Протипухлинний феромагнітний нанокомпозит

Реферат: Винахід належить до протипухлинного феромагнітного нанокомпозиту, який є кон'югатом наночастинок магнітної рідини з цисплатином, причому співвідношення компонентів нанокомпозиту складає, мас. %: магнетит - 10-15, олеат натрію - 6,0-7,5, поліетиленгліколь 1,0-1,8, цисплатин - 2,0-6,0 та фізіологічний розчин - решта. Нанокомпозит здатний до UA 112490 C2 (12) UA 112490 C2 вибіркового накопичення в пухлинному вогнищі, з вираженим протипухлинним ефектом щодо пухлин з фенотипом лікарської резистентності. UA 112490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Винахід, що заявляється, належить до медицини, зокрема до онкології та фармакології, і може бути використаний для лікування онкологічних хворих, особливо при розвитку лікарської резистентності до хіміопрепаратів. Рівень техніки. На сьогодні гостро стоїть проблема ефективної терапії злоякісних пухлин. Серед протипухлинних засобів, що широко застосовуються в медичній практиці, одні з найефективніших базуються на водному розчині мономерного комплексу цисплатину. Активним агентом у таких засобах є іон платини, зв'язаний координаційним зв'язком з лігандами-носіями, які поглинаються пухлинними клітинами майже так само інтенсивно, як і нормальними. Через це лікарські засоби, що містять цисплатин, характеризуються не тільки високою протипухлинною активністю, але й високою токсичністю. Особливо актуальною цю проблему робить феномен резистентності пухлин до цитостатиків, внаслідок чого їх ефективність різко знижується при збереженні сильних побічних ефектів на організм [1]. Останнім часом для покращення результатів протипухлинної терапії почали активно застосовувати досягнення нанотехнологій - ліпосомні форми препаратів [2, 3], їх комплекси з наночастинками різної природи [4-6] тощо. Відома магнітна протипухлинна рідина [7], яка містить магнетит, поліетиленгліколь і/або гідроксіапатит, олеат натрію та протипухлинний агент. Однак спосіб отримання нанокомпозиту не сприяє посиленню міжмолекулярних зв'язків між магнетитом та протипухлинним агентом. Сукупними суттєвими ознаками винаходу, який заявляється, та описаного вище аналога є магнетит, поліетиленгліколь, олеат натрію та цисплатин, причому цисплатин адсорбований на поверхні магнетиту вандерваальсівськими силами. Причинами, що перешкоджають аналогу одержати технічний результат винаходу, який заявляється, є низький терапевтичний ефект щодо пухлин з фенотипом резистентності до цитостатиків. Відомий спосіб посилення протипухлинного ефекту цисплатину in vitro [8], який полягає у використанні магнітних наночастинок у комплексі з цисплатином для гіпертермії. Сукупними суттєвими ознаками винаходу, що заявляється, та описаного вище аналога є використання комплексу магнітних наночастинок, кон'югованих з цисплатином. Причинами, що перешкоджають аналогу одержати технічний результат винаходу, що заявляється, є застосування гіпертермії, що в умовах in vivo призводить до термічного ураження прилеглих до пухлинного вогнища тканин. Відомий спосіб посилення протипухлинної активності цисплатину [9], найбільш близький за технічним результатом, який досягається, та сукупністю суттєвих ознак і вибраний нами за прототип, полягає у кон'югації протипухлинного препарату цисплатину з наночастинками магнітної рідини. Сукупними суттєвими ознаками винаходу, що заявляється, та описаного вище прототипу є використання кон'югату наночастинок та цисплатину. Причинами, що перешкоджають прототипу одержати технічний результат винаходу, що заявляється, є недостатній терапевтичний ефект щодо пухлин з фенотипом резистентності до цитостатиків. Власне опис винаходу, що заявляється В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу розробити протипухлинний феромагнітний нанокомпозит для подолання лікарської резистентності, який був би здатний до вибіркового накопичення в пухлинному вогнищі і демонстрував би достатню протипухлинну активність щодо пухлин з фенотипом лікарської резистентності та мав би такий же рівень безпечності щодо здорових тканин організму, що й офіцинальний цитостатик. Поставлена задача вирішується тим, що синтезують магнітну протипухлинну рідину, яка містить магнетит, стабілізатор (олеат натрію) та розчинник (фізіологічний розчин), а також поліетиленгліколь та протипухлинний агент (субстанція цисплатину), при такому співвідношенні компонентів, мас. %: магнетит 10-15 олеат натрію 6,0-7,5 поліетиленгліколь 1,0-1,8 цисплатин 2,0-6,0 фізіологічний розчин решта. Для одержання нанокомпозиту використовували такі реагенти: сульфат заліза (II) ДСТУ 4148-78 хлорид заліза (III) ДСТУ 4147-74 гідроксид амонію ДСТУ 9-92 1 UA 112490 C2 олеат натрію (ол.Nа) поліетиленгліколь (ПЕГ-2000) вода дистильована фізіологічний розчин цисплатин (ЦП) 5 10 15 Merck Schuchardtohg (Німеччина) Merck Schuchardtohg (Німеччина) ДСТУ 6709-72 тов. Новофарм-Біосинтез (Україна) Qilu Pharmaceutical со. ltd. (Китай) Феромагнітний нанокомпозит, що заявляється, готують таким чином: Спочатку синтезують магнетит рідинно-фазним способом, що ґрунтується на співосадженні солей дво- і тривалентного заліза водним розчином аміаку. Для проведення реакції солі FeSO47H2O (С=1,0 моль/л) і FeCl36H2O (С=2,0 моль/л) розчиняють у необхідній кількості дистильованої води. Профільтрований розчин повільно додають до 25 % розчину гідроксиду амонію при постійному перемішуванні. Синтезований осад магнетиту відділяють в полі постійного магніту і промивають дистильованою водою до нейтрального рН. Далі проводять стабілізацію модифікованих наночастинок магнетиту необхідною кількістю олеату натрію при постійному перемішуванні при температурі 80 °C протягом однієї години. Стабілізацію проводять шляхом хемосорбції молекул олеату натрію на поверхні магнетиту. Одержану магнітну рідину характеризують за розмірами стабілізованих наночастинок, намагніченістю насичення, седиментаційною стабільністю, стійкістю до розведення, величиною динамічної в'язкості та густиною. Фізичні властивості магнітної рідини представлені у табл. 1. Таблиця 1 Фізичні властивості магнітної рідини Назва властивості та одиниця вимірювання Розмір частинок, стабілізованих олеатом натрію, нм Намагніченість насичення Ms, Гc Седиментаційна стабільність, см/місяць Динамічна в'язкість , мПас 3 Густина МР, МР, г/см 20 25 30 35 40 45 Значення фізичної величини 13,78±2,93 14,1±2,5 % стабільна 1,2-0,9 1,14±1,0 % Для одержання нової форми лікарського препарату, стабілізовані наночастинки магнетиту (Fе3О4/ол.Nа) доводять фізіологічним розчином до робочої концентрації магнетиту С=3 мг/мл. Іммобілізацію цитостатика проводять на поверхні наночастинок магнітної рідини для системи Fе3О4/ол.Nа з концентрацією CFe3O4=3 мг/мл, Сцисплатину=0,4 мкг/мл. Адсорбція здійснюється в динамічному режимі впродовж 4 годин за кімнатної температури. Повноту адсорбції контролюють спектрофотометричними методами (Spektrometer Lambda 35 uv/vis Perkin Elmer Instruments). Одержану магнітну рідину з адсорбованим цитостатиком додатково модифікують ПЕГ-2000. Для цього у колоїдний розчин Fе3О4/ол.Nа/ЦП додають наважку ПЕГ з розрахунку 15 % (м. ч.) полімеру від маси наважки магнетиту. Синтез Fе3О4/ол.Nа/ЦП/ПЕГ здійснюють у динамічному режимі впродовж 3 годин. Модифікування поверхні наночастинок поліетиленгліколем проводять з метою підвищення стабільності магнітної рідини, зменшення агрегації частинок. Крім того, при використанні магнітної рідини у біологічному середовищі наявність полімерних ланцюгів ефективно перешкоджає адсорбції різних біомолекул на поверхню нанокомпозиту, у тому числі їх аглютинації активними компонентами, що входять до складу крові. Нанокомпозит зберігають у світлонепроникній тарі у прохолодному місці. Феромагнітний нанокомпозит досліджують наступним чином: Розміри і форму частинок у зразках феромагнітного нанокомпозиту вивчають методом просвічувальної електронної мікроскопії на приладі Transmission Electron Microscope JEOL 2010. Намагніченість зразків вимірюють за допомогою вібраційного магнітометра при частоті 228 Гц за кімнатної температури. Седиментаційну стабільність за температур 10-25 °C та стійкість до розведення водою у 10-20 разів магнітної рідини досліджують методами фотодинамічної спектроскопії при зберіганні у скляному посуді протягом 7-12 місяців. Динамічну в'язкість () магнітної рідини визначають за допомогою лабораторного віскозиметра (час витікання рідини через скляний капіляр складало 300 с). В'язкість розбавленої МР розраховують за формулою Ейнштейна: /0=1+5/2, 2 UA 112490 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 де 0 - динамічна в'язкість несучої рідини (0 води становить 0,890 мПас при температурі 25 °C). Вона складала 1,2-0,9 мПас. Густину магнітної рідини (МР) визначають методом гідростатичного зважування, вона 3 становила 1,14 г/см 1,0 %. Кількість іммобілізованого цисплатину на поверхні наночастинок визначають вимірюванням 2+ 2+ концентрації Pt контактних розчинів до і після іммобілізації. Вимірювання концентрації Pt ioнів здійснюють атомно-адсорбційним методом за допомогою однопроменевого двоканального спектрофотометра С-115М1 з полум'яним атомізатором, дейтерієвим коректором фону, цифровою реєстрацією. Використовують лампу з порожнистим катодом на платину, аналітична лінія - 265,9, паливно-окисна система: ацетилен - повітря. Цитотоксичну активність феромагнітного нанокомпозиту визначають in vitro на резистентних до цисплатину клітинах раку молочної залози (РМЗ) людини лінії MCF-7. Клітини культивують у культуральному модифікованому середовищі Dulbecco ISCOV (Sigma, Німеччина) з додаванням ембріональної телячої сироватки ("Сангва", Україна) за температури 37 °C. Клітини пересівають 4 2 двічі на тиждень зі щільністю посіву 2-4*10 клітин на см поверхні. Пересів клітин роблять, коли 50 % поверхні зайнято клітинами. 4 Резистентні до цисплатину клітини лінії MCF-7 (у концентрації 1*10 клітин/мл) висаджують по 100 мкл в 96-лункові пластикові планшети. Клітини культивують на модифікованому середовищі Dulbecco-ISCOV (Sigma, Німеччина) із додаванням ембріональної телячої сироватки та антибіотика - гентаміцину в концентрації 40 мкг/мл в стандартних умовах при 37 °C. Після 24-годинної адаптації клітин до умов культивування додають нанокомпозит у різних концентраціях (кожна у 3 паралелях, у 100 мкл) та інкубують за таких самих умов. Визначення цитотоксичності проводять через 24 години інкубації. Ефективність оцінюють за МТТ-колориметричним тестом. В основу методу покладено здатність мітохондріальних ферментів живої клітини перетворювати 3-[4,5-диметилтіазол-2-іл]-2,5-дифенілтетразол бромід (МТТ) - сіль жовтого кольору - в кристалічний МТТ-формазан лілового кольору. Для цього в лунки 96-лункового планшета додають по 20 мкл розчину МТТ (5 мг/мл у фосфатно-сольовому буфері) та інкубують протягом 3-х годин. Після центрифугування планшету (1500 об/хв., 5 хв.) за допомогою напівавтоматичного відсмоктувача видаляють супернатант. Для розчинення кристалів формазану в кожну лунку додають 100 мкл диметилсульфоксиду. Величину оптичного поглинання розчину вимірюють за допомогою мультилункового спектрофотометра при довжині хвилі 540 нм. Протипухлинний ефект феромагнітного нанокомпозиту визначають на щурах з резистентною до цисплатину карциномою Герена, яку перещеплюють під шкіру на спину по 0,4 мл 23 % суспензії пухлинної тканини у фізіологічному розчині. Через 8 діб після перещеплення починають курс терапії: п'ять внутрішньочеревних ін'єкцій у дозі 1,2 мг цисплатину/кг маси тварини. Нанокомпозит вводять 1 раз у 2 доби на фоні наркозу (Каліпсовет-Плюс, 1 мкл/г маси, в/м). Протипухлинний ефект оцінюють за зміною об'єму пухлин у тварин з резистентною карциномою Герена, яким вводять феромагнітний нанокомпозит, порівняно з групою тварин, яким вводять цисплатин. Висновок про біологічну безпеку феромагнітного нанокомпозиту роблять на підставі аналізу загальних і біохімічних показників крові, а також морфологічного дослідження життєво важливих органів тварин. Таким чином, сукупність суттєвих ознак протипухлинного феромагнітного нанокомпозиту, який заявляється, дозволяє поліпшити терапевтичний ефект для подолання лікарської резистентності за рахунок більшої протипухлинної активності щодо резистентних пухлин, обумовленої здатністю до вибіркового накопичення в пухлинному вогнищі, а також запобігти токсичному впливу цитостатика на організм в цілому. Суть винаходу пояснюється конкретними прикладами виконання. Приклад 1. У колбу об'ємом 500 мл додавали 1 М сульфату заліза та 2 М хлориду заліза, розчиняли у дистильованої воді та перемішували. Фільтрували одержаний розчин та додавали поступово до надлишку гідроксиду амонію. Одержаний магнетит (12,5 г) стабілізували 7,0 г олеату натрію при температурі 80 °C та перемішуванні протягом години і доводили одержану суміш до заданого об'єму фізіологічним розчином CFe3O4=3 мг/мл). Далі іммобілізували на поверхню наночастинок магнітної рідини у динамічному режимі 0,4 мг/мл цисплатину протягом 4 годин за кімнатної температури (Фіг. 1). Одержану магнітну рідину з адсорбованим цисплатином додатково модифікували 0,45 мг ПЕГ2000. Синтез здійснювали в динамічному режимі впродовж 2 годин. Поставлена задача вирішується. 3 UA 112490 C2 5 10 15 20 25 30 35 Одержані розподіли наночастинок по розмірах (Фіг. 2) дозволяють охарактеризувати синтезовану магнітну рідину, як полідисперсію, що складається з частинок магнетиту з поверхневим шаром олеату натрію розмірами 13,78±2,93 нм. Приклад 2. Резистентні до цисплатину клітини лінії MCF-7 (концентрація складала 1-10 клітин/мл в об'ємі 100 мкл) висаджували в 96-лункові пластикові планшети. Клітини культивували на модифікованому середовищі Dulbecco-ISCOV (Sigma, Німеччина) із додаванням ембріональної телячої сироватки та антибіотика гентаміцину в концентрації 40 мкг/мл в стандартних умовах при 37 °C. Після 24-годинної адаптації клітин до умов культивування додавали нанокомпозит та цисплатин у концентраціях від 0,1 до 20 мкг цисплатину/мл (кожна у 3 паралелях, у 100 мкл) та інкубували за тих самих умов. За результатами МТТ-тесту встановлено, що концентрація ІС50 для цисплатину складала 12,5 мкг цисплатину/мл, а для феромагнітного нанокомпозиту - 7,5 мкг цисплатину/мл (Фіг. 3), що свідчило про вищий цитотоксичний ефект нанокомпозиту щодо клітин РМЗ, резистентних до цисплатину. Поставлена задача вирішується. Приклад 3. Щурам лінії Wistar перещеплювали резистентну до цисплатину карциному Герена під шкіру на спину по 0,4 мл 23 % суспензії пухлинної тканини у фізіологічному розчині. Через 8 діб після перещеплення починали курс терапії цисплатином: 5 внутрішньочеревних ін'єкцій у дозі 1,2 мг цисплатину/кг маси. Препарат вводили 1 раз у 2 доби на фоні наркозу (Каліпсовет-Плюс, 1 мкл/г маси, в/м). Цисплатин не чинив достовірного ефекту на пухлини резистентного до цисплатину штаму: середній об'єм пухлин у контрольній групі складав 3 20,2±1,0см , а у тварин, яким вводили цисплатин, - 21,1±1,4 см (Фіг. 3, 4). Поставлена задача не вирішується. Приклад 4. Щурам лінії Wistar перещеплювали резистентну до цисплатину карциному Герена під шкіру на спину по 0,4 мл 23 % суспензії пухлинної тканини у фізіологічному розчині. Через 8 діб після перещеплення починали курс терапії феромагнітним нанокомпозитом: п'ять внутрішньочеревних ін'єкцій у дозі 1,2 мг цисплатину/кг маси. Препарат вводили 1 раз у 2 доби на фоні наркозу (Каліпсовет-Плюс, 1 мкл/г маси, в/м). Феромагнітний нанокомпозит чинив достовірний протипухлинний ефект на пухлини 3 резистентного до цисплатину штаму: середній об'єм пухлин знижувався з 20,2±1,0см у 3 контрольній групі до 12,1±2,4см у тварин, яким вводили нанокомпозит, відсоток гальмування росту пухлин складав 40 % (Фіг. 3, 4). Поставлена задача вирішується. Приклад 5. Біологічну безпеку феромагнітного нанокомпозиту у порівнянні до цисплатину, оцінювали за загальними та біохімічними показниками крові щурів лінії Wistar після завершення курсу терапії. Встановлено, що цисплатин та феромагнітний нанокомпозит призводять до підвищення рівня креатиніну у сироватці крові піддослідних тварин (табл. 2). Таблиця 2 Біохімічні показники сироватки крові щурів з резистентною до цисплатин карциномою Герена після впливу цисплатину та феромагнітного нанокомпозиту (n=10) Показники сироватки крові щурів Активність Активність Рівень Активність Активність Рівень Група Рівень аспартатгамасечовин аланінаміно лужної загального тварин креатиніну аміноглютаміли, трансфераз фосфатази, білірубіну, , мкмоль/л трансфетранспептиммоль/л и, од/л од/л мкмоль/л рази, од/л дази, од/л Контроль 16,2±4,0 43,0±2,1 494,0±80,0 50,6±2,2 302,6±47,1 7,4±1,0 9,6±1,0 Цисплати 19,0±3,0 73,0±9,0* 500,0±62,0 54,2±5,0 298,6±37,4 9,0±1,1 10,3±1,3 н Феромагн ітний 16,0±3,0 62,0±5,5* 465,0±36,0 45,8±2,8 263,8±35,8 7,0±1,0 11,0±1,3 нанокомп озит Примітка: * - показник достовірно відрізняється від відповідного в контролі (р