Шtam дpiжджib cryptococcus albidus-продуцент позаклітинної a-l-рамнозидази

Штам Cryptococcus albidus, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під номером ІМВ Y-5039, - продуцент позаклітинної -L-рамнозидази. (19) (21) a200904927 (22) 19.05.2009 (24) 10.01.2011 (46) 10.01.2011, Бюл.№ 1, 2011 р. (72) РЗАЄВА ОЛЬГА МИКОЛАЇВНА, ВАРБАНЕЦЬ ЛЮДМИЛА ДМИТРІВНА, ПІДГОРСЬКИЙ ВАЛЕНТИН СТЕПАНОВИЧ, НАГОРНА СВІТЛАНА СЕРГІЇВНА (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) WO 9606163 A1, 29.02.96. EP 0599159 B1, 19.02.01. CS 259581 B1, 15.03.89. US 5641659, 24.06.97. Tranchimand S., Brouant P., Iacazio G. The rutin catabolic pathway with special emphasis on quercetinase. Biodegradation. 2010, Nov;21(6):833 3 сутності та результату, що досягається, є штам Pichia angusta X349 [3], при глибинному культивуванні якого в певних умовах можна одержати ферментний препарат -L-рамнозидази з активністю 0,6 Од/мг білка (n-нітрофенільний субстрат). Культурально-морфологічні та фізіологобіохімічні особливості Через 3 доби при 25°С на сусло-агарі клітини круглі, овальні, в парах, маленьких гронах або коротких ланцюжках (3,5-8,8)х(5,5-10,0) м, часто капсульовані. Штрих-культура кремово-жовтувата, гладенька, блискуча, слизиста, псевдоміцелій не утворюється. В рідкому солодовому суслі формується кільце та осад. Ферментація джерел вуглецю: відсутня. Асиміляція джерел вуглецю: асимілює: глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, целобіозу, трегалозу, лактозу, мелібіозу, рафінозу, мелецитозу, D-ксилозу, L-арабінозу, D-арабінозу, D-рибозу, Lрамнозу, етанол, гліцерин, D-манніт, сорбіт, метил-D-глюкозид, саліцин, молочну, янтарну, лимонну кислоти, інозит. Не асимілює: L-сорбозу, інулін, крохмаль розчинний, N-aцeтил-D-глюкозамін, дульцтит. Нітрати асимілює. Не росте в середовищі у відсутності вітамінів. Не росте при 37°С. Фізіолого-біохімічні властивості Відношення до вуглецевого живлення: культура добре засвоює моносахариди - арабінозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, L-рамнозу, дисахариди лактозу, мальтозу, сахарозу, спирти - дульцит, манніт, інозит, сорбіт, а також соєве борошно. Тільки L-рамноза забезпечує здатність культури до синтезу -L-рамнозидази. Відношення до азотного живлення: однаково добре засвоює нітратний та амонійний азот. Із органічних джерел азоту асимілює пептон, гліцин, сечовину, дріжджовий автолізат. Найбільшу біосинтетичну активність забезпечує сульфат амонію та нітрат натрію. Штам зберігається на сусло-агарі при 5°С. Ідентифікація проведена за визначником "The yeasts. A taxonomic study." Forth edition (ed. Kurtzman С.Р., Fell Y.W.) - Amsterdam etc.: Elsevier. 1998. 1055p. Штам нетоксичний і авірулентний. Відношення до кисню: облігатний аероб. Відношення до температури: мезофіл, оптимальна температура для росту та біосинтезу ферменту 25-30°С. Відношення до кислотності поживного середовища: культура росте в діапазоні рН від 5,0 до 8,0. Оптимальне вихідне значення рН середовища для синтезу ферменту становить 6,0, в процесі росту та ферментації спостерігається зростання рН до 7,4. Поживним середовищем для ферментації є середовище наступного складу, (г/л): рамноза 1,0; пептон - 0,5; дріжджовий автолізат - 0,3; мальтоза - 0,3; вихідне значення рН - 6,0. Вирощування дріжджової культури проводять в глибинних умовах у колбах Ерленмейєра (500 93109 4 мл) на качалці, що робить 220 об/хв (рівень аерації 16,76 мг О2/л год) при 25-28°С впродовж 6 діб. Засів поживного середовища проводили 10%-ним двохдобовим інокулюмом. Біомасу відділяли фільтруванням, ферментативну активність визначали у супернатанті. Як субстрат для визначення активності використовували нарингін. Для визначення активності ферменту до 0,1 мл фільтрату додавали 0,1 мл розчину нарингіну, який готували наступним чином: 6,6 мг розчиняли в 0,2-0,3 мл етилового спирту і доводили до об'єму 10 мл 0,01М фосфат-цитратним буфером, рН 5,2. Реакційну суміш інкубували протягом 30 хв при температурі 37°С. Реакцію зупиняли додаванням 3 мл 4М розчину гідроксиду натрію. В контроль додавали ті ж компоненти, але в зворотньому порядку. Кількість L-рамнози, що відщепилася від субстрату внаслідок гідролізу, вимірювали колориметричним методом при 310 нм [2]. Встановлено, що при зберіганні та пересівах впродовж 1,5 років рівень ферментативної активності у Cryptococcus albidus штаму ІMB Y-5039 не знижується. Активність -L-рамнозидази, яка синтезується штамом Cryptococcus albidus ІMB Y-5039, в оптимальних умовах у культуральній рідині дорівнює 0,8-1,3 Од/мг білка. Перевагою запропонованого продуцента є його здатність синтезувати високоактивну та термостабільну -L-рамнозидазу, відсутність сезонності та токсичності, що є технологічно ефективним. Ферментний препарат, одержаний з цієї культури осадженням сульфатом амонію (90% насичення) здатний ефективно працювати при фізіологічних значеннях рН середовища (3,0-7,0) з помітним піком активності при рН 5,0. Фермент стабільний при зазначених вище значеннях рН впродовж доби. Ферментний препарат активний при 4-80°С, з максимальною активністю ферменту при 60°С. Термостабільність препарату при 25°С повністю зберігається впродовж доби; при 60°С - 120 хв. Препарат зберігає активність впродовж 1 року. Запропонований фермент може знайти використання у харчовій промисловості та медикотехнологічних процесах. Таким чином, виділено новий штам, який, у порівнянні з відомими, має інші культуральні ознаки і є новою культурою зі стійкими біохімічними властивостями. Література: 1. Рзаєва О.М. -L-рамнозидаза Реnісіllium commune 266: Автореф. дис. канд. біол. наук. Київ, 2007. - 21С. 2. Davis B.J. Assay of Naringinase /Anal. Biochem. - 1985. - Vol. 149, №2. - P. 566-571. 3. Yanai Т., Sato M. Purification and characterization of an -L-rhamnosidase from Pichia angusta X 349 // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2000. - Vol. 64, №10. - P. 2179-2185. 5 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 93109 6 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601