Моноклональне антитіло, що здатне зв’язуватися з рецептором infa/b,

1. Моноклональне антитіло, яке експресується гібридомою, що зберігається в Інституті Пастера (CNCM) під номером І-1698, і здатне зв'язуватися з рецептором IFN -  /  і блокувати біологічну активність IFN -  і IFN -  , і створювати більш високий антивірусний блокуючий титр проти IFN -  , ніж проти IFN -  . 2. Моноклональне антитіло, яке експресується гібридомою, що зберігається в Інституті Пастера (CNCM) під номером І-1699, і здатне зв'язуватися з рецептором IFN -  /  і блокувати біологічну активність IFN -  і IFN -  , і створювати більш високий антивірусний блокуючий титр проти IFN -  , ніж проти IFN -  . 3. Гуманізоване моноклональне антитіло, що містить варіабельні домени антитіла за п. 1 або 2 і константний домен імуноглобуліну людини. UA (21) 98116315 (22) 29.04.1997 (24) 15.08.2006 (86) PCT/IL97/00138, 29.04.1997 (31) 118096 (32) 01.05.1996 (33) IL (46) 15.08.2006, Бюл. № 8, 2006 р. (72) Новік Даніела , IL, Рубінштейн Менахем , IL (73) ЙЄДА РІСЕРЧ ЕНД ДІВЕЛОПМЕНТ КО. ЛТД, IL (56) WO A 9507716, 23.03.1995. WO A 0563487, 06.10.1993. P. BENOIT ET AL.: "A monoclonal antibody to recombinant human IFN-alpha receptor inhibits biologic activity of several spesies of human IFNalpha, IFN-beta, and IFN-omega". THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 150, no. 3, 1 February 1993, BALTIMORE, MD, USA, pages 707-716, XP002038835. O. COLAMONICI ET AL.: "Identification of a novel subunit of the type I interferon receptor localized to human chromosome 21". THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 268, no. 15, 25 May 1993, BALTIMORE, MD, USA, pages 10895-10899. D. NOVICK ET AL.: "The human interferon alpha/beta receptor: Characterization and molecular cloning". CELL, vol. 77, no. 3, 6 May 1994, CAMBRIDGE, MA, USA, pages 391-400, XP002038837. D. NOVICK ET AL.: "Soluble and membraneanchored forms of the human IFN-alpha/beta receptor". JOURNAL OF LEUKOCYTE BIOLOGY, vol. 57, no. 5, May 1995, NEW YORK, NY, USA, pages 712-718, XP002038838. 2 (19) 1 3 76396 4 4. Фармацевтична композиція для модуляції або Пастера (CNCM) під номером І-1698 23 квітня 1996р. блокування біологічної активності IFN -  , що міс9. Гібридома, яка експресує антитіло за п. 1, позтить антитіло за будь-яким з пп. 1-3 і фармацевтиначена як NUR 2 234.14 і депонована в Інституті чно прийнятний носій. Пастера (CNCM) під номером І-1699 23 квітня 5. Застосування антитіла за п. 1 для приготування 1996р. фармацевтичної композиції для модуляції або 10. Набір для проведення ELISA-аналізу IFNABIFN -  . блокування біологічної активності BPI і/або IFNAB-BPII, який містить промислові 6. Застосування антитіла за п. 2 для приготування планшети для мікротитрування, що містять перше фармацевтичної композиції для модуляції або покриття моноклональним антитілом, продуковаблокування біологічної активності IFN -  . ним гібридомою за п. 8, і друге покриття монокло7. Застосування антитіла за п. 3 для приготування нальним антитілом, продукованим гібридомою за фармацевтичної композиції для модуляції або п. 9. блокування біологічної активності IFN -  . 8. Гібридома, яка експресує антитіло за п. 1, позначена як NUR 2 117.7 і депонована в Інституті Настоящее изобретение относится к антителам против лиганд-связывающего компонента рецептора интерферона-/, которые способны избирательно модулировать активность различных интерферонов I типа. В публикации ЕР №588177 описан растворимый рецептор IFN-, обладающий молекулярной массой приблизительно 40000, который был идентифицирован путем поперечного сшивания с 125IIFN-2 и иммунопреципитации с анти-IFN- моноклональными антителами. Будучи получено из сыворотки, данное вещество обладало молекулярной массой 50кДа. В ней также описан указанный выше IFN--связывающий белок массой 40000Да (здесь далее "IFNAB-BP" или "IFNAB-BPII"), полученный из мочи в гомогенном состоянии и обладающий последовательностью, которая отлична от таковой любого другого известного белка. IFNAB-BP связывается с и блокирует активность множества подтипов IFN-, равно как и IFN-. В публикации ЕР №676413 описаны клонирование и секвенирование двух молекул кДНК, кодирующих предшественники IFNAB-BP. Обе молекулы, возможно, являются продуктами одного гена, например, в результате альтернативного сплайсинга. Также описана продукция двух рекомбинантных белков, обозначаемых как IFNAB-BPI и IFNAB-BPII, в клетках млекопитающих и других организмов-хозяев. Также описаны поликлональные и моноклональные антитела против IFNAB-BP и применимые для блокирования рецептора IFN для иммунологических анализов и иммунологической очистки IFNAB-BPI и IFNAB-BPII. В настоящем изобретении описаны две группы нейтрализующих антител, индуцированных против IFNAB-BPII, которые связываются с рецептором интерферона I типа на человеческих клетках, Антитела одной группы способны блокировать активность различных подтипов интерферона- в человеческих клетках без влияния на активность интерферона-. Таким образом, указанные антитела одной группы способны ингибировать нежелательные эффекты IFN- при очень небольшом воздействии на активность IFN-. Предпосылки изобретения. Интерфероны I типа (IFN) (IFN-, IFN- и IFN ) составляют семейство структурно родственных цитокинов, обычно определяемых по их способности обеспечивать сопротивляемость вирусным инфекциям. Сообщалось о множестве других биологических активностей IFN I типа, включая ингибирование клеточной пролиферации, индукции антигенов МНС I класса и некоторые другие иммунорегуляторные активности (1). IFN- и IFN- являются применимыми для лечения некоторых вирусных заболеваний, включая гепатит С (2, 3) и обыкновенных бородавок (4, 5), равно как и определенных злокачественных опухолей, таких как лейкозный ретикулоэндотелиоз (6), хронический миелолейкоз (7) и саркома Капоши (8). IFN- определяли в образцах сыворотки различных пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка (9), равно как и пациентов, страдающих ВИЧ-инфекцией (10). IFN- вовлечен в процесс развития юношеского диабета (11). Далее, было показано, что в некоторых случаях терапия при помощи IFN- приводит к нежелательным побочным эффектам, включая лихорадку и неврологические расстройства (12). Следовательно, существуют патологические состояния, при которых нейтрализация активности IFN- может являться желательной для пациента. Как и в случае других цитокинов, IFN- оказывает свои биологические эффекты посредством связывания с рецептором на поверхности клетки, который является специфичным для всех подтипов IFN-, равно как и IFN- (13). Человеческий рецептор IFN- (IFNAR) идентифицировали и клонировали на клетках Daudi (14). Клонированный рецептор состоит из одного трансмембранного домена, внеклеточного и внутриклеточного доменов. Будучи экспрессирован на мышиных клетках, данный рецептор определяет реактивность по отношению к человеческому IFN-Β, но не значительно определяет реактивность по отношению к другим видам IFN- и IFN-, указывая на то, что в формирование ответа на IFN- и на различные виды IFN- могут быть вовлечены дополнительные компоненты. Некоторые другие исследования указывают на то, что в процесс связывания IFN- и IFN- вовле 5 76396 6 чены дополнительные компоненты или субъедипродуцируемые такими трансформированными ницы рецептора (15-17). Однако, сообщалось, что организмами-хозяевами. Термин "молекулы ДНК" включает в себя геномную ДНК, кДНК, синтетичесв процесс связывания всех видов IFN- и IFN- кую ДНК и их комбинации. (18) вовлечен ранее описанный рецептор (14). Данное изобретение также относится к молеДействительно, недавно был идентифицирован и кулам ДНК, которые гибридизуются в строго опреклонирован второй рецепторный компонент, так деленных условиях с указанными выше молекуназываемый рецептор IFN-/ (публикация ЕР лами ДНК и кодируют последовательность белков, №676413 и ссылка 19). Авторами настоящей заявобладающих такой же биологической активноски было продемонстрировано, что рецептор IFNтью, что и моноклональные антитела и гуманизи/, внеклеточный домен которого обладает той рованные моноклональные антитела против рецеже последовательностью, что и IFNAB-BPI, предптора IFN-/, IFNAB-BPI и IFNAB-BPII. ставляет собой основной лиганд-связывающий Настоящее изобретение также обеспечивает компонент рецептора интерферона I типа. Более способы получения клеток-хозяев, способных того, рецептор интерферона-/ и IFNAR проявпродуцировать функциональные моноклональные ляют кооперативность связывания лиганда и обантитела и гуманизированные моноклональные разуют тройной комплекс с интерферонами I типа антитела против рецептора IFN-/, IFNAB-BPI и на клеточной поверхности (20). IFNAB-BPII. Моноклональные антитела, направленные Моноклональные антитела по настоящему против IFNAR и способные блокировать активизобретению ингибируют биологическую активность интерферонов I типа неизбирательным обность человеческого интерферона- в человечесразом были описаны ранее (21). Было описано ких клетках без воздействия на биологическую другое моноклональное антитело против неидентифицированного рецеторного компонента. Данактивность человеческого интерферона-. Биолоное антитело блокировало активность интерфегическую активность определяли путем количестронов I типа неизбирательным образом (22). венной оценки ингибирующего эффекта антитела Настоящее изобретение обеспечивает монокпри тестировании методом анализа ингибирования цитопатического эффекта с применением челональные антитела против рецептора IFN-/, ловеческих клеток WISH и вируса везикулярного который представляет собой обычный рецептор стоматита. IFN- и IFN-. Данные антитела связываются с В соответствии с заявкой на патент Израиля некоторыми формами рецептора, которые либо №106591, IFN-/-связывающий белок, обладаюэкспрессируются на человеческих клетках, либо щий молекулярной массой 40000кДа, (IFNAB-BP) существуют в виде растворимых форм IFNAB-BPI выделяли из обычной мочи в две хроматографии IFNAB-BPII. Были выработаны два типа нейтраческие стадии. Неочищенные белки мочи наносилизующих моноклональных антител. Высокий титр ли на колонку, состоящую из IFN-2, пришитого к антител одного типа наблюдается при применении для блокирования противовирусной активносагарозе. Колонку промывали в целях удаления неинтересующих белков, а связанные белки затем ти как IFN-, так и IFN-. Высокий блокирующий смывали при низких значениях рН. Смытые белки титр антител второго типа неожиданно наблюдаезатем разрешали с помощью ЖХВР с разделенится только в связи с противовирусной активностью ем по размеру (размероспецифичной ЖХВР) с IFN- при очень низком титре, связанном с активвыходом нескольких белковых фракций, одна из ностью IFN-. Таким образом, неожиданный втокоторых характеризовалась своей способностью рой тип моноклональных антител может быть специфично взаимодействовать с 125I-IFN-2 и применен в определенном интервале концентраблокировать противовирусную активность IFN- и ций для избирательного блокирования активности IFN-. Данный белок был далее охарактеризован с IFN-, тогда как активность IFN- изменяться не помощью анализа N-концевой микропоследоватебудет. льности. Полученную последовательность сравНастоящее изобретение также обеспечивает нили с и нашли отличной от таковой известного гуманизированные моноклональные антитела рецептора IFNAR (14). Она также отличалась от против рецептора IFN-/, экспрессированного на таковой любого другого известного белка, и она не человеческих клетках, IFNAB-BPI и IFNAB-BPII. кодировалась ни одной из известных последоваГуманизированные моноклональные антитела тельностей ДНК, что определяли путем ее сравпредставляют собой гибридные молекулы мышинения с вводами банков, данных Swissprot и ных и человеческих антител, в которых вариабеGenebaiik с применением программы FastA (23). льные домены происходят из мышиных антител, Гомогенные препараты IFNAB-BP, выделеннотогда как постоянные домены происходят из челого из мочи, применяли в качестве иммуногена для веческих антител. получения антител. Настоящее изобретение также обеспечивает Подразумевается, что термин "антитело" молекулы ДНК, кодирующие моноклональные анвключает в себя поликлональные антитела, монотитела и гуманизированные моноклональные анклональные антитела (МАТ), химерные антитела, титела против рецептора IFN-/, IFNAB-BPI и антиидиотипические (анти-Id) антитела к антитеIFNFB-BPII. лам, которые могут быть помечены в растворимой Данное изобретение далее обеспечивает репили связанной формах, равно как и их активные лицируемые экспрессирующие векторы, содеручастки, полученные в соответствии с любой изжащие указанные молекулы ДНК, трансформировестной методикой, такой как, но не ограничиваванные ими организмы-хозяева и белки, 7 76396 8 ясь, ферментативное расщепление, пептидный Antibodies: A Laboratory Manual, supra]. Данные синтез или рекомбинантные методики. ссылки включены сюда целиком в качестве ссылПоликлональные антитела представляют соки. бой гетерогенные популяции молекул антител, Антиидиотипическое (анти-Id) антитело предполученные из сыворотки животных, иммунизироставляет собой антитело, которое распознает ванных антигеном. Моноклональное антитело соспецифичные детерминанты, как правило, ассодержит, по существу, гомогенную популяцию анциированные с антигенсвязывающим сайтом антител, специфичных к антигенам, причем данная титела. Анти-Id антитело может быть получено популяция содержит, по существу, идентичные путем иммунизации животного одинакового вида и эпитопсвязывающие сайты. МАТ могут быть полугенотипа как источника МАТ (например, линии чены в соответствии с методиками, известными мышей) МАТ, на которое получают анти-Id. В орспециалистам в данной области. [Смотри, наприганизме иммунизированного животного будут промер, Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975); исходить распознавание и ответ на идиотипичесПатент США №4376110; Ausubel et al., eds., кие детерминанты иммунизирующего антитела в Current Protocols in Molecular Biology, Greene виде выработки антител на данные идиотипичесPublishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., кие детерминанты (анти-Id антитело). Смотри, (1987-1996); Harlow and Lane, Antibodies: A например, патент США №4699880, который вклюLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory чен здесь целиком в качестве ссылки. (1988); и Colligan et al., eds., Current Protocols in Анти-Id антитело может быть также применеImmunology, Greene PublishingAssoc. and Wiley но в качестве "иммуногена" для индукции иммунInterscience, N.Y., (1992-1996), причем содержание ного ответа еще в одном животном с получением данных ссылок приводится здесь целиком в качетак называемого анти-анти-Id антитела. Анти-Id стве ссылки]. Такие антитела могут являться имантитело может обладать идентичными эпитопамуноглобулинами любого класса, включая IgG, ми с исходным МАТ, которое индуцировало выраIgM, IgE, IgA, GILD и любой их подкласс. Гибридоботку анти-Id. Таким образом, с помощью примема, продуцирующая МАТ по настоящему изобренения антител к идиотипическим детерминантам тению, может быть выращена in vitro, in situ или in МАТ можно идентифицировать другие клоны, эксvivo. Продукция более высоких титров MAT in vivo прессирующие антитела идентичной специфичноили in situ делает данные методики предпочтитести. льным в настоящее время способом продукции. Соответственно, МАТ, выработанные против Химерные антитела представляют собой моIFNAB-BPI, IFNAB-ВРІІ и родственных белков по лекулы, различные части которых происходят от настоящему изобретению, могут быть применены животных разных видов, как, например, молекулы, для индукции анти-Id антител в подходящих живосодержащие вариабельный участок, происходятных, таких как мыши BALB/c. Спленоциты таких щий из мышиного МАТ, и постоянный участок чеиммунизированных мышей применяют для создаловеческого иммуноглобулина. Химерные антитения анти-Id гибридом, секретирующих анти-Id ла исходно применяли для снижения МАТ. Далее, анти-Id МАТ могут быть прикреплены иммуногенности в применении и для повышения к носителю, такому как гемоцианин keyhole limpet объема продукции, например, если мышиные МАТ (KLH), и применены для иммунизации дополнитепродуцируются гибридомами с более высоким льных мышей BALB/c. Сыворотка данных мышей выходом, но с более высокой иммуногенностью у будет содержать анти-Id антитела, которые облалюдей, такие как человеческие/мышиные, примедают параметрами связывания исходных МАТ, няют химерные МАТ. Химерные антитела и споспецифичных к IFNAB-BPI или IFNAB-BPII. собы их продукции известны в данной области Таким образом, анти-Id МАТ содержат собст[Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273венные идиотипические эпитопы, или "идиотопы", 3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. структурно сходные с эпитопом, подвергающимся USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature оценке, таким как IFNAB-BPI или IFNAB-BPII. 312:643-646 (1984); Cabilly et al., заявка на ЕвроТакже подразумевается, что термин "антитепейский патент 125023 (опубликованная 14 ноября ло" включает как интактные молекулы, так и их 1984 года); Neuberger et al., Nature 314:268-270 активные участки, такие как, например, Fab и (1985); Taniguchi et al., заявка на Европейский паF(ab')2, которые способны связывать антиген. Fabтент 171496 (опубликованная 19 февраля 1985 и F(ab')2-фрагменты не содержат Fc-фрагмента года); Morrison et al., заявка на Европейский паинтактного антитела, быстрее выводятся из циртент 173494 (опубликованная 5 марта 1986 года); куляции и могут в меньшем объеме осуществлять Neuberger et al., заявка по РСТ WO 8601533 (опунеспецифическое связывание с тканями по сравбликованная 13 марта 1986 года); Kudo et al., заянению с ин-тактным антителом [Wahl et al., J.. вка на Европейский патент 184187 (опубликованNucl. Med. 24:316-325 (1983)]. ная 11 июня 1986 года); Morrison et al., заявка на Было бы чрезвычайно полезно, если бы Fab- и Европейский патент 173494 (опубликованная 5 F(ab')2- и другие фрагменты антител, применимые марта 1986 года); Sahagan et al., J. Immunol. по настоящему изобретению, могли быть приме137:1066-1074 (1986); Robinson et al., публикация нены для избирательного блокирования биологиМеждународного патента, WO 9702671 (опубликоческой активности IFN- в соответствии с методиванная 7 мая 1987 года); Liu et al., Proc. Natl. Acad. ками, описанными здесь для интактных молекул Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. антител. Такие фрагменты обычно получают пуAcad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., тем протеолитического расщепления, применяя Science 240:1041-1043 (1988); и Harlow and Lane, ферменты, такие как папаин (для получения Fab 9 76396 10 фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2биотикам, или невосприимчивость к тяжелым мефрагментов). таллам, таким как медь, или тому подобное. ИзбОб антителе говорят, что оно "способно свяранный маркерный ген может быть либо непосзывать" молекулу, если оно способно специфично редственно пришит к последовательностям ДНК взаимодействовать с молекулой, посредством генов, подлежащих экспрессии, или введен в ту же чего молекула связывается с антителом. Подраклетку по методу котрансфекции. Дополнительные зумевается, что термин "эпитоп" относится к той элементы могут также быть необходимыми для части любой молекулы, способной к связыванию с оптимального синтеза одноцепочечной мРНК антителом, которая также может быть распознана binding protein. Данные элементы могут включать в данным антителом. Эпитопы или "антигенные десебя сплайсинг-сигналы, равно как и промоторы, терминанты" обычно состоят из химически активэнхансеры транскрипции и сигналы терминации ных поверхностных группировок молекул, таких (24). как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и В целях экспрессии указанных антител, их акобладают специфичными трехмерными структуртивных участков или производных молекула ДНК, ными характеристиками, равно как и специфичподлежащая введению в выбранные клетки, предными зарядовыми характеристиками. почтительно, будет включена в плазмиду или ви"Антиген" представляет собой молекулу или русный вектор, способный к автономной репликачасть молекулы, способную к связыванию с антиции в хозяине-реципиент. телом, которое к тому же способно индуцировать Представляющие важность факторы в выборе ответ иммунной системы животного в виде продуконкретной плазмиды или вирусного вектора цирования антитела, способного связываться с включают в себя: простоту, с которой клеткиэпитопом данного антигена. Антиген может содереципиенты, которые содержат вектор, могут быть ржать один или несколько эпитопов. Подразумераспознаны и выделены из тех клетоквается, что специфичная реакция, относящаяся к реципиентов, которые не содержат вектор; число указанному выше, указывает на то, что антиген копий вектора, которое желательно внести в будет высоко избирательно взаимодействовать с определенного хозяина; и является ли желаемым соответствующим ему антителом и не будет взаи"переносить" вектор между клетками-хозяевами модействовать с множеством других антител, выразличных видов. Предпочтительные прокариотиработка которых может быть индуцирована друческие векторы включают плазмиды, такие как гими антигенами. реплицируемые в Е. coli, например, pBR322, Антитела, включая фрагменты антител, приColE1, pSC101, pACYC 184 и т.д. (25); плазмиды менимые по настоящему изобретению, могут быть Bacillus, такие как рС194, рС221, рТ127 и т.д. (26); применены для блокирования биологической акплазмиды Streptomyces, включая рІJ101 (27), бактериофаги Streptomyces, такие как IC31 (28) и плативности подтипов IFN- с оказанием незначитезмиды Pseudomonas (29, 30). льного влияния на активность интеферона-. Предпочтительные эукариотические плазмиНастоящее изобретение также обеспечивает ды включают BPV, вирус коровьей оспы, SV40, 2молекулы ДНК, кодирующие последовательность микронное кольцо и т.д. или их производные. Талюбого из антител по настоящему изобретению, кие плазмиды хорошо известны в данной области которые определены выше, реплицмруемые эксп(31-35). рессирующие векторы, содержащие любые из Как только вектор или последовательность таких молекул ДНК, клетки-хозяева, трансформиДНК, содержащая мотив(ы) подготавливают к эксрованные любыми из таких зкспрессирующих векпрессии, экспрессирующий вектор может быть торов, включая прокариотические и эукариотичесвведен в подходящую клетку-хозяин посредством кие клетки-хозяева. любого из множества методов, таких как трансфоДанное изобретение далее относится к активрмация, трансфекция, липофекция, конъюгация, ным мутеинам и активным участкам указанных слияние протопластов, злектропорирование, каантител и к гибридным белкам, состоящим из анльцийфосфатная преципитация, прямая микроинтител дикого типа, или их активных мутеинов или ъекция и т.д. их активных участков, конденсированных с другим Клетки-хозяева, применимые по данному изополипептидом или белком и проявляющих сходбретению, могут являться либо прокариотическиную способность блокировать биологическую акми, либо эукариотическими. Предпочтительные тивность IFB I типа. прокариотические хозяева включают бактерии, ДНК, кодирующую последовательности укатакие как Е. coli, Bacillus, Streptomyces, занных антител, их активных участков, мутеинов Pseudomonas, Salmonella, Serratia и т.д. Наиболее или гибридных белков, и оперативно пришитые предпочтительным прокариотическим хозяином регуляторные сигналы транскрипции и трансляявляется Е. coli. Особенно интересующие бактеции, вносят в эукариотические векторы, которые риальные хозяева включают штамм 294 Е. coli K12 способны интегрировать последовательность же(АТСС 31446), Е. coli Х1776 (АТСС 31537), Е. coli лаемого гена в хромосому клетки-хозяина. В цеW3110 (F-,  , прототрофная (АТСС 27325)) и друлях выбора клеток, которые устойчиво интегриругие энтеробактерии, такие как Salmonella ют внесенную ДНК в свои хромосомы, применяют Typhimurium или Serratia marcescens и различные один или несколько маркеров, которые позволяют виды Pseudomonas. В таких условиях белок наховыбирать клетки-хозяева, которые содержат экспдится в негликозилированном состоянии. Прокарессирующий вектор. Маркер может обеспечить риотический хозяин должен быть совместим с прототрофность для ауксотрофного хозяина, непоследовательностью репликона и контрольной восприимчивость к биоцидам, например, к анти 11 76396 12 последовательностью в экспрессирующей плазобладает ли любой данный мутеин той же активмиде. ностью, что и указанное антитело, поскольку муПредпочтительными эукариотическими хозяетеин, который блокирует эффект любого вида инвами являются клетки млекопитающих, например, терферона I типа, в достаточной мере сохраняет человеческие, обезьяньи, мышиные клетки и яйактивность указанных антител и, таким образом, цеклетки китайского хомячка (СНО), поскольку они обладает, по крайней мере, одним из описанных обеспечивают посттрансляционные модификации применений указанных антител и, таким образом, белковых молекул, включая адекватное упорядообладает активностью, по существу, идентичной чивание, адекватное образование дисульфидных таковой указанных антител. связей, равно как и гликозилирование по адекватВ предпочтительном осуществлении любой ным сайтам. Также посттрансляционные модифитакой мутеин обладает идентичностью или гомокации пептидов, включая гликозилирование больлогией с последовательностью одного из указаншим количеством остатков маннозы, могут ных антител, составляющей, по крайней мере, проводить клетки дрожжей и клетки насекомых. 40%. Более предпочтительно, он обладает иденСуществует ряд стратегий экспрессии рекомбинатичностью или гомологией с ней, составляющей, нтной ДНК, где применяются высокопродуктивные по крайней мере, 50%, по крайней мере, 60%, по промоторные последовательности и большое кокрайней мере, 70%, по крайней мере, 80%, или, личество копий плазмид, которые могут быть приболее предпочтительно, по крайней мере, 90%. менены для получения желаемых белков в дрожМутeины указанных антител или их активных жевых клетках и в клетках насекомых. В участков, которые могут быть применены по надрожжевых клетках происходит распознавание стоящему изобретению, или кодирующая их послидерных последовательностей клонированных ледовательность нуклеиновая кислота, включают продуктов генов млекопитающего и секреция пепограниченный набор существенно соответствуютидов, несущих лидерные последовательности. щих друг другу последовательностей, как, наприПосле внесения вектора клетки-хозяева культивимер, замещающие пептиды или полинуклеотиды, руют в селективной среде, которая направляет которые могут быть традиционно получены сперост векторсодержащих клеток. Экспрессия клоциалистом в данной области без постановки канируемой(ых) последовательности(ей) генов приких-либо обширных экспериментов, основываясь водит к продукции указанных антител, гибридных на учениях и руководствах, представленных белков или мутеинов или их активных участков. здесь. Подробное описание белковой химии и Экспрессированные антитела затем выделяют и структуры смотри в [Schulz, G.E. et al., Principles of очищают в соответствии с любой традиционной Protein Structure, Springer-Verlag, New York, 1978; и методикой, включая экстракцию, осаждение, хроCreighton Т.Е., Proteins: Structure and Molecular матографию, электрофорез и тому подобное, или Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, по методу аффинной хроматографии. 1983], которые включены здесь в качестве ссылки. Как здесь используется, термин "мутеины" отПредставление замен в нуклеотидных последованосится к аналогам указанных антител, в которых тельностях, таких как предпочтения кодонов, смоодин или несколько аминокислотных остатков укатри в [Ausubel et al., supra, в §§ Α. 1.1-А. 1.24, и занных антител или их активных участков замеSambrook et al., supra, в Приложениях С и D]. щены различными аминокислотными остатками Предпочтительными изменениями мутеинов или удалены, или один или несколько аминокиспо настоящему изобретению являются таковые, лотных остатков добавлены к исходной последоизвестные как "консервативные" замены. Консервательности указанных антител, без существенновативные аминокислотные замены в указанных го изменения активности полученных продуктов по антителах, полипептидах или белках или их актисравнению с антителами дикого типа или их активных участках могут включать в себя синонимичвными участками. Данные мутеины получают в ные аминокислоты в пределах группы, которая соответствии с известными методиками синтеза обладает существенно сходными физикои/или сайт-специфического мутагенезаили в соохимическими свойствами, так что при замене метветствии с любой другой методикой, подходящей жду членами группы биологическая функция модля данных целей. лекулы сохранится, [Grantham, Science, Vol. 185, Любой такой мутеин обладает последоватеpp.862-864 (1)]. Понятно, что вставки и делеции льностью аминокислот, существенно дублируюаминокислот также могут быть выполнены и в укащей таковую указанных антител с тем, чтобы обзанных выше последовательностях без какоголадать активностью, по существу, идентичной либо изменения их функции, особенно, если встатаковой указанных антител или их активных участвки и делеции затрагивают лишь несколько амиков. Одна группа указанных антител способна нокислот, например, до тридцати, и более предблокировать противовирусную активность человепочтительно, до десяти, и если не удалены или не замещены аминокислоты, которые обладают ческого IFN-2 и человеческого IFN-. Другая групринципиальным значением для образования фуппа указан-ных антител способна блокировать нкциональной конформации, например, цистеинопротивовирусную активность человеческого IFNвые остатки, [Anfines, "Principles That Govern The 2, тогда как активность человеческого IFN- осFolding of Protein Chains", Science, Vol.181, pp.223тается, по большей части, неизменной. Таким об230 (1973)]. Белки и мутеины, полученные в реразом, с помощью постановки традиционных эксзультате таких делеции и/или вставок входят в периментов, заключающихся в подвергании такого сферу настоящего изобретения. мутеина, например, обычному анализу противоПредпочтительно, синонимичные аминокисловирусной активности, может быть определено, 13 76396 14 тные группы представляют собой таковые, определенные в Таблице I. Более предпочтительно, Таблица III синонимичные аминокислотные группы представляют собой таковые, определенные в Таблице II; и Наиболее предпочтительные группы синонимичнаиболее предпочтительно, синонимичные аминоных аминокислот кислотные группы представляют собой таковые, определенные в Таблице III. Аминокислота Синонимичная группа Ser Ser Таблица I Arg Arg Leu Leu, lle, Met Предпочтительные группы синонимичных аминоPro Pro кислот Thr Thr Ala Ala Аминокислота Синонимичная группа Val Val Ser Ser, Thr, Gly, Asn Gly Gly Arg Arg, Gin, Lys, Glu, His lle lle, Met, Leu Leu lle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Phe Phe Pro Gly, Ala, Thr, Pro Tyr Tyr Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, GIn, Thr Cys Cys, Ser Ala Gly, Thr, Pro, Ala His His Val Met, Tyr, Phe, lle, Leu, Val Gln Gln Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Asn Asn lle Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lle Lys Lys Phe Trp, Met, Tyr, lle, Val, Leu, Phe Asp Asp Tyr Trp, Met, Phe, lle, Val, Leu, Tyr Glu Glu Cys Ser, Thr, Cys Met Met, lle, Leu His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Trp Met Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Примеры выполнения замен аминокислот в Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys белках, которые могут быть применены для полуAsp Glu, Asn, Asp чения мутеинов указанных антител или их активGlu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu ных участков для применения по настоящему изоMet Phe, lle, Val, Leu, Met бретению включают любые известные стадии Trp Trp методики, такие как представленные в патентах США RE33653, 4959314, 4588585 и 4737462, выТаблица II данных Mark et al.; 5116943, выданном Koths et al.; 4965195, выданном Namen et al.; 4879111, выданБолее предпочтительные группы синонимичных ном Chong et al.; и 5017691, выданном Lee et al.; и аминокислот лизин-замещенных белках, представленных в патенте США №4904584 (Shaw et al.). В другом предпочтительном осуществлении Аминокислота Синонимичная группа настоящего, изобретения любой мутеин указанSer Ser ных антител или их активных участков обладает Arg His, Lys, Arg аминокислотной последовательностью сущестLeu Leu, lle, Phe, Met венно соответствующей таковой указанных·, антиPro Ala, Pro тел. Подразумевается, что термин "существенно Thr Thr соответствующий" охватывает белки с минимальAla Pro, Ala ными изменениями, внесенными в структуру приVal Val, Met, He родного белка, которые не влияют на основные Gly Gly характеристики природных белков, особенно когда lle lle, Met, Phe, Val, Leu речь идет об их способности полностью или избиPhe Met, Tyr, lle, Leu, Phe рательно блокировать активность IFN- и IFN-. Tyr Phe, Tyr Тип изменений, которые как правило, считают поCys Cys, Ser дпадающими под определение "существенно сооHis His, Gln, Arg тветствующий", представляет собой изменения, Gln Glu, Gln, His которые являются результатом применения траAsn Asp, Asn диционных методик мутагенеза ДНК, кодирующей Lys Lys, Arg последовательности данных антител, приводящеAsp Asp, Asn го к возникновению нескольких минимальных моGlu Glu, Gln дификаций, и скрининга на предмет желаемой Met Met, Phe, lle, Val, Leu активности обсуждавшимся выше способом. Trp Trp Мутеины по настоящему изобретению включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которую гибридизуют с ДНК или РНК, которая кодирует последователь 15 76396 16 ность указанных антител по настоящему изобресутствуют в качестве боковых цепей остатков или тению, в строго определенных условиях. Данное N- или С-концевых групп, известными в данной изобретение также включает такую нуклеиновую области способами, и функциональные производкислоту, которая также применима в качестве зонные включаются в область данного, изобретения, да для идентификации и очистки желаемой нуклепоскольку они остаются фармацевтически примеиновой кислоты. Кроме того, такая нуклеиновая нимыми, т.е. они не нарушают активность белка, кислота будет представлять собой главную канкоторая существенно сходна с активностью укадидатуру на определение, кодирует ли она послезанных антител, и не придают токсичных свойств довательность полипептида, который сохраняет содержащим их композициям. Данные композиции функциональную активность указанных антител по могут, например, содержать полиэтиленгликоленастоящему изобретению. Термин "строго опревые боковые цепи, которые способны маскировать деленные условия" относится к условиям гибриантигенные сайты и продлевать время циркуляции дизации и последующей промывки, которые спеуказанных антител или их активных участков в циалисты в данной области обычно называют жидкостях организма. Другие производные вклю"строгими". Смотри [Ausubel et al., Current чают алифатические эфиры карбоксильных групп, Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, амиды карбоксильных групп, образованные путем NY, §§ 6.3 и 6.4 (1987, 1992) и Sambrook et al., реакции с аммиаком или с первичными или вториsupra]. Без какого-либо ограничения примеры чными аминами, N-ацильные производные свобострого определенных условий включают в себя дных аминогрупп аминокислотных остатков, обраусловия промывки при температуре на 12-20°С зованные с ацильными радикалами (например, ниже рассчитанной для исследуемого гибрида ΤПЛ, алканоильные или карбоциклические ароильные например, в 2*SSC и 0,5% SDS в течение 5 минут, группы), или О-ацильные производные свободных 2*SSC и 0,1% SDS в течение 15 минут; 0,1*SSC и гидроксильных групп (например, таковых сериль0,5% SDS при 37°С в течение 30-60 минут и затем ных и треонильных остатков), образованные с 0,1*SSC и 0,5% SDS при 68°С в течение 30-60 ацильными радикалами. минут. Специалистам в данной области понятно, Под "активными участками" указанных античто строго определенные условия также зависят тел, мутеинов и гибридных белков в настоящем от длины последовательностей ДНК, олигонуклеоизобретении имеются в виду любой фрагмент или тидных зондов (таких как длиной в 10-40 основапредшественники полипептидной цепи указанных ний) или смешанных олигонуклеотидных зондов. антител, самих по себе или совместно с ассоцииПри применении смешанных зондов предпочтитерованными молекулами или присоединенными к льным является использование вместо SSC хлоним остатками, например, углеводными или фосрида тетраметиламмония (ТМАС). Смотри фатными остатками, или агрегаты любого из укаAusubel, supra. занных выше антител при условии, что указанный Термин "гибридный белок" относится к полиучасток обладает существенно сходной активноспептиду, содержащему указанные антитела или их тью с таковой указанных антител. активные участки или их мутеины, конденсироНастоящее изобретение далее относится к ванному с другим белком, который, например, фармацевтическим композициям, содержащим обладает продолжительным временем циркуляфармацевтически приемлемый носитель и укации в жидкостях организма. Указанные антитела занное антитело по данному изобретению или их или их активные участки могут быть гибридизоваактивные мутеины, гибридные белки и их соли, ны с другим белком, полипептидом и т.п. функциональные производные или их активные Термин "соли" здесь относится как к солям каучастки. рбоксильных групп, так и к солям добавления кисФармацевтические композиции по данному лот аминогрупп указанных антител, их активных изобретению получают для введения путем смеучастков, мутеинов или их гибридных белков. Сошивания указанных антител или их производных с ли карбоксильной группы могут образовываться физиологически приемлемыми носителями и/или известным в данной области образом и включают стабилизаторами и/или наполнителями и готовят в себя неорганические соли, например, соли нав дозированной форме, например, путем лиофитрия, кальция, аммония, железа (III) или цинка и лизации в дозировочных сосудах. Способ введет.п., и соли органических оснований, как, наприния может представлять собой любой из общепмер, соли, образованные с аминами, такими как ринятых способов введения подобных средств и триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, будет зависеть от подвергающегося лечению соспрокаин и т.п. Соли добавления кислот включают тояния, например, внутривенно, внутримышечно, в себя, например, соли минеральных кислот, таких подкожно, с помощью местной инъекции или мескак, например, соляная кислота или серная кислотного нанесения, или путем непрерывной инфузии та, и соли органических кислот, таких как, наприи т.д. Количество вводимого активного соединемер, уксусная кислота или щавелевая кислота. ния будет зависеть от способа введения, подверРазумеется, любые такие соли должны обладать гающегося лечению заболевания и состояния пасущественно сходной активностью с таковой укациента. При местной инъекции, например, занных антител или их активных участков. требуется меньшее количество белка на массу Термин "функциональные производные", как тела, чем требуется при внутривенной инфузии. здесь используется, охватывает производные укаУказанные антитела применимы для модулизанных антител или их активных участков и их рования или блокирования биологической активмутеинов и гибридных белков, которые могут быть ности различных подтипов IFN-, например, при получены из функциональных групп, которые присахарном диабете I типа, различных аутоиммун 17 76396 18 ных заболеваниях, отторжении трансплантата, 15% лошадиную сыворотку. ВИЧ-инфекции и сходных заболеваниях, при котоПример 2: Скрининг гибридом и характеризация моноклональных антител. рых имеет место нарушенная экспрессия IFN-, Скрининг гибридом, продуцирующих антит.е. указанные антитела могут быть применены IFNAB-BP моноклональ-ные антитела, проводили при любом состоянии, при котором избыток IFN- следующим образом: Супернатанты гибридом эндогенно продуцируется или вводится извне. тестировали на предмет наличия анти-IFNAB-BP Соответственно, указанные антитела, гуманиантител по методу инвертированного твердофаззированные антитела, их активные участки, мутеного радиоиммунного анализа (IsRIA) следующим ины, гибридные белки и их соли, функциональные образом. Планшеты для микротитрования, изготопроизводные и их активные участки предназначевленные из ПВХ, (Dynatech Laboratories, ны для лечения аутоиммунных заболеваний, друAlexagdria, VA) покрывали афинными очищенными гих воспалительных состояний в организме млекозьими анти-мышиными сывороточными F(ab)2 копитающих, для лечения токсических состояний, антителами (Jackson Labs, USA) (10мкг/мл, вызванных введением интерферона-альфа или 100мкл/лунка). После инкубации при 4°С в течеинтерферона-бета, юношеского диабета, системние ночи планшеты промывали дважды ФБР, соной красной волчанки и ВИЧ-инфекции. держащим БСА (0,5%) и Tween 20 (0,05%) и блоТеперь данное изобретение будет проиллюскировали в промывающем растворе в течение, по трировано следующими неограничивающими крайней мере, 2ч при 37°С. Добавляли культурапримерами: льные супернатанты гибридом (100мкл/лунка) и Пример 1: Иммунизация мышей IFNAB-BP и планшеты инкубировали в течение 4ч при 37°С. слияние с миеломными клетками. Планшеты промывали 3 раза промывным раствоСначала самкам мышей Ваlb/С (в возрасте 3 ром, и добавляли для дальнейшей инкубации 125Iмесяцев) вводили 2мкг очищенного IFNAB-BP в IFNAB-BP (100мкл, 105 срm) в течение 16 часов эмульсии на основе полного адъюванта Фройнда, при 4°С. Планшеты промывали 3 раза и отдельа через три недели подкожно в неполном адъюваные лунки выделяли и анализировали с помощью нте Фройнда. Пять дополнительных инъекций гамма-счетчика. Образцы, в которых подсчет давводили с 10-суточным интервалом подкожно в вал результат, по крайней мере, в 5 раз превыФБР. Сыворотки данных мышей имели титр свяшающий значение, полученное на отрицательном зывания 1:100000, что определяли по методу контроле, расценивали как давшие положительIsRIA (смотри ниже). Антисыворотки блокировали ный результат (Таблица IV). Все положительные противовирусную активность как IFN-, так и IFNклоны отбирали и субклонировали. Отдельные , что определяли в соответствии со следующей субклоны вводили мышам Balb/C, у которых с попроцедурой: Предварительно образованные момощью pristane стимулировали выработку асцитинослои человеческих клеток WISH в 96-луночных ческой жидкости. Иммуноглобулины выделяли из планшетах инкубировали в течение 2ч при 37°С с асцитической жидкости путем осаждения сульфадвукратными разведениями антисыворотки (или том аммония (50% насыщения). Изотипы антител моноклональных антител). Затем во все лунки определяли с применением коммерчески доступдобавляли IFN-2 или IFN- (в конечной концентного набора для ELISA (Amersham, UK). рации 10ЕД/мл; калибровано относительно станРазличные моноклональные антитела, равно дартов NIH) и далее планшеты инкубировали в как и супернатанты гибридом, концентрированные течение 4ч. Затем клетки заражали вирусом везисупернатанты гибридом, асцитическая жидкость кулярного стоматита (VSV) и инкубировали в теили иммуноглобулины из асцитической жидкости чение ночи до тех пор, пока в контрольных лунках, далее тестировали на предмет их способности не содержащих IFN, не отмечался полный цитопаблокировать рецептор и препятствовать противотический эффект. За нейтрализующий титр антивирусной активности IFN-2 и IFN-, как описано тел в лунках, проявляющих 50% ЦПД, приняли выше применительно к сыворотке иммунизиро9единиц/мл. Следовательно, 1 блокирующая едиванных мышей. Результаты приведены в Таблице ница/мл представляет собой концентрацию антиIV. Таким образом, было обнаружено, что моноктел, необходимую для блокирования активности лональные антитела 16.3, 53.2 и 392.1 блокируют 1ЕД/мл IFN в данных условиях анализа. Сыворотпротивовирусную активность как IFN-2, так и IFNка иммунизированных мышей имела нейтрализу в сравнимых титрах, тогда как было неожиданно ющий титр 120000ЕД/мл как по IFN-2, так и по обнаружено, что титр моноклональных антител IFN-. 35.9, 51.44 и 234.14 против IFN-2 значительно Окончательные повторные иммунизации очивыше, чем их титр против IFN-. Таким образом, щенным IFNAB-BP проводили внутрибрюшинно за моноклинальные антитела 35.9, 51.44 и 234.14 4 и за 3 суток до слияния. Слияние проводили, могут быть применены в определенном интервале применяя в качестве участников слияния миеломконцентраций для избирательного блокирования ную клеточную линию NSO/1 и лимфоциты, полуактивности IFN-, тогда как активность lFN- заченные как из селезенки, так и из лимфатических тронута не будет. узлов иммунизированной мыши. Слитые клетки распределяли по 96-луночным планшетам и гибридомы отбирали в DMEM, содержащей HAT и 19 76396 20 Таблица IV Характеризация моноклональных антител против рецептора IFN-/ (IFNAB-BP) IsRIA (число импуль- Нейтрализующий сов в минуту) титр IFN-2 (ЕД/мл) 16.3 Супернатант гибридомы 39103 >5120 16.3 Асцитическая жидкость1 НО2 60000 35.9 Супернатант гибридомы 33100 1280 35.9 Асцитическая жидкость НО 60000 51.44 Супертнатант гибридомы 6345 1000 51.44 Ig (5мг/мл) НО 15000 53.2 Супернатант гибридомы 26737 2000 53.2 Асцитическая жидкость НО 120000 117.7 Супернатант гибридомы 38945 2000 117.7 Ig (10мг/мл) НО 28800000 234.14 Супернатант гибридомы 21812 >5120 234.14 Ig (10мг/мл) НО 1440000 392.1 Супернатант гибридомы 34390 2400 392.1 Асцитическая жидкость НО 160000 Антитело 1 2 Нейтрализующий титр IFN- (ЕД/мл) НО 60000 150 15000