Цитомегаловірус, який умовно реплікується, як вакцина проти cmv

Реферат: UA 114896 C2 (12) UA 114896 C2 Винахід стосується умовно-дефектного по реплікації цитомегаловірусу (CMV), який містить пентамерний gH-комплекс, який включає в себе UL128, UL130, UL131, gH і gL та нуклеїнову кислоту, що кодує перший злитий білок між ІЕ1/2 і дестабілізуючим білком та другий злитий білок між UL51 і дестабілізуючим білком, причому дестабілізуючий білок є похідним FK506зв’язувального білка (FKBP), що має амінокислотні заміни F36V і L106P, де дикий тип IE1/2 і UL51 більше не присутній та де CMV є атенуйованим штамом, який відновлює складну експресію gH завдяки репарації мутації в гені UL131. UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується способів індукції імунної відповіді на цитомегаловірус (CMV) з використанням генетично модифікованого CMV, який є умовно-дефектним по реплікації. Даний винахід також стосується CMV, який був змінений рекомбінантними методами для створення можливості зовнішнього контролю над вірусною реплікацією. Композиції, які містять дефектний по реплікації CMV, також охоплені даним винаходом. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Цитомегаловірус (CMV), також відомий як вірус герпесу людини 5 типу (HHV-5), являє собою вірус герпесу, що класифікується як член підсімейства бета сімейства вірусів герпесу. Згідно з даними Центра по контролю і профілактиці захворювань, CMV інфекція поширена в людській популяції практично повсюдно, за оцінками ним інфіковані 40-80 % дорослого населення США. Вірус розповсюджується переважно через біологічні рідини і часто передається від вагітних жінок плоду або новонародженому. У більшості людей CMV інфекція протікає в латентній формі, хоча активація вірусу може приводити до високої температури, ознобу, підвищеної стомлюваності, головних болів, нудоти і спленомегалії. При тому, що в більшості випадків CMV інфекція у людини протікає безсимптомно, CMV інфекція у осіб з імунодефіцитом (таких як ВІЛ-позитивні пацієнти, пацієнти з алогенними трансплантатами і онкологічні пацієнти) або у осіб з незрілою імунною системою (таких як новонароджені) може бути здатна викликати особливо великі проблеми (Mocarski et al., Cytomegalovirus, в "Field Virology", 2701-2772, під редакцією: Knipes і Howley, 2007). CMV інфекція у таких осіб може викликати тяжкі клінічні прояви, включаючи пневмонію, гепатит, енцефаліт, коліт, увеїт, ретиніт, сліпоту і невропатію, серед інших хворобливих станів. Крім того, CMV інфекція під час вагітності є основною причиною вроджених дефектів дітей (Adler, 2008 J. Clin Virol, 41: 231; Arvin et al., 2004 Clin Infect Dis, 39: 233; Revello et al., 2008 J Med Virol, 80: 1415). CMV інфікує різні клітини in vivo, включаючи моноцити, макрофаги, дендритні клітини, нейтрофіли, ендотеліальні клітини, епітеліальні клітини, фібробласти, нейрони, гладком'язові клітини, гепатоцити і стромальні клітини (Plachter et al. 1996, Adv. Virus Res. 46: 195). Хоча клінічні ізоляти CMV реплікуються в клітинах різних типів, лабораторні штами AD169 (Elek & Stern, 1974, Lancet 1: 1) і Towne (Plotkin et al., 1975, Infect. Immun. 12: 521) реплікуються майже винятково в фібробластах (Hahn et al., 2004, J. Virol. 78: 10023). Обмеження по тропізму, що є результатом серійних пасажів і в кінцевому результаті пристосування вірусу до фібробластів, є зумовленим маркером атенуації (Gerna et al., 2005, J. Gen. Virol. 86: 275; Gerna et al., 2002, J. Gen Virol. 83: 1993; Gerna et al., 2003, J. Gen Virol. 84: 1431; Dargan et al., 2010, J. Gen Virol. 91: 1535). Мутації, що викликають втрату тропізму до епітеліальних клітин, ендотеліальних клітин, лейкоцитів і дендритних клітин у лабораторних штамів людського CMV, були картовані в трьох відкритих рамках зчитування (ORF): UL128, UL130 і UL131 (Hahn et al., 2004, J. Virol. 78: 10023; Wang and Shenk, 2005 J. Virol. 79: 10330; Wang and Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA. 102: 18153). Біохімічні і відновні дослідження показали, що UL128, UL130 і UL131 збираються в каркасну структуру gH/gL, утворюючи пентамерний gH-комплекс (Wang and Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA, 102: 1815; Ryckman et al., 2008 J. Virol. 82: 60). Відновлення цього комплексу у віріонах відновлює тропізм вірусів до епітеліальних клітин в лабораторних штамах (Wang and Shenk, 2005 J. Virol. 79: 10330). Втрату тропізму до ендотеліальних і епітеліальних клітин вважали недоліком у таких раніше вивчених вакцин, як Towne (Gerna et al., 2002, J. Gen Virol. 83: 1993; Gerna et al., 2003, J. Gen Virol. 84: 1431). Нейтралізуючі антитіла в сироватці людей, природним чином інфікованих CMV, мали підвищену більше ніж в 15 разів активність, перешкоджаючу проникненню вірусу в епітеліальні клітини, в порівнянні з активністю, перешкоджаючою проникненню в фібробласти (Cui et al., 2008 Vaccine 26: 5760). У людей з первинною інфекцією швидко виробляються нейтралізуючі антитіла, перешкоджаючі проникненню вірусу в епітеліальні і ендотеліальні клітини, але повільно виробляються нейтралізуючі антитіла, перешкоджаючі проникненню в фібробласти (Gerna et al., 2008 J. Gen. Virol. 89: 853). Більше того, нейтралізуюча активність, перешкоджаюча проникненню вірусу в епітеліальні і ендотеліальні клітини, відсутня в імунній сироватці людей, які отримували вакцину Towne (Cui et al., 2008 Vaccine 26: 5760). Зовсім нещодавно була описана панель людських моноклональних антитіл від чотирьох донорів, інфікованих HCMV, і більш активні нейтралізуючі клони з панелі впізнавали антигени пентамерного gH-комплексу (Macagno et al., 2010 J. Virol. 84: 1005). СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується умовно-дефектного по реплікації CMV (rdCMV) і застосування rdCMV в композиціях і способах для лікування і/або зниження імовірності CMV інфекції або патології, пов'язаної з такою інфекцією, у пацієнта. Описаний тут rdCMV містить нуклеїнову 1 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоту, що кодує один або більше злитих білків, що включають необхідний білок, злитий з дестабілізуючим білком. За відсутністю стабілізатора злитий білок руйнується. Таким чином, rdCMV можна вирощувати в тканинній культурі в умовах, що допускають реплікацію (тобто, в присутності стабілізатора), але реплікація зменшується, і переважно відвертається, при введенні пацієнту (за відсутністю стабілізатора). Один варіант здійснення даного винаходу стосується умовно-дефектного по реплікації CMV. rdCMV містить нуклеїнову кислоту, що кодує один або більше злитих білків, що включають необхідний білок, злитий з дестабілізуючим білком. Нуклеїнові кислоти, що кодують необхідний білок дикого типу, більше не присутні в rdCMV, і, таким чином, злитий білок є необхідним для вірусної реплікації. У переважних варіантах здійснення необхідні білки вибирають з групи, яка складається з IE1/2, UL51, UL52, UL79 і UL84, і дестабілізуючий білок являє собою FKBP або його похідне. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується композиції, що містить виділений rdCMV і фармацевтично прийнятний носій. Композиція може додатково містити ад'ювант, включаючи, але без обмеження, ад'ювант ISCOMATRIX® і алюміній-фосфатний ад'ювант. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується застосування композиції rdCMV для індукції імунної відповіді проти CMV у пацієнта. Пацієнтів можна лікувати профілактично або терапевтично шляхом введення rdCMV за даним винаходом. Профілактичне лікування забезпечує достатній захисний імунітет для зниження імовірності або тяжкості CMV інфекції, включаючи первинні інфекції, рецидивуючі інфекції (тобто, ті, які виникають в результаті реактивації латентного CMV) і суперінфекції (тобто, ті, які виникають внаслідок інфікування штамом CMV, відмінним від того, яким пацієнт був інфікований раніше). У конкретних варіантах здійснення жінок дітородного віку, особливо дівчаток-підлітків, вакцинують для зниження імовірності CMV інфекції (як первинної, так і рецидивуючої або суперінфекції) під час вагітності і, таким чином, зниження імовірності передачі CMV плоду. Терапевтичне лікування можна проводити для зниження тривалості/тяжкості поточної CMV інфекції. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується способів отримання rdCMV за винаходом, що включають розмноження rdCMV в епітеліальних клітинах, таких як клітини ARPE-19 (ATCC, реєстраційний № CRL-2302), в присутності Shield-1. У деяких варіантах здійснення rdCMV розмножують в епітеліальних клітинах на мікроносіях або інших системах клітинних культур високої густини. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1A-1B демонструють схематичну діаграму конструкції штаму CMV з відновленою експресією пентамерного gH-комплексу. (А) Стратегія отримання бактеріальної штучної хромосоми (BAC), яка самовидаляється, для маніпуляцій з вірусним геномом AD169. (В) Виправлення мутації зі зсувом рамки в UL131 для відновлення його експресії. (С) Заміна GFP геном cre-рекомбінази для створення BAC, яка самовидаляється, CMV. Фіг. 2A-2D демонструють вплив загальноприйнятих способів інактивації на імуногенність gHкомплексу. Використовували γ-опромінення (А, В) і β-пропіолактон (BPL) (С, D) для інактивації експресуючого gH-комплекс CMV. Кінетику інактивації визначали аналізом бляшкоутворення (А, С), а імуногенність визначали, оцінюючи сироватку мишей, яким вводили CMV, на нейтралізуючу активність проти проникнення вірусу в епітеліальні клітини (В, D). Фіг. 3 демонструє залежну від концентрації Shield-1 продукцію вірусного потомства експресуючого gH-комплекс CMV з різними необхідними білками, злитими з похідним FKBP. Клітини ARPE-19 інфікували вірусами rdCMV при множинності зараження 0,01 БУО/клітину протягом 1 години, двічі промивали свіжим середовищем і інкубували в ростовому середовищі, що містить 0, 0,05, 0,1 0,5 або 2 мкМ Shield-1. Через сім днів після інфікування позаклітинний вірус збирали, і титри вірусу визначали аналізом TCID50 на клітинах ARPE-19 в присутності 2 мкМ Shield-1. Фіг. 4A-4D демонструють кінетику зростання rdCMV в клітинах ARPE-19. Клітини інфікували вірусами, що містять злиті білки з (А) IE1/2, (В) UL51, (С) IE1/2-UL51, або (D) батьківським вірусом beMAD при множинності зараження 0,01 БУО/клітину. Через одну годину клітини двічі промивали свіжим середовищем і інкубували за відсутністю (незафарбовані кружки) або в присутності (зафарбовані кружки) 2 мкМ Shield-1. Позаклітинний вірус збирали у вказані моменти часу після інфікування, і інфекційний вірус кількісно визначали аналізом TCID50 на клітинах ARPE-19 в середовищі, що містить 2 мкМ Shield-1. Фіг. 5A-5E. Кінетика зростання rdCMV IE1/2-UL51 в клітинах різного типу. Клітини (А) MRC-5, (В) HUVEC, (С) AoSMC, (D) SKMC, (Е) CCF-STTG1 інфікували вірусом rdCMV і інкубували протягом однієї години. Клітини двічі промивали свіжим середовищем, а потім інкубували за відсутністю (незафарбовані кружки) або в присутності (зафарбовані кружки) 2 мкМ Shield-1. 2 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Позаклітинний вірус збирали у вказані моменти часу після інфікування, і інфекційний вірус кількісно визначали аналізом TCID50 на клітинах ARPE-19 в середовищі, що містить 2 мкМ Shield-1. Фіг. 6A-6C. Аналіз імуногенності rdCMV IE1/2-UL51 на мишах, кроликах і макаках-резус. (А) Мишей імунізували в тижні 0 і 4 beMAD (незафарбовані кружки) або rdCMV IE1/2-UL51 (зафарбовані кружки). (В) Кроликів імунізували в тижні 0, 3 і 8, використовуючи 10 мкг beMAD або вказаних rdCMV. (С) Макак-резус імунізували в тижні 0 і 8, використовуючи 100 мкг beMAD або rdCMV IE1/2-UL51. У кожному випадку зразки сироватки збирали і аналізували за допомогою мікроаналізу нейтралізації CMV на клітинах ARPE-19. Лінії вказують середнє геометричне титрів нейтралізуючих антитіл (NT50) в кожній групі. Фіг. 7 представляє протяжні у часі титри нейтралізуючих антитіл у макак-резус, вакцинованих вірусом з подвійним злиттям IE1/2-UL51. Групи макак-резус (n=5) вакцинували вказаними дозами вакцин або препаратів в тижні 0, 8 і 24 (показано червоними трикутниками), в той час як одна група отримувала gb/mf59 (30 мг/доза) в тижні 0, 4 і 24. Імунні сироватки збирали у вказані моменти часу і оцінювали в аналізі на нейтралізацію вірусу. GMT титрів NT50 накреслювали протягом часу зі стандартною помилкою для групи. AAHS: аморфний гідроксифосфат-сульфат алюмінію; IMX: ISCOMATRIX; HNS: базовий буфер. Фіг. 8A-8D представляють результати аналізу ELISPOT на IFN-γ у макак-резус, вакцинованих вірусом з подвійним злиттям IE1/2-UL51 при використанні або 100 мкг (А), або 10 мкг (B-D) на дозу. Ад'ювант або не використовували (A-B), або використовували AAHS (С) або ISCOMATRIX (D). PBMC стимулювали пулами пептидів, що представляють антигени HCMV. Сірі стовпчики представляють GMT для кожного антигену в групі (n=5). Частота позитивної відповіді для кожного антигену вказана зверху кожного антигену в панелях. Фіг. 9A-9B демонструють, що вакцинація вірусом з подвійним злиттям IE1/2-UL51 здатна викликати Т-клітинні відповіді як CD8+ (А), так і CD4+ (В) фенотипів у макак-резус. PBMC збирали від мавп, що отримували дозу або 100 мкг, або 10 мкг вакцини з ISCOMATRIX® як ад'ювант. PBMC стимулювали пулами пептидів, що представляють антигени HCMV, з подальшим фарбуванням на IFN-γ і CD4+/CD8+ поверхневі Т-клітинні маркери. Дані представлені у вигляді кількості позитивних по CD4+/CD8+, позитивних по IFN-γ клітин на мільйон PBMC. Лінії представляють значення середнього геометричного титрів (GMT) в групі, що отримувала одну і ту ж вакцину (n=5). Цифри в нижній частині графіків являють собою GMT в обох вакцинованих групах (n=10). CMV: очищений вірус; SEB: мітоген, використаний як позитивний контроль; IMX: ISCOMATRIX. Фіг. 10 демонструє, що алюміній-фосфатний ад'ювант Merck (MAPA) здатний збільшувати титри нейтралізуючих антитіл у мавп. Мавп резус імунізували дозою 30 мкг вакцини вірусу з подвійним злиттям, сформульованою в HNS (базовому буфері), AAHS або MAPA, в тижні 0 і 8. Зразки сироватки збирали в тиждень 12 і оцінювали відносно титрів нейтралізуючих антитіл. Лінії представляють значення геометричного середнього для групи. Фіг. 11A-11B демонструють стабільність експресуючого gH CMV в збалансованому сольовому розчині Хенка (HBSS) при різних температурах. (А) Зразки CMV в HBSS зберігали при вказаних значеннях температури протягом 4 днів до того, як вимірювали стабільність вірусу CMV за допомогою аналізу на проникнення вірусу. (В) Величини EC50 розраховували для зразків, використовуючи результати аналізу на проникнення вірусу. * вказує на те, що EC50 неможливо розрахувати в результаті повної втрати інфекційності. Фіг. 12A-12B демонструють вплив pH на стабільність експресуючого gH CMV при кімнатній температурі. (А) Зразки CMV в буферах з різним значенням pH зберігали при кімнатній температурі протягом 4 днів до того, як була виміряна стабільність вірусу CMV за допомогою аналізу на проникнення вірусу. (В) Величини EC50 розраховували для зразків, використовуючи результати аналізу на проникнення вірусу. Фіг. 13A-13B демонструють вплив сечовини самої по собі або в поєднанні з хлоридом натрію на стабільність експресуючого gH вірусу CMV. (А) 2 % сечовину окремо або в поєднанні з 150 мМ NaCl додавали до CMV в 25 мМ гістидиновому буфері, pH 6, при кімнатній температурі на 4 дні перед тим, як стабільність вірусу CMV вимірювали за допомогою аналізу на проникнення вірусу. (В) Величини EC50 розраховували для зразків, використовуючи результати аналізу на проникнення вірусу. Фіг. 14A-14B демонструють вплив іонної сили на стабільність експресуючого gH вірусу CMV. (А) NaCl в зростаючих концентраціях (0 мМ, 75 мМ, 150 мМ і 320 мМ NaCl) додавали до CMV в 25 мМ гістидиновому буфері, pH 6, при кімнатній температурі на 4 дні перед тим, як стабільність вірусу CMV вимірювали за допомогою аналізу на проникнення вірусу. (В) Величини EC50 розраховували для зразків, використовуючи результати аналізу на проникнення вірусу. 3 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фіг. 15 демонструє вплив кріопротекторів на стабільність експресуючого gH вірусу CMV при проведенні циклів заморожування-розмороження. Вказані кріопротектори додавали до CMV в 25 мМ гістидиновому буфері, pH 6, і проводили три цикли заморожування-розмороження перед тим, як стабільність вірусу CMV вимірювали за допомогою аналізу на проникнення вірусу. Величини EC50 розраховували для зразків, використовуючи результати аналізу на проникнення вірусу. Фіг. 16A-16B демонструють вплив температури зберігання на індукцію нейтралізуючих CMV антитіл при дослідженні імуногенності на мишах. Мишей імунізували в день 0, і робили бустерну ін'єкцію в день 21 з подальшим забором крові в день 28. Сироватку мишей тестували на нейтралізуючі антитіла проти експресуючого gH CMV з використанням клітин ARPE-19. Титри NT50 отримували шляхом апроксимації нелінійної кривої. (А) Зразки CMV зберігали при різних значеннях температури протягом 3 місяців до вивчення імуногенності. (В) Зразки CMV зберігали при різних значеннях температури протягом 8 годин після розмороження і до вивчення імуногенності. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується умовно-дефектного по реплікації CMV (rdCMV) і застосування rdCMV в композиціях і способах для лікування і/або зниження імовірності CMV інфекції або патології, пов'язаної з такою інфекцією, у пацієнта. Описаний тут rdCMV містить нуклеїнову кислоту, що кодує один або більше злитих білків, що включають необхідний білок, злитий з дестабілізуючим білком, замість необхідного білка дикого типу. За відсутністю стабілізатора злитий білок руйнується апаратом клітини-хазяя. У присутності стабілізатора злитий білок стабілізується і не руйнується. Прийнятні злиті білки для використання за даним винаходом в достатній мірі зберігають необхідну білкову активність для полегшення вірусної реплікації в клітині-хазяїні в присутності стабілізатора і спричиняють зменшення (переважно зменшення більше ніж на 50 %, 75 %, 90 %, 95 % або 99 %) реплікації CMV за відсутністю стабілізатора. Переважно, необхідний білок для використання в злитому білку є неструктурним білком і, таким чином, не упаковується у віріони rdCMV. Прийнятні необхідні білки, визначені тут, включають білки CMV, що кодуються необхідними генами IE1/2, UL51, UL52, UL79 і UL84. Приклад дестабілізуючого білка і стабілізатора описаний в патентній публікації США 2009/0215169, в якій розкриті композиції, системи і способи модуляції стабільності білків за допомогою малих молекул. Коротко, проводять злиття білка з білком, що впливає на стабільність, FKBP або його похідним. Додана екзогенно проникаюча в клітини мала молекула, Shield-1 (Shld-1), взаємодіє з FKBP або його похідним і стабілізує злитий білок. За відсутністю Shield-1 FKBP або його похідне направляє руйнування злитого білка апаратом клітини-хазяя. У одному з варіантів здійснення даного винаходу необхідний білок CMV злитий з FKBP або його похідним. У присутності Shield-1 злитий білок стабілізується. Однак за відсутністю Shield-1 FKBP або його похідне направляє руйнування злитого білка апаратом клітини-хазяя. За відсутністю злитого білка реплікація rdCMV зменшується (переважно, на більше ніж 50 %, 75 %, 90 %, 95 % або 99 % в порівнянні з CMV, що не містить дестабілізований необхідний білок) або відвертається. Рекомбінантний вірус, що використовується в способі за винаходом, також експонує імуногенний пентамерний gH-комплекс на віріоні. Варіанти здійснення також включають рекомбінантний CMV або його композиції, описані тут, або вакцину, що містить або що складається з вказаного CMV, або композиції (i) для застосування в, (ii) для застосування як лікарського засобу для, або (iii) для застосування в отриманні лікарського засобу для: (a) терапії (наприклад, людського організму); (b) медицини; (с) інгібування реплікації CMV; (d) лікування або профілактики CMV інфекції або (е) лікування, профілактики або відстрочки початку або прогресування пов'язаного з CMV захворювання(-нь). У цих варіантах застосування рекомбінантний CMV, його композиції і/або вакцин, що містять або що складаються з вказаного CMV або композицій, необов'язково можна використовувати в поєднанні з одним або більше противірусними засобами (наприклад, противірусними сполуками або противірусними імуноглобулінами; комбінованими вакцинами, описаними нижче). Використовуваний тут термін "індукувати імунну відповідь" стосується здатності умовнодефектного по реплікації CMV викликати імунну відповідь у пацієнта, переважно ссавця, більш переважно людини, якій його вводять, при цьому відповідь включає, але без обмеження, виробництво елементів (таких як антитіла), які специфічно зв'язують і переважно нейтралізують CMV і/або викликають активацію Т-клітин. "Захисна імунна відповідь" являє собою імунну відповідь, яка знижує імовірність того, що пацієнт отримає CMV інфекцію (включаючи первинну, 4 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рецидивуючу і/або суперінфекцію), і/або полегшує щонайменше одну патологію, пов'язану з CMV інфекцією, і/або знижує тяжкість/тривалість CMV інфекції. Використовуваний тут термін "імунологічно ефективна кількість" означає кількість імуногену, здатну при введенні пацієнту викликати імунну відповідь проти CMV, яка може захистити пацієнта від CMV інфекції (включаючи первинну, рецидивуючу і/або суперінфекцію), і/або полегшити щонайменше одну патологію, пов'язану з CMV інфекцією, і/або знизити тяжкість/тривалість CMV інфекції у пацієнта. Кількість повинна бути достатньою, щоб значно знизити імовірність або тяжкість CMV інфекції. Тваринні моделі, відомі в даній галузі, можна використовувати для оцінки захисного ефекту від введення імуногену. Наприклад, імунні сироватки або імунні Т-клітини від індивідуумів, яким вводили імуноген, можна аналізувати на нейтралізуючу здатність антитіл або цитотоксичних Т-клітин або цитокін-продукуючу здатність імунних Т-клітин. Аналізи, що звичайно використовуються для такої оцінки, включають, але без обмеження, аналіз на нейтралізацію вірусу, аналіз ELISA на вірусні антигени, аналіз ELISA на цитокін інтерферон-гамма, аналіз ELISPOT на інтерферон-гамма, внутрішньоклітинне 51 фарбування різних цитокінів (ICS) і аналіз на цитотоксичність з вивільненням хрому. Тваринні моделі зі стимуляцією антигеном також можна використовувати для визначення імунологічно ефективної кількості імуногену. Використовуваний тут термін "умовно-дефектний по реплікації вірус" стосується вірусних частинок, які здатні реплікуватися в певних умовах середовища, але не в інших. У переважних варіантах здійснення вірус роблять умовно-дефектним по реплікації вірусом шляхом дестабілізації одного або більше білків, необхідних для вірусної реплікації. Нуклеїнові кислоти, що кодують недестабілізовані необхідні білки дикого типу, більше не присутні в умовнодефектному по реплікації вірусі. У умовах, в яких один або більше необхідних білків дестабілізовані, вірусна реплікація скорочується переважно на більше ніж 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % в порівнянні з реплікацією вірусу без дестабілізованих необхідних білків. Однак в умовах, які стабілізують дестабілізовані необхідні білки, вірусна реплікація може відбуватися на рівні, переважно щонайменше 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % від рівня реплікації CMV, що не містить дестабілізований необхідний білок. У більш переважних варіантах здійснення один або більше з необхідних білків дестабілізуватимуть шляхом злиття з дестабілізуючим білком, таким як FKBP або його похідне. Такі злиті білки можуть бути стабілізовані в присутності стабілізатора, такого як Shield-1. Використовуваний тут термін "rdCMV" стосується умовно-дефектного по реплікації цитомегаловірусу. У переважних варіантах здійснення імунна відповідь, що індукується дефектним по реплікації вірусом, в порівнянні з його природним вірусним аналогом є таким же або практично таким же по мірі і/або широті. У інших переважних варіантах здійснення морфологія дефектного по реплікації вірусу при електронно-мікроскопічному аналізі є невідмітною або практично такою ж, як у його природного вірусного аналога. Використовуваний тут термін "FKBP" стосується дестабілізуючого білка з SEQ ID NO: 11. Злиті білки, що містять FKBP, руйнуються апаратом клітини-хазяя. Використовуваний тут термін "похідне FKBP" стосується білка FKBP, або його частини, який був змінений в результаті однієї або більше амінокислотних замін, делецій і/або додатків. Похідні FKBP при злитті з білком зберігають практично всі зі дестабілізуючих властивостей FKBP і також зберігають практично повністю здатність FKBP стабілізуватися Shield-1. Переважні похідні FKBP мають одну або більше з наступних замін у вказаних положеннях амінокислот F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I і L106P. Похідне FKBP, що має заміни F36V і L106P (SEQ ID NO: 12), є особливо переважним. У переважних варіантах здійснення нуклеїнова кислота, що кодує FKBP або похідне FKBP, містить щонайменше деякі кодони, які звичайно не використовуються в ендогенному FKBP у людини. Це зменшує імовірність того, що FKBP або похідне FKBP в злитому білку піддається реаранжируванню або рекомбінації зі своїм аналогом в геномі людини. Послідовність нуклеїнової кислоти SEQ ID NO: 13 кодує SEQ ID NO: 12 з використанням таких кодонів. Використовувані тут терміни "Shield-1" або "Shld1" означають синтетичну малу молекулу, яка зв'язується з FKBP дикого типу і його похідними і виступає як стабілізатор. Зв'язування з похідним F36V приблизно в 1000 раз більш міцне, ніж з FKBP дикого типу (Clackson et al., 1998, PNAS 95: 10437-42). Shield-1 можна синтезувати (в основному, як описано в статтях Holt et al., 1993, J. Am. Chem. Soc. 115: 9925-38 і Yang et al., 2000, J. Med. Chem. 43: 1135-42 і Grimley et al., 2008, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18: 759) або купувати у Cheminpharma LLC (Farmington, CT) або Clontech Laboratories, INC. (Mountain View, CA). Солі Shield-1 також можна використовувати в способах за винаходом. Shield-1 має наступну структуру: 5 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Використовувані тут терміни "злитий" або "злитий білок" стосуються двох поліпептидів, скомбінованих в рамці зчитування у вигляді частин однієї безперервної послідовності амінокислот. Злиття може бути прямим, так, що між поліпептидами немає додаткових амінокислотних залишків, або опосередкованим, при якому існує невеликий амінокислотний лінкер для підвищення активності або додаткової функціональності. У переважних варіантах здійснення злиття є прямим. Використовувані тут терміни "пентамерний gH-комплекс" або "gH-комплекс" означають комплекс з п'яти вірусних білків на поверхні віріону CMV. Комплекс складається з білків, що кодуються UL128, UL130 і UL131 і зібраних в каркасну структуру gH/gL (Wang and Shenk, 2005 Proc Natl Acad Sci USA. 102: 1815; Ryckman et al., 2008 J. Virol. 82: 60). Послідовності білків комплексу зі штаму AD169 CMV вказані під реєстраційними номерами GenBank NP_783797.1 (UL128), NP_040067 (UL130), CAA35294.1 (UL131), NP_040009 (gH, також відомий як UL75) і NP 783793 (gL, також відомий як UL115). Деякі атенуйовані штами CMV мають одну або більше мутацій в UL131, так, що білок не експресується, і, отже, gH-комплекс не утворюється. У таких випадках UL131 повинен бути відновлений (за допомогою способів, таких як ті, що описані в статті Wang and Shenk, 2005 J. Virol. 79: 10330), таким чином, щоб gH-комплекс експресувався в rdCMV за винаходом. Віруси за даним винаходом експресують п'ять вірусних білків, які утворюють пентамерний gH-комплекс, і пентамерний gH-комплекс розташовується на оболонці вірусу. Використовуваний тут термін "необхідний білок" стосується вірусного білка, який необхідний для вірусної реплікації in vivo і в тканинній культурі. Приклади необхідних білків CMV включають, але без обмеження, IE1/2, UL37 × 1, UL44, UL51, UL52, UL53, UL56, UL77, UL79, UL84, UL87 і UL105. Використовуваний тут термін "дестабілізований необхідний білок" стосується необхідного білка, який експресується і виконує свої функції у вірусній реплікації і руйнується за відсутністю стабілізатора. У переважних варіантах здійснення необхідний білок злитий з дестабілізуючим білком, таким як FKBP або його похідне. У нормальних умовах росту (тобто, без присутності стабілізатора) злитий білок експресується, але руйнується апаратом клітини-хазяя. Руйнування не дозволяє необхідному білку функціонувати у вірусній реплікації, і, таким чином, має місце функціональний нокаут необхідного білка. У умовах, коли стабілізатор, такий як Shield-1, присутній, злитий білок стабілізується і може виконувати свої функції на рівні, який може підтримувати вірусну реплікацію, тобто, переважно щонайменше 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % від рівня реплікації CMV, який не містить дестабілізований необхідний білок. Дефектний по реплікації CMV У способах за даним винаходом використовують дефектний по реплікації CMV (rdCMV), який експресує пентамерний gH-комплекс. Будь-який атенуйований вірус CMV, який експресує пентамерний gH-комплекс, можна зробити дефектним по реплікації за допомогою способів за винаходом. У одному варіанті здійснення атенуйований CMV являє собою AD169, в якому була відновлена експресія gH-комплексу внаслідок виправлення мутації в гені UL131 (див. приклад 1). Умовно-дефектні по реплікації віруси являють собою мутанти, в яких один або більше необхідних вірусних білків замінені дестабілізованими аналогами необхідних білків. Дестабілізований аналог кодується нуклеїновою кислотою, яка кодує злитий білок, що складається з необхідного білка і дестабілізуючого білка. Дестабілізований необхідний білок здатний функціонувати, підтримуючи вірусну реплікацію тільки в присутності стабілізатора. У переважних варіантах здійснення способи, описані в патентній публікації США 2009/0215169, використовують для придання умовно-дефектного по реплікації фенотипу експресуючому 6 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 пентамерний gH-комплекс CMV. Коротко, проводять злиття одного або більше білків, необхідних для реплікації CMV, з дестабілізуючим білком, FKBP або похідним FKBP. Нуклеїнові кислоти, що кодують необхідний білок дикого типу, більше не присутні в rdCMV. У присутності екзогенно доданого проникаючого в клітини низькомолекулярного стабілізатора, Shield-1 (Shld1), злитий білок стабілізується, і необхідний білок може функціонувати, підтримуючи вірусну реплікацію. Реплікація rdCMV в присутності стабілізатора переважно складає щонайменше 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % від рівня реплікації CMV, який не містить дестабілізуючого злитого білка (наприклад, батьківського атенуйованого CMV, використаного для конструювання rdCMV). За відсутністю Shield-1 дестабілізуючий білок із злитого білка є причиною того, що злитий білок значною мірою руйнується апаратом клітини-хазяя. За відсутністю або в присутності мінімальних кількостей необхідного білка CMV не може реплікуватися в мірі, достатній, щоб викликати або підтримувати CMV інфекцію у пацієнта. Реплікація rdCMV за відсутністю стабілізатора не відбувається або скорочується переважно більше ніж на 50 %, 75 %, 90 %, 95 % або 99 % в порівнянні з реплікацією CMV, який не містить дестабілізуючого злитого білка (наприклад, батьківського атенуйованого CMV, використаного для конструювання rdCMV). За допомогою методів рекомбінантної ДНК, добре відомих в даній галузі, нуклеїнову кислоту, що кодує білок, необхідний для реплікації CMV і/або виникнення/підтримки CMV інфекції, приєднують до нуклеїнової кислоти, яка кодує FKBP або його похідне. Кодований злитий білок містить FKBP, або похідне FKBP, злитий в рамці зчитування з необхідним білком. Кодований злитий білок стабільний в присутності Shield-1. Однак кодований злитий білок дестабілізуватиметься за відсутністю Shield-1 і підлягає руйнуванню. У переважних варіантах здійснення FKBP являє собою SEQ ID NO: 11. У інших переважних варіантах здійснення похідне FKBP являє собою FKBP, що містить одну або більше амінокислотних замін, вибраних з групи, яка складається з: F15S, V24A, H25R, F36V, E60G, M66T, R71G, D100G, D100N, E102G, K105I і L106P. У більш переважному варіанті здійснення похідне FKBP містить заміни F36V і/або L106P (SEQ ID NO: 12). У більш переважному варіанті здійснення похідне FKBP кодується SEQ ID NO: 13. Необхідні білки, намічені для дестабілізації внаслідок злиття з FKBP або його похідним, 1) є необхідними для вірусної реплікації, 2) здатні витримувати злиття з дестабілізуючим білком без істотного порушення функції необхідного білка, і 3) здатні витримувати вставку нуклеїнової кислоти, що кодує FKBP або його похідне, на 5' або 3'-кінці вірусної ORF, що кодує необхідний білок, без істотного порушення ORF інших оточуючих вірусних генів. У переважних варіантах здійснення необхідні білки, намічені для дестабілізації внаслідок злиття з FKBP або з його похідним, являють собою неструктурні білки і, як такі, мають меншу імовірність бути упакованими у віріони рекомбінантного CMV. У таблиці 1 приведені гени CMV, які відповідають вищепереліченим критеріям. Таблиця 1 Вірусні гени, вибрані для конструювання злитого з FKBP білка Вірусний ген IE1/2 (UL123/122) UL37 × 1 UL51 UL52 UL53 UL77 UL79 Вірусний ген UL84 UL87 Функція* модулятори вірусної транскрипції регуляції вірусних генів упаковування ДНК упаковування і розщеплення ДНК вихід з капсиду; вихід з ядра упаковування ДНК невідомо Функція* реплікація ДНК невідомо Кінетична фаза Злиття з FKBP Послідовність злитого білка передрання N-кінець SEQ ID NO: 1-2 передрання N-кінець пізня N-кінець SEQ ID NO: 3-4 пізня N-кінець SEQ ID NO: 5-6 рання С-кінець рання пізня С-кінець N-кінець Злиття з FKBP С-кінець N-кінець Кінетична фаза рання-пізня ? 7 SEQ ID NO: 7-8 Послідовність злитого білка SEQ ID NO: 9-10 UA 114896 C2 *згідно з Mocarski, Shenk and Pass, Cytomegalovirus, в "Field Virology", 2701-2772, під редакцією: Knipes і Howley, 2007. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід охоплює rdCMV, який містить злиті білки, що складаються з необхідного білка або його похідного, злитого з дестабілізуючим білком. Похідні необхідного білка містять одне або більше з амінокислотних замін, додатків і/або делецій відносно необхідного білка дикого типу, хоч всі ще можуть забезпечувати активність необхідного білка щонайменше в достатній мірі, щоб підтримувати вірусну реплікацію в присутності Shield-1. Приклади вимірювання вірусної активності приведені в прикладах нижче. Можна використовувати методи, відомі в даній галузі, для визначення міри відмінності між необхідним білком CMV, який цікавить, і його похідним. У одному варіанті здійснення для визначення спорідненості використовують ідентичність послідовності. Похідні за винаходом будуть переважно на щонайменше 85 % ідентичними, щонайменше 90 % ідентичними, щонайменше 95 % ідентичними, щонайменше 97 % ідентичними, щонайменше 99 % ідентичними базовій послідовності. Процент ідентичності визначають як кількість ідентичних залишків, ділена на загальну кількість залишків і помножена на 100. Якщо послідовності при вирівнюванні мають різну довжину (внаслідок розривів або подовжень), в розрахунках використовують довжину найдовшої послідовності, що представляє значення загальної довжини. У деяких варіантах здійснення один або більше з необхідних для вірусної реплікації вірусних білків, намічених для дестабілізації, вибирають з групи, яка складається з IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79, UL87, UL37 × 1, UL77 і UL53 або їх похідних. У конкретному варіанті здійснення один або більше з необхідних для вірусної реплікації вірусних білків, намічених для дестабілізації, вибирають з групи, яка складається з IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79, UL87. У більш конкретному варіанті здійснення один або більше з необхідних для вірусної реплікації вірусних білків, намічених для дестабілізації, вибирають з групи, яка складається з IE1/2, UL51, UL52, UL79 і UL84. Більше ніж один необхідний білок може бути дестабілізований шляхом злиття з FKBP або його похідним. У деяких варіантах здійснення необхідні білки функціонують на різних стадіях реплікації і/або інфікування CMV (включаючи, але без обмеження, передранню, ранню або пізню стадії). У переважних варіантах здійснення поєднання необхідних для вірусної реплікації вірусних білків, намічених для дестабілізації, вибирають з групи, яка складається з IE1/2 і UL51, IE1/2 і UL52, IE1/2 і UL79, IE1/2 і UL84, UL84 і UL51, а також UL84 і UL52. У більш переважному варіанті здійснення IE1/2 і UL51 вибирають для дестабілізації в одному і тому ж рекомбінантному CMV. У найбільш переважному варіанті здійснення злитий білок, що містить IE1/2, являє собою SEQ ID NO: 1, і злитий білок, що містить UL51, являє собою SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 1 і 3 можуть кодуватися SEQ ID NO: 2 і 4, відповідно. Геном rdCMV з дестабілізованими IE1/2 і UL51 приведений в SEQ ID NO: 14. Можна проводити злиття FKBP або його похідного з необхідним білком або напряму, або опосередковано. У переважних варіантах здійснення проводять злиття FKBP або його похідного з необхідним білком напряму. Можна проводити злиття FKBP або його похідного з необхідним білком або на N-, або на Скінці необхідного білка. У переважних варіантах здійснення проводять злиття FKBP на N-кінці необхідного білка. Можна проводити злиття більше ніж одного FKBP або його похідного з необхідним білком. У варіантах здійснення, в яких більше ніж один FKBP або його похідне злиті з необхідним білком, всі з окремих FKBP або їх похідних можуть бути однаковими або різними. У переважних варіантах здійснення один FKBP, або його похідне, злитий з необхідним білком. Додаткові способи інактивації У деяких варіантах здійснення rdCMV, описаний вище, додатково інактивують шляхом хімічної або фізичної інактивації. Приклади такої інактивації включають термічну обробку, інкубацію з формальдегідом, β-пропіолактоном (BPL), або бінарним етиленіміном (BEI), або гамма-опромінення. Переважні способи не порушують або істотно не порушують імуногенність, включаючи, але без обмеження, імуногенність, що індукується пентамерним gH-комплексом. Як така, імунна відповідь, що викликається CMV, який був додатково інактивований, зберігається або значною мірою зберігається в порівнянні з відповіддю на rdCMV, який не підданий додатковій інактивації. В переважних варіантах здійснення здатність додатково інактивованого CMV викликати продукцію нейтралізуючих антитіл порівнянна з такою здатністю у rdCMV, не підданого додатковій інактивації. Режим інактивації з використанням одного з, або поєднання, хімічних або фізичних методів визначають емпірично для забезпечення імуногенності CMV, включаючи пентамерний gH-комплекс. 8 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Оцінка вірусної реплікації Фахівець в даній галузі може використовувати тести на вірусну реплікацію для визначення корисності конкретного необхідного білка, злитого з FKBP або його похідним. Оскільки експресія гена/функції продукту, що кодується не повинна бути істотним чином порушена внаслідок приєднання FKBP або його похідного до необхідного білка в присутності Shield-1, rdCMV в присутності Shield-1 повинен реплікуватися зі швидкістю, порівнянною зі швидкістю реплікації батьківського CMV (переважно на рівні щонайменше 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % від рівня батьківського вірусу). Реплікація rdCMV істотно відрізняється від реплікації батьківського CMV за відсутністю Shield-1 (зменшується переважно більше ніж на 50 %, 75 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % в порівнянні з реплікацією CMV, який не містить дестабілізуючого злитого білка). У переважних варіантах здійснення rdCMV в присутності щонайменше 2 мкМ Shield-1 реплікується переважно на рівні щонайменше 90 %, більш переважно щонайменше 95 %, найбільш переважно щонайменше 99 % від рівня, на якому реплікується не-rdCMV. У одному варіанті здійснення композиція, що містить rdCMV за винаходом, має титр вірусу 5 7 щонайменше 10 БУО/мл, більш переважно щонайменше 10 БУО/мл, в присутності щонайменше 2 мкМ Shield-1. Навпаки, rdCMV не повинен істотно реплікуватися за відсутністю Shield-1. Про якість механізму реплікаційнго дефекту судять по тому, наскільки суворим є контроль в умовах, заборонених для вірусної реплікації, тобто, які інфекційні титри віріонів потомства в таких умовах. rdCMV за даним винаходом практично не здатний реплікуватися (як в клітинній культурі, так і в організмі пацієнта) без присутності Shield-1. Його реплікація в клітинах ARPE-19 і інших типах первинних клітин людини є умовною, і молярна концентрація Shield-1 вища 0,1 мкМ, переважно щонайменше 2 мкМ, в культуральному середовищі необхідна для підтримки вірусної реплікації. У одному варіанті здійснення композиція, що містить rdCMV за винаходом, має вірусний титр менший 2 БУО/мл, більш переважно менший 1 БУО/мл, за відсутністю Shield-1. Способи оцінки реплікації CMV можна використовувати, щоб оцінювати реплікацію rdCMV або за відсутністю, або в присутності Shield-1. Однак в переважних варіантах здійснення використовують TCID50. У іншому варіанті здійснення титри rdCMV визначають за допомогою аналізу для визначення 50 % інфекційної дози для тканинної культури (TCID50). Коротко, цей аналіз з розбавленням дозволяє розрахувати кількість вірусу, необхідну для загибелі 50 % інфікованих хазяїв. Клітини-хазяї (наприклад, клітини ARPE-19) висівають, і до них додають вірус в серійному розведенні. Після інкубації визначають і реєструють процент загибелі клітин (тобто, інфікованих клітин) для кожного розведення вірусу. Результати використовують, щоб математично розрахувати TCID50. У іншому варіанті здійснення титри rdCMV визначають за допомогою аналізу бляшкоутворення. Аналіз на утворення вірусних бляшок дозволяє визначати кількість бляшкоутворювальних одиниць (БУО) в зразку вірусу. Коротко, моношар клітин-хазяїв (наприклад, клітин ARPE-19), що злився, інфікують rdCMV в різному розведенні і покривають напівтвердим середовищем, таким як агар або карбоксиметилцелюлоза, для запобігання безладному поширенню вірусної інфекції. Вірусна бляшка утворюється, коли вірус інфікує клітину в фіксованому клітинному моношарі. Інфіковані вірусом клітини будуть лізуватися і поширювати інфекцію в сусідні клітини, і цикл інфікування-лізис буде повторюватися. Область інфікованих клітин утворює бляшку (область інфекції, оточену неінфікованими клітинами), яку можна побачити візуально або за допомогою оптичного мікроскопа. Бляшки підраховують, і результати в поєднанні з коефіцієнтом розведення, що використовується для конкретної чашки, використовують для розрахунку кількості бляшкоутворювальних одиниць на одиницю об'єму зразка (БУО/мл). Отримане значення БУО/мл відповідає кількості інфекційних частинок в зразку, і воно основане на припущенні, що кожна утворена бляшка представляє одну інфекційну вірусну частинку. У іншому варіанті здійснення модель на мишах hu-SCID використовують для оцінки здатності rdCMV реплікуватися in vivo. Коротко, шматочки тканин плоду людини (наприклад, тимусу і печінки) хірургічним шляхом імплантують в ниркову капсулу мишей SCID. rdCMV інокулюють через 2-3 місяці, коли людські тканини стають васкуляризованими. Вірусні титри оцінюють через 3-4 тижні після інокуляції в аналізах на бляшкоутворення. Експерименти на тваринах можна проводити за відсутністю або в присутності Shield-1. Оцінка імунної відповіді 9 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Введення rdCMV за винаходом пацієнту викликає імунну відповідь на CMV, переважно захисну імунну відповідь, яка здатна лікувати і/або зменшувати імовірність інфекції CMV або патології, пов'язаної з такою інфекцією, у пацієнта. Імунна відповідь виникає, щонайменше частково, через пентамерний gH-комплекс. Імунна відповідь, викликана rdCMV, можна оцінювати за допомогою методів, відомих в даній галузі. Тваринні моделі, відомі в даній галузі, можна використовувати для оцінки захисного ефекту від введення rdCMV. У одному варіанті здійснення імунну сироватку від індивідуумів, яким вводили rdCMV, можна аналізувати на нейтралізуючу здатність, включаючи, але без обмеження, блокування прикріплення вірусу або проникнення вірусу в клітину-хазяя. У інших варіантах здійснення Т-клітини від індивідуумів, яким вводили rdCMV, можна аналізувати на здатність продукувати цитокіни, включаючи, але без обмеження, інтерферон-гамма, в присутності антигену, що цікавить. Тваринні моделі зі стимуляцією антигеном також можна використовувати для визначення імунологічної ефективної кількості імуногену. Нейтралізація вірусу означає, що специфічні для вірусу антитіла здатні перешкоджати проникненню і/або реплікації вірусу в культурах. Загальноприйнятим аналізом для вимірювання нейтралізуючої активності є аналіз на зменшення бляшкоутворення. Аналізи на нейтралізацію в даному винаході означають титрування сироватки, здатної блокувати проникнення вірусу в клітини. Титри NT50 визначають як реципрокні розведення сироватки, необхідні для блокування 50 % внесеного вірусу в аналізах на нейтралізацію вірусу. Титри NT50 отримують з апроксимації нелінійної логістичної чотирипараметричної кривої. Отримання дефектного по реплікації CMV Даний винахід стосується способів отримання rdCMV. rdCMV за винаходом розмножують в присутності стабілізатора, такого як Shield-1, на епітеліальних клітинах, переважно людських епітеліальних клітинах, і більш переважно людських пігментованих епітеліальних клітинах сітківки. У додаткових варіантах здійснення людські пігментовані епітеліальні клітини сітківки являють собою клітини ARPE-19, депоновані в Американській колекції типових культур (ATCC) з реєстраційним № CRL-2302. У деяких варіантах здійснення Shield-1 присутній в середовищах для тканинних культур в концентрації щонайменше 0,5 мкМ. У переважних варіантах здійснення Shield-1 присутній в середовищах для тканинних культур в концентрації щонайменше 2,0 мкМ. У деяких варіантах здійснення клітини, що використовуються для розмноження rdCMV, вирощують на мікроносіях. Мікроносій являє собою підтримуючу матрицю, що дозволяє рости клітинам, які прикріплюються у обертових колбах або біореакторах (таких як мікрогравитаційні біореактори з обертовими стінами). Мікроносії, як правило, являють собою 125-250-мкм сфери, що мають густину, яка дозволяє їм підтримуватися в суспензії при обережному перемішуванні. Мікроносії можуть бути виконані з різних матеріалів, включаючи, але без обмеження, DEAEдекстран, скло, полістирольний пластик, акриламід і колаген. Мікроносії можуть мати різний хімічний склад поверхні, включаючи, але без обмеження, білки позаклітинного матриксу, рекомбінантні білки, пептиди і заряджені молекули. Можна також використовувати інші системи клітинних культур високої густини, такі як системи Corning HyperFlask® і HyperStack®. Безклітинне середовище для тканинних культур можна збирати і виділяти з неї rdCMV. Вірусні частинки CMV мають приблизно 200 нм в діаметрі і можуть бути відділені від інших білків, присутніх в зібраному середовищі, за допомогою методів, відомих в даній галузі, включаючи, але без обмеження, ультрацентрифугування в градієнті густини або в "подушці" з 20 % сорбіту. Вміст білка у вакцинах можна визначати аналізом по Бредфорду. Для контролю реплікації rdCMV можна використовувати Shield-1 в поєднанні з FKBP. Після того, як вирощування потрібної кількості вірусів в клітинах тканинної культури буде завершене, здатність до реплікації перестає бути потрібною. Shield-1 виводять з rdCMV, щоб зробити вірус дефіцитним по реплікації (наприклад, для введення пацієнту). У одному варіанті здійснення rdCMV очищають від Shield-1 промиванням один або більше разів. У іншому варіанті здійснення rdCMV очищають від Shield-1 ультрацентрифугуванням. У іншому варіанті здійснення rdCMV очищають від Shield-1 діафільтрацією. Як правило, для очищення вірусних частинок використовують діафільтрацію. У одному варіанті здійснення використовують фільтри з розміром пор приблизно 750 кілодальтон, через які може проходити тільки Shield-1. Після очищення rdCMV від Shield-1 в композиції rdCMV може залишатися невелика кількість залишкового Shield-1. У одному варіанті здійснення рівень Shld-1 в композиції CMV після очищення щонайменше в 100 раз нижчий рівня, необхідний для підтримки реплікації в тканинній культурі. У іншому варіанті здійснення рівень Shld-1 в композиції CMV після очищення становить 0,1 мкМ або менше. У іншому варіанті здійснення рівень Shld-1 в композиції CMV після очищення не піддається визначенню. 10 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Визначення рівнів Shield-1 в композиції можна проводити за допомогою РХ/МС (рідинна хроматографія/мас-спектроскопія) або ВЕРХ/МС (високоефективна рідинна хроматографія/масспектроскопія) аналізів. Дані методи поєднують можливості фізичного розділення РХ або ВЕРХ з можливостями аналізу маси і дозволяють виявляти хімічні речовини, які цікавлять, в комплексних сумішах. Ад'юванти Ад'юванти являють собою речовини, які здатні допомагати імуногену викликати імунну відповідь. Ад'юванти можуть мати різні механізми дії, наприклад, один або більше з наступних: збільшення біологічного або імунологічний часу напіврозпад антигену; поліпшення доставки антигену до антигенпредставляючих клітин; поліпшення процесингу і представлення антигену антигенпредставляючими клітинами; можливість щадного режиму дозування і індукція вироблення імуномодулюючих цитокінів (Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30: S266). У деяких варіантах здійснення композиції за винаходом містять rdCMV і ад'ювант. Можна використовувати ад'юванти різних типів, щоб сприяти розвитку імунної відповіді. Приклади конкретних ад'ювантів включають гідроксид алюмінію; фосфат алюмінію, гідроксифосфат алюмінію, ад'ювант аморфний гідроксифосфат-сульфат алюмінію (AAHSA) або інші солі алюмінію; фосфат кальцію; мотиви CpG ДНК; монофосфорилліпід А; холерний токсин; термолабільний токсин Е. coli; коклюшний токсин; мурамілдипептид; неповний ад'ювант Фрейнда; MF59; SAF; імуностимулюючі комплекси; ліпосоми; біорозкладані мікросфери; сапоніни; неіонні блок-співполімери; аналоги мурамілпептиду; поліфосфазен; синтетичні полінуклеотиди; IFN-γ; IL-2; IL-12 і ISCOMS. (Vogel, 2000, Clin Infect Dis 30: S266; Klein et al., 2000, J Pharm Sci 89: 311; Rimmelzwaan et al., 2001, Vaccine 19: 1180; Kersten, 2003, Vaccine 21: 915; O'Hagen, 2001, Curr. Drug Target Infect. Disord. 1: 273.) У деяких варіантах здійснення ад'юванти на масляній основі, включаючи, але без обмеження, неповного ад'ювант Фрейнда і MF59, не використовують в композиціях за винаходом. У інших варіантах здійснення ад'юванти у вигляді частинок, включаючи, але без обмеження, ад'ювант ISCOMATRIX® і/або алюмінію-фосфатний ад'ювант, використовують в композиціях за винаходом. Фармацевтичні композиції Ще однією особливістю винаходу є застосування рекомбінантного CMV, описаного тут, в композиції, переважно імуногенної композиції або вакцини, для лікування пацієнтів з CMV інфекцією і/або зниження імовірності CMV інфекції. Відповідно, композиція містить фармацевтично прийнятний носій. "Фармацевтично прийнятний носій" означає рідкий наповнювач, розріджувач або інкапсулюючу речовину, які можна безпечно використовувати для системного введення. Залежно від конкретного способу введення можна використовувати різноманітні фармацевтично прийнятні носії, добре відомі в даній галузі. Ці носії можна вибирати з групи, яка включає цукор, крохмаль, целюлозу і її похідні, солод, желатин, тальк, сульфат кальцію, рослинні олії, синтетичні масла, поліоли, альгінову кислоту, фосфатні буферні розчини, включаючи фосфатно-сольовий буфер, емульгатори, ізотонічний сольовий розчин і апірогенну воду. Зокрема, фармацевтично прийнятні носії можуть містити різні компоненти, такі як буфер, стерильна вода для ін'єкцій, нормальний сольовий розчин або фосфатно-сольовий буфер, сахароза, гістидин, солі і полісорбат. Такі терміни, як "фізіологічно прийнятний", "розріджувач" або "ексципієнт", можна використовувати взаємозамінно. Способи отримання вакцинних препаратів розкриті, наприклад, в книзі "New Generation Vaccines" (1997, Levine et al., Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong), включеній в даний документ за допомогою посилання. Препарати У деяких варіантах здійснення rdCMV за винаходом вводять пацієнту, щоб викликати імунну відповідь. Бажано мінімізувати або уникати втрати активності композиції rdCMV під час зберігання імуногенної композиції. Умови для досягнення цієї мети включають, але без обмеження, (1) стійку стабільність при зберіганні, (2) стійкість до стресу циклів заморожуваннярозморожування, (3) стабільність при температурах навколишнього середовища на термін до тижня, (4) збереження імуногенності, (5) сумісність зі стратегією використання ад'ювантів. Умови, які впливають на стабільність rdCMV, включають, але без обмеження, pH буфера, іонну силу буфера, наявність/відсутність конкретних ексципієнтів і температуру. Композиції містять буфери для підвищення стабільності очищених вірусних частинок rdCMV, прийнятних як вакцинна композиція. Збереження цілісності вірусних частинок можна оцінювати за допомогою аналізів на імуногенність, що проводяться на мишах, і/або аналізів на проникнення вірусу. Здатність вірусу 11 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до проникнення залежить від цілісності і функцій вірусних глікопротеїнів, включаючи пентамерний gH-комплекс. Пентамерний gH-комплекс також значною мірою забезпечує імуногенність rdCMV, таким чином, ці дві властивості пов'язані. У деяких варіантах здійснення rdCMV зберігають в буфері, що містить 15-35 мМ гістидину і 100-200 мМ NaCl при значенні pH від 5 до 7. В більш конкретному варіанті здійснення буфер містить 25 мМ гістидину і 150 мМ NaCl при pH 6. У інших варіантах здійснення можна додавати цукор для забезпечення додаткової стабільності, наприклад, поліоли (включаючи, але без обмеження, маніт і сорбіт); моносахариди (включаючи, але без обмеження, глюкозу, манозу, галактозу і фруктозу); дисахариди (включаючи, але без обмеження, лактозу, мальтозу, мальтозу, сахарозу, лактулозу і трегалозу) і трисахариди (включаючи, але без обмеження, рафінозу і мелізитозу). У більш конкретному варіанті здійснення цукор являє собою сахарозу. У ще більш конкретному варіанті здійснення сахароза становить 5-15 %. У переважних варіантах здійснення rdCMV зберігають в буфері, що містить 25 мМ гістидину, 150 мМ NaCl, 9 % сахарози при pH 6. Вступ rdCMV, описаний тут, можна формулювати і вводити пацієнту, використовуючи посібник, наданий тут, нарівні з методами, добре відомими в даній галузі. Посібник для фармацевтичного введення, як правило, можна знайти, наприклад, в книгах "Vaccines" під редакцією Plotkin і Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999; "Remington's Pharmaceutical Sciences" 20-е видання, під редакцією Gennaro, Mack Publishing, 2000; і "Modern Pharmaceutics" 2-е видання, під редакцією Banker і Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990. Вакцини можна вводити різними способами, наприклад, підшкірним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним, на слизові оболонки, парентеральним, черезшкірним або внутрішньошкірним. Підшкірне і внутрішньом'язове введення можна виконувати з використанням, наприклад, голок або безголкових шприців. У одному з варіантів здійснення вакцину за винаходом вводять внутрішньом'язово. Черезшкірну або внутрішньошкірну доставку можна виконувати за допомогою шприца з голкою для внутрішньошкірних ін'єкцій або передових пристроїв, таких як мікронні голки або пластири з мікрочипами. Композиції, описані тут, можна вводити способом, сумісним з дозованою препаративною формою, і в такій кількості, яка імунологічно ефективна для лікування і/або зниження імовірності CMV інфекції (включаючи первинну, рецидивуючу і/або суперінфекцію). Доза, що вводиться пацієнту, в контексті даного винаходу, повинна бути достатньою для надання благотворного впливу на пацієнта з плином часу, наприклад, для зниження рівня CMV інфекції, полегшення симптомів захворювання, пов'язаного з CMV інфекцією, і/або зменшення тривалості і/або тяжкості CMV інфекції, або для зниження імовірності CMV інфекції (включаючи первинну, рецидивуючу і/або суперінфекцію). Прийнятні режими дозування можуть бути легко визначені фахівцями в даній галузі і переважно визначені з урахуванням чинників, добре відомих в даній галузі, включаючи вік, масу тіла, стать і медичний стан пацієнта, спосіб введення, бажаний ефект і конкретну використовувану композицію. При визначенні ефективної кількості rdCMV, яку треба вводити для лікування або профілактики CMV, лікар може оцінювати циркулюючі рівні вірусу в плазмі, прогресування захворювання і/або продукцію анти-CMV антитіл. Доза для вакцинної композиції 3 12 знаходиться в діапазоні від 10 до 10 бляшкоутворювальних одиниць (БУО). У різних 4 10 5 9 варіантах здійснення використовують дози в діапазоні від 10 до 10 БУО, від 10 до 10 БУО, 6 8 від 10 до 10 БУО або будь-яку дозу в цих вказаних діапазонах. При введенні більше однієї вакцини (тобто, в комбінованих вакцинах) кількість кожної діючої речовини вакцини знаходиться в описаному для нього діапазоні. Вакцинну композицію можна вводити однією дозою або в багатодозовому форматі. Вакцини можна готувати з ад'ювантом за декілька годин або днів до введень, залежно від визначення стабілізуючого буфера(-ів) і відповідного ад'ювантного складу. Вакцини можна вводити в об'ємах, які звичайно практикуються, в діапазоні від 0,1 мл до 0,5 мл. Вибір часу дозування залежить від чинників, добре відомих в даній галузі. Після первинного введення одну або більше додаткових доз можна вводити для підтримки і/або підвищення титрів антитіл і Т-клітинного імунітету. Додаткові бустерні введення можуть вимагатися для підтримки захисних рівнів імунних відповідей, які знаходять відображення в титрах антитіл і показниках Т-клітинного імунітету, що визначаються, наприклад, аналізом ELISPOT. Рівні таких імунних відповідей залежать від клінічних досліджень. У випадку комбінованих вакцинацій, всі імуногени можна вводити разом в одній композиції або окремо в різних композиціях. rdCMV, описаний тут, вводять одночасно з одним або більше з 12 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бажаних імуногенів. Термін "одночасно" означає не тільки введення терапевтичних засобів точно в один і той же час, він швидше означає, що rdCMV, описаний тут, і інший бажаний імуноген(-и) вводять суб'єкту в такій послідовності і в такому часовому інтервалі, що вони можуть діяти спільно, приносячи більше користі, ніж якби їх вводили іншим чином. Наприклад, всі терапевтичні засоби можна вводити одночасно або послідовно в будь-якому порядку в різні моменти часу; однак, якщо їх не вводити одночасно, то вони повинні бути введені досить близько за часом, щоб забезпечити бажаний терапевтичний ефект. Кожний терапевтичний засіб можна вводити окремо, в будь-якій відповідній формі і будь-яким відповідним способом введення. Популяція пацієнтів Термін "пацієнт" стосується ссавця, який може бути інфікований CMV. У переважному варіанті здійснення пацієнтом є людина. Пацієнт може отримувати профілактичне або терапевтичне лікування. Профілактичне лікування забезпечує достатній захисний імунітет для зниження імовірності або тяжкості CMV інфекції, включаючи первинні інфекції, рецидивуючі інфекції (тобто, ті, які виникають в результаті реактивації латентного CMV) і суперінфекції (тобто, ті, які виникають внаслідок інфікування штамом CMV, відмінним від того, яким пацієнт був інфікований раніше). Терапевтичне лікування можна проводити для зниження тяжкості CMV інфекції або зниження імовірності/тяжкості рецидивуючої або суперінфекції. Лікування можна проводити з використанням фармацевтичної композиції, що містить rdCMV, описаний тут. Фармацевтичні композиції можна вводити всім верствам населення, особливо тим особам, які мають підвищений ризик отримання CMV інфекції (як первинної, так і рецидивуючої або суперінфекції), або для яких CMV інфекція була б особливо проблематичною (наприклад, особам з імунною недостатністю, пацієнтам з трансплантатами або вагітним жінкам). У одному варіанті здійснення жінок дітородного віку, особливо дівчинок-підлітків, вакцинують для зниження імовірності CMV інфекції (як первинної, так і рецидивуючої або суперінфекції) під час вагітності. Потребуючі лікування включають тих, які вже мають інфекцію, а також тих, які схильні до інфекції або для яких було б бажаним зниження імовірності отримання інфекції. Лікування може полегшувати симптоми захворювання, пов'язаного з CMV інфекцією, і/або зменшувати тривалість і/або тяжкість CMV інфекції, включаючи інфекцію внаслідок реактивації латентного CMV. Особи з підвищеним ризиком отримання CMV інфекції (як первинної, так і рецидивуючої або суперінфекції) включають пацієнтів з ослабленим імунітетом або пацієнтів, яким належить бути проведена терапія, що приводить до ослаблення імунітету (наприклад, тих, хто проходить хіміотерапію або радіотерапію внаслідок онкологічного захворювання або тих, хто приймають придушуючі імунітет лікарські засоби). Використовуваний тут термін "ослаблений імунітет" стосується імунної системи, яка в меншій мірі здатна боротися з інфекціями через те, що імунна відповідь неправильно функціонує або не функціонує на рівні, відповідному рівню у нормальної здорової дорослої людини. Прикладами пацієнтів з ослабленим імунітетом є немовлята, діти молодшого віку, немолоді, вагітні або пацієнти із захворюванням, яке впливає на функцію імунної системи, таким як ВІЛ-інфекція або СНІД. ПРИКЛАДИ Нижче приведені приклади для подальшої ілюстрації різних відмітних ознак даного винаходу. Приклади також ілюструють корисну методологію для практичного застосування винаходу. Дані приклади не обмежують заявлений винахід. Приклад 1: Відновлення пентамерного gH-комплексу Інфекційний клон CMV з бактеріальною штучною хромосомою був сконструйований так, що був закодований віріон, який експресує пентамерний gH-комплекс, що складається з UL128, UL130 і UL131, зібраних в каркасну структуру gH/gL. Штам AD169 CMV спочатку був виділений з аденоїдів 7-річної дівчинки (Elek and Stern, 1974, Lancet, 1: 1). Було проведено 58 пасажів вірусу в людських фібробластах різних типів для атенуації вірусу (Neff et al., 1979, Proc Soc Exp Biol Med, 160: 32), з останніми 5 пасажами в людських фібробластах WI-38. Цей пасивований варіант вірусу AD169, названий в даному дослідженні Merck AD169 (MAD169), використовували як батьківський вірус для конструювання інфекційного ВАС-клону. Ні батьківський вірус AD169, ні пасивований варіант вірусу MAD169 не експресували UL131 або пентамерний gH-комплекс. MAD169 використовували як батьківський вірус для конструювання інфекційного клону з бактеріальною штучною хромосомою (BAC). BAC-вектор являє собою молекулярний інструмент, що дозволяє проводити генетичні маніпуляції з фрагментом ДНК великого розміру, таким як геном CMV (~230 т.п. н.), в Е. coli. Елемент BAC разом з маркерним геном GFP 13 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 вбудовували відразу після стоп-кодона відкритої рамки зчитування US28 (між ORF US28 і US29 у вірусному геномі) з сайтом LoxP, створеним на обох кінцях фрагмента (фіг. 1A). Коротко, фрагмент ДНК, що містить експресійну касету GFP, фланковану двома сайтами loxP, і послідовності US28-US29 CMV, синтезували і клонували у вектор pBeloBAC11. BAC-вектор лінеаризували ферментом рестрикції Pme I і спільно трансфікували в клітини MRC-5 з ДНК MAD169, екстрагованої з очищених віріонів. Рекомбінантні варіанти, ідентифіковані по експресії зеленого флуоресцентного білка, були очищені шляхом утворення бляшок. Після одного циклу ампліфікації кільцеву форму вірусного генома витягували з інфікованих клітин і вводили електропорацією в клітини DH10 E. coli. Проводили скринінг бактеріальних колоній методом ПЛР на присутність областей US28 і US29. Колонії-кандидати додатково вивчали рестрикційним аналізом з використанням EcoR I, EcoR V, Hind III, Spe I і Bam HI. Після скринінгу один клон, bMAD-GFP, продемонстрував однакову картину рестрикції з батьківським вірусом MAD169. Мутацію зі зсувом рамки в першому екзоні UL131, що є причиною відсутності тропізму до епітеліальних клітин в MAD169, виправляли генетично в Е. coli (фіг. 1B). Зокрема, один аденіновий нуклеотид (н) з 7-н А-фрагмента в гені UL131 був делетований (фіг. 1B). Делеції 1 н було достатньо для відновлення тропізму до епітеліальних і ендотеліальних клітин за рахунок UL131, і, таким чином, пентамерний gH-комплекс знову експресувався. Експресію підтверджували методами ELISA і вестерном-блотингу (дані не представлені). Даний клон був додатково модифікований шляхом видалення сегмента BAC за допомогою рекомбінації LoxP/Cre. ДНК BAC трансфікували в клітини ARPE-19, людські пігментовані епітеліальні клітини сітківки (ATCC, реєстраційний № CRL-2302), для відновлення інфекційного вірусу (фіг. 1C). Отриманий інфекційний вірус, названий ВАМ-похідним вірусом MAD169 з тропізмом до епітеліальних клітин (beMAD), відрізнявся від MAD169 тільки по двох локусах, (1) ORF UL131, в якій один аденіновий нуклеотид був делетований, і (2) сайтом LoxP з 34 п.о., вставленим між ORF US28 і US29 (див. таблицю 2). Геном ВАС-клону beMAD був повністю секвенований. Загальна структура генома beMAD ідентична тій, про яку повідомлялося для варіанту AD169 ATCC (GenBank, реєстраційний № X17403), яка складається з двох унікальних областей, унікальної довгої (UL) і унікальної короткої (US). Кожна унікальна область обмежена двома послідовностями повторів, кінцевим повтором довгої (TRL)-внутрішнім повтором довгої (IRL), кінцевим повтором короткої (TRS)внутрішнім повтором короткої (IRS). Кінетики зростання пасивованого варіанту MAD169 і похідного вірусу beMAD були невідмітні в клітинах MRC-5, лінії клітин людських фібробластів (ATCC, реєстраційний № CCL-171) (дані не представлені). Оскільки gH-комплекс не є необхідним для зростання на фібробластах, відмінності в експресії gH-комплексу між MAD169 і beMAD не мають значення. Таблиця 2 Молекулярні відмінності вірусів CMV Назва вірусу AD169 MAD169 beMAD 40 45 Генетичний склад Лабораторний штам ATCC, що містить мутацію зі зсувом рамки в UL131, що є причиною відсутності тропізму до епітеліальних клітин Містить мутацію зі зсувом рамки в UL131, ідентичну мутації в AD169 з ATCC Виправлена мутація зі зсувом рамки в UL131; послідовність LoxP (34 п.о.) між ORF US28 і US29 Білки у віріонах Ідентичні AD169 з ATCC Ідентичні MAD169, з доданням пентамерного gH-комплексу Приклад 2: Вплив звичайних методів інактивації на gH-комплекс Вивчали вплив двох загальноприйнятих методів вірусної інактивації, γ-опромінення і βпропіолактону (BPL), на CMV, який експресує gH. γ-Опромінення проводили на ліофілізованих віріонах. Вакцинний препарат рекомбінантного CMV в концентрації 0,15 мг/мл в HNS (25 мМ гістидину, 150 мМ NaCl, 9 % мас./об. сахарози, pH 6,0) ліофілізували з використанням консервативного циклу ліофілізації (заморожування при 50 °C і первинне висушування при -35 °C протягом ~30 годин з подальшим повторним висушуванням при 25 °C протягом 6 годин), отримуючи сухий порошок. Вакцину ліофілізували в 3-мл скляних флаконах, вносячи по 0,5 мл в кожний флакон. У кінці ліофілізації флакони закривали пробками в атмосфері азоту, і зразки виймали, наклеювали етикетки, укупорювали 14 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обтиск і зберігали при -70 °C до проведення гамма-опромінення. Флакони опромінювали в опромінювачі з Co до досягнення необхідної дози опромінення. Для обробки BPL маточний розчин BPL додавали до неочищеного вірусного культурального супернатанта, отриманого після зростання на клітинах ARPE-19, до досягнення кінцевих концентрацій 0,01 % або 0,1 % (по об'єму). Реакцію зупиняли додаванням тіосульфату натрію в різні моменти часу. Потім оброблені BPL експресуючі gH CMV очищали ультрацентрифугуванням. Кінетику інактивації для обох способів визначали аналізом бляшкоутворення на клітинах ARPE-19. Коротко, отримували серійне розведення вірусних зразків в PBS, і 0,1 мл використовували для інокуляції в кожну ямку 6-ямкового планшета, в якому знаходилися висіяні клітини ARPE-19. Планшети інкубували при 37 °C протягом 1 години перед додаванням по 6 мл в ямку покривного середовища, що містить 0,5 % агарози. Планшети інкубували протягом 18 днів при 37 °C. Для візуалізації бляшок в кожну ямку додавали приблизно 0,5 мл розчину MTT в концентрації 5 мг/мл (тіазоліл синій тетразолій бромід, Sigma M5655). Планшети інкубували при 37 °C протягом 2-4 годин, і бляшки підраховували з допомогою пристрою для перегляду з підсвічуванням (фіг. 2A і 2C). Імуногенність інактивованого експресуючого gH CMV аналізували шляхом визначення титрів нейтралізуючих антитіл у мишей. Коротко, самиць мишей Balb/с (n=10) імунізували 2,5 мкг CMV на дозу в тижні 0 і 3. Сироватки збирали в тиждень 4 і оцінювали на нейтралізуючу активність проти проникнення вірусу в епітеліальні клітини. Титр нейтралізуючих антитіл (NT50) визначали як реципрокне розведення сироватки, що приводить до 50 % зменшення проникнення вірусу в епітеліальні клітини в порівнянні з негативним контролем. Результати вивчення імуногенності на мишах продемонстрували, що обидва загальноприйняті способи інактивації негативно впливали на титри нейтралізуючих антитіл, вироблених у відповідь на експресуючий gH CMV (фіг. 2B і 2D). Зниження титрів NT50 корелювало з тривалістю обробки γ-опроміненням або BPL. Тривала обробка робила CMV, який експресує пентамерний gH-комплекс, більш схожим на батьківський AD169 CMV відносно імуногенності у мишей. Аналогічні результати були отримані на кроликах і макаках-резус при тестуванні вакцин, інактивованих γ-опроміненням або BPL (дані не представлені). Ці спостереження показали, що пентамерний gH-комплекс чутливий до обох методів інактивації при вибраних умовах інактивації. Приклад 3: Конструювання і скринінг злитих продуктів FKBP-необхідний білок CMV конструювали з використанням як основи атенуйованого штаму AD169 з відновленим тропізмом до епітеліальних клітин, який в той же час є умовно-дефектним по реплікації. Для відновлення тропізму до епітеліальних клітин використовували способи, описані в прикладі 1. Вірусні білки для злиття з похідним FKBP вибирали на основі двох критеріїв. По-перше, білки, які цікавлять, не були виявлені у віріонах CMV протеомним аналізом (Varnum et al., 2004, J. Virol. 78: 10960), таким чином, була знижена імовірність того, що злитий з FKBP білок буде включений у вірус. По-друге, білки, які цікавлять, були необхідними для вірусної реплікації в тканинній культурі. Використовуючи beMAD як батьківський вірус, проводили злиття похідного FKBP (SEQ ID NO: 12) з 12 необхідними вірусними білками окремо, включаючи IE 1/2 (SEQ ID NO: 1), pUL37 × 1, pUL44, pUL51 (SEQ ID NO: 3), pUL52 (SEQ ID NO: 5), pUL53, pUL56, pUL77, pUL79 (SEQ ID NO: 7), pUL84 (SEQ ID NO: 9), pUL87 і pUL105. Також конструювали вірус з двома різними необхідними білками, злитими з FKBP, при цьому кожний з IE1/2 і UL51 був злитий з похідним FKBP (геном rdCMV з дестабілізованими IE1/2 і UL51 приведений в SEQ ID NO: 14). Після конструювання всі рекомбінантні ДНК BAC трансфікували в клітини ARPE-19 і культивували в середовищі, що містить Shld-1. Вивчали залежність зростання вірусу від Shld-1. Віруси зі злитими IE1/2, UL51, UL52, UL84, UL79 і UL87 легко виживали в аналізі на бляшкоутворення з додаванням 2 мкМ Shld-1 (дані не представлені). Віруси з UL37 × 1, UL77 і UL53 також утворювали бляшки, але бляшки були невеликими, і вони росли значно повільніше в порівнянні з батьківським beMAD. Збільшення концентрації Shld-1 до 10 мкМ істотно не прискорювало зростання вірусів (дані не представлені). Віруси зі злитими UL56 і UL105 не виживали, що свідчило про те, що злиття цих білків порушує їх функції або експресію сусідніх генів. Варіюючі концентрації Shld-1 використовували в додаткових експериментах для подальшої оцінки вірусної реплікації в присутності або за відсутністю Shld-1. Клітини ARPE-19 інфікували експресуючим gH CMV, який також містив похідне FKBP, злите з необхідним білком, при MOI 0,01 БУО/мл. Після інфікування протягом 1 години клітини двічі промивали свіжим середовищем для видалення Shld-1 з інокулятів. Потім інокуляти додавали до клітин ARPE-19, що культивуються в середовищі, яке містить 0,05, 0,1, 0,5 або 2 мкМ Shield-1. Через сім днів після 15 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інфікування позаклітинне потомство вірусу в супернатанті збирали і титрували на клітинах ARPE-19 при додаванні 2 мМ Shield-1. Титри вірусу визначали за допомогою аналізу для визначення 50 % інфекційної дози для тканинної культури (TCID50). Коротко, цей аналіз з розбавленням дозволяє розрахувати кількість вірусу, необхідну для загибелі 50 % інфікованих хазяїв. Клітини ARPE-19 висівали і додавали вірус в серійному розведенні. Після інкубації процент клітинної загибелі (тобто, інфікованих клітин) вручну підраховували і реєстрували для кожного розведення вірусу. Результати використовували для математичного розрахунку TCID50. Як показано на фіг. 3, ефективна реплікація всіх CMV, що містять продукти злиття з FKBP, залежала від концентрації Shield-1, хоч і в різній мірі. Більш низька концентрація Shield-1, як правило, приводила до зниження титру отриманого потомства вірусу. Серед вірусів з одиночним злиттям тільки UL51 і UL52 безумовно мали потребу в Shield-1 для реплікації. Інші віруси з одиночним злиттям, IE1/2, UL84, UL79, і UL87, були здатні породжувати вірусне потомство, що піддається визначенню за відсутністю Shield-1. Це правило було особливо суворим, коли похідне FKBP було злите з UL51 або UL52. Кінетику зростання вірусів зі злитими IE1/2, UL51, IE1/2-UL51 порівнювали з кінетикою батьківського вірусу beMAD в присутності або за відсутністю 2 мкМ Shld-1. Як показано на фіг. 4, в присутності Shld-1 віруси з одиночним або подвійним злиттям демонстрували кінетику зростання, порівнянну з такою у батьківського beMAD. Однак за відсутністю Shld-1 тільки вірус IE1/2 був здатний реплікуватися, хоч і в меншій мірі і з меншою швидкістю, ніж батьківський beMAD. Ступінь контролю вірусної реплікації у вірусі з подвійним злиттям також тестували в клітинах різного типу (фіг. 5). Ці клітини включали клітини пупкової вени людини (HUVEC), фібробласти MRC-5, гладком'язові клітини аорти (AoMC), клітини скелетних м'язів (SKMC) і клітини CCFSTTG1 астроцитоми. Клітини інфікували вірусом зі злитими IE1/2-UL51 при MOI 0,01 БУО/клітину (за винятком CCF-STTG1, які інфікували при MOI 5 БУО/клітину), а потім інкубували в середовищі в присутності або за відсутністю Shield-1. Клітини всіх типів були здатні підтримувати літичну вірусну реплікацію в присутності Shield-1. Ніякої продукції вірусу не спостерігали за відсутністю Shield-1. Приклад 4: Імуногенність вірусу з подвійним злиттям IE1/2-UL51 у тварин Імуногенність вірусу з подвійним злиттям IE1/2-UL51 оцінювали на мишах, кроликах і мавпах резус. Спочатку порівнювали дозозалежну нейтралізуючу відповідь проти вірусу з подвійним злиттям IE1/2-UL51 або батьківського вірусу beMAD у мишей (фіг. 6A). Шеститижневих самиць мишей BALB/с імунізували в тижні 0 і 4 вірусом beMAD або вірусом з подвійним злиттям IE1/2UL51 в дозах, що знаходяться в діапазоні від 0,12 мкг до 10 мкг. Зразки сироватки в тиждень 6 збирали і аналізували мікроаналізом на нейтралізацію CMV на клітинах ARPE-19, як описано раніше (Tang et al., Vaccine, "А novel throughput neutralization assay for supporting clinical evaluations of human cytomegalovirus vaccines" електронна публікація 30 серпня 2011 р. на doi: 10.1016/j.vaccine.2011.08.086). Відповіді порівнювали при дозах 0,12, 0,37, 1,1, 3,3 і 10 мкг. У діапазоні більш низьких доз (від 0,12 до 1,1 мкг) beMAD був дещо більш імуногенним, при цьому нейтралізуючі антитіла постійно виявлялися при рівнях доз вище 0,37 мкг. У діапазоні високих доз (3,3 і 10 мкг) титри нейтралізуючих антитіл, індукованих обома вірусами, були порівнянними. Потім порівнювали імуногенність різних вірусів в дозі 10 мкг на кроликах. Самиць кроликів NZW імунізували в тижні 0, 3 і 8, використовуючи 10 мкг beMAD або вказаних вірусів зі злитими білками. У тиждень 10 сироватки збирали і аналізували мікроаналізом на нейтралізацію CMV на клітинах ARPE-19 (фіг. 5B). Вірус beMAD, віруси з одиночним злиттям IE1/2 або UL51 і вірус з подвійним злиттям IE1/2-UL51 були здатні індукувати значно більш високі титри нейтралізуючих антитіл, ніж MAD169, вірус, схожий з AD169 і позбавлений пентамерного gH-комплексу. Це підтвердило, що експресія gH-комплексу вірусом значно підвищує імуногенність рекомбінантного CMV. Потім імуногенність 100 мкг вірусу з подвійним злиттям IE1/2-UL51 або батьківського вірусу beMAD тестували на макаках-резус. У тиждень 12 сироватки збирали і аналізували мікроаналізом на нейтралізацію CMV на клітинах ARPE-19. GMT титрів NT50 в тиждень 12 (після дози 3) становили 11500 або 15600, відповідно. Ці титри були порівнянні з титрами NT50, що спостерігаються у індивідуумів, інфікованих природним чином (фіг. 5C). Тривалість імунної відповіді, індукованої вакциною вірусу CMV з подвійним злиттям IE1/2UL51, була продемонстрована на макаках-резус. Тварини були вакциновані або 10 мкг/доза, або 100 мкг/доза вірусом з подвійним злиттям IE1/2-UL51 (з розрахунку на загальну масу білка). Також були включені препарати вакцини 10 мкг/доза з ад'ювантом аморфним гідроксифосфатсульфатом алюмінію (AAHS) або ISCOMATRIX®. Вакцини вводили в тижні 0, 8 і 24 макакам 16 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 резус (n=5). Для порівняння, контрольна група отримувала рекомбінантний gB в кількості 30 мкг/доза, сформульований з ад'ювантом MF59, в тижні 0, 4 і 24. Середні геометричні значення для реципрокних титрів NT50 (GMT) для всіх груп представлені з плином часу (фіг. 7). До вакцинації не було ніяких титрів нейтралізуючих антитіл >40, що піддаються визначенню, у жодної з мавп. Мінімальну нейтралізуючу активність виявляли після першої дози в тиждень 4 для всіх груп, з списами піками титрів нейтралізуючих антитіл приблизно в тиждень 12 і тиждень 28 (через чотири тижні після другої і третьої вакцинації, відповідно). Пікове значення GMT в тиждень 28 для групи 100 мкг/доза становило 14500 (приблизно в 3 рази вище, ніж титр 4660 для групи 10 мкг/доза). Ад'ювант ISCOMATRIX®, але не AAHS, забезпечував ад'ювантну перевагу при порівнянні з групою 10 мкг/доза. Значення GMT в тиждень 28 для групи ISCOMATRIX® становило 15800, тоді як для групи AAHS становило 3000 і для групи 10 мкг/доза становило 4660. Мінімальну нейтралізуючу активність виявляли в контрольній (gB/MF59) групі, з піком GMT ніколи не перевищуючим 200. У тиждень 72 дослідження, ближче до 1 року після завершення режиму вакцинації в тижні 0, 8 і 24, величини GMT для групи 100 мкг/доза і групи препарату з ISCOMATRIX® підтримувалися на рівнях 1400 і 3000, відповідно. У цей час GMT для групи 10 мкг/доза і групи з AAHS становили приблизно 200. Мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) від макак-резус збирали в тиждень 28 (через 4 тижні після дози 3) режиму вакцинації і оцінювали в аналізі ELISPOT на IFN-γ. Мавп вакцинували або 100 мкг/доза (фіг. 8A), або 10 мкг/доза (фіг. 8B-8D) вірусом з подвійним злиттям IE1/2-UL51. Крім того, препарат 10 мкг/дозу складали або без ад'юванта (фіг. 8B), або з ад'ювантами AAHS (фіг. 8C) або ISCOMATRIX® (фіг. 8D). Антигени об'єднаних пептидів, що перекриваються, які представляють п'ять антигенів HCMV, використовували для стимулювання продукції IFN-γ ex-vivo. Використовуваними антигенами HCMV були IE1 і IE2 (обидва вірусні регуляторні білки), а також pp65, gB і pp150 (переважаючі вірусні структурні антигени). Якість Тклітинних відповідей оцінювали по величині (геометричним середнім) результатів аналізу ELISPOT, а також по частоті позитивної відповіді на вірусні антигени. До вакцинації не було ніякого антиген-специфічного титру в аналізі ELISPOT у жодної з мавп (дані не представлені). У тиждень 28 середні геометричні значення відповідей в аналізі ELISPOT на п'ять антигенів HCMV (тобто, IE1, IE2, pp65, gB і pp150) становили 186, 132, 253, 87, 257 створюючих "ореол" клітин (SFC)/106 PBMC для групи 100 мкг/доза проти 21, 24, 107, 111, 33 SFC/106 PBMC для групи 10 мкг/доза, відповідно (фіг. 8A і 8B). Частоту позитивних відповідей в кожній групі (n=5) оцінювали на основі критерію порога відсікання більш ніж 55 SFC/106 PBMC і більш ніж 3кратного перевищення антигенної-специфічної відповіді над відповіддю на диметилсульфоксид (ДМСО). Число позитивних відповідей на антигени HCMV (тобто, IE1, I?2, pp65, gB і pp150) становило 4, 4, 5, 1, 3 для групи 100 мкг/доза проти 1, 1, 5, 4, 0 для групи 10 мкг/доза. Вплив ад'юванта ISCOMATRIX® на Т-клітинні відповіді на 10 мкг/доза віруси з подвійним злиттям IE1/2-UL51 показаний на фіг. 8D. Середні геометричні значення відповідей в аналізі ELISPOT на п'ять антигенів HCMV (тобто, IE1, IE2, pp65, gB і pp150) становили 114, 53, 491, 85, 113 SFC/106 PBMC, відповідно, і число позитивних відповідей в групі (n=5) становило 3, 2, 5, 3, 3, відповідно. Величина і широта Т-клітинних відповідей в групі з ад'ювантом ISCOMATRIX® були схожі з такими в групі 100 мкг/доза. PBMC від тварин, вакцинованих або 10 мкг/доза, або 100 мкг/доза вірусу з подвійним злиттям IE1/2-UL51 (з розрахунку на загальну масу білка) з ISCOMATRIX® додатково аналізували шляхом внутрішньоклітинного фарбування цитокінів після стимулювання антигенами HCMV (pp65, IЕ1, IЕ2 або цілого віріону HCMV). Негативним контролем служили клітини однієї інтактної мавпи, не вакцинованої вірусом з подвійним злиттям IE1/2-UL51, тоді як позитивною контрольною речовиною служив стафілококовий ентеротоксин типу В (SEB). На фіг. 9 показано, що негативний контроль демонстрував мінімальні відповіді на всі стимуляції антигенами, але відповідав на позитивну контрольну речовину стафілококовий ентеротоксин типу В (SEB), як і очікувалося. У всіх десяти вакцинованих мавп з обох груп спостерігали відповіді на специфічні для HCMV антигени з однаковою величиною і патернами. Середні геометричні значення для кожного антигену були розраховані для всіх десяти мавп. У всіх мавп спостерігали порівнянні CD8+ (фіг. 9A) і CD4+ (фіг. 9B) Т-клітинні відповіді, коли їх PBMC стимулювали пулами пептидних антигенів CMV (тобто, pp65, IE1 і IE2), але переважно спостерігали CD4+ Т-клітинні відповіді при стимуляції цілими віріонами HCMV. Це не було несподіваним, оскільки цілі віріони є білковими антигенами, і ймовірно, процесуються як екзогенні антигени і представляються молекулами MHC класу II CD4+ Т-клітинам. Вірус з подвійним злиттям IE1/2-UL51 може викликати Т-клітинні відповіді як CD4+, так і CD8+ фенотипів, подібно до того, як це звичайно відбувається у здорових суб'єктів з HCMV інфекцією. 17 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Порівнювали різні препарати вірусу з подвійним злиттям IE1/2-UL51, що містять солі алюмінію, по їх здатності викликати продукцію нейтралізуючих антитіл у макак-резус (фіг. 10). 30 мкг/доза вірусу з подвійним злиттям IE1/2-UL51 формулювали або з HNS (базовий буфер), або з ад'ювантами аморфним гідроксифосфат-сульфатом алюмінію (AAHS) або алюмініємфосфатним ад'ювантом Merck (MAPA), і вводили в тижні 0 і 8. Зразки сироватки, зібрані в тиждень 12, показали, що, хоч MAPA підвищував продукцію нейтралізуючих антитіл, підвищення не було статистично значущим (непарний двосторонній критерій Стьюдента). Приклад 5: Визначення буферів для зберігання Вірус CMV в HBSS (збалансований сольовий розчин Хенка), що зберігається при -70 °C до використання, розбавляли ~10× відповідним буфером. Залишкові компоненти буфера HBSS в кожному зразку включали хлорид калію 0,533 мМ, одноосновний фосфат калію 0,044 мМ, двоосновний фосфат натрію 0,034 мМ, хлорид натрію 13,79 мМ, бікарбонат натрію 0,417 мМ і глюкозу 0,1 % мас./об. Потім зразки зберігали при кімнатній температурі або при температурі від 2 °C до 8 °C протягом 4 днів, або заморожували і розморожували. Для заморожуваннярозморожування зразок зберігали при -70 °C протягом щонайменше 1 години і розморожували при RT протягом 30 хвилин протягом одного або трьох циклів. Стабільність зразків тестували в день 4 за допомогою аналізу на проникнення вірусу. Коротко, аналіз проводили, використовуючи декілька різних розведень зразка для отримання кривої відповідей, і значення EC50 (мкг/мл) отримували на основі результатів аналізу на проникнення вірусу шляхом апроксимації нелінійної кривої. Більш низькі значення EC50 відповідають більш високій стабільності. Значення EC50 зразків для вивчення стабільності порівнювали з результатами для замороженого при -70 °C контрольного зразка. Аналіз на проникнення вірусу дозволяє вимірювати здатність CMV інфікувати клітини ARPE19 і експресувати IE1 (передранній білок 1). Аналіз проводили в прозорих 96-ямкових планшетах. Специфічні для IE1 первинні антитіла і біотинільовані вторинні антитіла використовували для виявлення цільових білків в фіксованих клітинах, і флуоресцентний сигнал від кожної ямки кількісно визначали з використанням кон'югата барвника IR Dye 800CW зі стрептавідином, нарівні з барвником Sapphire 700/DRAQ5 (для нормування внеску клітин). На основі результатів будували графік залежності інтегрованого відношення інтенсивності 800/700 (інтегр. відношення) від концентрації CMV (загальний білок, мкг/мл). Значення EC50 також отримували з результатів аналізу інфекційності шляхом апроксимації нелінійної кривої. Оскільки інфікування клітин ARPE-19 вірусом залежить від цілісності вірусних глікопротеїнових антигенів, зокрема, пентамерного gH-комплексу, значення EC50 відображають те, наскільки добре вірусні частинки зберігаються в цих умовах. Як видно на фіг. 11, CMV втрачає інфекційність при зберіганні протягом чотирьох днів в HBSS при RT. Більше того 3 цикли заморожування-розморожування в HBSS приводили до повної втрати інфекційності, яку оцінювали аналізом на проникнення вірусу. Таким чином, HBSS не був оптимальним буфером для зберігання CMV. Вплив pH на стабільність CMV при кімнатній температурі вивчали в діапазоні pH від 3 до 8. Використовували наступні буфери: цитратний буфер (25 мМ), pH 3,0; ацетатний буфер (25 мМ), pH 4; ацетатний буфер (25 мМ), pH 5; гістидиновий буфер (25 мМ), pH 6; HEPES буфер (25 мМ), pH 7; збалансований сольовий розчин Хенка (HBSS), pH 7,5, і Тріс-буфер (25 мМ), pH 8. Зразки готували розбавленням маточного розчину вірусу в 10 разів відповідним буфером. Зразки зберігали при RT (25 °C) протягом 4 днів. У день 4 стабільність зразків вимірювали за допомогою аналізу на проникнення вірусу. CMV в HBSS, що зберігається замороженим при 70 °C, використовували як контроль. Спектри в УФ/видимій області для кожного із зразків отримували в момент часу 0 і в день 4 для вивчення структурних змін і агрегації, що відбувається під час зберігання. Як показано на фіг. 12, 25 мМ гістидиновий буфер при pH 6 забезпечував кращу стабільність CMV, зберігаючи більш високу інфекційність при RT в порівнянні з іншими тестованими значеннями рН. Друге похідне УФ-спектра вказувало на схожий структурний профіль вірусу при всіх значеннях pH (дані не представлені). Ніякої істотної агрегації не спостерігали ні при одному із тестованих значень pH, судячи за результатами вимірювання оптичної густини при 350 нм (дані не представлені). Вплив сечовини самої по собі або в поєднанні з хлоридом натрію на стабільність вірусу CMV тестували в 25 мМ гістидиновому буфері, pH 6. Додавання однієї 2 % сечовини не надавало впливу на стабільність CMV. Однак 2 % сечовина в поєднанні з 150 мМ NaCl підвищувала стабільність CMV при RT (фіг. 13). Вплив іонної сили на стабільність CMV вивчали при pH 6. NaCl у зростаючих концентраціях (0 мМ, 75 мМ, 150 мМ і 320 мМ NaCl) додавали до 25 мМ гістидинового буфера при pH 6. 18 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Стабільність CMV залежала від іонної сили, причому більш висока іонна сила приводила до більш високої стабільності (фіг. 14). Присутність сечовини не мала або мала мінімальний вплив на стабільність CMV (дані не представлені). Крім того, перевіряли вплив деяких інших ексципієнтів (сахарози, сорбіту, гліцерину і проліну) на стабільність експресуючого gH CMV при кімнатній температурі. Тестовані ексципієнти додавали до CMV в 25 мм гістидиновому буфері, pH 6, при кімнатній температурі на 4 дні до того, як стабільність вірусу CMV вимірювали за допомогою аналізу на проникнення вірусу. Для зразків розраховували значення EC50. Серед всіх протестованих ексципієнтів, 150 мМ NaCl окремо або в поєднанні з 9 % мас./об. сахарозою забезпечував більш високу стабільність при pH 6 (дані не представлені). Таким чином, рекомендованим буфером для зберігання CMV при RT є 25 мМ гістидин (pH 6) з 150 мМ NaCl з додаванням або без додавання 9 % мас./об. сахарози. Вивчали вплив кріопротекторів на стабільність CMV в процесі заморожуваннярозморожування. Як вказувалося раніше (фіг. 11), CMV в HBSS повністю втрачає свою інфекційність, коли його піддають трьом циклам заморожування-розморожування. Різні кріопротектори (включаючи сахарозу, сорбіт, гліцерин) тестували на здатність зменшувати стрес для CMV при заморожуванні-розморожуванні. Для кожного циклу заморожуваннярозморожування зразки заморожували при -70 °C протягом щонайменше 1 години і розморожували при RT протягом 30 хвилин. Додавання кріопротекторів приводило до підвищення стабільності вірусу. Крім того, 9 % мас./об. сахарози в поєднанні з 150 мМ хлоридом натрію значно підвищували стабільність вірусу в порівнянні з іншими протестованими кріопротекторами (фіг. 15). Таким чином, рекомендованим буфером для зберігання CMV при 70 °C або при використанні 3 циклів заморожування-розморожування є 25 мМ гістидин, 150 мМ NaCl і 9 % сахарози (буфер HNS). Буфер HNS порівнювали з буфером HBSS з точки зору збереження стабільності CMV в процесі трьох циклів заморожування-розморожування, при охолоджуванні (2-8 °C) і RT (25 °C). Буфер HNS забезпечував більш високу стабільність живого вірусу CMV при всіх протестованих умовах зберігання (дані не представлені). Приклад 6: Стабільність CMV в буфері HNS Стік вірусу CMV з подвійним злиттям IE1/2-UL51 переводили в буфер HNS і зберігали при 70 °C до використання. Дослідження стабільності проводили при концентрації 100 мкг/мл (з розрахунку на загальний вміст білка, виміряний аналізом по Бредфорду). Маточний розчин вірусу розбавляли буфером HNS до кінцевої концентрації вірусу. Потім зразки зберігали при відповідних температурах і тестували, як описано, в термін до 3 місяців. Для заморожуваннярозморожування зразки заморожували при -70 °C протягом щонайменше 1 години і розморожували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Зразки відбирали в різні моменти часу і зберігали замороженими при -70 °C до аналізу. Загальний вміст білка в зразках вимірювали аналізом по Бредфорду. Загальний вміст білка в зразках не змінювався протягом 3-місячного періоду (дані не представлені). Розмір частинок CMV в зразках з плином часу контролювали шляхом вимірювання гідродинамічного діаметра зразка методом DLS. Даний метод дозволяє відстежувати будь-яку агрегацію або руйнування вірусних частинок з плином часу і при різних температурах зберігання. Не спостерігали ніяких реальних тенденцій для спорадичних змін розмірів частинок в конкретних зразках (дані не представлені). Результати свідчили про те, що вірусні частинки були інтактними і не агрегували при підвищених температурах. Приклад 7: Вплив умов зберігання на здатність вірусу до проникнення і імуногенність Значні зміни в титрах вірусного проникнення (значення EC50) спостерігали, піддаючи зразки CMV зберіганню при різних температурах (дані не представлені). Зберігання при -20 °C приводило до зниження титрів вірусного проникнення в порівнянні із зберіганням при 2-8 °C і 25 °C. Титри зразків, що зберігаються при 2-8 °C, як встановлено, були нижче в порівнянні з титрами вірусного проникнення образів, що зберігаються при 25 °C. На основі значень EC50 температура зберігання була ранжирована в наступному порядку (від максимальної стабільності до мінімальної стабільності): 25 °C > 2-8 °C > -20 °C аж до часової точки 1 місяць. Титри вірусного проникнення не піддавалися виявленню у часовій точці 3 місяці для зразків, що зберігаються при -20 °C, 2-8 °C і 25 °C. Дослідження імуногенності на мишах починали в кінці дослідження стабільності, щоб визначити вплив температури зберігання на здатність CMV викликати продукцію нейтралізуючих CMV антитіл. Мишей імунізували вакциною по 2,5 мкг на дозу в/м в день 0 і виконували бустерну ін'єкцію в день 21 з подальшим забором крові в день 28. Мишачу 19 UA 114896 C2 5 10 15 20 25 30 сироватку тестували на нейтралізуючі антитіла проти експресуючого gH CMV, використовуючи клітини ARPE 19, і титри NT50 отримували шляхом апроксимації нелінійної кривої. Оцінювали вплив зберігання при різних температурах протягом 3 місяців на імуногенність CMV з подвійним злиттям IE1/2-UL51. Титри NT50 залежали від температури зберігання, причому більш високі температури приводили до зниження титрів в порівнянні з контролем, замороженим при -70 °C, хоч і незначно (р=0,2584, однофакторний аналіз ANOVA) (фіг. 16A). Титр NT50 для препаратів, що зберігаються при -20 °C, був знижений менше ніж в 2 рази, однак титри в аналізі на проникнення вірусу для цих зразків були істотно змінені в порівнянні з контролем, замороженим при -70 °C. Тенденція для титрів NT50 зразків для вивчення стабільності, що зберігаються при -20 °C, 2-8 °C і 25 °C, логічно витікала з титрів CMV, отриманих методом мас-ELISA для даних зразків. Оцінювали вплив зберігання при різних температурах протягом 8 годин після розморожування на імуногенність CMV з подвійним злиттям IE1/2-UL51. Титри NT50 препаратів порівнювали з контролем, замороженим при -70 °C. Титри NT50 не змінювалися (р=0,5865, однофакторний аналіз ANOVA) при зберіганні зразків протягом 8 годин при будь-якій з протестованих температур (фіг. 16B). У дослідженні імуногенності на мишах вивчали вплив зберігання CMV з подвійним злиттям IE1/2-UL51 при 25 °C протягом різних періодів часу після розмороження зразків. Титри NT50 цих препаратів порівнювали з контролем, замороженим при -70 °C. Титри NT50 не змінювалися (р=0,1848, непарний двосторонній критерій Стьюдента) при зберіганні зразків при 25 °C протягом терміну до тижня. Через 3 місяці титри NT50 падали трохи більше ніж в 2 рази, вказуючи на можливі проблеми зі стабільністю препарату у випадку зберігання при 25 °C протягом більш тривалого часу (дані не представлені). У дослідженні імуногенності на мишах вивчали вплив 3 циклів заморожуваннярозморожування на CMV з подвійним злиттям IE1/2-UL51, сформульований в буфері HNS. Три цикли заморожування-розморожування (F/Т) препарату CMV з подвійним злиттям не надавали впливу на імуногенність (р=0,2103, непарний двосторонній критерій Стьюдента) в порівнянні з контролем, замороженим при -70 °C (дані не представлені). Інші варіанти здійснення знаходяться в рамках наступної формули винаходу. Хоч були представлені і описані деякі варіанти здійснення, можна здійснювати різні модифікації без відступу від суті і об'єму даного винаходу. 20 UA 114896 C2 21 UA 114896 C2 22 UA 114896 C2 23 UA 114896 C2 24 UA 114896 C2 25 UA 114896 C2 26 UA 114896 C2 27 UA 114896 C2 28