) невисокого ступеня. ДВЗ приводить до відкладення фібрину в мікросудинах, що приводить до порушення багатьох органів. Антикоагулянти на основі білків, мішенню яких є ТФ, включають нейтралізуючі ТФ антитіла, які інгібують активний сайт фактора Vlla («FVIIai»), інгібітор шляху метаболізму тканинного фактора («TFPI») і антикоагулювальний білок нематод («NAPC2»). Результати, отримані з використанням моделей тромбозу на основі гострого артеріального ушкодження, свідчать про те, що білкові інгібітори FVIIa/ΤΦ є ефективними антитромботичними агентами, які характеризуються меншою здатністю у порівнянні з гепарином викликати кровотечу, безпосередніми інгібіторами тромбіну, інгібіторами тромбоцитів й інгібіторами FXa [Himber J. і ін., Thromb. Haemost. 85, 2001, cтop.475-481; Harker L.A. і ін., Thromb. Haemost. 74(1), 1995, стор.464-472]. Крім того, інгібітори FVIIa/ΤΦ є більш ефективними, ніж інші антикоагулянти (наприклад, гепарин, інгібітор FXa) відносно здатності запобігати потовщенню неоінтими й судинний стеноз після пошкодження балоном [Jang Y. і ін., Circulation, 92(10), 1995, стор.3041-3050]. 81114 6 За допомогою експериментальних моделей сепсису встановлено, що інгібування ТФ, FVIIa або комплексу FVIIa/ΤΦ являє собою ефективний антитромботичний шлях запобігання ДВЗ і зниження смертності. Аналоги TFPI запобігають індукованому як тромбопластином, так й ендотоксиному ДВЗ у кроликів [Day К.С. і ін., Blood, 76, 1990, стор.1538-1545); Bregengard С. і ін., Blood Coagul. Fibrinolysis, 4, 1993, стор.699-706]. Моноклональні антитіла до FVIIa [Biemond B.J. і ін., Thromb. Haemost, 73, 1993, стор.223-230 або Levi Μ. і ін., J. Clin. Invest., 93, 1994, стор.114-120] запобігають індукованому ендотоксином ДВЗ у мавп. Нейтралізуючі ТФ антитіла, FVIIai й TFPI інгібують ДВЗ і знижують смертність павіанів при використанні моделі індукованого Е. соlі сепсису [Creasey А.А. і ін., J. Clin. Invest. 91, 1993, стор.2850-2860; Taylor F.В. і ін., Blood, 78, 1991а, стор.364-368; Taylor F.В. і ін., Сіте. Shock, 33, 1991b, стор.127-134; Taylor F.В. Haemostasis Suppl. 1 26, 1996, стор.83-91]. Відомо, що як FXa, так і комплекс FVIIa/TФ/FXa індукують виробництво прозапальних цитокинїв, які зв'язані з підвищеним ризиком смерті пацієнтів, які страждають від сепсису [Riewald Μ. і ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 2001, стор.7742-7747]. Цікаво відзначити, що, як встановлено з використанням як модельних тваринних павіанів, FVIIai знижує рівні в плазмі IL-6 й IL-8 [Taylor F.B. і ін., Blood, 91, 1998, стор.1609-1615], що дозволяє припустити, що інгібування FVIIa/ΤΦ може виявляти додаткову протизапальну дію, не пов'язану з іншими антикоагулювальними механізмами. З літератури відомо декілька антитіл, які є ефективними антикоагулянтами і які зв'язуються або нейтралізують або ТФ, або комплекс FVIIa/ΤΦ, або і їх обох [див, наприклад, Carson S.D. і ін., Blood, 66(1), 1985, стор.152-156; Tanaka Η. і ін., Thromb. Res., 40(6), 1985, стор.745-756; Kirchhofer D. і ін., Throomb. Haemost., 84(6), 2000, стор.10721081; Kirchhofer D.i ін, Biochemistry, 40(3), 2001, стор.675-682; Faelber K.i ін., J. Моl. Biol.,313, 2001, стор.83-87 і патенти США 5506134, 5986065 й 6274142]. Антитіла до ТФ, запропоновані в даному винаході, є ефективними антикоагулянтами, які мають поліпшені характеристики в порівнянні з описаними раніше антитілами до ТФ. Зокрема, антитіла, запропоновані у винаході, зв'язуються з більшою афінністю з комплексом FVIIa/ΤΦ, ніж з вільним ТФ, і вони не конкурують із FVII або з FX за зв'язування із ТФ. Даний винахід стосується антитіл, які діють як антикоагулянти, які зв'язуються з більшою афінністю з комплексом фактор VIIa/тканинний фактор («FVIIa/ΤΦ»), ніж: з вільним тканинним фактором («ТФ»). Відповідно до одного з варіантів здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, мають принаймні в 2 рази більш високу афінність до зв'язування з комплексом FVIIa/ΤΦ, ніж з вільним ТФ, при оцінці за допомогою мікрокалориметричного аналізу. Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані .у винаході, мають принаймні в 5 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом FVIIa/ΤΦ, ніж з вільним 7 ТФ. Відповідно до ще більш переважного варіанта здійснення винаходу, антитіла, запропоновані у винаході, мають принаймні в 10 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом FVIIa/ΤΦ, ніж з вільним ТФ. Відповідно до іншого варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, не конкурують за зв'язування з TF з одним або декількома факторами згортання, вибраними із групи, яка включає фактори VII («FVII»), IX («FIX») і X («FX»). Відповідно до переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, не конкурують за зв'язування з TF з факторами FVII й FX. Відповідно до більш переважного варіанта здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, зв'язуються з більшою афінністю з комплексом FVIIa/ΤΦ, ніж з вільним ТФ і не конкурують за зв'язування із ТФ із факторами FVII й FX. Антикоагулювальне антитіло, запропоноване у винаході, здійснює спрямоване перенесення і зв'язується з комплексом FVIIa/ΤΦ в ділянці пошкодження й інгібує активацію фактора X («FX»), запобігаючи тим самим утворенню тромбу і внаслідок цього має ефективність як антикоагулянт при лікуванні певних захворювань, включаючи (але, не обмежуючись ними) сепсис, дисеміноване внутрішньосудинне згортання крові, ішемічний «удар», тромбоз глибоких вен, гострий коронарний синдром, зв'язані з тромбозом ускладнення після пластичної операції на судинах, і коагулопатія при прогресуючому раку. Крім того, антитіло можна застосовувати при мікросудинній хірургії, при трансплантації шкіри й вен і трансплантації органів. Ще одним об'єктом винаходу є фармацевтичні композиції, які містять запропоновані у винаході антитіла. Наступним об'єктом винаходу є спосіб захисту пацієнт від утворення тромбу, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла, запропонованого у винаході, і тим самим інгібують утворення тромбіну, не здійснюючи при цьому безпосереднього впливу на інші параметри згортання, такі як активація й агрегація тромбоцитів. Наступним об'єктом винаходу є спосіб зменшення й лікування тромбозу глибоких вен («ТГВ») або дисемінованого внутрішньосудинного згортання («ДВЗ») або гострого коронарного синдрому або раку з ознаками коагулопатії в пацієнта, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла, запропонованого у винаході. Наступним об'єктом винаходу є спосіб регуляції запальної відповіді в пацієнта, який полягає в тому, що пацієнтові вводять терапевтично ефективну кількість антитіла, запропонованого у винаході. Ще одним об'єктом винаходу є антитіло, запропоноване у винаході, яке можна застосовувати для нанесення нетромбогенного покриття на поверхню медичних пристосувань, які контактують із кров'ю. 81114 8 Наступним об'єктом винаходу є набір, який містить антитіло, запропоноване у винаході, яке зв'язується з комплексом FVIIa/ΤΦ. В іншому варіанті набір може містити послідовності ДНК, які кодують компоненти антитіла. У винаході запропоновані також способи одержання антитіл, запропонованих у винаході, як шляхом рекомбінації, так і шляхом синтезу. На кресленнях показано: на Фіг.1 - дані про активність ТФ-зв'язувальних одноланцюгових антитіл, отримані на основі аналізу здатності рΤΦ/FVIIa здійснювати гідроліз пептиду (пептидний гідроліз). Аналіз здатності рΤΦ/FVIIa здійснювати пептидний гідроліз здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням зрівноваженої суміші FVIIa (5нМ) і рТФ (10нМ), який заснований на афінності FVIIa до рТФ (KD(apр) становить ~10нМ). Гідроліз хромогенного пептидного субстрату S2266 оцінювали відповідно до описаного методу. Представлено кінцеві концентрації експресованих у бактеріях одноланцюгових антитіл і контрольних білків FVIIai (FVIIa, який інактивується хлорметилкетонним пептидом, РРАСК) і МАт №4504 (фірма American Diagnostica); на Фіг.2 - дані, які свідчать про те, що зв'язування scFv(TF)3e10 із рТФ підвищує уявну афінність рТФ до FVIIa. Аналіз здатності рΤΦ/FVIIa здійснювати цептидний гідроліз здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням 2нМ FVIIa у присутності 800нМ експресованого в бактеріях антитіла scFv(TF)3e10 або без нього. При здійсненні цього аналізу рТФ титрували й визначали швидкість розщеплення хромогенного пептидного субстрату S2266. Уявне значення KD для рТФ розраховували за допомогою стандартної апроксимації 4-параметричної залежності; на Фіг.3 - дані про активність антитіл, які зв'язують ТФ, отримані шляхом оцінки протромбінового часу (ПЧ). Аналіз ПЧ здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням рекомбінантного людського тромбоїшастину (фірма Dade, Inc.), що містить повнорозмірний людський ТФ у фосфоліпідних пухирцях. Визначали кінцеві концентрації експресованих у бактеріях одноланцюгових антитіл і контрольного білка FVIIai; на Фіг.4 - дані про уявну афінність до зв'язування scFv(TF)3e10 із рТФ. Аналіз здатності pΤΦ/FVIIa здійснювати пептидний гідроліз проводили відповідно до методу, описаному в прикладі 4, із застосуванням 3нМ рТФ й 2нМ FVIIa. Застосовувана концентрація рТФ була нижче значення KD, яке характеризує зв'язування з FVIIa. Вносили зростаючі концентрації експресованого в бактеріях scFv(TF)3e10 і зростаюну швидкість реакції використали для визначення уявних значень KD, які характеризують зв'язування цього антитіла із рТФ, за допомогою стандартної апроксимації 4-параметричної залежності; Афінність scFv(TF)3e10 до комплексу рТФ/FVIIa (KD(арр)=65нМ) виявилася вищою, ніж афінність scFv(TF)3e10 до рТФ при вимірюванні за допомогою BIAcore (KD(APP)=470нМ); 9 на Фіг.5 - дані про афінності до зв'язування scFv(TF)3e10 із ТФ і комплексом FVIIa/ΤΦ. Мікрокалориметричний аналіз здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, використовуючи антитіло scFv(TF)3e10, експресоване в СНО-клітинах. Цей аналіз показав, що scFv(TF)3e10 має ~ в 20 разів більш високу афінність до зв'язування з комплексом рΤΦ/FVIIa («комплекс»), ніж до рТФ («вільного ТФ»); на Фіг.6 - дані про залежну від дози здатність scFv(TF)3e10 інгібувати активацію FX. Аналіз активації FX здійснювали за допомогою методу, описаного в прикладі 4, використовуючи зростаючі концентрації експресованого в бактеріях scFv(TF)3e10, 250нМ FX і комплекс FVIIa/ΤΦ на поверхні фосфоліпідів (10пМ FVIIa). Значення ІС50 являє собою дозу, необхідну для досягнення 50%ного інгібування; на Фіг.7 - дані, які свідчать про те, що scFv(TF)3e10 неконкурентно інгібує активацію FX за допомогою комплексу FVIIa/ΤΦ. Аналіз активації FX здійснювали відповідно до методу, описаному в прикладі 4, використовуючи експресовану в бактеріях scFv(TF)3e10, 25-400нМ FX і комплекс FVIIa/ΤΦ на поверхні фосфоліпіду (10пМ FVIIa). У цьому аналізі здійснювали титрування з використанням зростаючих концентрацій scFv(TF)3e10 (0нМ, незафарбований квадрат; 0,25нМ, незафарбований ромб; 0,74нМ, незафарбований трикутник, 2,2нМ, незафарбоване коло; 6,7нМ, зафарбований ромб; 20нМ, зафарбований трикутник). Представлений графік залежності Lineweaver-Burk (1/[S], де S (субстрат) означає фактор X (мкМ); відносно 1/v, де ν (швидкість) виражають у вигляді мОГ/хв., що характеризує гідроліз S2222 за допомогою FXa, який відбувається протягом 5хв.) свідчить про те, що scFv(TF)3e10 є неконкурентним інгібітором відносно субстрату, тобто FX. Всі криві перетинаються на (або поблизу) осі абсцис, що характерно для неконкурентного інгібування (при конкурентному інгібуванні всі криві повинні перетинатися на осі ординат); на Фіг.8 - дані, які підтверджують ефективність scFv(TF)3e10 на моделі in vivo дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові («ДВЗ»). Антитіло до ТФ scFV(TF)3e10, експресоване в СНО-клітинах, оцінювали з використанням моделі тромбоемболії,індукованої в щурів, яка описана в прикладі 6, на основі (А) відсотка смертності й (Б) показника захворюваності-смертності. (А) Для обробленої носієм групи застосовувана доза ТФ викликала 60%-ну смертність (LD60). Антитіло scFv(TF)3e10 у дозі 0,7нмоля/кг не впливало на рівень смертності, але в дозі 7,0нмолів/кг знижувало смертність до рівня