Спосіб скринінгу та моніторингу ризику щільноклітинного раку порожнини рота серед населення з групи епідеміологічного ризику

Корисна модель належить до медицини, а саме до онкології, і може бути використана для масового скринінгу та моніторингу ризику щільноклітинного раку порожнини рота серед населення з групи епідеміологічного ризику. Щільноклітинні раки порожнини рота характеризуються неконтрольованим, агресивно-деструктивним ростом, часто локально-регіональним ураженням, наявністю первинно-множинних пухлин, метастазуванням і найчастіше неможливістю радикального видалення пухлини, а також частими рецидивами після проведеного лікування та високими показниками смертності від цієї патології. Згідно даних аналітичної епідеміології, розвиток раку порожнини рота та всього верхнього аеродегестивного шляху (згідно класифікації, пухлини належать до пухлин голови та шиї) пов'язують з тривалим курінням (більше 20-ти років, більше 20-ти цигарок в день; згідно іншим даним, для населення в індустріальних країнах, від 10 до 20 років і більше 20 цигарок в день), вживанням алкоголю та прямою дією канцерогенів та мутагенів і генетичною чутливістю до них. Підвищена чутливість до мутагенів є визначальним фактором ризику раків цієї локалізації. Показано, що при канцерогенезі пухлин епітелію слизової верхнього аеродегестивного шляху характерним є наявність так званих полів малігнізації, де відмічаються клітинні та структурні зміни в епітелії слизової. Саме з цих полів, згідно сучасної концепції канцерогенезу пухлин цієї локалізації, при постійній дії епідеміологічних чинників на слизову розвиваються пухлини. Підтвердженням цього є наявність первинно-множинних пухлин, їх рецидиви та виникнення вторинних пухлин після проведеного хіміотерапевтичного та променевого лікування. Тому актуальним для раннього виявлення пухлин цієї локалізації є розробка методів масового скринінгу та моніторингу ризику канцерогенезу в порожнині рота серед населення з груп епідеміологічного ризику і на цій основі застосування профілактичних заходів та превентивної терапії. Спеціальних, швидких та неінвазивних методів для скринінгу та моніторингу ризику раку слизової порожнини рота не існує, а звідси не має і програм масового обстеження населення. В клінічній практиці при диференціальній діагностиці біопсийного та післяопераційного матеріалу, згідно міжнародної класифікації, основними діагностичними критеріями є цитологічні та морфологічні ознаки оцінки ступеню дисплазії і малігнізації епітелію слизової порожнини рота та гістоструктура новоутворення. Слід зазначити, що в останні десятиріччя для діагностики новоутворень в порожнині рота та пухлин верхнього аеродегестивного шляху почали застосовувати молекулярно генетичні методи для виявлення ранніх маркерів злоякісності та генетичних змін, які характерні для пухлин цього гістогенезу та локалізації, а саме: рівень експресії фосфопротеїну р53 гену супресору пухлинного росту та мутації або втрату в хромосомі 17р13 (регуляція клітинного циклу, апоптозу, показник прогресії інвазивного фенотипу), Кі-67, Всl-2 (показник проліферативної активності та блокування апоптозу, відповідно) зміни в хромосомах: 9p21LOH (гіперплазія), 3р, 17р13 (дисплазія), 11q13 amp (ампліфікація), 13q21, 14q24LOH, Cyclin D1 amp (Ca in citu), 6p, 8p23, 4q26-q28 LON (карцинома). Ці методи потребують сучасних коштовних технологій, сучасного обладнання, проводяться в спеціалізованих медичних та наукових установах і характеризуються складністю та потребують значного часу для отримання результату. Ураховуючи викладене, розробка швидких, неінвазивних методів для масового скринінгу та моніторингу ризику раку порожнини рота в групах епідеміологічного ризику є важливим напрямком сучасної діагностики. В цьому відношенні перспективним виявилося дослідження вмісту ДНК (реакція Фельгіна) за оптичною щільністю в інтерфазних ядрах епітелію слизової порожнини рота при станах, що передують виникненню пухлини, де виявлено анеуплодію з характерним для цих пухлин накопиченням епітеліальних клітин з триплоїдним вмістом ДНК в ядрах клітин, що дає можливість оцінити характер розвитку процесу. Цей метод вважається інформативним, але потребує коштовного технічного обладнання та тривалого часу для його виконання, і тому не може бути використаний для масового скринінгу та моніторингу ризику раку порожнини рота. Найближчим аналогом до способу, що заявляється, є цитологічне дослідження відбитків слизової порожнини рота з застосуванням індексу диференціювання клітин. Цей метод застосовують при запальних ураженнях слизової порожнини рота та шлунку, який ми обрали за прототип [3]. При забарвленні відбитків епітелію слизової азур-еозином за цитологічними, морфологічними та морфометричними показниками та оцінкою базофілії та оксифілії цитоплазми розрізняють шість стадій диференціювання епітеліальних клітин з відповідною цитоморфологічною характеристикою клітин [1, 2]: 1-ша стадія - базальні клітини круглої чи овальної форми, діаметром від 16,5 до 22,5 μкм, діаметр ядра від 10 до 13,5 μкм, ядерно-цитоплазматичне відношення в межах 0,5, цитоплазма базофільна. 2 стадія - пара базальні клітини, круглої чи овальної форми, діаметром від 17 до 45,5 μкм, діаметр ядра від 7 до 17,5 μкм. Ядерно-цитоплазматичне відношення в межах 0,4, цитоплазма менш базофільна, ніж у базальних клітин. 3 стадія - проміжні клітини 1-го типу, форма овальна, діаметр від 31 до 51,5 μкм, діаметр ядра від 9 до 18,5 μкм, ядерно-цитоплазматичне відношення близько 0,3, цитоплазма слабобазофільна, іноді з виростами. 4 стадія - проміжні клітини II типу, полігональної форми, діаметр від 25 до 88 μкм, діаметр ядра від 7,5 до 15 μкм, ядерно-цитоплазматичне відношення близько 0,3, цитоплазма слабобазофільна, утворює вирости, з'являються перші ознаки кератинізації. 5 стадія-поверхневі клітини, полігональної форми, діаметр від 22,2 до 82 μкм, діаметр ядра від 6 до 13 μкм, ядерно-цитоплазматичне відношення менше 0,2, ядро пікнотичне, цитоплазма від слабо базофільної до оксифільної, виражені явища кератинізації, цитоплазма утворює широкі вирости, границі цитоплазми не чіткі. 6 стадія - без’ядерні клітини неправильної форми або безформна маса клітин, діаметр від 28 до 55 μкм, оксифільні з високим ступенем кератинізації. Часто на місті ядра - порожнина. На основі цих показників була розроблена методика обчислення індексу диференціювання епітеліоцитів [3], де подальша оцінка цитограм відбитків слизової щоки проводилась з обчисленням індексу диференціювання клітин (ІДК) за формулою: ІДК=1а+2б+3в+4г+5д+6ж, де 1, 2, 3, 4, 5, 6 - стадії диференціювання клітин; а, б, г, д, ж - відсоток клітин кожної стадії. В рамках цього методу показано, що ІДК для слизової порожнини рота практично здорових людей коливається від 450 до 560. При виразково-запальних процесах в гострий період захворювання ІДК може понижуватись до 200-300, при гіперкератозах - збільшуватись до 600, а на етапах лікування поступово наближатись до норми. При дослідженні у практично здорових людей різного віку (чоловіків і жінок) рівня диференціювання клітин епітелію в відбитках з різних ділянок слизової порожнини рота ІДК та його коливання в межах 25 з піднебіння склав 590±1, коливання 584-596, язика - 501±1, нижньої губи - 490±2, коливання 483-497, слизова щоки - 498±1, коливання 493-503 [3]. Отримані дані показали, що цитологічні показники диференціювання клітин та ІДК отримані з відбитків слизової щоки статистично достовірно не відрізняються від показників зі слизової язика і в відбитках відмічаються поодинокі клітини 4-ї стадії, а основну масу клітин складають клітини самих пізніх стадій диференціювання (5, 6 стадії), а рівень ІДК в нормі має показники від 450 до 596 [3, 4, 5]. Цей метод дозволяє об'єктивно оцінити запальні та дистрофічні процеси в порожнині рота та навіть виразкове запальні процеси в гастроентеральному шляху, дає цінну інформацію функціонального стану слизової при її ураженнях різного характеру та в динаміці проведення різних методів лікування та профілактики. Недоліком цього методу є взяття матеріалу способом відбитку з самої поверхневої зони епітелію слизової порожнини рота, де концентруються в великій кількості мертві поверхневі клітини (5, 6-стадії). Це не дає повної інформації про те, що відбувається в парабазальному шарі (2 стадія) та проміжному шарі (3 стадія) епітелію, що не дозволяє виявити та об'єктивно оцінити гіперпластичні та диспластичні процеси в епітелії слизової при передпухлинних станах; при забарвленні клітин азур-еозином також неможливо чітко визначити перехідні форми базофільної цитоплазми до оксифільної, що може суттєво впливати на результат. Це все обмежує діагностичні можливості цього методу при застосуванні в онкології. Застосування для цих цілей шкребків з поверхні слизової та загальновживаного в цитологічних дослідженнях забарвлення мазків епітеліальних клітин за методом Papanikolaou (Пап-тест) дозволяє мати на цитограмі клітини всіх стадій та більш об'єктивно оцінити базофілію та оксифілію цитоплазми клітин і відповідно стадію диференціювання клітин [5]. Отже спосіб - прототип, як і наведені молекулярно-генетичні методи ранньої діагностики раку порожнини рота, мають суттєві обмеження в використанні для оцінки ризику раку аеродегестивного шляху; в першому випадку - методичні, а в другому - із-за складності молекулярно-генетичних методів, тривалого часу на їх виконання та коштовних технологій, і тому вони не можуть бути застосовані для масового скринінгу та моніторингу ризику щільноклітинного раку порожнини рота серед населення з групи епідеміологічного ризику. Спосіб, що пропонується, базується на розробленій неінвазивній та доступній методиці оцінки ризику раку для скринінгу та моніторингу ризику щільноклітинного раку порожнини рота серед населення з групи епідеміологічного ризику на основі визначення вагомості індивідуальних епідеміологічних факторів ризику цієї патології та аналізу розподілу епітеліоцитів за стадіями диференціювання з обчисленням індексу диференціювання клітин (ІДК) та показників атипії клітин в шкребках слизової щоки. Задача вирішується шляхом визначення вагомості індивідуальних епідеміологічних факторів ризику (ступінь ризику: 1 - високий ризик, 2 - ризик є) після аналізу інформаційно-аналітичної картки обстеження пацієнта і оцінки цитологічних змін серед епітеліоцитів, обчислення процентного вмісту епітеліоцитів слизової щоки на різних стадіях диференціювання та обчислення індексу диференціювання клітин (ІДК) на серійних цитологічних препаратах шкребків слизової щоки при моніторингу, висновок про прогноз ризику, отримання рекомендацій. Реалізація такого підходу дозволить створити на основі отриманих даних базу даних (електронний варіант) в установі, що проводить скринінг та моніторинг ризику раку порожнини рота. Суть корисної моделі полягає у прогнозуванні ризику раку порожнини рота у пацієнтів з епідеміологічної групи ризику шляхом визначення вагомості індивідуальних факторів ризику (ступінь ризику: 1 - високий ризик, 2 - ризик є) з урахуванням супутньої патології, що може вплинути на досліджувані показники і оцінки процентного вмісту епітеліоцитів слизової щоки на різних стадіях диференціювання та обчислення ІДК. 1. При віднесенні пацієнта за індивідуальними епідеміологічними факторами ризику до групи 1 (1 - високий ризик) чи групи 2 (2 - ризик є) і при постійній дії виявлених індивідуальних епідеміологічних факторів ризику цієї патології та при виявленні епітеліоцитів переважно в 2-й та 3-й стадії диференціювання клітин (парабазальні і проміжні клітини 1-го типу відповідно) і наявності тяжів та скупчення клітин на цих стадіях з ознаками дисплазії та атипії в окремих клітинах чи наявності в різних ділянках порожнини рота виразково-запальних зон, лейкоплакій чи пухлинних новоутворень і при виявленні в цитограмі серед епітеліоцитів від 2 % і більше базальних клітин (1-ша стадія) та показниках ІДК 300 та нижче прогнозують високий ризик виникнення пухлини в порожнині рота. При таких показниках для об'єктивізації прогнозу про ступінь високого ризику раку у пацієнта призначають проведення на біопсії слизової з порожнини рота аналіз молекулярно-генетичних маркерів злоякісності раку порожнини рота з обстеженням в спеціалізованій медичній установі. 2. При віднесенні пацієнта за індивідуальними епідеміологічними факторами ризику до групи 2 (2 - ризик є) і при постійній дії виявлених індивідуальних епідеміологічних факторів ризику цієї патології та при виявленні в слизовій щоки епітеліоцитів переважно в 2-й та 3-й стадії диференціювання та в 4-й і 5-й стадіях (парабазальні, проміжні клітини 1-го типу та проміжні клітини ІІ-го типу, відповідно) і виявленні в цитограмі серед епітеліоцитів 2 % і більше базальних клітин (1-ша стадія) та при показниках ІДК в межах 300-450 призначають моніторинг за змінами в епітелії слизової порожнини рота один раз на рік, або раніше при появі суб'єктивних симптомів. У дослідженнях було використано комплекс методів: розроблена нами інформаційно-аналітична картка обстеження пацієнта, загальновживаний цитологічний метод забарвлення епітеліальних клітин за Papanikolaou в модифікації Руденко (Пап-тест) [6], модифікована нами методика цитологічної оцінки на відбитках стадій диференціювання епітеліоцитів слизової порожнини рота з відповідною цитологічною та цитоморфологічною їх характеристикою за D.E. Lange на відбитках епітелію щоки та за К.П. Ганіна з співавт. на шкребках слизової щоки [1, 2, 5], та метод обчислення індексу диференціювання цих клітин, розроблений І.А. Биковим з співавт. [3, 4]. Модифікація методики цитологічної оцінки полягає в використанні шкребків слизової щоки замість відбитків та включення в аналіз класифікаційних цитологічних показників дисплазії та атипії клітин епітелію слизової. Розроблений методичний комплекс був використаний при порівняльному дослідженні показників диференціювання епітеліоцитів слизової щоки на шкребках слизової в репрезентативних групах. 1. Група практично здорових чоловіків-волонтерів, (10 спостережень, студенти, 19-22 років), що не курять і не вживають алкоголь, не проживають на забруднених територіях, а також продовж свого життя ще не мали суттєвих контактів зі шкідливими чинниками навколишнього середовища. 2. Група епідеміологічного ризику, чоловіки-волонтери, різного віку (40 спостережень, 19-60 років ), що постійно проживають в забрудненій 5-ти км зоні Ровенської АЕС (після Чорнобильської аварії внесена до забрудненої території), що мали різний статус куріння і зловживання алкоголем та професійно (будівельники покрівель) мають постійні контакти зі шкідливими факторами (фарби, лаки, розчинники, смола та інші). 3. Група хворих на рак слизової порожнини рота (30 спостережень, чоловіки віком 43-77 років), злоякісна пухлина в яких локалізувалася в різних її ділянках, а хворі мали різний статус куріння, зловживання алкоголем, та різний ступінь контактів з мутагенами та канцерогенами. Отримані дані показників диференціювання епітеліоцитів та ІДК в слизовій щоки в групі епідеміологічного ризику порівнювались з показниками диференціювання епітеліоцитів та ІДК слизової щоки, отриманими в групі хворих на шкребках слизової з протилежної щоки по відношенню до локалізації пухлини, та з показниками стану слизової в біопсіях, взятих на відстані від пухлини в зовнішньо морфологічно незміненій слизовій, у чоловіків з раком порожнини рота за цитоморфологічними змінами в структурі епітелію при наявності пухлини та за показниками проліферативної активності, апоптозу, експресії р53, денситометричних показників вмісту та структури ДНК в ядрах епітеліоцитів, а також в залежності від віку, соціально-демографічних параметрів, статусу куріння, вживання алкоголю та статусу контактів з мутагенами та канцерогенами продовж життя. Між хворими отримані дані оцінювались в залежності від клінічної стадії процесу за TNM, рівню диференціювання пухлини, інвазії та маркерів злоякісності в пухлині-показників проліферативної активності, апоптозу. рівню експресії Кі67 і р53 в пухлинних клітинах та рівня VEGF в сироватці хворих. Аналіз епітелію слизової щоки (шкребки) та слизової на відстані від пухлини (біопсія слизової) показав, що у хворих на рак порожнини рота за показниками диференціювання, дозрівання епітеліоцитів, ІДК слизової щоки та за цитоморфологічними характеристиками структурних змін в епітелії слизової та згідно показників, досліджених маркерів, нормального епітелію в слизовій порожнини рота не існує. Прогресія гістопатологічного фенотипу клітин в слизовій на відстані від пухлини була в прямій залежності від клінічної стадії процесу, рівня інвазії пухлини, статусу р53 , рівня клітин в S-фазі, вмісту ДНК в пухлині та рівню VEGF в сироватці крові хворих. Аналіз показав, що розвиток раку в слизовій порожнині рота у чоловіків, що проживають в різних регіонах України, не залежав від тривалого часу куріння. Серед хворих на рак порожнини рота відмічені як пацієнти з тривалим статусом куріння, так і низьким. Однак всі хворі на протязі життя піддавались впливу шкідливих факторів та факторів, що пошкоджують ДНК (мутагени та канцерогени). Відмічені спільні порушення в диференціюванні та дозріванні епітеліоцитів та достовірне пониження ІДК в епітелії слизової щоки у чоловіків з групи ризику та у хворих на рак порожнини рота: контроль, ІДК 392, коливання 380-406; група ризику, ІДК 294, коливання 223-343; хворі, ІДК 265, коливання 218-336, (р