Спосіб прогностичної діагностики неплідності різної етіології у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів

Реферат: Винахід належить до медицини, а саме до сексопатології, i може бути використаний для прогностичної діагностики неплідності різної етіології у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів. Спосіб передбачає визначення особливостей експресії протеїну Ubiquitin у структурних елементах біоптата яєчка за імуногістохімічним коефіцієнтом, який отримують перемножуванням значень розповсюдженості і інтенсивності забарвлення, які оцінюють напівкількісним методом у балах. Згідно із винаходом за результатами морфологічного UA 102912 C2 (12) UA 102912 C2 дослідження та при наявності певних показників імуногістохімічних коефіцієнтів експресії Ubiquitin по-окремо в цитоплазмі та ядрах клітин Сертолі та клітин Лейдіга визначають екскреторно-обтураційну, секреторну чи поєднану форму чоловічої неплідності, а також визначають спосіб лікування неплідності та роблять подальший прогноз щодо відновлення фертильності. UA 102912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до галузі медицини, а саме до сексопатології, і може бути використаний для визначення особливостей порушення сперматогенезу у чоловіків, які проживають на забруднених радіонуклідами територіях України. Постійне зростання кількості неплідних шлюбів в останні десятиріччя свідчить про суттєві медико-соціальні проблеми, пов'язані з негативним впливом факторів зовнішнього середовища, зокрема - іонізуючого опромінення, на генеративну функцію чоловіків. Після відкриття нового механізму внутрішньоклітинного розщеплення білків, яка дістала назву убіквітинопосередкованої нанотехнології, встановлено, що убіквітин-протеолізна система (ubiquitin protein ligase) контролює регуляцію клітинного циклу, репарацію ДНК, тривалість життя клітини, розщеплення внутрішньоклітинних білків. Виявлено також, що інактивація ubiquitin protein ligase, локалізованої в чоловічих статевих клітинах, призводить до блокування сперматогенезу та і розвитку неплідності. Враховуючи це, можна передбачити, що структурні та функціональні пошкодження компонентів убіквітин-протеасомної системи можуть відігравати значну роль в патогенезі чоловічої неплідності різної етіології, і, зокрема, при дії іонізуючого опромінення. Відомий спосіб визначення імуногістохімічної експресії протеїнів екстра-целюлярного матриксу та морфометричних показників в тканині яєчка (1), прийнятий нами за прототип, який полягає в імуногістохімічному визначенні експресії протеїнів fibronectin, yimentin, laminin, collagen type IV позаклітинного матриксу та морфометричних показників в перитубулярній тканині яєчка. Недоліком даного способу є те, що ризначають імуногістохімічні особливості протеїнів позаклітинного матриксу та морфометричні показники в перитубулярній тканині яєчка. В основу винаходу поставлено задачу удосконалити спосіб прогностичної діагностики неплідності різної етіології у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів шляхом визначення імуногістохімічних особливостей протеїну Ubiquitin та морфометричних показників в структурних елементах біоптата яєчка, які оцінюють в балах, та при наявності зрілих сперматозоїдів в канальцях визначають екскреторно-обтураційну форму неплідності у хворих, які проживають в забруднених радіонуклідами регіонах, та при певних значеннях імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі і в клітинах Лейдіга діагностують поєднану форму чоловічої неплідності, що потребує додаткової до хірургічного лікування корекції ендокринних та секреторних порушень сперматогенезу, хворі же на секреторну неплідність, при значенні імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,9±0,36, в цитоплазмі 5,8±0,14 бали, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 0, а в цитоплазмі - 5,5±0,07 бали, мають несприятливий прогноз щодо відновлення сперматогенезу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі прогностичної діагностики неплідності різної етіології у чоловіків із забруднених радіонуклідами регіонів, що включає визначення морфометричних показників та імуногістохімічної експресії протеїну в тканині яєчка, згідно із винаходом, імуногістохімічні особливості експресії протеїну Ubiquitin у структурних елементах біоптата яєчка визначають за імуногістохімічним коефіцієнтом, який отримують перемножуванням значень розповсюдженості і інтенсивності забарвлення, які оцінюють у балах за Таблицею 1, та при наявності зрілих сперматозоїдів в канальцях і при значеннях імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,8±0,5, цитоплазмі - 5,3±0,5 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 1,51±0,5 і цитоплазмі - 4,6±0,67 бала, діагностують екскреторнообтураційну форму неплідності, поєднану із секреторною, що потребує додаткової до хірургічного лікування корекції ендокринних та секреторних порушень сперматогенезу, при відсутності зрілих сперматозоїдів в канальцях і при значеннях імуногістохімічного коефіцієнта в клітинах Сертолі: в ядрі - 6,9±0,36, в цитоплазмі -5,8±0,14 бала, в клітинах Лейдіга: в ядрі - 0, а в цитоплазмі - 5,5±0,07 бала, діагностують секреторну неплідність із несприятливим прогнозом щодо відновлення сперматогенезу. Запропонований спосіб виконують наступним чином: для гістологічного дослідження біоптата тканини яєчка фіксують в рідині Буена і заливають в парафін, з парафінових блоків виготовляють зрізи завтовшки 5 мкм, які фарбують гематоксилін-еозином. Імуногістохімічний аналіз здійснюють з використанням стандартного авідин-біотинового (ABC) методу, при цьому біоптати фіксують у 12 % формаліні, заливають в парафін і виготовляють зрізи, які після депарафінізації в ксилолі і дегідратації в батареї спиртів, для блокади активності ендогенної пероксидази, вміщують на 5 хвилин у 0,3 % розчин перекису водню, розведеному на фосфатному буфері (рН 7,4). Після промивання дистильованою водою зрізи інкубують у мікрохвильовій печі при температурі 98 °C в 0,1 М нітратному буфері (рН 6,0) протягом 30 хв. і негайно охолоджують. Далі зрізи преінкубують протягом 15 хв. у 1 % розчині конячого сироваткового альбуміну, розведеного на фосфатному буфері, інкубують з первинними антитілами Ubiquitin в розведенні 1:800 протягом 18 годин при температурі 4 °C. Із 1 UA 102912 C2 5 10 вторинними мишачими моноклональними антитілами зрізи інкубують у вологій камері 30 хв. при кімнатній температурі. Після чого зрізи інкубують в авідин-біотиновому комплексі 30 хвилин при кімнатній температурі, який готують за 30 хвилин до використання. Кожний етап закінчують триразовим промиванням по 5 хв. у фосфатному буфері. Після проявлення 1-2 хв. у 0,05 % розчині діамінбензидину зрізи дофарбовують гематоксиліном та заключають в канадський бальзам. Як позитивний контроль використовують зрізи тканин із відомим заздалегідь високим вмістом протеїну Ubiquitin, як негативний - служать зрізи без обробки первинними антитілами. В кожному випадку для імуногістохімії аналізують 12-16 зрізів. Імуногістохімічну реакцію оцінюють за розповсюдженістю та інтенсивністю забарвлення і визначають імуногістохімічним коефіцієнтом, який вираховують за напівкількісним методом в балах, представленими в таблиці 1. Загальний результат імуногістохімічної реакції визначають за показниками імуногістохімічного коефіцієнта від 0 до 9 балів, який одержують перемножуванням оцінок розповсюдженості та інтенсивності забарвлення. Проводять статистичний аналіз отриманих результатів. 15 Таблиця 1 Показники імуногістохімічної реакції в балах Показники Розповсюдженість Інтенсивність 20 25 30 35 40 45 50 Бали 0 Відсутність забарвлення Відсутність забарвлення 1 2 Забарвлено клітин 10 %