Спосіб лікування болю із застосуванням анти-ngf антитіла

Реферат: Винахід стосується способу лікування болю, пов'язаного зі станом, який спричинюється підвищеною експресією фактора росту нервової тканини (NGF) або підвищеною чутливістю до NGF, що включає введення пацієнту фармацевтичної композиції, яка містить фармацевтично прийнятний носій та виділене антитіло, яке має легкий ланцюг, який включає послідовність SEQ ID NО: 44, та важкий ланцюг, який включає послідовність SEQ ID NО: 40. UA 102775 C2 (12) UA 102775 C2 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка претендує на пріоритет заявки на патент США № 12/576,522, поданої 9 жовтня 2009 року, яка частково продовжує заявку на патент США № 12/277,919, поданої 25 листопада 2008 року, яка є продовженням заявки на патент США № 10/891,658, поданої 15 липня 2004 року, і претендує на пріоритет попередньої заявки на патент США № 60/487,431, поданої 15 липня 2003 року. Ця заявка також стосується заявки на патент США № 11/767,326, поданої 22 червня 2007 року, яка є виділеною заявкою 10/891,658. Розкриття усіх згаданих заявок включено до цього опису шляхом посилання. Галузь, до якої належить винахід Цей винахід належить до людських моноклональних антитіл, які зв’язують фактор росту нервової тканини (NGF). Описуються також композиції та способи лікування болю та розладів, пов’язаних із болем. Передумови створення винаходу Кожного дня у Сполучених Штатах хронічний біль позбавляє працездатності більше двох мільйонів людей (Джессел (Jessell), Келлі (Kelly), 1991, “Pain and Analgesia” in PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, 3 видання, (редактори Кандел (Kandel), Шварц (Schwartz), Джессел (Jessell)), Elsevier, Нью-Йорк). На жаль, існуючі способи лікування болю мають лише часткову ефективність і багато з цих способів лікування самі по собі спричинюють ослаблення здоров’я або мають небезпечні побічні ефекти. Наприклад, незважаючи на те, що такі нестероїдні протизапальні лікарські засоби (“NSAIDs”) як аспірин, ібупрофен та індометацин, є помірно ефективними проти запального болю, вони також є нирковими токсинами, і високі дози цих засобів є спричиненням подразнення шлунково-кишкового тракту, виникнення виразок, кровотеч та появи сплутаності свідомості. Хворі, ліковані опіоїдами, також часто відчувають сплутаність свідомості, а тривале застосування опіоїдів пов’язується із звичністю та залежністю. Місцеві анестезуючі засоби, наприклад, лідокаїн та мексілетин, одночасно пригнічують біль і викликають втрату нормальної чутливості. Біль являє собою відчуття, основу якого становлять сигнали, які надходять із навколишнього середовища, а передаються і інтерпретуються нервовою системою (дивись Міллан (Millan), 1999, Prog. Neurobiol. 57:1-164). Шкідливі подразники, наприклад, тепло та торкання, примушують спеціалізовані чутливі нервові закінчення у шкірі надсилати сигнали до центральної нервової системи (“ЦНС”). Цей процес називають сприйняттям болю, а периферичні чутливі нейрони, що його опосередковують, носять назву ноці(ре)цепторів (больових рецепторів). У залежності від інтенсивності сигналу від ноціцептора(-ів) та виділення і обробки цього сигналу ЦНС, особа може сприйняти або може не сприйняти шкідливий подразник як больовий. Коли сприйняття болю особою відповідним чином співвідноситься з інтенсивністю подразника, біль виконує призначену йому захисну функцію. Однак пошкодження тканин певних типів викликає явище, відоме як гіпералгезія або підвищена больова чутливість, у разі якої відносно нешкідливі подразники сприймаються як сильно болючі, оскільки больовий поріг особи знизився. Гіпералгезія може викликатись як запальним пошкодженням, так і пошкодженням нервової тканини. Особи, уражені запальними станами, наприклад, сонячною еритемою, остеоартритом, колітом, кардитом, дерматитом, міозитом, невритом, дифузною хворобою сполучної тканини судин (яка включає ревматоїдний артрит і вовчак) тощо, часто відчувають посилене сприйняття болю. Подібним же чином травма, хірургічне втручання, ампутація, абсцес, каузалгія, дифузна хвороба сполучної тканини судин, демієлінізуюче захворювання, невралгія трійчастого нерва, рак, хронічний алкоголізм, інсульт, таламічний больовий синдром, діабет, герпетичні інфекції, синдром набутого імунодефіциту (“СНІД”), токсини та хіміотерапія спричиняють пошкодження нервової тканини, наслідком чого є надмірний біль. Оскільки механізми передачі ноціцепторами зовнішніх сигналів за нормальних та гіпералгетичних умов стають краще зрозумілими, на процеси, залучені до гіпералгезії, можна цілеспрямовано впливати для запобігання зниження больового порогу і, таким чином, зниження інтенсивності болю, що сприймається. "Було показано. що нейротрофні фактори відіграють значну роль у передачі фізіологічного та патологічного болю. Особливо важливим видається фактор росту нервової тканини (NGF) (дивись Макмагон (McMahon), 1996, Phil. Trans. R. Soc. Lond. 351:431-440; та Апфел (Apfel), 2000, The Clinical Journal of Pain 16:S7-S11). Було показано, що як місцеве, так і системне введення NGF викликає гіпералгезію і алодинію (Левін (Lewin) та інші, 1994, Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912). Внутрішньовенне вливання NGF викликає у людей міалгію усього тіла, у той час як місцеве введення, крім системних ефектів, спричинює гіпералгезію і алодинію на місці ін’єкції (Апфел (Apfel) та інші, 1998, Neurology 51:695-702). Значний обсяг даних вказує також на причетність ендогенного NGF до станів, головною особливістю яких є біль. Наприклад, 1 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 активація NGF спостерігається у шваннівських клітинах гангліїв задніх корінців головного мозку (DRG) протягом щонайменше 2 місяців після пошкодження периферичної нервової тканини. Повідомляли про підвищені рівні NGF у суглобах тварин, які страждають від різноманітних моделей артриту (наприклад, Алоу (Aloe) та інші, 1993, Growth Factors 9:149-155). Щодо людей, то рівні NGF підвищені у синовіальній рідині хворих на ревматоїдний артрит або артрити інших типів (наприклад, Алоу (Aloe) та інші, 1992, Arthritis and Rheumatism 35:351-355). Крім того, було показано, що антагонізм функції NGF запобігає виникненню гіпералгезії та алодинії, на моделях невропатичного та хронічного запального болю. Наприклад, на тваринних моделях невропатичного болю (наприклад, перев’язка нервового стовбура або спинномозкового нерва) системна ін’єкція NGF-нейтралізуючих антитіл запобігає виникненню як алодинії, так і гіпералгезії (Ремер (Ramer) та інші, 1999, Eur. J. Neurosci. 11:837-846; та Ро (Ro) та інші, 1999, Pain 79:265-274). Приклади анти-NGF антитіл, відомих у цій галузі, наведені, наприклад, у публікаціях WO 01/78698, WO 01/64247, WO 02/096458 та WO 2004/032870; патентах США № 5,844,092, № 5,877,016 та № 6,153,189; Хонго (Hongo) та інші, 2000, Hybridoma 19:215-227; Хонго (Hongo) та інші, 1993, Cell. Mol. Biol. 13:559-568; депонуваннях GenBank’у № U39608, № U39609, № L17078 або № L17077. Зрозуміло, що існує потреба у нових безпечних та ефективних способах лікування болю, зокрема, шляхом цільового впливу на медіатори або загострювачі болю невеликої молекулярної маси, наприклад, NGF. Короткий виклад суті винаходу Цей винахід пропонує нові людські моноклональні антитіла, які є терапевтично придатними для зняття болю. Зокрема, цей винахід пропонує моноклональні антитіла, які зв’язуються з фактором росту нервової тканини (NGF). За варіантом, якому віддають перевагу, згаданими моноклональними антитілами є людські моноклональні антитіла, які нейтралізують біологічні активності NGF і є придатними для поліпшення ефектів NGF-опосередкованих больових реакцій. Цим винаходом пропонуються також клітини, які продукують і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, секретують до культуральних середовищ моноклональні антитіла за цим винаходом. Крім їх застосування для лікування та зняття болю, антитіла за цим винаходом є придатними для лікування реакцій, пов’язаних з невропатичним та запальним болем. Цей винахід також пропонує гібридні білки, які містять послідовність Fc-ділянки антитіла і одну або декілька послідовностей, представлених послідовностями SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, and SEQ ID NOs: 79-130. Такі молекули можна одержати із застосуванням способів, описаних, наприклад, у публікації міжнародної заявки WO 00/24782, яку включено до цього опису шляхом посилання. Такі молекули можуть експресуватись, наприклад, у клітинах ссавців (наприклад, у клітинах яєчника китайського хом’ячка) або бактеріальних клітинах (наприклад, у клітинах E. coli). За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські антитіла і людські моноклональні антитіла, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену послідовностями SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 6, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 10, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 4. За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить константну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, яка включає константні ділянки важкого ланцюга IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA та IgE або будь-який їхній алельний варіант (як обговорюється у роботі Кабат (Kabat) та інших, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, п’яте видання, U.S.Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, що включена до цього опису шляхом посилання), а варіабельна ділянка важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 10, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло за цим винаходом містить амінокислотну послідовність константної ділянки 2 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важкого ланцюга IgG2, представлену послідовністю SEQ ID NO: 4, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, за варіантом, якому віддають перевагу, людські антитіла, за варіантом, якому віддають більшу перевагу. моноклональні антитіла, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, людські моноклональні антитіла, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 8, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а варіабельна ділянка легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 12, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, антитіла за цим винаходом містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 10, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За іншими аспектами, варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 12, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За додатковими аспектами, важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з послідовністей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 20, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За ще іншими додатковими аспектами, легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з послідовностей SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 або SEQ ID NO: 24, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід пропонує також антитіла, які специфічно зв’язуються з NGF, важкий ланцюг яких містить варіабельну ділянку, яка містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 10, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить варіабельну ділянку, яка містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 12, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, які специфічно зв’язуються з NGF, де згадані антитіла містять: (a) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 79, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 80, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (b) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 81, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 82, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; (c) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 83, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 12, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент; або (d) важкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 86, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, і легкий ланцюг, де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 87, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, цей винахід пропонує також антитіла, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, яка має щонайменше 75 %, за варіантом, якому віддають перевагу, 80 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 85 %, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % і, за варіантом, якому віддають 3 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 найбільшу перевагу, приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою послідовністю SEQ ID NO: 10, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить послідовність, яка має щонайменше 80 %, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 85 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою послідовністю SEQ ID NO: 12, де згадане антитіло специфічно зв’язується з NGF. Цей винахід також пропонує антитіла, які специфічно зв’язуються з NGF, важкий ланцюг яких містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 14, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 16, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. За певними аспектами, цей винахід пропонує антитіла, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого важкого ланцюга містить послідовність, яка має щонайменше 75 %, за варіантом, якому віддають перевагу, 80 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 85 %, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою будьякою з послідовностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 22, і де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, і де варіабельна ділянка згаданого легкого ланцюга містить амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 80 %, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 85 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, приблизно 99 % ідентичність з амінокислотною послідовністю, представленою послідовністю SEQ ID NO: 16, де згадане антитіло специфічно зв’язується з NGF. Цей винахід також пропонує одноланцюгові антитіла, одноланцюгові Fv антитіла, F(ab) антитіла, F(ab) антитіла і (Fab)2 антитіла. За конкретними аспектами, цей винахід пропонує легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 16, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. На додаток до цього, цей винахід пропонує важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, представлену будь-якою з послідовностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 або SEQ ID NO: 22, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Цей винахід також має відношення до виділених людських антитіл, які специфічно зв’язують NGF, де згадане антитіло містить: (a) остовні ділянки людського важкого ланцюга, CDR1 ділянку людського важкого ланцюга, CDR2 ділянку людського важкого ланцюга та CDR3 ділянку людського важкого ланцюга; і (b) остовні ділянки людського легкого ланцюга, CDR1 ділянку людського легкого ланцюга, CDR2 ділянку людського легкого ланцюга та CDR3 ділянку людського легкого ланцюга. За певними аспектами, CDR1 ділянка людського важкого ланцюга може бути CDR1 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла (mAb), позначеного 4D4, як показано послідовністю SEQ ID NO: 22, а CDR1 ділянка людського легкого ланцюга може бути CDR1 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано послідовністю SEQ ID NO: 24. За іншими аспектами, CDR2 ділянка людського важкого ланцюга може бути CDR2 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано послідовністю SEQ ID NO: 18, а CDR2 ділянка людського легкого ланцюга може бути CDR2 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано послідовністю SEQ ID NO: 20. За ще іншими аспектами, CDR3 ділянка людського важкого ланцюга є CDR3 ділянкою важкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано послідовністю SEQ ID NO: 14, а CDR3 ділянка людського легкого ланцюга є CDR3 ділянкою легкого ланцюга моноклонального антитіла 4D4, як показано послідовністю SEQ ID NO: 16. Цей винахід також пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв’язують фактор росту нервової тканини, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий важкий ланцюг містить варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену послідовностями SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 або SEQ ID NO: 87, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. 4 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід додатково пропонує виділені людські антитіла, що специфічно зв’язують NGF, які містять важкий ланцюг і легкий ланцюг, де згаданий легкий ланцюг містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену послідовностями SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91 або SEQ ID NO: 131, або її антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент. Антитіла за цим винаходом характеризуються здатністю антагонізувати щонайменше одну in vitro та/або in vivo активність, пов’язану з NGF поліпептидами. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділені людські антитіла проти людського NGF з високою спорідненістю зв’язування з NGF поліпептидами, де згадані антитіла зв’язуються з людським NGF поліпептидом і відділяються від людського NGF поліпептиду з константою дисоціації (KD) -12 приблизно 5010 М або менше, як визначається із застосуванням KinExA, або які пригнічують -8 NGF-індуковану виживаність у in vitro реакції нейтралізації з IC50 приблизно 110 М або менше. За варіантом, якому віддають перевагу, цей винахід пропонує виділене людське антитіло проти людського NGF, що має наведені нижче характеристики: a) пригнічує NGF-індуковану виживаність у in vitro реакції нейтралізації з IC 50 приблизно -9 110 М або менше; b) має CDR3 важкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 14; і c) має CDR3 легкого ланцюга, що містить амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 16. Цей винахід також пропонує виділені людські антитіла або їх антигензв’язувальні чи імунологічно функціональні імуноглобулінові фрагменти, що специфічно зв’язуються з NGF з високою спорідненістю, де згадані антитіла або фрагменти відділяються від людського NGF -9 поліпептиду з KD приблизно 110 або менше і нейтралізують біологічну активність людського -8 NGF у стандартній in vitro реакції з IC50 приблизно 110 M або менше, і де антитіла або фрагменти містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що містить: a) CDR1 ділянку, яка містить амінокислотну послідовність формули: 1 2 3 4 5 aaaaa, де: 1 2 a – полярний гідрофільний амінокислотний залишок; a – ароматичний амінокислотний 3 4 залишок; a – аліфатичний, полярний гідрофобний, ароматичний амінокислотний залишок; a – 5 нейтральний гідрофобний або аліфатичний амінокислотний залишок; і a – аліфатичний або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; b) CDR2 ділянку, яка містить амінокислотну послідовність формули: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 bbbbbbbbbb b b b b b b b , де: 1 2 b – аліфатичний, полярний гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; b – 3 аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; b – полярний гідрофільний або 4 ароматичний амінокислотний залишок; b – полярний гідрофільний, гідрофобний або 5 9 ароматичний амінокислотний залишок; b -b , незалежно один від одного, являють собою 10 полярні гідрофільні або аліфатичні амінокислотні залишки; b – полярний гідрофільний, 11 ароматичний або аліфатичний амінокислотний залишок; b – ароматичний або гідрофобний 12 амінокислотний залишок; b – аліфатичний гідрофобний або полярний гідрофільний 13 амінокислотний залишок; b – аліфатичний, гідрофобний або полярний гідрофільний 14 16 амінокислотний залишок; b і b , незалежно один від одного, являють собою полярні 15 гідрофільні амінокислотні залишки; b – аліфатичний або ароматичний гідрофобний 17 амінокислотний залишок; і b – аліфатичний кислий амінокислотний залишок; і c) CDR3 ділянку, яка містить амінокислотну послідовність формули: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 cccccccccc c c c c c c c , де: 1 2 c – відсутній або являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; c – відсутній або 3 являє собою полярний гідрофільний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; c 4 і c , незалежно один від одного, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні 5 гідрофобні або аліфатичні амінокислотні залишки; c – відсутній або являє собою полярний 6 гідрофільний, аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; c – відсутній або являє 7 собою полярний гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; c – полярний 8 гідрофільний або аліфатичний амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний, 9 гідрофобний або ароматичний амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний, 10 ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; c – 5 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний 11 13 амінокислотний залишок; c -c , незалежно один від одного, являють собою полярні гідрофільні 14 або ароматичні гідрофобні амінокислотні залишки; c – аліфатичний або ароматичний 15 гідрофобний амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний або нейтральний 16 гідрофобний амінокислотний залишок; c – відсутній або являє собою полярний гідрофільний 17 амінокислотний залишок; і c – ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок. 1 2 За одним аспектом, a – полярний гідрофільний амінокислотний залишок; a – ароматичний 3 гідрофобний амінокислотний залишок; a – аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; 4 5 a – нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; a – полярний гідрофільний 1 2 амінокислотний залишок; b – аліфатичний або ароматичний амінокислотний залишок; b – Ile; 3 4 b – полярний гідрофільний амінокислотний залишок; b – полярний гідрофільний або 5 9 ароматичний амінокислотний залишок; b -b , незалежно один від одного, являють собою 10 полярні гідрофільні або аліфатичні амінокислотні залишки; b – аліфатичний амінокислотний 11 12 13 залишок; b – Tyr; b – аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; b – аліфатичний 14 16 або полярний гідрофільний амінокислотний залишок; b і b , незалежно один від одного, 15 являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; і b – аліфатичний гідрофобний 17 1 амінокислотний залишок; b – аліфатичний кислий амінокислотний залишок; c – відсутній або 2 являє собою аліфатичний амінокислотний залишок; c – відсутній або являє собою полярний 3 4 гідрофільний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; c і c , незалежно один від одного, відсутні або являють собою полярні гідрофільні, ароматичні гідрофобні або 5 аліфатичні амінокислотні залишки; c – відсутній або являє собою полярний гідрофільний 6 амінокислотний залишок; c – відсутній або являє собою полярний гідрофільний або 7 аліфатичний амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний або аліфатичний 8 амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний, гідрофобний або ароматичний 9 амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний, аліфатичний або ароматичний 10 гідрофобний амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний, ароматичний гідрофобний 11 13 або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; c -c , незалежно один від одного, 14 являють собою полярні гідрофільні або ароматичні гідрофобні амінокислотні залишки; c – 15 аліфатичний або ароматичний гідрофобний амінокислотний залишок; c – полярний 16 гідрофільний або нейтральний гідрофобний амінокислотний залишок; c – відсутній або являє 17 собою полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і c – ароматичний гідрофобний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок. 1 2 3 4 За конкретним аспектом, a – Ser, Asp або Thr; a – Tyr; a – Ala, Ser, Trp або Gly; a – Met 5 1 2 3 4 або Ile; a – His, Gly або Asn; b – Tyr, Gly, Ile або Asp; b – Ile; b – Ser, Thr, Tyr або Asn; b – Trp, 5 6 7 8 Arg або Pro; b – Ser, Asn або Gly; b – Ser, Arg, Asp або Gly; b – Ser, His або Gly; b – Ser, Ile, 9 10 11 12 13 Asp або Thr; b – Leu, Ile або Thr; b – Gly, Lys або Phe; b – Tyr; b – Ala або Ser; b – Asp, Gly 14 15 16 17 1 або Pro; b – Ser; b – Val або Phe; b – Lys або Gln; b – Gly; c – відсутній або являє собою 2 3 4 аліфатичний амінокислотний залишок; c – відсутній або являє собою Tyr; c та c , незалежно 5 один від одного, відсутні або являють собою Tyr, Asn, Val або Glu; c відсутній або являє собою 6 7 8 Ser, Gly або Trp; c відсутній або являє собою Ser, Gly, Glu або Leu; c – Gly, Arg або Asp; c – 9 10 11 13 Trp, Pro, Ser або Thr; c – His, Gly або Tyr; c – Val, Tyr або Arg; c -c , незалежно один від 14 15 16 одного, являють собою Ser, Phe, Tyr, Asp або Asn; c – Phe, Val або Gly; c – Met або Asp; c 17 відсутній або являє собою Asp або Asn; і c – Tyr або Val. 1 2 3 4 5 За іншим конкретним аспектом, a – Ser або Asp; a – Tyr; a – Ala або Ser; a – Met або Ile; a 1 2 3 4 5 – His або Asn; b – Tyr або Gly; b – Ile; b – Ser, Thr, Tyr або Asn; b – Trp, Arg або Pro; b – Ser 6 7 8 9 10 або Asn; b – Ser або Arg; b – His або Gly; b – Ile або Thr; b – Leu, Ile або Thr; b – Gly або Phe; 11 12 13 14 15 16 17 b – Tyr; b – Ala або Ser; b – Asp або Gly; b – Ser; b – Val або Phe; b – Lys або Gln; b – 1 2 3 4 Gly; c – відсутній або являє собою Gly; c – відсутній або являє собою Tyr; c та c , незалежно 5 один від одного, відсутні або являють собою Tyr, Gly або Val; c відсутній або являє собою Ser; 6 7 8 9 10 11 13 c – Ser або Gly; c – Gly або Arg; c – Trp або Pro; c – His, Gly або Tyr; c – Val або Tyr; c -c , 14 15 незалежно один від одного, являють собою Ser, Tyr, Phe або Asp; c – Phe або Val; c – Met 16 17 або Asp; c відсутній або являє собою Asp; і c – Tyr або Val. За іншими конкретними аспектами: a) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 22, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 18, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 14; b) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 92, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену 6 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовністю SEQ ID NO: 93, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 94; c) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 98, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 99, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 100; d) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 104, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 105, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 106; e) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 110, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 111, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 112; f) CDR1 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 116, CDR2 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 117, і CDR3 важкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 118. Цей винахід також пропонує виділене людське антитіло або його антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, що специфічно зв’язується з NGF, де згадане антитіло або фрагмент містить варіабельну ділянку легкого ланцюга, що містить: a) CDR1 ділянку, яка містить амінокислотну послідовність формули: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 aaaaaaaaaa a a , де: 1 2 11 12 a – полярний гідрофільний амінокислотний залишок; a , a і a , незалежно один від 3 5 7 8 одного, являють собою аліфатичні або гідрофобні амінокислотні залишки; a , a , a і a , незалежно один від одного, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні 4 6 амінокислотні залишки; a – полярний гідрофільний амінокислотний залишок; a – аліфатичний 9 або гідрофобний амінокислотний залишок; a – відсутній або являє собою аліфатичний або 10 полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і a – аліфатичний, ароматичний або гідрофобний амінокислотний залишок; b) CDR2 ділянку, яка містить амінокислотну послідовність формули: 1 2 3 4 5 6 7 bbbbbbb, де: 1 2 b – аліфатичний, полярний гідрофобний або гідрофобний амінокислотний залишок; b – 3 4 аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; b та b , незалежно один від одного, 5 являють собою полярні гідрофільні, аліфатичні або гідрофобні амінокислотні залишки; b – 6 полярний гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; b – полярний 7 гідрофільний або аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; і b – полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і c) CDR3 ділянку, яка містить амінокислотну послідовність формули: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 cccccccccc c c c c c c c , де: 1 2 c і c , незалежно один від одного, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні 3 залишки; c – полярний гідрофільний, аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; 4 5 6 c , c і c , незалежно один від одного, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або 7 гідрофобні амінокислотні залишки; c – відсутній або являє собою полярний гідрофільний або 8 аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; c – полярний гідрофільний або 9 гідрофобний амінокислотний залишок; і c – полярний гідрофільний амінокислотний залишок; і де згадане антитіло або фрагмент відділяється від людського NGF поліпептиду з KD приблизно -9 110 або менше і нейтралізує біологічну активність людського NGF у стандартній in vitro -8 реакції з IC50 приблизно 110 M або менше. 1 3 4 7 8 За одним аспектом, a , a , a , a і a , незалежно один від одного, являють собою полярні 2 6 11 12 гідрофільні амінокислотні залишки; a , a , a і a , незалежно один від одного, являють собою 5 аліфатичні гідрофобні амінокислотні залишки; a – полярний гідрофільний або аліфатичний 9 амінокислотний залишок; a – відсутній або являє собою аліфатичний або полярний 10 гідрофільний амінокислотний залишок; a – аліфатичний або ароматичний амінокислотний 1 2 залишок; b – аліфатичний, полярний гідрофобний або гідрофобний амінокислотний залишок; b 3 4 7 – аліфатичний гідрофобний амінокислотний залишок; b , b і b , незалежно один від одного, 5 6 являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; b і b , незалежно один від одного, 7 UA 102775 C2 1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2 являють собою полярні гідрофільні або аліфатичні гідрофобні амінокислотні залишки; c і c , 3 незалежно один від одного, являють собою полярні гідрофільні амінокислотні залишки; c – 4 5 6 полярний гідрофільний, аліфатичний або гідрофобний амінокислотний залишок; c , c і c , незалежно один від одного, являють собою аліфатичні, полярні гідрофільні або гідрофобні 7 амінокислотні залишки; c – відсутній або являє собою аліфатичний гідрофобний 8 9 амінокислотний залишок; c – гідрофобний амінокислотний залишок; і c – полярний гідрофільний амінокислотний залишок. 1 3 4 7 2 5 За конкретним аспектом, a , a , a і a – Arg, Ser, Gln та Ser, відповідно; a – Ala; a – Gly або 8 9 10 1 Ser; a – Ser або Ile; a – відсутній, Ser або Gly; a – Ala, Tyr, Trp або Phe; b – Asp, Gly, Ala або 2 3 4 5 6 7 Val; b і b – Ala та Ser, відповідно; b – Ser або Asn; b – Leu або Arg; b – Glu, Ala або Gln; b – 1 2 3 4 5 6 Ser або Thr; c і c – Gln; c – Phe, Тyr, Arg або Ala; c – Asn, Gly або Ser; c – Ser або Asn; c – 7 8 9 Tyr, Ser, Trp або Phe; c – відсутній, Pro або His; c – Leu, Trp, Тyr або Arg; і c – Thr. 1 2 3 4 7 5 За іншим конкретним аспектом, a , a , a , a і a – Arg, Ala, Ser, Gln та Ser, відповідно; a – 8 9 10 1 2 3 Gly або Ser; a – Ser або Ile; a – відсутній, Ser або Gly; a – Ala або Tyr; b – Asp або Gly; b і b 4 5 6 7 – Ala та Ser, відповідно; b – Ser або Asn; b – Leu або Arg; b – Glu, Ala або Gln; b – Ser або Thr; 1 2 3 4 5 6 c і c – Gln; c – Phe, Тyr, Arg або Ala; c – Asn, Gly або Ser; c – Ser або Asn; c – Tyr, Ser, Trp 7 8 9 або Phe; c – відсутній, Pro або His; c – Leu, Trp, Тyr або Arg; і c – Thr. За іншими конкретними аспектами: a) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 24, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 20, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 16; b) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 95, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 96, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 97; c) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 101, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 102, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 103; d) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 107, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 108, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 109; e) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 113, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 114, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 115; f) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 119, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 120, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 121; g) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 122, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 123, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 124; h) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 125, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 126, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 127; i) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 128, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 129, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, послідовністю SEQ ID NO: 130; j) CDR1 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 132, CDR2 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 133, і CDR3 легкого ланцюга має амінокислотну послідовність, представлену послідовністю SEQ ID NO: 134. Частиною цього винаходу також є полінуклеотидні послідовності, які кодують нові людські антитіла проти людського NGF, вектори, що містять полінуклеотидні послідовності, які кодують 8 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людські антитіла проти людського NGF, клітини-хазяї, трансформовані векторами, що містять полінуклеотиди, які кодують людські антитіла проти людського NGF, композиції, що містять людські антитіла проти людського NGF та способи її одержання та застосування. Цей винахід також пропонує способи визначення рівня NGF у біологічній пробі, що включають стадію контактування згаданої проби з антитілом за цим винаходом або його антигензв’язувальним фрагментом. Анти-NGF антитіло за цим винаходом може застосовуватись у будь-якому відомому аналітичному методі, наприклад, реакціях конкурентного зв’язування, прямих та непрямих сендвіч-методах, методах імунопреципітації та твердофазному імуноферментному аналізі (ELISA) (див. Сола (Sola), 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, стор. 147-158, CRC Press, Inc.) для виявлення та кількісного визначення NGF. Антитіла можуть зв’язувати NGF зі спорідненістю, що відповідає застосованому аналітичному методу. На додаток до цього, цей винахід пропонує способи лікування захворювання, пов’язаного з підвищеним продукуванням NGF або підвищеною чутливістю до NGF, що включають стадію введення фармацевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить щонайменше одне антитіло за цим винаходом або його антигензв’язувальний чи імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент, індивіду, який цього потребує. Конкретні варіанти здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, стануть очевидними з наведеного нижче докладнішого опису певних варіантів здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, та формули винаходу. Короткий опис фігур На Фіг. 1 зображені графіки, які демонструють нейтралізацію активності NGF у реакції нейтралізації на основі нейронів DRG моноклональними антитілами 4D4, виділеними з кондиціонованих середовищ для гібридом та очищеними. На Фіг. 2 зображені графіки, які демонструють експресію VR1, стимульовану активністю людського NGF і нейтралізацію активності NGF у реакціях нейтралізації на основі нейронів DRG анти-NGF моноклональним антитілом (4D4), виділеним із кондиціонованих середовищ для гібридом та очищеним. На Фіг. 3 зображені графіки, які демонструють нейтралізацію активності NGF у реакціях нейтралізації на основі нейронів DRG тимчасово експресованими рекомбінантними моноклональними анти-NGF антитілами 4D4, експресованими як IgG1 або IgG2 та у клітинах, вирощених у ролерній культурі (R) або у спін-культурі (S). На Фіг. 4 зображений порівняльний аналіз послідовностей нейротрофінів. Цифрові позначення та елементи вторинної структури над послідовностями відносяться до зрілого людського NGF. Консервативні залишки помічені зірочкою, а ділянки з низькою гомологією послідовностей заштриховані. Людський NGF –SEQ ID NO: 135; мишачий NGF –SEQ ID NO: 136; BDNF –SEQ ID NO: 137; NT3 –SEQ ID NO: 138. На Фіг. 5 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR1 важкого ланцюга анти-NGF антитіл 14D10 (SEQ ID NO: 98), 6H9 (SEQ ID NO: 104), 7H2 (SEQ ID NO: 110), 4G6 (SEQ ID NO: 116), 14D11 (SEQ ID NO: 92) та 4D4 (SEQ ID NO: 22). На Фіг. 6 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR2 важкого ланцюга анти-NGF антитіл 14D10 (SEQ ID NO: 99), 6H9 (SEQ ID NO: 105), 7H2 (SEQ ID NO: 111), 4G6 (SEQ ID NO: 117), 14D11 (SEQ ID NO: 93) та 4D4 (SEQ ID NO: 18). На Фіг. 7 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR3 важкого ланцюга анти-NGF антитіл 14D10 (SEQ ID NO: 100), 6H9 (SEQ ID NO: 106), 7H2 (SEQ ID NO: 112), 4G6 (SEQID NO: 118), 14D11 (SEQ ID NO: 94) та 4D4 (SEQ ID NO: 14). На Фіг. 8 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR1 легкого ланцюга анти-NGF антитіл 14D10 (SEQ ID NO: 95), 6H9 (SEQ ID NO: 107), 7H2 (SEQ ID NO: 113), 4G6а (SEQ ID NO: 119), 4G6b (SEQ ID NO: 122), 4G6c (SEQ ID NO: 125), 4G6d (SEQ ID NO: 128), 4G6e (SEQ ID NO: 132), 14D11 (SEQ ID NO: 95) та 4D4 (SEQ ID NO: 24) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 9 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR2 легкого ланцюга анти-NGF антитіл 14D10 (SEQ ID NO: 96), 6H9 (SEQ ID NO: 108), 7H2 (SEQ ID NO: 114), 4G6а (SEQ ID NO: 120), 4G6b (SEQ ID NO: 123), 4G6c (SEQ ID NO: 126), 4G6d (SEQ ID NO: 129), 4G6e (SEQ ID NO: 133), 14D11 (SEQ ID NO: 96) та 4D4 (SEQ ID NO: 20) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на 9 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 10 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності CDR3 легкого ланцюга анти-NGF антитіл 14D10 (SEQ ID NO: 97), 6H9 (SEQ ID NO: 109), 7H2 (SEQ ID NO: 115), 4G6а (SEQ ID NO: 121), 4G6b (SEQ ID NO: 124), 4G6c (SEQ ID NO: 127), 4G6d (SEQ ID NO: 130), 4G6e (SEQ ID NO: 134), 14D11 (SEQ ID NO: 97) та 4D4 (SEQ ID NO: 16) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 11 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності легкого ланцюга антиNGF антитіл 14D10 (SEQ ID NO: 82), 6H9 (SEQ ID NO: 84), 7H2 (SEQ ID NO: 86), 4G6а (SEQ ID NO: 88), 4G6b (SEQ ID NO: 89), 4G6c (SEQ ID NO: 90), 4G6d (SEQ ID NO: 91), 4G6e (SEQ ID NO: 131), 14D11 (SEQ ID NO: 80) та 4D4 (SEQ ID NO: 12) (антитіло 4G6a на різних Фігурах позначається як 20031028340; антитіло 4G6b на різних Фігурах позначається як 20031028351; антитіло 4G6c на різних Фігурах позначається як 20031071526; антитіло 4G6d на різних Фігурах позначається як 20031028344; антитіло 4G6e на різних Фігурах позначається як 20031000528). На Фіг. 12 зображений порівняльний аналіз і відсоток ідентичності важкого ланцюга антиNGF антитіл 4D4 (SEQ ID NO: 10), 4G6 (SEQ ID NO: 87), 14D10 (SEQ ID NO: 81), 14D11 (SEQ ID NO: 79), 7H2 (SEQ ID NO: 85) та 6H9 (SEQ ID NO: 83). Докладний опис конкретних варіантів здійснення винаходу, яким віддають перевагу Назви розділів, які застосовуються у цьому описі, переслідують лише організаційні цілі і не повинні розглядатись як такі, що обмежують об’єкт опису. Усі посилання, згадані у цьому описі, включені до цього опису шляхом посилання для будь-якої мети. Визначення Для одержання рекомбінантних ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культивування та трансформації тканин можна вдаватись до традиційних методів (наприклад, електропорації, ліпофекції). Ферментативні реакції та методи очищення можуть здійснюватись за специфікаціями виробника, за традиційними для цієї галузі методиками або за наведеним описом. Подальші методики та процедури можуть, у цілому, здійснюватись за способами, добре відомими у цій галузі, та за описами, наведеними у різноманітних загальних та спеціалізованих джерелах, які наводяться шляхом посилання та обговорюються у цьому описі. Дивись, наприклад, Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LFBORATORY MANUAL, 3 видання, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, який включено до цього опису шляхом посилання з будь-якою метою. У разі відсутності конкретних визначень, у цьому описі у зв’язку з та по відношенню до лабораторних процедур та методів аналітичної хімії, синтетичної органічної хімії, медичної та фармацевтичної хімії застосовується номенклатура, що є добре відомою і традиційно застосовуваною у цій галузі. Подібним чином, для хімічного синтезу, хімічних аналізів, одержання фармацевтичних препаратів, композицій, їх доставки та лікування хворих можуть застосовуватись традиційні методи. Слід розуміти, що наведені нижче терміни, які вживаються у описі цього винаходу, у разі відсутності інших визначень, мають таке значення: Словосполучення “біологічна властивість”, “біологічна характеристика” і термін “активність” відносно антитіла за цим винаходом вживаються у цьому описі взаємозамінно і означають (але не обмежуються) спорідненість і специфічність відносно антигенної детермінанти (наприклад, зв’язування людського антитіла проти людського NGF з людським NGF), здатність до антагонізування активності цільового поліпептиду (наприклад, активності NGF), in vivo стабільність антитіла та імуногенні властивості антитіла. Іншими біологічними властивостями або характеристиками антитіла, які піддаються визначенню і визнаються у цій галузі, є, наприклад, перехресна реактивність (тобто з гомологами цільового поліпептиду нелюдського походження або, взагалі, з іншими білками або тканинами) і здатність до збереження високих рівнів експресії білка у клітинах ссавців. Вищезгадані властивості або характеристики можуть спостерігатись або вимірюватись із застосуванням визнаних у цій галузі методів, у тому числі, але без обмеження, із застосуванням твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), конкурентного ELISA, аналізу поверхневого плазмонного резонансу, in vitro та in vivo реакцій нейтралізації (наприклад, Приклад 2) та імуногістохімічних методів зі зрізами тканин із різних джерел, у тому числі від людей, приматів або з будь-якого іншого джерела, відповідно до потреб. Конкретні активності та біологічні властивості людських антитіл проти людського NGF докладно описані у наведених нижче Прикладах. 10 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Словосполучення “виділений полінуклеотид”, яке застосовується у цьому описі, означає полінуклеотид геномного, кДНК або синтетичного походження чи їх комбінації, причому, завдяки своєму походженню, згаданий виділений полінуклеотид (1) не є пов’язаним із цілим полінуклеотидом або частиною полінуклеотиду, у складі якого виділений полінуклеотид знаходиться за природних умов, (2) є зв’язаним із полінуклеотидом, з яким він не є зв’язаним за природних умов або (3) не зустрічається за природних умов, як частина більшої послідовності. Словосполучення “виділений білок”, яке згадується у цьому описі, означає, що цільовий білок (1) є вільним від щонайменше деяких інших білків, з якими він знаходиться за нормальних умов, (2) є по суті вільним від інших білків з того самого джерела, наприклад, від того самого виду, (3) експресується клітиною іншого виду, (4) було відділено від щонайменше приблизно 50 відсотків полінуклеотидів, ліпідів, вуглеводів або інших матеріалів, з якими він є пов’язаним за природних умов, (5) не є зв’язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з частинами білка, з якими згаданий “виділений білок” є зв’язаним за природних умов, (6) є функціонально зв’язаним (ковалентною або нековалентною взаємодією) з поліпептидом, з яким він не є зв’язаним за природних умов або (7) не зустрічається за природних умов. Такий виділений білок може кодуватись геномною ДНК, кДНК, мРНК або іншою РНК синтетичного походження чи будьякою їх комбінацією. За варіантом, якому віддають перевагу, згаданий виділений білок є по суті вільним від білків або поліпептидів чи інших забруднювачів, що знаходяться у його природному оточенні, які могли б перешкоджати його застосуванню (терапевтичному, діагностичному, профілактичному, науково-дослідному тощо). “Виділеним” антитілом є антитіло, яке було ідентифіковане і відділене та/або виділене зі складової його природного оточення. Забруднювальними складовими його природного оточення є матеріали, які могли б перешкодити діагностичному або терапевтичному застосуванням антитіла, і вони можуть включати ферменти, гормони та інші білкові або небілкові розчинені речовини. За варіантом, якому віддають перевагу, антитіло буде очищеним (1) до рівня, що перевищує 95 % (мас.) антитіла, що визначається за методом Лоурі, а за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, до рівня, що перевищує 99 % (мас.), (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності із застосуванням секвенатора з центрифугальною чашкою, або (3) до однорідності із застосуванням електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) за відновних або невідновних умов із застосуванням барвника кумасі блакитного або, за варіантом, якому віддають перевагу, срібла. Виділене антитіло включає антитіло in situ у межах рекомбінантних клітин, оскільки щонайменше одна складова природного середовища антитіла буде відсутньою. Терміни “поліпептид” або “білок” означають молекули, які мають послідовність нативних білків, тобто білків, продукованих природними клітинами та специфічними нерекомбінантними клітинами, генно-інженерними або рекомбінантними клітинами, і включають молекули, що мають амінокислотну послідовність нативного білка або молекули, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот нативної послідовності. Терміни “поліпептид” та “білок”, зокрема, означають анти-NGF антитіла або послідовності, з яких були видалені, до яких були додані та/або замінені одна або декілька амінокислот анти-NGF антитіла. Термін “фрагмент поліпептиду” означає поліпептид, що має делецію на амінокінці, делецію на карбоксильному кінці та/або внутрішню делецію. За певних варіантів здійснення довжина фрагментів становить від щонайменше 5 амінокислот до приблизно 500 амінокислот. Буде зрозуміло, що, за певними варіантами здійснення довжина фрагментів становить щонайменше 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 амінокислот. Особливо прийнятні фрагменти поліпептидів містять функціональні домени, у тому числі зв’язувальні домени. У разі анти-NGF антитіла, прийнятні фрагменти містять (але не обмежуються) CDR (гіперваріабельну) ділянку, варіабельну ділянку важкого або легкого ланцюга, частину ланцюга антитіла або лише його варіабельну ділянку, що містить дві гіперваріабельні ділянки тощо. Термін “специфічний зв’язувальний агент” означає природну або штучну молекулу, яка специфічно зв’язується з мішенню. Прикладами специфічних зв’язувальних агентів є (але ними не обмежуються) білки, пептиди, нуклеїнові кислоти, вуглеводи і ліпіди. За певними варіантами здійснення специфічним зв’язувальним агентом є антитіло. Термін “специфічний NGF-зв’язувальний агент” означає специфічний зв’язувальний агент, який специфічно зв’язує будь-яку частину NGF. За певними варіантами здійснення специфічним NGF-зв’язувальним агентом є антитіло, що специфічно зв’язується з NGF. Термін “імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент”, який вживається у цьому описі, означає фрагмент поліпептиду, що містить щонайменше гіперваріабельні ділянки 11 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 важкого і легкого ланцюгів імуноглобуліну. Імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом є здатним до зв’язування з антигеном. За варіантами, яким віддають перевагу, антиген являє собою ліганд, що специфічно зв’язується з рецептором. За цими варіантами здійснення зв’язування імунологічно функціонального імуноглобулінового фрагмента за цим винаходом запобігає зв’язуванню ліганду з його рецептором, з перериванням біологічної реакції, що є наслідком зв’язування ліганду з рецептором. За варіантом, якому віддають перевагу, імунологічно функціональний імуноглобуліновий фрагмент за цим винаходом специфічно зв’язується з NGF. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, згаданий фрагмент специфічно зв’язується з людським NGF. Термін “природний”, який вживається у цьому описі і стосується об’єкта, означає те, що цей об’єкт може бути знайденим у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, присутня у організмі (у тому числі вірусах), яка може бути виділена із природного джерела і навмисно людиною не модифікувалась, є природною. Термін “функціонально зв’язаний” означає, що складові, до яких вживається цей термін, знаходяться у взаємозв’язку, який надає їм можливість здійснення притаманних їм функцій за відповідних умов. Наприклад, контрольна послідовність, “функціонально зв’язана” з кодувальною послідовністю білка, є сполучена з нею таким чином, що експресія кодувальної послідовності білка відбувається за умов, сумісних із транскрипційною активністю контрольних послідовностей. Термін “контрольна послідовність”, який вживається у цьому описі, означає полінуклеотидні послідовності, які можуть забезпечувати експресію, процесинг або внутрішньоклітинну локалізацію кодувальних послідовностей, з якими вони зв’язані. Природа таких контрольних послідовностей може залежати від організму-хазяїна. За конкретними варіантами здійснення контрольні послідовності для прокаріот можуть містити промотор, сайт зв’язування рибосом і термінатор транскрипції. За іншими конкретними варіантами здійснення, контрольні послідовності для еукаріот можуть включати промотори, що містять один або множину сайтів упізнання факторів транскрипції, енхансерних послідовностей транскрипції, термінаторів транскрипції та послідовностей поліаденілування. За певними варіантами здійснення “контрольні послідовності” можуть включати лідерні послідовності та/або послідовності гібридизаційного партнера. Термін “полінуклеотид”, який вживається у цьому описі, означає одноланцюгові або дволанцюгові нуклеїновокислотні полімери довжиною щонайменше 10 нуклеотидів. За певними варіантами здійснення нуклеотидами, що входять до складу полінуклеотиду, можуть бути рибонуклеотиди або дезоксирибонуклеотиди чи модифікована форма нуклеотиду будь-якого з цих типів. Згадані модифікації включають модифікації основ, наприклад, бромуридину, модифікації рибоз, наприклад, арабінозиду та 23-дидезоксирибози та модифікації внутрішньонуклеотидних зв’язків, наприклад, фосфоротіоату, фосфородітіоату, фосфороселеноату, фосфородиселеноату, фосфороанілотіоату, фосфороаніладату і фосфороамідату. Термін “полінуклеотид”, зокрема, включає однониткові та двониткові форми ДНК. Термін “олігонуклеотид”, який вживається у цьому описі, включає природні і модифіковані нуклеотиди, зв’язані природними та/або штучними олігонуклеотидними зв’язками. Олігонуклеотиди являють собою субпопуляцію полінуклеотидів, члени якої є, як правило, однонитковими і мають у довжину 200 нуклеотидів або менше. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають від 10 нуклеотидів до 60 нуклеотидів у довжину. За певними варіантами здійснення олігонуклеотиди мають 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 нуклеотидів або від 20 нуклеотидів до 40 нуклеотидів у довжину. Олігонуклеотиди можуть бути однонитковими або двонитковими, наприклад, для застосування при конструюванні генетичного мутанту. Олігонуклеотиди за цим винаходом можуть бути смисловими або антисмисловими олігонуклеотидами відносно білок-кодувальної послідовності. Термін “природні нуклеотиди” означає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. Термін “модифіковані нуклеотиди” означає нуклеотиди з модифікованими або заміненими цукровими групами тощо. Термін “олігонуклеотидні зв’язки” означає олігонуклеотидні зв’язки, наприклад, фосфоротіоат, фосфородітіоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фосфороаніладат, фосфороамідат тощо. Дивись, наприклад, Лапланш (LaPlanche) та інші, 1986, Nucl. Acids Res., 14:9081; Стек (Stec) та інші, 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6077; Стейн (Stein) та інші, 1988, Nucl. Acids Res., 16:3209; Зон (Zon) та інші, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Зон (Zon) та інші, 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, стор. 87-108, (редактор Ф. Екстейн (F. Eckstein)), Oxford University Press, Oxford England; Стек (Stec) та інші, патент США № 5,151,510; Ульман (Uhlmann), Пейман (Peyman), 12 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1990, Chemical Reviews, 90:543, розкриття яких наведено у цьому описі шляхом посилання для будь-якої мети. Олігонуклеотид може містити виявну мітку, яка надає можливість виявлення олігонуклеотиду або його гібридизації. Термін “вектор” означає нуклеїновокислотну молекулу, здатну до транспортування іншої нуклеїнової кислоти, з якою вона зв’язана. Вектором одного з типів є “плазміда”, що являє собою кільцеву петлю двониткової ДНК, до якої можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Вектором іншого типу є вектор на основі вірусного геному, де додаткові сегменти ДНК можуть бути лігованими до вірусного геному. Певні вектори є здатними до автономної реплікації у клітини-хазяїні, до якої вони були введені (наприклад, вектори на основі бактеріального геному, що мають бактеріальний сайт ініціювання реплікації та вектори на основі епісом ссавців). Інші вектори (наприклад, вектори не на основі епісом ссавців) можуть бути інтегровані до геному клітини-хазяїна при введенні до згаданої клітини і, таким чином, розмножуватися разом із геномом хазяїна. Більше того, певні вектори є здатними до спрямування експресії генів, з якими вони є функціонально зв’язані. Такі вектори згадуються у цьому описі, як “рекомбінантні вектори експресії” (або просто “експресійні вектори”). Взагалі, експресійні вектори, придатні для методу рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У цьому описі терміни “плазміда“ і “вектор” можуть вживати взаємозамінно, оскільки плазміда являє собою найпоширенішу форму вектора. Цей винахід, однак, включає інші форми експресійних векторів, наприклад, вектори на основі вірусного геному (наприклад, реплікаційно-дефектні ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які здійснюють еквівалентні функції. Словосполучення “рекомбінантна клітина-хазяїн” (або просто “клітина-хазяїн”) означає клітину, до якої було введено рекомбінантний експресійний вектор. Фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що такі терміни, як мається на увазі, означають не лише конкретну клітину-об’єкт, але і потомство такої клітини. Оскільки у подальших генераціях можуть відбуватись певні модифікації унаслідок мутацій або впливу навколишнього середовища, таке потомство може, по суті не бути ідентичним батьківській клітині, однак воно, як і до того, включається до обсягу терміну “клітина-хазяїн”, який вживається у цьому описі. Для експресії антитіл за цим винаходом можуть застосовуватись найрізноманітніші системи експресії в хазяїні, у тому числі бактеріальні, дріжджові, бакуловірусні системи експресії та системи експресії у ссавцях (а також системи експресії з фаговою індикацією). Прикладом прийнятного експресійного вектора на основі бактеріального геному є pUC19. Для рекомбінантної експресії антитіл, клітина-хазяїн трансфікується одним або декількома рекомбінантними експресійними векторами, що несуть фрагменти ДНК, що кодує легкі та важкі ланцюги антитіла таким чином, що згадані легкі та важкі ланцюги експресуються у клітині-хазяїні і, за варіантом, якому віддають перевагу, секретуються до живильного середовища, у якому культивуються клітини-хазяї, з якого згадані антитіла можуть виділятись. Стандартна методика рекомбінантних ДНК застосовується для одержання генів важких і легких ланцюгів антитіла, включення цих генів до рекомбінантних експресійних векторів та введення цих векторів до клітин-хазяїв, описаних, наприклад, у Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, (під редакцією Осбел Ф.М. (Ausubel F.M.) та інших, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associaties, (1989)) та у патенті США № 4,816,397, виданому на ім’я Босс (Boss) та інші. Термін “клітина-хазяїн” застосовують для позначення клітини, яку було трансформовано або яка є здатною до трансформування нуклеїновокислотною послідовністю з подальшою експресією вибраного гена, який становить інтерес. Згаданий термін доти включає потомство батьківської клітини, незалежно від того, чи є згадане потомство ідентичним вихідній батьківській клітині за морфологією або організацією генетичного матеріалу, доки є присутнім вибраний ген. Термін “трансдукція” означає перенесення генів від однієї бактерії до іншої, як правило, із застосуванням фага. “Трансдукція” означає також набуття та перенесення еукаріотних клітинних послідовностей ретровірусами. Термін “трансфекція” означає захоплення клітиною чужорідної або екзогенної ДНК і клітина є “трансфікованою” у разі, коли екзогенна ДНК була введена досередини клітинної мембрани. У цій галузі добре відомі численні методи трансфекції, які розкриваються у цьому описі. Дивись, наприклад, Грехем (Graham) та інші, 1973, Virology 52:456; Сембрук (Sambrook) та інші, 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Девіс (Davis) та інші, 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; Чу (Chu) та інші, 1981, Gene, 13:197. Такі методи можуть застосовуватись для введення до прийнятних клітинхазяїв однієї або декількох екзогенних ДНК. 13 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін “трансформація”, який вживається у цьому описі, означає зміну генетичних характеристик клітини, і клітина є трансформованою у тому разі, коли вона була модифікована таким чином, що містить нову ДНК. Наприклад, клітина є трансформованою у тому разі, коли її піддали генетичній модифікації порівняно з її нативним станом. Після трансфекції або трансдукції, трансформуюча ДНК може рекомбінуватись із ДНК клітини шляхом фізичної інтеграції з хромосомою клітини або може тимчасово підтримуватись як епісомний елемент без реплікації або може реплікуватись незалежно як плазміда. Клітина вважається стабільно трансформованою, коли ДНК реплікується разом із поділом клітини. Термін “природний” або “нативний”, у разі вживання у зв’язку з біологічними матеріалами, наприклад, молекулами нуклеїнової кислоти, поліпептидами, клітинами-хазяями тощо, означає матеріали, які знаходяться у природі, і не зазнавали маніпуляції з боку людини. Аналогічно, термін “штучний” або “ненативний”, що вживається у цьому описі, означає матеріал, який є відсутнім у природі або який був структурно модифікованим або синтезованим людиною. Термін “антиген” означає молекулу або частину молекули, здатну до зв’язування селективним зв’язувальним агентом, наприклад, антитілом, і додатково здатну до застосування у організмі тварини для продукування антитіл, здатних до зв’язування з антигенною детермінантою цього антигену. Антиген може мати одну або декілька антигенних детермінант. Термін “ідентичність”, як відомо у цій галузі, означає спорідненість між послідовностями двох чи декількох поліпептидних молекул або двох чи декількох нуклеїновокислотних молекул, що визначається шляхом порівняння їх послідовностей. Термін “ідентичність” у цій галузі означає також ступінь спорідненості послідовностей між нуклеїновокислотними молекулами або поліпептидами, відповідно, що визначається сумісністю ниток двох чи декількох нуклеотидних або двох чи декількох амінокислотних послідовностей. “Ідентичність” встановлює відсоток ідентичних співпадінь між меншими з двох або декількох послідовностей з впорядкованим розміщенням двониткових розривів (у разі їх присутності), який визначають із застосуванням конкретної математичної моделі або комп'ютерної програми (тобто “алгоритмів”). Термін “подібність” застосовують у цій галузі відносно спорідненої концепції, але на відміну від “ідентичності”, “подібність” означає ступінь спорідненості, який включає як ідентичні співпадіння, так і консервативні замінні співпадіння. Якщо дві поліпептидні послідовності мають, наприклад, 10/20 ідентичних амінокислот, а усі залишкові амінокислоти є неконсервативними замінами, у такому разі відсоток як ідентичності, так і подібності буде дорівнювати 50 %. Якщо, у тому самому прикладі, є п’ять додаткових позицій, де є консервативні заміни, у такому разі відсоток ідентичності залишиться на рівні 50 %, а відсоток подібності буде становити 75 % (15/20). Таким чином, у тих випадках, де є консервативні заміни, відсоток подібності між двома поліпептидами буде вищим за відсоток ідентичності між цими двома поліпептидами. Ідентичність і подібність споріднених нуклеїнових кислот і поліпептидів може бути легко обчислена за відомими методами. До них належать (але ними не обмежуються) методи, описані у COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY (редактор Леск А.М. (Lesk A.M.)), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, (редактор Сміт Д.В. (Smith D.W.)), 1993, Academic Press, New York; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1, (редактори Гріффін А.М. (Griffin A.M.), Гріффін Г.Дж. (Griffin H.G.)), 1994, Humana Press, New Jersey; фон Гейне Дж. (von Heinje G.), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1987, Academic Press; SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, (Грібсков В. (Gribskov V.), Деверо Дж. (Devereux J.)), 1991, M. Stockton Press, New York; Карілло (Carillo), 1988, SIAM J. Applied Math., 48:1073; Дурбін (Durbin) та інші, 1998, BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS, Cambridge University Press. Методи визначення ідентичності, яким віддають перевагу, розробляються таким чином, щоб вони забезпечували найбільшу сумісність між послідовностями, які перевіряються. Методи визначення ідентичності описуються у доступних комп'ютерних програмах. Методи комп'ютерних програм із визначення ідентичності двох послідовностей, яким віддають перевагу, включають (але ними не обмежуються) пакет програм GCG, що містить програми GAP (Деверо (Devereux) та інші, 1984, Nucl. Acid Res., 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, штат Вісконсін), BLASTP, BLASTN та FASTA (Алтшул (Altschul) та інші, 1990, J. Mol. Biol., 215:403-410). Програма BLASTX є доступною від Національного центру з біотехнологічної інформації (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) та з інших джерел (BLAST Manual, Алтшул (Altschul) та інші, NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Алтшул (Altschul) та інші, 1990, дивись вище). Для визначення ідентичності може застосовуватись також добре відомий алгоритм Сміта Уотермена (Smith Waterman algorithm). Наслідком застосування певних схем порівняльного аналізу з впорядованим розміщенням двох амінокислотних послідовностей може виявитись сумісність лише короткої ділянки двох 14 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 згаданих послідовностей, і ця невелика впорядковано розміщена ділянка може мати дуже високу ідентичність послідовностей, незважаючи навіть на відсутність значної спорідненості між двома непроцесованими послідовностями. Відповідно, за певними варіантами здійснення наслідком застосування вибраного методу порівняльного аналізу (програма GAP) виявиться впорядковане розміщення, що охоплює щонайменше 50 суміжних амінокислот цільового поліпептиду. Наприклад, у разі застосування комп'ютерного алгоритму GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, штат Вісконсін), два поліпептиди, у яких слід визначити відсоток ідентичності послідовностей, впорядковано розміщуються для оптимального співпадіння їх відповідних амінокислот (“суміщений відрізок”, як визначається алгоритмом). За певними варіантами здійснення разом з алгоритмом застосовують штрафні бали за розрив (які обчислюються, як потроєна середня діагональ, де “середня діагональ” є середнім значенням діагоналі застосованої порівняльної матриці; “діагональ” являє собою бал або число, що приписується кожному абсолютному співпадінню амінокислоти конкретною порівняльною матрицею) і штрафні бали за довжину розриву (які, як правило, дорівнюють одній десятій штрафних балів за розрив), а також порівняльну матрицю, наприклад, PAM 250 або BLOSUM 62. За певними варіантами здійснення алгоритмом застосовується також стандартна порівняльна матриця (дивись Дейхофф (Dayhoff) та інші, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352 щодо порівняльної матриці PAМ 250; Хенікофф (Henikoff) та інші, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 щодо порівняльної матриці BLOSUM 62). За певними варіантами здійснення параметри порівняння поліпептидних послідовностей охоплюють наведене нижче: алгоритм: Нідлмен (Needleman) та інші, 1970, J. Mol. Biol., 48:443-453; порівняльна матриця: BLOSUM 62 від Хенікофф (Henikoff) та інші, 1992, дивись вище; штрафні бали за розрив: 12; штрафні бали за довжину розриву: 4; поріг подібності: 0. З вищенаведеними параметрами корисною може бути програма GAP. За певними варіантами здійснення вищезгадані параметри є параметрами за замовчуванням для порівняння поліпептидних послідовностей (без штрафних балів за закінчення розриву) із застосуванням алгоритму GAP. Термін “гомологія” означає ступінь подібності між білковими або нуклеїновокислотними послідовностями. Інформація щодо гомології є корисною для розуміння генетичної спорідненості певних видів білків або нуклеїнових кислот. Гомологія може визначатись шляхом впорядкованого розміщення і порівняння послідовностей. За типовим варіантом, для визначення гомології амінокислот, білкову послідовність порівнюють із базою даних відомих білкових послідовностей. Гомологічні послідовності мають спільні функціональні одиниці на якійсь ділянці своїх послідовностей. Високий ступінь подібності або ідентичності, як правило, є свідченням гомології, хоча низький ступінь подібності або ідентичності не обов’язково вказує на відсутність гомології. Для визначення гомології шляхом порівняння амінокислот однієї послідовності з амінокислотами іншої послідовності може застосовуватись декілька варіантів підходів. Взагалі, згадані варіанти підходів можна підрозділити на дві категорії: (1) порівняння фізичних характеристик, а саме полярності, заряду, вандерваальсівського об’єму, для створення порівняльної матриці; і (2) порівняння ймовірної заміни амінокислоти у послідовності будь-якою іншою амінокислотою, що грунтується на спостереженні багатьох білкових послідовностей відомих гомологічних білків, і створення Матриці Прийнятних Точкових Мутацій (Point Accepted Mutation Matrix (PAM)). Відсоток ідентичності може обчислюватись шляхом застосування голки для відбирання програм (пакет програм EMBOSS) або розширювача програм (пакет програм EMBOSS) чи узгоджування програм X, як модуля вектора NTI пакета програм 9.0.0, із застосуванням значень параметрів, за замовчуванням (наприклад, 5 штрафних балів за присутність двониткового розриву, 15 штрафних балів за відкриття двониткового розриву, 6,6 штрафних балів за довжину двониткового розриву). У цьому описі застосовуються двадцять традиційних амінокислот та їхні скорочені позначення. Див. IMMUNOLOGY – A SYNTHESIS 2 видання, (ред. Е.С.Голуб (E.S. Golub), Д.Р. Грен (D.R. Gren)), Sinauer Associates: Sunderland, штат Массачусетс, 1991, який включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Стереоізомери (наприклад, Dамінокислоти) двадцяти традиційних амінокислот; штучні амінокислоти, наприклад, α-, αдвозаміщені амінокислоти, N-алкіламінокислоти, молочна кислота та інші нетрадиційні 15 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислоти можуть також бути прийнятними складовими для поліпептидів за цим винаходом. Прикладами нетрадиційних амінокислот є: 4-гідроксипролін, γ-карбоксиглутамат, ε-N,N,Nтриметиллізин, ε-N-ацетиллізин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формілметіонін, 3метилгістидин, 5-гідроксилізин, σ-N-метиларгінін та інші подібні амінокислоти та імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). У позначенні поліпептидів, яке застосовується у цьому описі, лівостороннім напрямом є напрям до амінокінця, а правостороннім напрямом є напрям до карбоксильного кінця, відповідно до стандартного застосування і традиції. Природні залишки можуть підрозділятись на класи на основі властивостей звичайних бічних ланцюгів: 1) гідрофобні: норлейцин (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro; 2) полярні гідрофільні: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr; 3) аліфатичні: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro; 4) аліфатичні гідрофобні: Ala, Ile, Leu, Val, Pro; 5) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 6) кислі: Asp, Glu; 7) основні: His, Lys, Arg; 8) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: Gly, Pro; 9) ароматичні: His, Trp, Tyr, Phe; і 10) ароматичні гідрофобні: Phe, Trp, Tyr. Консервативні амінокислотні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів іншим членом того самого класу. Консервативні амінокислотні заміни можуть охоплювати штучні амінокислотні залишки, які, як правило, включаються скоріше хімічним синтезом пептидів, аніж синтезом у біологічних системах. Сюди включаються пептидоміметики та інші обернені або інвертовані форми амінокислотних складових. Неконсервативні заміни можуть включати заміну члена одного з цих класів членом іншого класу. Такі замінені залишки можуть вводитись на ділянки людського антитіла, що є гомологічними з антитілами нелюдського походження або на негомологічні ділянки молекули. У разі здійснення таких замін, за певними варіантами здійснення, до уваги може прийматись гідропатичний індекс амінокислот. Кожній амінокислоті, на основі характеристик її гідрофобності та заряду, був приписаний гідропатичний індекс. Вони є такими: ізолейцин (+4,5); валін (+4,2); лейцин (+3,8); фенілаланін (+2,8); цистеїн/цистин (+2,5); метіонін (+1,9); аланін (+1,8); гліцин (0,4); треонін (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролін (-1,6); гістидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамін (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагін (-3,5); лізин (-3,9); і аргінін (-4,5). Важливість гідропатичного індексу амінокислот при наданні білку інтерактивної біологічної функції є зрозумілою у цій галузі (дивись, наприклад, Кайт (Kyte) та інші, 1982, J. Mol. Biol., 157:105-131). Відомо, що певні амінокислоти можуть бути замінені іншими амінокислотами, що мають подібний гідропатичний індекс або коефіцієнт, і зберегти, як і досі, подібну біологічну активність. При здійсненні замін, виходячи з гідропатичного індексу, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах 2. За певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах 1, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, гідропатичні індекси яких знаходяться у межах 0,5. У цій галузі зрозуміло також, що заміна подібних амінокислот може здійснюватись ефективніше на основі гідрофільності, зокрема, у тому разі, коли одержаний таким чином біологічно функціональний білок або пептид призначається для застосування у імунологічних варіантах здійснення, що розкриваються у цьому описі. За певними варіантами здійснення найбільша місцева середня гідрофільність білка, яка регулюється гідрофільністю прилеглих амінокислот, корелює з його імуногенністю та антигенністю, тобто з біологічними властивостями білка. Цим амінокислотним залишкам були приписані наведені нижче значення гідрофільності: аргінін (+3,0); лізин (+3,0); аспартат (+3,01); глутамат (+3,01); серин (+0,3); аспарагін (+0,2); глутамін (+0,2); гліцин (0); треонін (-0,4); пролін (-0,51); аланін (-0,5); гістидин (-0,5); цистеїн (1,0); метіонін (-1,3); валін (-1,5); лейцин (-1,8); ізолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенілаланін (-2,5); і триптофан (-3,4). При здійсненні замін, виходячи з подібних значень гідрофільності, за певними варіантами здійснення включають заміну амінокислот, значення гідрофільності яких знаходяться у межах 2, за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах 1, і за певними варіантами здійснення включають амінокислоти, значення гідрофільності яких знаходяться у межах 0,5. За послідовностями основних амінокислот, на основі гідрофільності, можуть також бути ідентифіковані антигенні детермінанти. Ці ділянки називають також “коровими ділянками антигенних детермінант”. 16 UA 102775 C2 Зразкові амінокислотні заміни наведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Амінокислотні заміни Вихідні залишки Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val 5 10 15 20 25 30 Зразкові заміни Val, Leu, He Lys, Gln, Asn Gln Glu Ser, Ala Asn Asp Pro, Ala Asn, Gln, Lys, Arg Leu, Val, Met, Ala, Phe, норлейцин норлейцин, Ile, Val, Met, Ala, Phe Arg, 1,4 діаміномасляна кислота, Gln, Asn Leu, Phe, Ile Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Ala Thr, Ala, Cys Ser Tyr, Phe Trp, Phe, Thr, Ser Ile, Met, Leu, Phe, Ala, норлейцин Заміни, яким віддають перевагу Val Lys Gln Glu Ser Asn Asp Ala Arg Leu Ile Arg Leu Leu Gly Thr Ser Tyr Phe Leu Досвідчений фахівець зможе визначити відповідні варіанти поліпептиду, як наведено у цьому описі, із застосуванням добре відомих методів. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може визначити відповідні ділянки молекули, які можуть бути змінені без руйнування активності, обираючи мішенню ті ділянки, які, як гадають, не є важливими для активності. За іншими варіантами здійснень досвідчений фахівець може визначити залишки та ділянки молекул, які зберігаються серед подібних поліпептидів. За додатковими варіантами здійснень навіть ділянки, які можуть бути важливими для біологічної активності або для структури, можуть бути піддані консервативним амінокислотним замінам без знищення біологічної активності або без виявлення негативного впливу на структуру поліпептидів. На додаток до цього, фахівець у цій галузі може переглянути дані структурнофункціональних досліджень, які визначають залишки подібних поліпептидів, що є важливими для активності або структури. Приймаючи до уваги результати такого порівняння, досвідчений фахівець може прогнозувати важливість амінокислотних залишків у білку, що відповідають амінокислотним залишкам, важливим для активності або структури у подібних білків. Фахівець у цій галузі для таких визначених важливих амінокислотних залишків може вибрати хімічно подібні амінокислотні заміни. Фахівець у цій галузі може також проаналізувати об’ємну структуру і амінокислотну послідовність у зв’язку з такою структурою у подібних поліпептидів. Приймаючи до уваги таку інформацію, фахівець у цій галузі може прогнозувати впорядковане розміщення амінокислотних залишків антитіла відповідно до його об’ємної структури. За певними варіантами здійснення фахівець у цій галузі може уникнути варіанта внесення радикальних змін до амінокислотних залишків, які передбачаються на поверхні білка, оскільки такі залишки можуть бути залученими до важливих взаємодій з іншими молекулами. Більше того, фахівець у цій галузі може розробити експериментальні варіанти, які включають заміну однієї амінокислоти на кожному бажаному амінокислотному залишку. Після цього згадані варіанти можуть перевірятись у реакціях визначення активності, відомих фахівцям у цій галузі. Такі варіанти можуть застосовуватись для збирання інформації щодо прийнятних варіантів. Наприклад, у разі визначення того, що наслідком заміни певного амінокислотного залишку є знищена, небажано знижена або невідповідна активність, варіанти з такою заміною можуть виключатись. Іншими словами, виходячи з інформації, зібраної шляхом подібних звичайних експериментів, фахівець 17 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у цій галузі може легко визначити амінокислоти, які слід виключити з процесу замін або самостійно, або у поєднанні з іншими мутаціями. Ряд наукових публікацій присвячено прогнозуванню вторинної структури. Дивись Молт (Moult), 1996, Curr. Op. in Biotech., 7:422-427; Чу (Chou) та інші, 1974, Biochemistry, 13:222-245; Чу (Chou) та інші, 1974, Biochemistry, 113:211-222; Чу (Chou) та інші, 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148; Чу (Chou) та інші, 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; Чу (Chou) та інші, 1979, Biophys. J., 26:367-384. Крім того, зараз є доступними комп’ютерні програми, які допомагають визначити вторинну структуру. Один із методів прогнозування вторинної структури базується на моделюванні гомології. Наприклад, два поліпептиди або білки, що мають ідентичність послідовності, яка перевищує 30 %, або подібність, яка перевищує 40 %, часто мають подібну структурну топологію. Нещодавнє збільшення обсягу бази даних із структури білків (PDB) забезпечує значне посилення ступеню прогнозованості вторинної структури, у тому числі потенційної кількості складок у межах структури поліпептиду або білка. Дивись Холм (Holm) та інші, 1999, Nucl. Acid. Res., 27:244-247. Висунули припущення (Бреннер (Brenner) та інші, 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:369-376) про існування обмеженої кількості складок у даного поліпептиду або білка і про те, що після визначення критичної кількості структур, структурне прогнозування стане набагато точнішим. Додаткові методи прогнозування вторинної структури включають “нарізання різьби” (Джоунс (Jones), 1997, Curr. Op. Struct. Biol., 7:377-387; Сіппл (Sippl) та інші, 1996, Structure 4:15-19), “аналіз профілю” (Боуі (Bowie) та інші, 1991, Science 253:164-170; Грібсков (Gribskov) та інші, 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Грібсков (Gribskov) та інші, 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:43554358) та “еволюційний зв’язок” (дивись Холм (Holm), 1999, (дивись вище); та Бреннер (Brenner), 1997 (дивись вище)). За певними варіантами здійснення варіанти антитіл включають глікозиловані варіанти, де кількість та/або тип сайту глікозилування був змінений, порівняно з амінокислотними послідовностями вихідного поліпептиду. За певними варіантами здійснення білкові варіанти включають більшу або меншу кількість N-зв’язаних сайтів глікозилування, аніж нативний білок. N-зв’язаний сайт глікозилування характеризується послідовністю: Asn-X-Ser або Asn-X-Thr, де амінокислотним залишком, позначеним як X, може бути будь-який амінокислотний залишок, за винятком проліну. Заміна амінокислотних залишків для одержання цієї послідовності забезпечує одержання потенційно нового сайту для додання N-зв’язаного вуглеводного ланцюга. За альтернативним варіантом заміни, які ліквідують цю послідовність, будуть видаляти існуючий N-зв’язаний вуглеводний ланцюг. Пропонується також реаранжування Nзв’язаних вуглеводних ланцюгів, де один або декілька N-зв’язаних сайтів глікозилування (як правило, природних) ліквідуються з утворенням одного або декількох нових N-зв’язаних сайтів. Додаткові варіанти антитіл, яким віддають перевагу, включають цистеїнові варіанти, де, порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю, один або декілька цистеїнових залишків видаляють або замінюють на іншу амінокислоту (наприклад, серин). Цистеїнові варіанти можуть бути прийнятними у тому разі, коли антитіла повинні повторно укладатись до біологічно активної конформації, такої як, наприклад, після виділення нерозчинних тілець включення. Цистеїнові варіанти, як правило, мають меншу кількість залишків цистеїну, аніж нативний білок і, типово, мають парну їх кількість для зведення до мінімуму взаємодій, що є наслідком неспарованих залишків цистеїну. За додатковими варіантами здійснення варіанти антитіл можуть включати антитіла, що містять модифікований Fc-фрагмент або модифіковану константну ділянку важкого ланцюга. Fcфрагмент (де скорочення означає “фрагмент, що кристалізується”) або константна ділянка важкого ланцюга можуть бути модифіковані шляхом мутації для надання антитілу змінених характеристик зв’язування. Дивись, наприклад, Бартон (Burton), Вуф (Woof), 1992, Advances in Immunology 51:1-84; Равеч (Ravetch), Болланд (Bolland), 2001, Annu. Rev. Immunol. 19:275-290; Шілдс (Shields) та інші, 2001, Journal of Biol. Chem. 276:6591-6604; Теллман (Telleman), Джунханс (Junghans), 2000, Immunology 100:245-251; Медсан (Medesan) та інші, 1998, Eur. J. Immunol. 28:2092-2100; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання. Такі мутації можуть включати заміни, додання, делеції або будь-яку їх комбінацію, і здійснюються, як правило, сайт-спрямованим мутагенезом із застосуванням одного або декількох мутагенних олігонуклеотидів за методами, опис яких наведено у цьому описі, або за методами, відомими у цій галузі (дивись, наприклад, Сембрук (Sambrook) та інші, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3 видання, 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. та Бергер (Berger), Кіммел (Kimmel), METHODS IN ENZYMOLOGY, том 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, штат Каліфорнія, які включено до цього опису шляхом посилання). 18 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За певними варіантами здійснення амінокислотними замінами є заміни, які: (1) знижують сприйнятливість до протеолізу, (2) знижують сприйнятливість до окиснення, (3) змінюють зв’язувальну спорідненість для утворення білкових комплексів, (4) змінюють зв’язувальні спорідненості та/або (5) надають або модифікують інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких поліпептидів. За певними варіантами здійснення одиночна амінокислотна заміна або численні амінокислотні заміни (за певними варіантами здійснення консервативні амінокислотні заміни) можуть здійснюватись у природній послідовності (за певними варіантами здійснення на ділянці поліпептиду за межами домену(-ів), що забезпечує міжмолекулярні контакти). За варіантами здійснення, яким віддають перевагу, консервативна амінокислотна заміна, як правило, суттєво не змінює структурних характеристик вихідної послідовності (наприклад, замінна амінокислота не руйнує спіралі, що існує у вихідній послідовності, і не руйнує вторинної структури інших типів, що характеризує вихідну послідовність). Приклади визнаних у цій галузі вторинних та третинних структур поліпептидів описані у PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, (редактор Крейтон (Creighton)), 1984, W.H. Freeman and Company, New York; INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (редактори К. Бренден (C. Branden), Дж. Туз (J. Tooze)), 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.; Торнтон (Thornton) та інші, 1991, Nature 354:105; кожну з цих робот включено до цього опису шляхом посилання. Аналоги пептидів широко застосовують у фармацевтичній промисловості як непептидні лікарські засоби з властивостями, аналогічними властивостям матричного пептиду. Непептидні сполуки такого типу називають “пептидними міметиками” або “пептидоміметиками”. Дивись Фошер (Fauchere), 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Вебер (Veber), Фрідінгер (Freidinger), 1985, TINS, 392; Еванс (Evans) та інші, 1987, J. Med. Chem. 30:1229; усі ці роботи включено до цього опису шляхом посилання для будь-яких цілей. Такі сполуки часто розробляються із застосуванням комп’ютеризованого молекулярного моделювання. Пептидоміметики, структурно подібні до терапевтично прийнятних пептидів, можуть застосовуватись для одержання подібного терапевтичного або профілактичного ефекту. Взагалі, пептидоміметики є структурно подібними до парадигматичного поліпептиду (тобто поліпептиду, що має біохімічну властивість або фармакологічну активність), наприклад, людського антитіла, але мають один або декілька пептидних зв’язків, факультативно заміненими зв’язком, вибраним з групи, що включає: -CH2NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (цис і транс), -COCH2-, -CH(OH)CH2- і -CH2SO-, методами, добре відомими у цій галузі. Систематична заміна однієї або декількох амінокислот консенсусної послідовності на D-амінокислоту того самого типу (наприклад, D-лізин замість Lлізину) може застосовуватись у певних варіантах здійснення для одержання більш стійких пептидів. На додаток до цього, обмежені пептиди, що містять консенсусну послідовність або по суті ідентичний варіант консенсусної послідовності, можуть одержуватись із застосуванням методів, відомих у цій галузі (Різо (Rizo), Гераш (Gierasch), 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387; ця робота включена до цього опису шляхом посилання для будь-якої мети); наприклад, шляхом додання внутрішніх залишків цистеїну, здатних до утворення міжмолекулярних дисульфідних містків, які циклізують пептид. Термін “антитіло” або “антитіло-пептид(-и)” означає інтактне антитіло або його зв’язувальний фрагмент, що конкурує з інтактним антитілом за специфічне зв’язування. За певними варіантами здійснення зв’язувальні фрагменти одержують методами рекомбінантних ДНК. За додатковими варіантами здійснення зв’язувальні фрагменти одержують шляхом ферментативного або хімічного розщеплення інтактних антитіл. Зв’язувальні фрагменти включають (але ними не обмежуються) F(ab), F(ab), F(ab)2, Fv та одноланцюгові антитіла. Термін “важкий ланцюг” включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно NGF. Термін “легкий ланцюг” включає будь-який імуноглобуліновий поліпептид, що має достатню послідовність варіабельної ділянки для надання специфічності відносно NGF. Непроцесований важкий ланцюг включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, VH-ділянку, та три константні ділянки важкого ланцюга, CH1, CH2 і CH3. VH-ділянка знаходиться на амінокінці поліпептиду, CH3-ділянка знаходиться на карбоксильному кінці. Термін “важкий ланцюг”, який вживається у цьому описі, означає непроцесований важкий ланцюг та його фрагменти. Непроцесований легкий ланцюг включає варіабельну ділянку легкого ланцюга, VL-ділянку, та константну ділянку легкого ланцюга, CL-ділянку. Подібно важкому ланцюгу, варіабельна ділянка легкого ланцюга знаходиться на амінокінці поліпептиду. Термін “легкий ланцюг”, який вживається у цьому описі, означає непроцесований легкий ланцюг та його фрагменти. F(ab)-фрагмент включає один легкий ланцюг, CH1 і варіабельні ділянки одного важкого ланцюга. Важкий ланцюг молекули F(ab) не може утворювати дисульфідний зв’язок з іншою молекулою важкого ланцюга. F(ab ) 19 UA 102775 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагмент включає один легкий ланцюг і один важкий ланцюг, що містить більшу частину константної ділянки, між ділянками CH1 і CH2, завдяки чому між двома важкими ланцюгами може утворюватись міжланцюговий дисульфідний зв’язок з утворенням молекули F(ab )2. Fv-ділянка включає варіабельні ділянки як важкого, так і легкого ланцюгів, однак їй бракує константних ділянок. Одноланцюгові антитіла є молекулами Fv, у яких варіабельні ділянки важкого і легкого ланцюгів з’єднуються гнучким лінкером з утворенням одного поліпептидного ланцюга, який являє собою антигензв’язувальну ділянку. Одноланцюгові антитіла докладно обговорюються у публікації міжнародної заявки на WO 88/01649 і патентах США № 4,946,778 і № 5,260,203. Слід розуміти, що двовалентне антитіло, крім “мультиспецифічного” або “мультифункціонального” антитіла, за певними варіантами здійснення включає зв’язувальні сайти, що мають ідентичну антигенну специфічність. При визначенні зв’язування та специфічності антитіла за цим винаходом, антитіло по суті пригнічує адгезію ліганду до рецептора, коли надлишок антитіла зменшує кількість ліганду, зв’язаного з рецептором щонайменше приблизно на 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % або більше (що визначається, inter alia, із застосуванням in vitro реакції конкурентного зв’язування). Словосполучення “нейтралізуюче антитіло” означає молекулу антитіла, здатну блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію антигена-мішені, з яким вона зв’язується. Відповідно, “нейтралізуюче” анти-NGF антитіло є здатним блокувати або суттєво знизити ефекторну функцію NGF, наприклад, зв’язування з рецептором та/або викликання клітинної реакції. Словосполучення “суттєво знизити” означає щонайменше приблизно 60 %, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше приблизно 70 %, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше приблизно 75 %, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 80 %, за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, щонайменше приблизно 85 %, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше приблизно 90 % зниження ефекторної функції антигена-мішені (наприклад, людського NGF). Термін “антигенна детермінанта” включає будь-яку детермінанту, за варіантом, якому віддають перевагу, поліпептидну детермінанту, здатну до специфічного зв’язування з імуноглобуліном або Т-клітинним рецептором. За певними варіантами здійснення антигенні детермінанти включають хімічно активні поверхневі групи молекул, наприклад, амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і за певними варіантами здійснення можуть мати специфічні об’ємні структурні характеристики та/або специфічні зарядні характеристики. Антигенна детермінанта являє собою ділянку антигену, яка зв’язується антитілом. За певними варіантами здійснення кажуть, що антитіло специфічно зв’язується з антигеном, коли воно переважно розпізнає свій антиген-мішень у складній суміші білків та/або макромолекул. За варіантами, яким віддають перевагу, кажуть, що антитіло специфічно -8 зв’язується з антигеном, коли константа дисоціації у стані рівноваги становить 10 M, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, коли константа дисоціації у стані рівноваги -9 становить 10 M і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, коли константа дисоціації -10 у стані рівноваги становить 10 M. Антитіло зв’язує “по суті ту саму антигенну детермінанту”, що і еталонне антитіло, коли два антитіла розпізнають ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються. Найширше застосовуваними і швидкими методами визначення того, чи зв’язують два антитіла ідентичні антигенні детермінанти або антигенні детермінанти, що стерично перекриваються, є конкурентні реакції, які можуть розроблятись для здійснення у найрізноманітніших форматах, із застосуванням міченого антигену або міченого антитіла. Як правило, антиген іммобілізують на субстраті, і здатність немічених антитіл до блокування зв’язування мічених антитіл визначається із застосуванням радіоактивних або ферментних міток. Термін “агент” вживають у цьому описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів. Терміни “мітка” або “мічений”, які вживаються у цьому описі, означають включення виявного маркера, наприклад, шляхом включення амінокислоти, міченої радіоактивним ізотопом, або приєднання до поліпептиду біотинових складових, які можуть бути виявлені міченим авідином (наприклад, стрептавідином, який, за варіантом, якому віддають перевагу, містить виявний маркер, наприклад, флуоресцентний маркер, хемілюмінесцентний маркер, або який має ферментативну активність, що може бути виявлена оптичними або колориметричними методами). За певними варіантами здійснення згадана мітка може також бути терапевтичною. У цій галузі відомі різні методи мічення поліпептидів і глікопротеїнів, які можуть ефективно бути застосовані у методах, що розкриваються у цьому описі. Прикладами міток для поліпептидів є (але ними не обмежуються) наведені нижче: радіоактивні ізотопи або радіоактивні нукліди 20 UA 102775 C2 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14 15 35 90 99m 111 125 131 (наприклад, H, C, N, S, Y, Tc, In, I, I), флуоресцентні мітки (наприклад, флуоресцинізотіоціанат або FITC, родамін або лантаноїдні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза з хрону, β-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні мітки, гаптенові мітки, наприклад, біотинільні групи, та попередньо визначені поліпептидні антигенні детермінанти, розпізнані вторинним репортером (наприклад послідовності зі зв’язаними парами залишків лейцину, зв’язувальні сайти вторинних антитіл, ділянки зв’язування металів або мітки антигенних детермінант). За певними варіантами здійснення мітки приєднуються спейсерними групами (наприклад (CH 2)n, де n