Штами cryptococcus flavescens, стійкі до протиоконазолу, для біологічного контролю фузаріозу

Реферат: Винахід належить до штамів Cryptococcus flavescens депонований в NRRL № під номером Y50378 та Y-50379, стійких до протиоконазолу. Також винахід належить до способу та композиції для придушення фузаріозу злаків, що включає внесення в колосся зазначеного злаку щонайменше одного мікроорганізму-антагоніста, вибраного із групи,що містить заявлені UA 106383 C2 (12) UA 106383 C2 UA 106383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рівень техніки [0001] Даний винахід присвячений новим агентам біоконтролю для контролю фузаріозу. Рівень техніки [0002] Фузаріоз являє собою важке захворювання пшениці і ячменю, розповсюджене в усьому світі в напіввологих і вологих регіонах вирощування зернових (McMullen et al., 1997, Scab of wheat and barley: a re emerging disease of devastating impact. Plant Disease, 81, 13401348; Muthomi et al., 2002, Susceptibility of Kenyan wheat varieties to head blight, fungal invasion and deoxynivalenol accumulation inoculated with Fusarium graminearum, Journal of Phytopathology, 150, 30-36; Yu. Gagkaeva and Yli-Mattila, 2004, Genetic diversity of Fusarium graminearum in Europe and Asia, European Journal of Plant Pathology, 110, 551-562). Основним збудником фузаріозу є Fusarium graminearum Schwabe групи 2 (Aoki and O’Donnell, 1999, Morphological and molecular characterization of Fusarium pseudograminearum sp. nov., formerly recognized as the Group 1 population of F. graminearum, Mycologia, 91, 597-609) [зроблена стадія = Gibberella zeae (Schwein.) Petch]. Крім втрат урожаю зернових, G. zeae може утворювати мікотоксини, наприклад, естрогенний токсин зеараленон (F-2) (Hesseltine et al., 1978, Fungi, especially Gibberella zeae, and zearalenone occurrence in wheat. Mycologia, 70, 14-18) і трихотеценовий мікотоксин дезоксиніваленол (DON, вомітоксин) (Snijders, 1990, Fusarium head blight and mycotoxin contamination of wheat, a review. Netherlands Journal of Plant Pathology, 96, 187-198), які можуть впливати на якість зерна [Cardwell et al., 2001, Mycotoxins:the cost of achieving food security and food quality, APS Net: Feature story August, 2001] і шкодити здоров'ю тварин [Marasas, 1991, Toxigenic Fusaria, in: Mycotoxins and Animal Foods, J.E. Smith and R.S. Henderson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, FL; Beardall and Miller, 1994, Diseases in humans with mycotoxins as possible causes, in Mycotoxins in Grain: Compounds Other than Aflatoxin (MILLER, J.D. & TRENHOLM, H.L., Eds.). Eagan Press, St.Paul, MN, pp. 387-39; Pestka and Bondy, 1994, Immunotoxic effects of mycotoxins, in Mycotoxins in Grain: Compounds Other than Aflatoxin (MILLER, J.D. & TRENHOLM, H.L., Eds.) Eagan Press, St. Paul, MN, pp. 339-358]. [0003] Зниження впливу фузаріозу на врожай і якість зерна залишається вдалечінь проблемою. Іноді фузаріоз придушують за допомогою фунгіцидів [Wilcoxson, 1996, Fungicides for control of Fusarium head blight, Int. J. Tropical Plant Disease, 14, 27-50; Suty and MaulerMachnik, 1997, Fusarium ear blight on wheat-epidemiology and control of Gibberella zeae, the teleomorph of Fusarium graminearum with Folicur, in Diagnosis and Identification of Plant Pathogens, Proceedings of the 4th International Symposium of the European Foundation for Plant Pathology (DEHNE, H.W., ADAM, G., DIEKMANN, M., FRAHM, J., MAULER-MACHNIK & VAN HALTEREN, P., Eds). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht., pp. 243-246; Jones, 1999, Seedling blight development and control in spring wheat damaged by Fusarium graminearum Group 2. Plant Disease, 83, 1013-1018], однак за їхнього використання варто враховувати можливість потенційних проблем, пов'язаних із залишковими кількостями, повідомленнями про стійкість до фунгіцидів і випадками зростання змісту DON у зерні [Mauler-Machnik and Zahn, 1994, Ear fusarioses in wheat-new findings on their epidemiology and control with Folicur (tebuconazole). Pflanzenschutz-Nachrichten Bayer, 47, 129-155; Ramirez et al., 2004, Impact of environmental factors and fungicides on growth and deoxynivalenol production by Fusarium graminearum isolates from Argentinian wheat. Crop Protection, 23, 117-125; Chen et al, 2000, Recent advances in wheat head scab research in China, in Proc. Int. Symp. Wheat Improvement for Scab Resistance (RAUPP, W. J., MA, Z., CHEN, P. & LIU, D., Eds.). Nanjing Agricultural University, Jiangsu, China, pp. 258-273; Gale et al, 2002, Population analysis of Fusarium graminearum from wheat fields in eastern China, Phytopathology,92, 1315-1322]. Хоча розробка стійких культиварів або анатомічно змінених різновидів (Legzdina and Buerstmayr, 2004, Comparison of infection with Fusarium head blight and accumulation of mycotoxins in grain of hulless and covered barley, Journal of Cereal Science, 40, 6167) мелкозерновых культур вважається перспективним підходом для придушення фузаріозу, культивари з високим ступенем стійкості й ідеальними агрономічними характеристиками дотепер не розроблені (Johnston, 1994; Bushnell et al., 1998, Genetic engineering of disease resistance in cereals, Canadian Journal of Plant Pathology, 20, 137-149; Bai et al., 2000, Inheritance of resistance to Fusarium graminearum in wheat, Theoretical and Applied Genetics, 100, 1-8). Генетична розмаїтість G. zeae [O’Donnell et al., 2004, Genealogical concordance between the mating type locus and seven other nuclear genes supports formal recognition of nine phylogenetically distinct species within the Fusarium graminearium clade, Fungal Genetics and Biology, 41, 600-623; McCallum et al., 2004, Barrage zone formation between vegetatively incompatible Fusarium graminearum (Gibberella zeae) isolates. Phytopathology, 94, 432-437; Walker et al., 2001, Variation among isolates of Fusarium graminearum associated with Fusarium head blight in North Carolina, Plant Disease,85, 404-410; Cumagun et al., 2004, Genetic mapping of pathogenicity and 1 UA 106383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 aggressiveness of Gibberella zeae (Fusarium graminearum) toward wheat, Phytopathology, 94, 520526] підсилює потенційні проблеми, пов'язані із тривалістю ефективної дії фунгіцидів і стійких культиварів. Традиційна обробка грунту полів є частково ефективною відносно придушення утворення посівного матеріалу патогену й, отже, фузаріозу (Miller et al., 1998, Effect of tillage practice on Fusarium head blight of wheat, Canadian Journal of Plant Pathology, 20, 95-103; DillMacky and Jones, 2000, The effect of previous crop residues and tillage on Fusarium head blight of wheat, Plant Disease, 84, 71-76; Pereyra et al., 2004, Survival and inoculum production of Gibberella zeae in wheat residue, Plant Disease, 88, 724-730), однак з погляду збереження ґрунтів кращим агротехнічним прийомом є мінімальна обробка грунту. Беручи до уваги великий радіус поширення посівного матеріалу й розмаїтість культур, здатних відігравати роль альтернативних хазяїв для даного патогену (Chongo et al., 2001, Reaction of seedling roots of 14 crop species to Fusarium graminearum from wheat head, Canadian Journal of Plant Pathology, 23, 132-137), сівозміна є неспроможним рішенням. [0004] Біологічний контроль фузаріозу залучає значний інтерес із середини 1990-х, і з того часу у цій галузі досягнуті значні успіхи [Perondi et al., 1996, Controle microbiologico da giberela do trigo, Fitopatologia Brasiliera, 21, 243-249; Bujold et al., 2001, Effect of Microsphaeropsis sp. on the production of perithecia and ascospores of Gibberella zeae, Plant Disease, 85, 977-984; Schisler et al., 2002, Biological control of Fusarium head blight of wheat and deoxynivalenol levels in grain via use of microbial antagonists, in Mycotoxins and Food Safety (DeVRIES, J.W., TRUCKSESS, M.W. & JACKSON, L.S., Eds.). Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, pp. 53-69; da Luz et al, 2003, Biological control of Fusarium graminearum, in Fusarium head blight of wheat and barley (LEONARD, K.J. & BUSHNELL, W.R., Eds.) APS Press, St. Paul, MN, 381-394; Gilbert & Fernando. 2004, Epidemiology and biological control of Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Canadian Journal of Plant Pathology, 26, 1-9]. Суспільне визнання, сумісність із іншими мірами боротьби з даним захворюванням і тривалість дії є привабливими факторами, що підтримують стратегію розробки засобів біологічного контролю фузаріозу. [0005] Schisler et al. (патент США № 6562337) описали виділення чотирьох дріжджових і однієї бактеріальної культури, що були ефективними антагоністами, здатними придушувати фузаріоз. Ці мікроорганізми, отримані з пильовиків зернових, включали дріжджовий штам Cryptococcus flavescens OH 182.9 (спочатку класифікований як C. nodaensis), депонований у Колекції культур Служби сільськогосподарських досліджень США (NRRL) під обліковим номером депонування NRRL Y-30216. Недавно Schisler et al. (2006, Selection and evaluation of the potential of choline-metabolizing microbial strains to reduce Fusarium head blight, Biological Control, 39, 497-506) описали вибір холінутилізуючих штамів мікроорганізмів як агентів біологічного контролю фузаріозу. [0006] Хоча міри, спрямовані на розробку агентів біологічного контролю фузаріозу, є ефективними, розробка й використання хімічних фунгіцидів залишається важливим інструментом в арсеналі засобів боротьби з фузаріозом злаків. Останнім часом для боротьби з фузаріозом пшениці під час цвітіння найбільше часто використовують хімічний фунгіцид протиоконазол. [0007] У той же час, незважаючи на ці й інші досягнення, залишається потреба в удосконалених мікроорганізмах для біологічного контролю фузаріозу. Сутність винаходу [0008] Автори даного винаходу відкрили нові штами Cryptococcus flavescens, що є ефективними антагоністами F. graminearum. Ці мікроорганізми є ефективним засобом придушення й контролю фузаріозу злаків, зокрема, пшениці і ячменю. Штами відповідно до винаходу являють собою стійкі до протиоконазолу варіанти раніше описаного C. flavescens OH 182.9 (NRRL Y-30216). Більше того, ці стійкі до протиоконазолу варіанти, як не дивно, демонструють істотно підвищену ефективність проти F. graminearum у порівнянні з вихідним штамом OH 182.9. [0009] Відповідно до цих даних, метою даного винаходу є надання нових штамів мікроорганізмів, що придушують розмноження F. graminearum у колоссях пшениці і ячменя. [0010] Ще одною метою даного винаходу є надання нових штамів мікроорганізмів, що ефективно придушують F. graminearum у колоссі пшениці і ячменя, а також володіють стійкістю до дії фунгіциду протиоконазола. [0011] Додатковою метою даного винаходу є подання нових штамів мікроорганізмів, що є ефективним засобом контролю F. graminearum у колоссі пшениці і ячменя, які можна використовувати разом з фунгіцидом протиоконазолом і його похідними. [0012] Ця й інші цілі даного винаходу очевидні з наступного опису. Депонування біологічного матеріалу 2 UA 106383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0013] Два штами Cryptococcus flavescens, стійких до протиоконазолу, OH 182.9 варіант 3C і OH 182.9 варіант 4C, депонували 21 травня 2010 р., відповідно до положень Будапештського договору, у Колекції культур Служби сільськогосподарських досліджень США (NRRL), 1815 Н. Юніверсіті-Стріт, Пеорія, штат Іллінойс, 61604, США, із присвоєнням облікових номерів депонування NRRL Y-50378 і NRRL Y-50379, відповідно. Ці штами являють собою дріжджі, що мають морфологічні й культуральні властивості, характерні для Cryptococcus flavescens; їхня ідентичність підтверджена секвенуванням доменів D1/D2 гени 26S рРНК і областей ITS 1+2 гени рРНК із використанням стандартних методик (Okoli et al., 2006, Cryptotrichosporon anacardii gen. nov., sp. nov., a new trichosporonoid capsulate basidiomycetous yeast from Nigeria that is able to form melanin on niger seed agar. FEMS Yeast Res, 7:339-350). Філогенетичне дерево сконструювали за допомогою методики об'єднання сусідніх пар з моделлю некоректованої ('p') заміни, проміжки при вирівнюванні обробляли як пропущені символи, всі символи обробляли як неупорядковані й що мають однакову вагу. Значення бутстрепів обчислювали на основі 100 повторів. Докладний опис винаходу [0014] Варто розуміти, що для цілей даного винаходу припускають, що використання терміну Fusarium включає як полову (телеоморфну), так і безстатеву (анаморфну) стадію розвитку цього організму, також називані досконалою й недосконалою стадіями, відповідно. Наприклад, анаморфна стадія Gibberella zeae відома як Fusarium graminearum - збудник фузаріозу. Це захворювання виникає в результаті засіву квітки або колосся (також називаного супліддям) конидіями, утвореними недосконалою формою, або аскоспорами, утвореними досконалою формою цього гриба, причому зараження колосся наступає за подією засіву. [0015] Вираз "ефективний антагоніст", використовуване в даному документі стосовно мікроорганізму, означає той факт, що штам, про яке йде мова, демонструє ступінь інгібування фузаріозу, що статистично суттєво перевищує цей показник для неопрацьованого контролю. [0016] Термін "злаки" або "зернові" у даному описі означає будь-який вид злаків, у нормі підданий фузаріозу. Повідомлялося, що злаки, піддані фузаріозу, включають пшеницю, ячмінь, овес і тритикале, хоча пшениця і ячмінь являють собою ті дві культури, стосовно яких дане захворювання являє собою істотну економічну проблему. Кожний із цих злаків може бути видом-мішенню для контролю фузаріозу. [0017] F. graminearum заражає головним чином колосся (суцвіття або супліддя) злаків, починаючи з періоду цвітіння до стадії м'якої воскової спілості розвитку колосся. Пророслі конидії або аскоспори F. graminearum проникають у пильовики й пов'язані з ними тканини, ініціюючи зараження хазяїна й розвиток симптомів фузаріозу. [0018] Антагоністи F. graminearum відповідно до даного винаходу являють собою варіанти штамів, що походять від Cryptococcus flavescens OH 182.9 (NRRL Y-30216, у минулому ідентифікованого як C. nodaensis), описаного раніше в патенті США № 6562337, зміст якого включено в даний документ за допомогою посилання. Хоча C. flavescens OH 182.9 ефективно придушує фузаріоз злаків, він, на жаль, є чутливим до фунгіциду протиоконазолу навіть у низьких концентраціях. Ця чутливість обмежує застосування C. flavescens проти фузаріозу на полях, які також обробляють або будуть обробляти протиоконазолом. Автори винаходу виявили, що можна одержати варіанти або мутанти C. flavescens OH 182.9, що володіють істотно більшою стійкістю до протиоконазолу (здатного рости в присутності протиоконазолу), ніж вихідний штам OH 182.9. Більше того, автори виявили, що щонайменше деякі із цих стійких до протиоконазолу штамів є ефективними антагоністами F. graminearum і мають істотно більшу ефективність проти фузаріозу, ніж вихідний штам C. flavescens OH 182.9. [0019] Стійкі до протиоконазолу штами відповідно до винаходу одержували шляхом тривалої серії культивувань, за яких дріжджі піддавали впливу концентрацій, що збільшуються, протиоконазолу. Відповідно до докладного опису в розділі Приклада, вихідний штам C. flavescens OH 182.9 культивували в живильному середовищі, що містить щонайменше від слідових концентрацій до приблизно 4 м.д. протиоконазолу, переважно, приблизно 1 м.д. протиоконазолу; штами, що демонстрували ріст, відбирали для культивування при більш високих концентраціях протиоконазолу. Цей процес повторювали, культивуючи вибрані штами в присутності поступово наростаючих концентрацій фунгіциду, в остаточному підсумку виділяючи штами, здатні рости в живильному , середовищі, що містить щонайменше від приблизно 2 м.д. до приблизно 10 м.д. протиоконазолу, переважно 5 м.д. протиоконазолу. [0020] Виділені штами C. flavescens, стійкі до протиоконазолу, надалі випробовували на ефективність відносно зниження ваги фузаріозу бажаного злаку, переважно, пшениці. Коротенько, варіанти, стійкі до протиоконазолу, пересівали в ході біопроби на рослинах, за якої клітини дріжджів вносили в колосся злаків, засіяні конидіями F. graminearum. В одному із кращих 3 UA 106383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантів реалізації F. graminearum одержували на щільному ростовому середовищу, а рівень 4 6 зібраного посівного матеріалу повинен був перебувати в межах порядку 10 - 10 конидій/мол, 5 переважно, приблизно 10 конидій/мол водної суспензії. Клітини дріжджів-антагоністів, стійких до протиоконазолу, вносили в середовищі або підходящому буфері в концентрації приблизно 7 8 10 - 10 КОЕ/мл. В одному з варіантів реалізації винаходу конидії F. graminearum і клітики досліджуваного штаму поєднували в слабкому фосфатному буфері, а для засіву колосся рослин використовували приблизно 10 мкл цієї суспензії. Потім рослини культивували в умовах приблизно 100% відносної вологості, сприятливих для грибної інфекції, протягом приблизно 3 доби. Через проміжок часу, достатній для розвитку помітних ознак захворювання (звичайно щонайменше близько 2 тижнів після засіву), ті варіанти дріжджів, використаних для обробки колосся, які викликали зменшення видимих симптомів фузаріозу, відбирали для подальшої оцінки. [0021] Варіанти дріжджів, стійкі до протиоконазолу, відібрані в ході вищеописаної біопроби на рослинах, необов'язково піддавали другій біопробі на колоссі рослин, подібній до першої, але виконаній в більшій кількості повторів. Дріжджі знову вирощували на підходящому середовищі до наробітку їхньої кількості, достатньої для використання в ході біопроби. Однак у ході цієї другої біопроби на рослинах було переважно вирощувано штами в рідкій культурі, оскільки такий підхід широко використовується в промисловості, і антагоністи повинні мати біологічну ефективність при вирощуванні в умовах рідкої культури. Середовище, що містить клітини окремих штамів і суспензію конидій F. graminearum, використовували для засіву колосся відповідно до вищенаведеного опису. Клітини й суспензію конидій можна було попередньо об'єднати перед засівом. Як і в першій біопробі на рослинах, ті варіанти дріжджів, використаних для обробки колосся, які викликали зменшення видимих симптомів фузаріозу, відбирали як потенційних антагоністів. [0022] Підтвердити ефективність антагоніста відносно контролю F. graminearum можна в ході тепличних дослідів у збільшеному масштабі або польових дослідженнях, у яких квітучі рослини обробляють клітинами штамів, що тестують, до, під час або після засіву конидіями F. graminearum. Обробку рослин можна виконувати так само, як при даному застосуванні в польових умовах. [0023] Автори визначили, що стійкі до протиоконазолу варіанти OH 182.9 перевершували штам-попередник дикого типу 182.9, якщо в ході тепличних дослідів або польових випробувань на пшениці при подібній методиці вирощування клітин попередника й варіанта в рідкій культурі, варіанти, стійкі до протиоконазолу, знижували симптоми ваги захворювання щонайменше на 50% або щонайменше на 25% сильніше в порівнянні зі штамом-попередником. Важкість захворювання визначали, розраховуючи середнє процентне співвідношення площі поверхні окремого колосся пшениці, на якій проявлялися симптоми інфекції F. graminearum. [0024] За допомогою вищезгаданого способу автори винаходу виділили два нових штами, стійких до протиоконазолу і які є ефективними антагоністами фузаріозу: Cryptococcus flavescens, OH 182.9 варіант 3C і OH 182.9 варіант 4C. Передбачається, що цей спосіб можна відтворювати з метою виділення додаткових варіантів C. flavescens OH 182.9, стійких до протиоконазолу й що володіють істотно більшою ефективністю відносно придушення фузаріозу злаків. [0025] Варіанти C. flavescens OH 182.9, стійкі до протиоконазолу, звичайно ростуть в аеробних рідких культурах, що містять джерела вуглецю, азоту й неорганічні солі, засвоювані мікроорганізмом і що сприяють ефективному росту клітин. Кращими джерелами вуглецю є гексози, наприклад, глюкоза, але їх можна заміщати іншими засвоюваними джерелами, наприклад, амінокислотами. Як джерела азоту в процесі росту можна використовувати багато неорганічних й білковоподобних речовин. Кращими джерелами азоту є амінокислоти й сечовина; інші джерела азоту включають газоподібний аміак, неорганічні солі нітратів і аміаку, вітаміни, пурини, піримідини, дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, протеозопептон, соєве борошно, гідролізати казеїну, фільтрат барди й т.п. Неорганічні речовини, які можна включати до складу живильного середовища включають стандартні солі, здатні вивільнювати іони кальцію, цинку, заліза, марганцю, магнію, міді, кобальту, калію, натрію, а також молібдатні, фосфатні, сульфатні, хлоридні, боратні й т.п. іони. [0026] Ріст клітин дріжджів відповідно до винаходу можна здійснити при температурах між 1 і 36 °C, причому діапазон кращих температур становить 15-3 °C. pH живильного середовища можна міняти від 4 до 9, однак кращим робочим діапазоном є область pH 6-8. Звичайно максимальний вихід клітин спостерігають у проміжок часу 20-72 години після засіву. [0027] Відповідно до докладного опису, наведеним далі, контроль фузаріозу можна здійснювати шляхом нанесення одного або декількох варіантів C. flavescens OH 182.9, стійких 4 UA 106383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до протиоконазолу, на колосся (також називаний супліддям) злаку. У даному описі терміни “колосся” або “супліддя” стосуються колосся, що містить насіння або зародки насіння. Антагоністи наносять у кількості, що ефективно знижує рівень розвитку фузаріозу в порівнянні з неопрацьованим контролем. [0028] Хоча вищезгадані варіанти, стійкі до протиоконазолу, є ефективними при використанні окремо, у необов'язковому, але кращому варіанті реалізації їх використовують у комбінації з іншими відомими хімічними або біологічними агентами для контролю фузаріозу. Як зазначено вище, завдяки стійкості до протиоконазолу, ці варіанти можна використовувати в комбінації із протиоконазолом або його похідними. Як альтернатива, ці варіанти можна наносити на злаки, які окремо оброблені або будуть оброблені протиоконазолом або його похідними. Для використання в рамках даного винаходу підходять багато інших агентів біологічного контролю, що включають агенти, описані в публікаціях Perondi et al., 1996, ibid; Bujold et al., 2001, ibid; Schisler et al., 2002, ibid; da Luz et al., 2003, ibid; Gilbert & Fernando, 2004, ibid; Schisler et al., патенти США №№ 6562337 і 6312940 і патентна заявка США № 11/640,091, подана 15 грудня 2006 р.; зміст всіх цих джерел включено в даний документ за допомогою посилань. Кращим є використання в комбінації з мікробними антагоністами, описаними Schisler у патентах США й заявці, що перебуває на стадії розгляду, а саме, Bacillus sp. (NRRL B-30210), Bacillus sp. (NRRL B-30211), Torula aurea (недавно перейменований в Cryptococcus aureus)(NRRL Y-30213), неідентифікованими дріжджами (NRRL Y-30214), Bacillus sp. (NRRL B30212) і Torula sp. (недавно перейменований в Cryptococcus aureus)(NRRL Y-30215). Ці додаткові антагоністи можна застосовувати разом з антагоністами відповідно до винаходу, наприклад, у суміші, або окремо, або в різний час. [0029] Варіанти відповідно до винаходу, стійкі до протиоконазолу, можна наносити на поверхню колосся злаків відповідно до будь-якого загальноприйнятого способу. Наприклад, їх можна наносити у вигляді водного спрею, змочуваного порошку або тонкодисперсного порошку. Сполуки, розроблені для цих способів нанесення, звичайно включають підходящий рідкий або твердий носій разом з іншими ад’ювантами, наприклад, зволожувачами, липкими речовинами й т.п. Крохмаль, полісахариди, альгінат натрію, целюлозу й т.д. часто використовують у таких сполуках як носії й липкі речовини. [0030] Вираз "ефективна кількість" і "придушувальна кількість" використовують у даному документі стосовно такої кількості антагоніста, що при підходящих умовах обробки відповідно до опису в даному документі є достатньою для зниження рівня захворювання в порівнянні з рівнем, спостережуваним для контролю, що не піддавався обробці. Фактичну норму внесення 3 рідкої сполуки звичайно варіюють від мінімального значення, приблизно рівного 1 x 10 , до 10 6 приблизно 1 x 10 життєздатних клітин/мл, переважно від приблизно 1 x 10 до приблизно 5 x 9 10 життєздатних клітин/мл. При більшості умов штами відповідно до винаходу, описані нижче в 6 прикладі, повинні бути найбільш ефективні при нормі внесення в діапазоні від приблизно 1 x 10 9 до 1 x 10 життєздатних клітин/мл, виходячи з способу внесення, що дозволяє досягти практично однорідного контакту щонайменше з 50% поверхні колосся пшениці. Якщо антагоністи використовують у вигляді твердого препарату, норму внесення варто встановлювати так, щоб вона забезпечувала нанесення порівнянної кількості життєздатних клітин на одиницю площі поверхні колосся злаку в порівнянні з кількістю, одержуваною при використанні вищезгаданих норм внесення рідкого препарату. [0031] Припускають, що діапазон температур, при яких антагоністи є ефективними, повинен становити від приблизно 5 °C до приблизно 35 °C. Кращий температурний діапазон становить 15-30 °C, а оптимальний діапазон уважають рівним 18-28 °C. [0032] Антагоністи теоретично можна наносити на колосся в будь-який час розвитку зернових після фази трубкування й до фази твердої спілості. Колосся злаків сприйнятливе до інфекції F. graminearum у процесі формування зерна тільки з початку цвітіння (опилення) до фази м'якої воскової спілості. Таким чином, найкращим часом для внесення агентів біологічного контролю повинен бути інтервал від часу, що безпосередньо передує цвітінню, до фази м'якої воскової спілості. Нанесення антагоністів на колосся до цвітіння може дозволити антагоністам колонізувати колосся пшениці до того, як вони стануть сприйнятливі до інфекції. Крім того, антагоністи повинні бути правильно розташовані для колонізації й захисту пильовиків, як тільки вони вийдуть із квіток. У той же час очікується, що антагоністи повинні зберігати ефективність при їхньому нанесенні після початку цвітіння, але до настання фази твердої спілості. У той же час припускають, що тривалі затримки можуть знизити ефективність обробки залежно від способів виготовлення й нанесення препаратів клітин. [0033] Наступний приклад призначений лише для додаткового пояснення даного винаходу й не призначений для обмеження рамок винаходу, визначених формулою винаходу. 5 UA 106383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 1 [0034] Для одержання стійких до протиоконазолу варіантів антагоніста фузаріозу Cryptococcus flavescens OH 182.9 (NRRL Y-30216) - чисті культури цього штаму висівали на 1/ 5розведений триптичний соєвий агар (TSBA) з вихідної культури, що зберігалася з 10% гліцерином при -80 °C. Через 24 години росту при 25 °C клітини переносили в 10 мл 1/ 5розведений триптический соєвий бульйон (TSB), що містив 1 м.д. фунгіциду протиоконазола (PTC) в 50-мл колби Эрленмейера, одержуючи суспензію з вихідною оптичною щільністю (A620), приблизно рівною 0,100. Колби ставили на качалку при 250 об/хв. і пересівали на чашки після 5 доби інкібування при 25 °C на 1/5 TSBA + 1 м.д. PTC. Після інкібування при 25 °C протягом декількох діб чашки містили кілька колоній, що досягали більшого розміру, ніж більшість колоній, отриманих на середовищі 1/5 TSBA + 1 м.д. PTC. Чотири із цих колоній відібрали й висіяли штрихом для перевірки чистоти на 1/5 TSBA + 1 м.д. PTC. Потім процес росту на рідкому середовищі цих 4 варіантів, приблизно стійких до PTC, повторювали 4-5 разів на рідких і твердих середовищах у присутності концентрацій PTC, що поступово зростають до кінцевої концентрації, рівної 5 м.д.; найбільшу колонію, отриману для кожної із цих 4 окремих варіантних ліній, вибирали для початку наступного циклу росту в рідкій культурі, що містить трохи більшу концентрацію PTC. [0035] Кожну із цих 4 варіантних ліній потім оцінювали на еквівалентність штамупопередникові OH 182.9 дикого типу на основі ефективності придушення фузаріозу пшениці в тепличних досвідах у такий спосіб. Для виконання біопроб на рослинах склоподібну червонозернисту ярицю (культивар Norm) вирощували в камерах для вирощування рослин на тепличних стелажах. Біомасу штаму-попередника OH 182.9 і стійких до PTC варіантів 1C, 3C, 4C і 5C одержували в 125-мл колбах Ерленмеєра без відбійників, що містили 25 мл рідкого середовища (SDCL, Slininger et al. 2003. Postharvest biological control of potato sprouting by Fusarium dry rot suppressive bacteria. Biocontrol Science and Technology. 13:477-494), які інкібували на качалці з розмахом 2,5 см при 250 про/хв. і 25 °C протягом 72 год., і розбавляли перед використанням dH2O до концентрації 1/4. Інокулят, що містив конидії збудника фузаріозу штаму Gibberella zeae Z-3639 - одержували на проясненому сусло-агарі V8 протягом 7 діб при флуоресцентному висвітленні по 12 год./доба і 24 °C. Клітини OH 182.9 наносили у вигляді аерозолю під час цвітіння пшениці на приблизно 14 колосся пшениці за сеанс обробки, після 4 чого негайно наносили суспензію конидій у вигляді аерозолю (3 x 10 конидій/мл). Колосся, оброблені водою після нанесення суспензії конидій, використовували як контроль "тільки патоген". Рослини поміщали в камери з підвищеною вологістю на 3 доби, через 16 доби оцінювали важкість захворювання й швидкість росту в логарифмічній фазі в 1/5 TSB, що не містив PTC. Важкість захворювання визначали, розраховуючи середнє процентне співвідношення площі поверхні окремих колосся пшениці, на якій проявлялися симптоми інфекції F. graminearum. Варіантні лінії також порівнювали за загальною кількістю колонієутворюючих одиниць на мл (КОЕ/мл), що досягається за рості на середовищі 1/5 TSB + 5 м.д. PTC. Штам-Попередник OH 182.9 не ріс на цьому середовищі, у той час як всі варіанти OH 7 182.9, стійкі до PTC, продукували більше 5 x 10 КОЕ/мл. [0036] Варіанти C flavescens OH 182.9 3C і 4C, стійкі до протиоконазолу, демонстрували значно більшу ефективність, чим вихідний штам OH 182.9, і були збережені для подальшої роботи. Результати представлені в 1-3. [0037] Варто розуміти, що вищезгаданий докладний опис наведений лише для пояснювальних цілей, і що в нього можна внести модифікації й зміни без виходу за рамки даного винаходу. Таблиця 1 Вплив дріжджів-антагоністів OH 182.9, варіанта 4C OH 182.9, стійкого до a,b протиоконазолу і їхніх комбінацій на фузаріоз у ході тепличних випробувань 6 UA 106383 C2 Таблиця 1 Культивар пшениці норма Обработка c Неопрацьований контроль OH 182.9 дикого типу OH 182.9 варіант 4C OH 182.9 д.т.+ Пролін OH 182.9 4C + Пролін Тільки Пролін Значення P Зміна у Зміна в Зміна в порівнянні ЧЗ порівнянні з 100 порівнянні з ВЗ (%) з (%) контролем м.з. (г) контролем, контролем (%) % (%) A A B 42 0 54 0 3,0 0 AB AB A 27 -36 38 -30 3,6 20 CD BC A 7 -83 16 -70 4,1 37 D C A 1 -98 8 -85 4,3 37 D C A 0 -100 0 -100 4,1 37 D C A 0 -100 0 -100 4,0 33 0,001 0,001 0,001 a В межах стовпчика середні значення, після яких не поставлені однакові букви, є значимо різними (P ≤ 0,05, поділ середніх з поправкою Бонфероні) b ВЗ = важкість захворювання, ЧЗ = частота захворювання, 100 м.з. = маса зерна * 100 c Пролін = комерційний препарат протиоконазолу, внесений у кількості, еквівалентних 5 унцій/акр, OH 182.9 д.т. = штам OH 182.9 дикого типу 5 Таблиця 2 Результати польових випробувань 2008 р у Пеорії, штат Іллінойс, США: Вплив протиоконазолу, дріжджів-антагоністів OH 182.9, варіантів 3C і 4C OH 182.9, стійких до протиоконазолу, і їхніх комбінацій на параметри захворювання культивара озимої пшениці a,b Pioneer Brand 2545 фузаріозом Таблиця 2 Обработка Культивар пшениці Pioneer Brand 2545 ЧЗ (%) 100 м.з. (г) A DE 41,3 3,07 F AB 8,0 3,57 ABC E 31,2 2,99 BCD BCDE 29,6 3,26 CD CDE 24,5 3,13 F ABC 8,8 3,49 EF ABC 10,7 3,47 EF A 10,9 3,64 F ABCD 4,5 3,43 0,001 0,001 c Неопрацьований контроль Пролін (5 унцій/акр) OH 182.9 д.т. OH 182.9 варіант 3C OH 182.9 варіант 4C OH 182.9 3C + Пролін OH 182.9 4C + Пролін Пролін + д.т. (затримка 24 ч) Пролін + 3С (затримка 24 ч) Значення P ВЗ (%) A 8,0 DEF 1,5 AB 7,6 ABC 5,3 BCD 4,6 DEF 1,4 DEF 1,6 CDEF 2,3 F 0,6 0,001 DON (м.д.) A 11,8 BC 3,9 A 13,6 AB 10,4 ABC 7,0 C 2,3 C 2,4 C 2,6 C 1,1 0,001 a В межах стовпчика середні значення, після яких не поставлені однакові букви, є значимо різними (P < 0,05, поділ середніх з поправкою Бонфероні) b ВЗ = важкість захворювання, ЧЗ = частота захворювання, 100 м.з. = маса зерна * 100, DON = дезоксиніваленол c Пролін = комерційний препарат протиоконазолу, внесений у кількості, еквівалентних 5 унцій/акр, OH 182.9 д.т. = штам OH 182.9 дикого типу 10 Таблиця 3 Результати польових випробувань 2008 р у Вустере, штат Огайо, США: Вплив протиоконазолу, дріжджів-антагоністів OH 182.9, варіантів 3C і 4C OH 182.9, стійких до протиоконазолу, і їхніх комбінацій на параметри захворювання культивара озимої пшениці a,b Pioneer Brand 2545 фузаріозом 7 UA 106383 C2 Таблиця 3 Обработка c Неопрацьований контроль Пролін (5 унцій/акр) OH 182.9 д.т. OH 182.9 варіант 3C OH 182.9 варіант 4C OH 182.9 3C + Пролін OH 182.9 4C + Пролін Пролін + д.т. (затримка 24 ч) Пролін + 3С (затримка 24 ч) Значення P ТЗ (%) A 11,9 BC 3,5 A 12,6 A 9,4 AB 9,0 C 2,5 C 2,8 Культивар пшениці Pioneer Brand 2545 Урожай Маса, ЗПФ (%) бушель/акр фунтів/бушель A C D 42,5 47,4 47,3 ABC AB A-D 12,8 57,8 51,4 ABC BC A-D 29,5 49,4 49,0 ABC ABC CD 25,5 49,8 47,7 ABC ABC BCD 17,4 50,4 48,2 BC ABC AB 6,3 55,3 52,4 BC A A 12,5 58,5 52,6 ЧЗ (%) A 32,4 BC 11,3 A 28,0 AB 24,3 AB 22,9 BC 8,2 BC 8,2 C 8,2 C 8,4 0,001 2,6 2,3 0,001 BC ABC 15,7 BC C 2,5 0,001 ABC 52,6 AB 52,2 0,001 55,6 57,1 0,001 A AB DON (м.д.) A 8,1 AB 4,0 AB 6,8 AB 6,7 AB 6,6 AB 4,2 B 3,5 AB 3,9 B 3,5 0,001 a В межах стовпчика середні значення, після яких не поставлені однакові букви, є значимо різними (P < 0,05, поділ середніх з поправкою Бонфероні) b ВЗ = важкість захворювання, ЧЗ = частота захворювання, ЗПФ = зерна, ушкоджені фузаріозом, Урожай = виражений у бушелях на акр, Маса = маса випробовуваного зерна, виражена у фунтах на бушель, DON = дезоксиниваленол c Пролін = комерційний препарат протиоконазолу, внесений у кількості, еквівалентних 5 унцій/акр, OH 182.9 д.т. = штам OH 182.9 дикого типу 5 10 15 20 ДАНІ, ЩО СТОСУЮТЬСЯ ДЕПОНОВАНОГО МІКРООРГАНІЗМУ БІОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ Дата депонування: 21 травня 2010 р. Номер доступу: NRRL Y-50378 NRRL Y-50379 Назва й адреса депозитної установи: Колекція культур Служби сільськогосподарських досліджень США (NRRL) 1815 Північ-Юніверсіті-Стріт Пеорія, штат Іллінойс 61604 Сполучені Штати Америки Дата депонування: 07 вересня 1999 Номер доступу: NRRL B-30210 NRRL B-30211 NRRL B-30212 NRRL Y-30213 NRRL Y-30214 NRRL Y-30215 NRRL Y-30216 Назва й адреса депозитної установи: Колекція культур Служби сільськогосподарських досліджень США (NRRL) 1815 Північ-Юниверсити-Стрит Пеория, штат Іллінойс 61604 Сполучені Штати Америки АБО ІНШОГО 25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 1. Мікроорганізм, який являє собою штам Cryptococcus flavescens, стійкий до протиоконазолу й вибраний із групи, являє собою штам Cryptococcus flavescens 3C, депонований в NRRL під № Y50378 і штам Cryptococcus flavescens 4C, депонований в NRRL під № Y-50379. 2. Мікроорганізм за п. 1, який відрізняється тим, що являє собою біологічно чисту культуру. 3. Мікроорганізм за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений штам являє собою штам Cryptococcus flavescens 3C, депонований в NRRL під № Y-50378. 8 UA 106383 C2 5 10 15 20 25 30 4. Мікроорганізм за п. 1, який відрізняється тим, що зазначений штам являє собою штам Cryptococcus flavescens 4C, депонований в NRRL під № Y-50379. 5. Спосіб пригнічення фузаріозу злаків, що включає внесення в колосся зазначеного злаку щонайменше одного мікроорганізму-антагоніста, вибраного із групи,що містить штам Cryptococcus flavescens 3C, який депонований в NRRL під № Y-50378 і штам Cryptococcus flavescens 4C, який депонований в NRRL під № Y-50379, і їхні комбінації, причому зазначений мікроорганізм-антагоніст, що є стійким до протиоконазолу, вносять у кількості, ефективній для зниження рівня фузаріозу. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст являє собою біологічно чисту культуру. 7. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст являє собою штам Cryptococcus flavescens 3C, депонований в NRRL під № Y-50378. 8. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст являє собою штам Cryptococcus flavescens 4C, депонований в NRRL під № Y-50379. 9. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст вносять у колосся до настання фази твердої спілості. 10. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст вносять у колосся під час цвітіння. 11. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст вносять у колосся до цвітіння. 12. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначений злак являє собою пшеницю або ячмінь. 13. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що зазначений злак являє собою пшеницю. 14. Композиція для пригнічення фузаріозу злаків, що включає мікроорганізм-антагоніст, вибраний із групи, що являє собою штам Cryptococcus flavescens 3C, депонований в NRRL під № Y-50378 і штам Cryptococcus flavescens 4C, депонований в NRRL під № Y-50379, де мікроорганізм-антагоніст є стійким до протиоконазолу, і їхню комбінацію, на твердому або рідкому носієві з ад’ювантами. 15. Композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що являє собою біологічно чисту культуру. 16. Композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст являє собою штам Cryptococcus flavescens 3C, депонований в NRRL під № Y-50378. 17. Композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що зазначений мікроорганізм-антагоніст являє собою штам Cryptococcus flavescens 4C, депонований в NRRL під Y-50379. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 9