Спосіб оцінки імунологічного стану слизової оболонки порожнини рота

Спосіб оцінки імунологічного стану слизової оболонки порожнини рота, що включає відбір ма Винахід відноситься до галузей біологи та медицини і може бути використаний для оцінки імунологічного стану слизової оболонки порожнини рота за фізіологічних умов та при стоматологічних захворюваннях, для моніторингу патологічного процесу ВІДОМІ такі способи оцінки імунологічного стану слизової оболонки визначення рівня slgA в ротовій рідині [Данилевский Н Ф , Борисенко А В Заболевания пародонта -Київ «Здоров'я» -2000 461с], визначення фагоцитарної активності лейкоцитів [Данилевский Н Ф , Борисенко А В Заболевания пародонта -Київ «Здоров'я» -2000 -461с ], цитологічне дослідження слизової оболонки порожнини рота [Данилевский Н Ф , Несин О Ф , Рахній Ж І Захворювання слизової оболонки порожнини рота -Київ "Здоров'я" -1998 -406с ] Найближчим способом до заявляемого є спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки порожнини рота за допомогою маркерів CD3, CD4, CD8, CD20, CD16, CD14 та HLA-DR [Пат 2001096503 Украйна, МПК 7 А61С17/00 Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки порожнини рота Пат 2001096503 Украйна, МПК 7 А61С17/00/ Кайдашев І П , Ткаченко П І , Куроедова В Д , Карасюнок О О , Шинкевич В І, Баштовенко О А (Украйна), №41428, Заявл24 09 2001, Опубл 10 06 2002-Зс ], п 45519 від 15 08 2002р Для його здійснення під анестезією відбирають бюптат слизової оболонки порожнини рота, з матеріалу виготовляють крюстатні зрізи 5-7мкм, їх фіксують в льодяному ацетоні Використовуючи теріалу із захопленням слизової оболонки разом із власною пластинкою, виготовлення із матеріалу зрізів, обробку зрізів антитілами до імунокомпетентних клітин, візуалізацію антитіл та оцінку КІЛЬКОСТІ й розташування цих клітин, який відрізняється тим, що як антитіла використовують антитіла до у-, 5 - Т- клітинних рецепторів лімфоцитів маркери (антитіла) до рецепторів, що складають фенотип імуноцитів, визначають або ідентифікують клітини за допомогою імунопстохімічного аналізу Визначають CD3+, CD4+, CD8+ CD20+, CD16+, CD14+, HLA-DR+ клітини, які присутні в слизовій оболонці порожнини рота Метод включає три реакції, сутність яких полягає у взаємодії клітинних антигенів із специфічними антитілами та проявку цієї реакції Для методу використовується другий шар антитіл, мічених біотином- В результаті третьої реакції взаємодіють біотин з стрептавідшпероксидазою Клітини підраховують, характеризують їх локалізацію Візуалізація проводиться з використанням діамінобензидину солянокислого Кінцевим продуктом ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції є нерозчинний пігмент коричневого кольору, що випадає в МІСЦІ знаходження антигену Недоліком даного способу являється недостатня інформативність щодо характеристики внутрішньо епітеліальних лімфоцитів, зумовлена наступними обставинами Серед внутрішньо епітеліальних лімфоцитів слизової оболонки переважають у-, 5 - (гама-, дельта-) Т- лімфоцити, що підкреслює значну роль цих клітин в роботі імунологічного апарату слизової оболонки [Дранник Г Н Клиническая иммунология и аллергология - Одесса «АстроПринт» -1999 -603 с , Хаитов Р М Физиология иммунной системы // Российский физиологический журнал им Сеченова -2000 -Т 86, №3 -С 252-267], а їх виявлення є дуже важливим, у-, 5 - Т-лімфоцити можуть нести CD4 або CD8 молекули на своїй поверхні, як і а-, р СО (О 00 ю 58163 лімфоцити, тому антитіла CD4, CD8 не надають можливості з'ясувати походження лімфоцитів, розташованих внутрішньо-епітеліально В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб, шляхом удосконалення відомого, щоб досягти підвищення інформативності та достовірності оцінки імунологічного стану слизової оболонки порожнини рота за допомогою визначення КІЛЬКОСТІ та розташування у-, 5 - Т -лімфоцитів, що дозволить судити про рівень імунних реакцій Поставлену задачу вирішують створенням способу дослідження, що включає відбір матеріалу із захопленням слизової оболонки разом із власною пластинкою, виготовлення із матеріалу зрізів, обробку зрізів антитілами до у-, 5 - Т-клітинних рецепторів лімфоцитів, візуалізацію антитіл та оцінку КІЛЬКОСТІ й розташування цих клітин Спосіб оцінки здійснюється наступним шляхом 1 Матеріал для дослідження одержується за допомогою біопсії епітелію з власною та/або підслизовою пластинкою У разі проведення вказаної процедури під місцевою анестезією, важливо уникати інфільтрації анестетіком безпосередньо ділянки, де намічена біопсія, оскільки при цьому не виключена можливість змін архітектоніки тканини Отримують крюстатні зрізи, та фіксують їх в охолодженому ацетоні 2 Зрізи обробляють моноклональними антитілами до у-,5- Т-ланцюпв Т-клітинного рецептора 3 Наступним етапом виявляють первинні моноклональні антитіла - до у-, 5 - Т-клітинного рецептора 4 Візуалізують реакцію атиген - антитіло за допомогою хромотропа 5 Проводиться дозабарвлення препаратів гематоксиліном, що дозволяє оцінити співвідношення виявлених імунцитів з ГІСТОЛОГІЧНОЮ будовою слизової оболонки 6 Ідентифікують у-, 5 - Т-лімфоцити, оцінюють їх КІЛЬКІСТЬ, локалізацію відносно шарів епітелюцитівта солокалізацію, особливості будови, ІНШІ характеристики Приклад використання 1 Дослідження проводилося для слизової оболонки ясен при хронічному катаральному ГІНГІВІТІ середнього ступеня важкості у дітей, за допомогою непрямого біотин - екстравідин - пероксидазного методу [Дж Полак, С Ван Норден Введение в иммуноцитохимию Современные методы и проблемы // Перевод с англ Глуховой М А , под ред Хрущова Н Г-М «Мир»-1987-74с] В якості первинних антитіл використовували у-, 5 - моноклональні мишачі антитіла Друга реакція полягала у зв'язуванні первинних у-,5- моноклональних антитіл антитілами, міченими біотином Екстравідін використовувався у якості третього шару і виявляв бютинильовану мітку Візуалізація реакції проводилася за допомогою діамінобензидину солянокислого Отримані результати, в загальних рисах, показали збільшення КІЛЬКОСТІ активованих у-, 5 Тлімфоцитів без зміни їх локалізації Приклад 2 Проведено дослідження слизової оболонки міжзубного сосочка в області встановленого дентального імплантата з титанового сплаву непрямим Імуноферментним методом [Дж Полак, С Ван Норден Введение в иммуноцитохимию Современные методы и проблемы // Перевод с англ Глуховой М А, под ред Хрущова Н Г-М «Мир»-1987-74с ] В якості первинних моноклональних антитіл використовували у-, 5 - моноклональні мишачі антитіла Другим шаром служили антитіла кози до IgG миші, мічені пероксидазою хріна (anti IgG-HRP) Візуалізацію проводили за допомогою З-амшо-9-етилкарбазола (Sigma, USA) Продукт реакції мав червоне забарвлення Було виявлено зміни імунологічного апарату слизової оболонки, які стосувалися у-, 5 - Тлімфоцитів, та проявлялися зменшенням їх числа в епітелії та перерозподілом по шарах у вигляді сукупчень в ділянках дистрофічне змінених епітеЛІОЦИТІВ Приклад З Було проведено дослідження слизової оболонки ясен при генералізованому пародонтиті середнього ступеня важкості за допомогою прямого імунофлуоресцентного методу В якості первинних моноклональних антитіл використовували у-,5моноклональні антитіла, мічені флуорецешізотюцианатом (ФІТЦ) Забарвлений зріз оцінювали під мікроскопом з ультрафіолетовою оптикою, при цьому в місцях зв'язування антитіл спостерігали зелену флуоресценцію Приклад 4 Досліджували слизову оболонку ясен при генералізованому пародонтиті важкого ступеня за допомогою непрямого імунофлуоресцентного методу В якості первинних моноклональних антитіл використовували у-, 5 - мишачі моноклональні антитіла Другий шар антитіл був представлений антитілами кози до первинних специфічних антитіл і мічений ФІТЦ Забарвлений зріз оцінювали під мікроскопом з ультрафіолетовою оптикою, при цьому в місцях зв'язування антитіл спостерігали зелену флуоресценцію Приклад 5 Досліджували слизову оболонку, що вкриває зону остеомієліту нижньої щелепи за допомогою пероксидаза- антипероксидазного методу В якості первинних моноклональних антитіл використовували у-, §- кролячі моноклональні антитіла Другий шар формували немічені антитіла кози до кролячого IgG Третій шар складався з комплексу кролячих антитіл до пероксидази, зв'язаних з пероксидазою (ПАП-комплекс) Реакцію візуалізували за допомогою З-амшо-9-етилкарбазола (Sigma, USA) В місцях зв'язування антигену спостерігалося червоне забарвлення Представлені результати досліджень, проведених запропонованим методом, дозволяють зробити висновок про високу інформативність аналізу імунологічного стану слизової оболонки на глибокому структурному рівні, який уточнює роль імунних механізмів у патогенезі захворювань слизової оболонки 58163 Комп'ютерна верстка Н Лисенко Підписано до друку 05 08 2003 Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна