Бівалентна вакцина проти хвороби марека

1 Бівалентна вакцина проти хвороби Марека, що містить суміш суспензій клітин, інфікованих штамом вірусу герпесу індичок (ВГІ) 3 серотипу і штамом вірусу герпесу курей (ВГК) 2 серотипу, сироватку крові великої рогатої худоби (ВРХ) і диметилсульфоксид, який відрізняється тим що містить суміш суспензій клітин, інфікованих вірусом ВГІ (3 серотип) та ВГК (2 серотип) 2 Бівалентна вакцина по п 1, яка відрізняється тим, що як базовий компонент вакцина містить штам FC-126 ВГІ в ефективній КІЛЬКОСТІ 3 Бівалентна вакцина за п 1, яка відрізняється тим, що як посилюючий компонент вакцина містить штам SBG ВГК (ІЕКВМ) в ефективній КІЛЬКОСТІ 4 Бівалентна вакцина за п 1, яка відрізняється тим, що вакцина містить штам FC-126 вірусу герпесу індичок з біологічною активністю не нижче 1 10 5 ФУО/см 3 5 Бівалентна вакцина за п 1, яка відрізняється тим, що вакцина містить штам SBG вірусу герпесу курей з біологічною активністю не нижче 1 10 6 ФУО/см 3 6 Бівалентна вакцина по п 1, яка відрізняється тим, що вакцина містить суміш суспензій фібробластів, вільних від патогенних факторів (ВПФ) ем Винахід відноситься до ветеринарної вірусологи та біотехнологм, може бути використаний при розробці і виготовленні засобів специфічної профілактики хвороби Марека бріонів курей, інфікованих штамом вірусу герпесу індичок FC-126 і штамом вірусу герпесу курей SBG (ІЕКВМ) сироватку крові великої рогатої худоби і д и мети л сульфоксид у наступному співвідношенні компонентів, мас % суспензія клітин, інфікованих FS126 ВГІ -38-45 суспензія клітин інфікованих SBG ВГК (ІЕКВМ) - 38-45 сироватка крові ВРХ - 8-12 д и мети л сульфоксид (ДМСО) - 5-12 7 Спосіб виготовлення вакцини проти хвороби Марека, що включає окреме інфікування клітин штамом вірусу герпесу індичок 3 серотипу і штамом вірусу герпесу курей 2 серотипу, інкубування зараженої культури, збір вірусовмісної суспензії клітин з наступним їхнім об'єднанням, додаванням крюпротектора й одержанням цільового продукту, який відрізняється тим, що зі штамів 3 серотипу використовують штам вірусу герпесу індичок, сім Herpesvindae, рід Herpesvirus, FC-126 ВГІ в ефективній КІЛЬКОСТІ 8 Спосіб за п 7, який відрізняється тим, що інфікують культуру клітин фібробластів ВПФ - ембріонів курей 9 Спосіб за п 7, який відрізняється тим, що одержують цільовий продукт зі вмістом штаму FC-126 вірусу герпесу індичок з біологічною активністю не нижче 1 105ФУО/см3 10 Спосіб за п 7, який відрізняється тим, що зі штамів 2 серотипу використовують штам SBG (ІЕКВМ) вірусу герпесу курей в ефективній КІЛЬКОСТІ 11 Спосіб за п 7, який відрізняється тим, що одержують цільовий продукт зі вмістом штаму SBG вірусу герпесу курей з біологічною активністю не нижче 1 10 ФУО/см3 Хвороба Марека (ХМ) високо контагіозне, лімфопроліферативне, злоякісне, вірусне захворювання птахів ХМ реєструється у всіх країнах світу, де розвинуте промислове птахівництво, у тому числі й у нашій країні, викликаючи великі економі О 00 (О 61780 сумішами штамів серотипів 1 і 3 чи 1 і 2 (Witter R L , etal AvianPathol , 1984, 13, 1 75) Відома полівалентна вакцина проти ХМ (патент России №2059404 А 61 К 39/255, 10 05 96), що містить суміш суспензій клітин ФЕК, інфікованих штамом FC-126 ВГІ 3 серотипу і штамами "42" і/або "50", ВГК 2 серотипу, сироватку крові ВРХ і ДМСО в наступних співвідношеннях, мас % Суміш суспензій інфікованих клітин - 80-90 Сироватка крові ВРХ - 5-10 ДМСО - інше Недоліком даної вакцини є те, що вона не має досить високої імуногенної активності у господарствах з високим рівнем захворюваності на ХМ Найбільш близькою до винаходу, що передбачається є бівалентна вакцина проти ХМ (патент России №2144377 от 28 06 1999 А 61 К 39/255, С 12 N 7/00, "Бивалентная вакцина против болезни Марека и способ ее изготовления", авт Куляшбенова Ш К и др ) Це рішення може бути прототипом Вакцина містить як базовий компонент штам "ВНИИЗЖ/110-ДЕП" вірусу герпесу індичок (ВГІ), а як посилюючий компонент, штам SB-1 ВГК, що містить суміш суспензій інфікованих клітин фібробластів ВПФ-ембрюнів курей (ФЕК), сироватку крові великої рогатої худоби (ВРХ) та диметилсульфоксид (ДМСО) Недоліком вакцини-прототипу є то, що в ній використовують російський штам, а не вітчизняний, та ще ця вакцина не володіє необхідною імуногенністю у птахогосподарствах з високим рівнем захворюваності на ХМ В основу винаходу поставлено задачу розробити бівалентну вакцину проти хвороби Марека, що містить суміш суспензій клітин, інфікованих ВГІ (З серотип) та ВГК (2 серотип), сироватку крові ВРХ і ДМСО, шляхом використання як базового компоненту штаму FC-126 ВГІ, а посилюючого компоненту штам SBG ВГК (ІЕКВМ) в ефективній Відома вакцина проти ХМ, що містить суспензію клітин ФЕК, інфікованих штамом "ВНІВП" ВГІ З КІЛЬКОСТІ серотипу, сироватку крові ВРХ і ДМСО (Патент Як клітинний субстрат вакцина містить культуРоссии № 2059404 А 61 К 39/255, 10 05 96) ру клітин ФЕК Вакцина містить штам FC-126 ВГІ з біологічною активністю не нижче 1 106 ФУО/см3 Недоліки відомих вакцин полягають утому, що вони не усувають носійства вірулентного вірусу Вакцина містить штам SBG ВГК (ІЕКВМ) із біоОбидва віруси (ВГІ і ВХМ) можуть одночасно перлогічною активністю не нижче 1 106 ФУО/см систувати в організмі птиці ВІДОМІ вакцини не усуВакцина містить суміш суспензій інфікованих вають небезпеки ураження лімфатичних органів клітин ФЕК, сироватку крові ВРХ і ДМСО в наступптиці від високо вірулентних онкогенних штамів ному співвідношенні компонентів, мас % ВХМ суспензія клітин, інфікованих FC126 ВГІ 38-45, Відомо, ЩО бі- і полівалентні вакцини, що суспензія клітин, інфікованих SBG ВГК включають вакцинні штами групи ВХМ-ВГІ сероти(ІЕКВМ) 38-45, пів 1, 2 і 3 , виявляють більш високу імуногенність сироватка крові ВРХ 8-12, у порівнянні з моновалентними, особливо проти ДМСО 5-12, дуже вірулентних польових штамів, що стають щоб забезпечити спосіб виготовлення бівалентної переважаючими в зонах інтенсивного птахівництвакцини проти хвороби Марека ва Це обумовлено тим, що штами цієї групи in vivo виявляють протективний синергизм, тобто ефекАналіз рівня техніки щодо патентних та наукотивність одною вакцинної о компонента зростає во-технічних джерел інформації дозволив зробити від дуже низької дози іншого і навіть часткові дози висновок, що рішення, яке заявляється, відповідає двох штамів ефективніше повної дози одного умовам патентоспроможності, "новизна" та "винаштаму ВІДОМІ дані про синергизм між штамами хідницький рівень" FC-126 (серотип 3) і SB-1 (серотип 2) ВикористанСпосіб виконується таким чином ня вакцини на основі зазначених штамів забезпеДля одержання клітинної суспензії і вирощучує більш високий захист проти ХМ у порівнянні із вання первинних культур клітин ФЕК і роздільного культивування штамів SBG ВГК (ІЕКВМ) і FCчні збитки Хвороба характеризується утворенням одиничних (у початковій стадії) і множинних пухлин у внутрішніх органах, шкірі, м'язах, а також змінами в центральній і периферичній нервовій системі курей Вірус хвороби Марека (ВХМ) ушкоджує імунокомпетентні органи (селезінку, тимус, бурсу) і має імунодепресивні властивості, що призводить до зниження загальної резистентності птахів і підвищення їхньої чутливості до інших хвороб У зв'язку з цим ХМ досить часто протікає в асоціації з іншими інфекціями Важливим засобом попередження ХМ від захворювання є вакцинопрофілактика Для специфічної профілактики використовують живі вакцини трьох типів із атенуйованих штамів ВХМ (серотип 1), із природноослабленого непатогенного ВХМ (серотип 2) і зі штамів вірусу герпесу індичок (ВГІ, серотип 3) Серотип 1 включає всі онкогенні віруси й атенуйовані варіанти ВХМ, серотип 2 - усі природноослаблені штами ВХМ, серотип 3 - антигенно спорідненні ВХМ віруси герпесу індичок Відома вакцина проти ХМ, що містить суспензію клітин фібробластів вільних від патогенних факторів (ВПФ) ембріонів курей (ФЕК), інфікованих штамом CVI-988 ВХМ 1 серотипу, сироватку крові великої рогатої худоби (ВРХ) і диметилсульфоксид (ДМСО) у якості крюпротектора (Сюрин В Н и др Вирусные болезни животных М ВНИТИБП, 1998, С 713-715) Відома вакцина проти ХМ, що містить суспензію клітин ФЕК, інфікованих штамом SB-1 вірусу герпесу курей ВГК 2 серотипу, сироватку крові ВРХ і ДМСО (Сюрин В Н и др Вирусные болезни животных - М ВНИТИБП, 1998, С 713-715) Відома вакцина проти ХМ, що містить суспензію клітин ФЕК, інфікованих штамом FC-126 ВГІ 3 серотипу, сироватку крові ВРХ і ДМСО (Временная инструкция по изготовлению и контролю клеточной культуральной вирусвакцины против БМ из штамма РС-126 ВГИ Утверждена ГУВ МСХ СССР 04 06 84) 61780 126 ВГІ використовують трипсин, сольовий розчин Хенкса чи Ерла, середовище Ігла, 0,5% розчин ГЛА на розчині Хенкса (ГЛАХ) чи Ерла (ГЛАЕ), середовище 199 і сироватку крові ВРХ У якості ростового середовища використовують суміш з рівних об'ємів середовищ на основі гідролізату лактальбумину (ГЛА), Ігла і 199 з 10% сироватки крові ВРХ Як підтримуюче середовище для культивування штамів SBG ВГК та FC-126 використовують суміш з рівних обсягів середовищ на основі ГЛА, Ігла і 199 з 2% сироватки крові ВРХ Виготовлення виробничої серії вакцини включає чотири етапи "освіження" і напрацювання вірусу в пасажах, знімання інфікованих клітин і формування серії вакцини, заморожування інфікованих клітин і контроль серії вакцини Освіження вірусу проводять двома послідовними пасажами Для цього в культуральних судинах ємкістю 1,5 дм 3 з моношаром культури клітин ФЕК проводять заміну ростового середовища на підтримуюче і вносять вірус з розрахунку для штаму SBG ВГК 200000 ФУО, для штаму FC126 ВГІ 100000 ФУО КІЛЬКІСТЬ ампул, використовуваних для зараження, визначають виходячи з титру маточного штаму вірусу Ампули дістають з рідкого азоту і негайно поміщають у воду з температурою 27°С до повного розморожування, потім ампули обробляють 3% розчином перекису водню, фламбують і розкривають Вміст ампул поєднують і розводять живильним середовищем з розрахунку, щоб у кожному см 3 суспензії містилося 10000 ФУО Для першого пасажу необхідно заражати не менш 6 культуральних судин Культуральні судини з зараженим моношаром клітин поміщають у термальні кімнати на три доби із ВГІ і 5-7 діб з ВГК На час збору вірусу типова ЦПД у виді фокусів повинна бути чіткою видно під мікроскопом (30-50% ураження моношару) Із судин видаляють підтримуюче середовище і вносять підігріту до 37°С диспергуючу суміш (0,02% розчин Версенута 0,25% розчин трипсину у співвідношенні 9 1) з 3 розрахунку 90-120 см Моношар змочують диспергуючим розчином протягом 1-3 хвилин, потім його швидко видаляють, а судини поміщають у термальну кімнату на 10-15 хвилин обертають при кімнатній температурі 5-10 хвилин зі швидкістю 20 об/хв Після закінчення часу в судини вносять підтримуюче середовище без сироватки, енергійним струшуванням відшаровують клітини від скла і суспендують у ньому, не допускаючи їхнього розбризкування по поверхні культуральної судини Потім проводять другий пасаж з розрахунку для ВГІ -48-72 години, для ВГК-98-120 годин При 7080% ураження моношару вірусом другого пасажу проводять знімання інфікованих кліток Клітинну суспензію піддають центрифугуванню при 1000 об/хв протягом 10 хвилин, після цього видаляють диспергуючий розчин і у флакон вносять живильне середовище в невеликому обсязі (10 см 3 на судину) без сироватки і ретельно ресуспендують осад кліток Потім концентрацію кліток доводять до 10-12 млн/см підтримуючим середовищем Концентрацію кліток визначають у камері Горяєва Виробничий обсяг виробничий маточної розплідки 6 3 повинен бути не менш 500 см При необхідності проводять третій і четвертий пасажі У цьому випадку суспензією кл іти нноз в'яза ного вірусу другого пасажу заражають моношарові культури клітин (3 пасаж) з розрахунку до об'єму підтримуючого живильного середовища 1 10-1 20 для штаму FC-126 ВГІ і 1 20-1 50 для штаму SBG ВГК Четвертий пасаж виконують з розрахунку 1 50-1 100 для штаму FC-126 ВГІ, 1 50 для штаму SBG ВГК Культуру клітин, інфікованих штамом FC-126 ВГІ, шкубують протягом 48-72 годин, а культуру клітин, інфікованих штамом SBG ВГК протягом 120 годин Збір інфікованих клітин проводять так само, як і при зніманні вірусу другого пасажу Після видалення диспергуючого розчину в судині вносять підтримуюче середовище з 20% сироватки крові ВРХ і 10% ДМСО Суспензію інфікованих клітин, сироватку крові ВРХ і ДМСО беруть у співвідношенні 12 16-3 5-1 3 ВІДПОВІДНО Суспензії інфікованих клітин поєднують, при цьому концентрація інфікованих клітин у суспензії повинна бути 5-10 млн/см3 для штаму FC-126 ВГІ і 4,04,5 млн/см3 для штаму SBG ВГК Зібрану суспензію інфікованих клітин розливають по 4 см 3 у попередньо марковані ампули, закривають стерильною ватою, поміщають на кювет з льодом, запаюють у полум'ї газового пальника з наступним заморожуванням інфікованих клітин методом поступового зниження температури Після цього ампули негайно занурюють у рідкий азот, поміщаючи їх в окрему посудину Д'юара чи в окремий контейнер ХБ Приклад 1 Контроль готової вакцини здійснювали ВІДПОВІДНО до ТУ У Для цього готували ПОСЛІДОВНІ де сятикратні розведення вірусу на живильному середовищі від 10 1 до 10 5 Кожне розведення вірусу ретельно піпетували, не допускаючи утворення піни в пробірці, і по 0,5 см 3 вносили у 3-5 флакони з моношаром клітин, попередньо звільнених від ростового середовища і залитих підтримуючим середовищем Заражену культуру шкубували при температурі 39-40°С зі зміною підтримуючого середовища через 24 години Через 4-5 доби після зараження клітинний моношар фарбували амідовим чорним Результати титрування враховували по наявності крапкових пофарбованих фокусів Підраховували фокуси в 3-5 флаконах, що відповідали тому самому розведенню вірусу, у якому число фокусів не перевищує 100 і не менш 10 Титр вірусу обчислювали за формулою де Т - титр вірусу у ФУО/см3, А - середня КІЛЬКІСТЬ фокусів у флаконі, Р - розведення вірусу, 2 - коефіцієнт перерахування на 1 см 3 Титр базового компонента вакцини (штам SBG) і другого компонента (штам FC-126) повинен бути не нижче 1 105 ФУО/см3 По титру встановлюють КІЛЬКІСТЬ імунізуючих доз у 1 см За одну прищепну дозу приймають 1000±100 ФУО для обох штамів Приклад 2 61780 8 Отримана вакцина являє собою заморожену кишкового тракту, а при бактеріологічному дослісуспензію жовто-рожевого кольору, при розведенні дженні виділена кишкова паличка являє собою гомогенну суспензію У подальших спостереженнях за ПІДДОСЛІДНИТермін придатності бівалентної вакцини за МИ курчатами захворювання і загибель курчат не умови збереження и в рідкому азоті 12 МІСЯЦІВ реєструвалась, за винятком 3 групи (контроль патогенності вірусу), у якій виявлене 1 хворе курча з Приклад З КЛІНІЧНИМИ ознаками викривлення шиї, відкинутої Бівалентну вірусвакцину рідку культуральну назад голови, парезу КІНЦІВОК, дистрофії м'язів застосовували з профілактичною метою Вакцинували курчат в перші години після вибірки з вивідОкрім цього, 2 голови з II групи ПІДДОСЛІДНИХ них шаф безпосередньо в інкубатори курей загинули ВІДПОВІДНО на 92 і 173 добі, внаслідок ущемлення голів у чарунках кліток При їх розПеред проведенням щеплень пенал з бівалентині виявлені зміни внутрішніх органів лише в півтною культуральною вірусвакциною обережно виня у вигляді збільшення залозистого шлунку, геймали із посудини Д'юара Потім з пеналу витягуморагічного запалення кишок і атрофії тимусу з вали необхідну КІЛЬКІСТЬ ампул і швидко переносикрапковими крововиливами ли у ємкості з водою при температурі 35-37°С Після розморожування ампули розкривали, Приклад 5 вакцину переносили у флакони з розріджувачем, Через 70, 90, 120 діб відібрано проби крові та що містить поліетиленгліколь, дотримуючись асепроведено контрольний забій по 3 гол із кожної птики Розріджувач при зміщуванні був охолоджепіддослідної групи курей Через 70 днів після імуний до температури холодильника 4-8°С нізації з послідуючим зараженням курей контрольним штамом вірусу ХМ "Таганрог-2001" виявлені В кожнім флаконі, що містить 160 см 3 розріущільнення і набряк слизової оболонки залозистих джувача, розводили 800 доз Розведену вакцину в шлунків у курей першої групи та в 2 голів третьої обємі 0,2 см вводили курчатам внутрішньомя'зово групи У курок третьої групи (контроль патогенності у верхню третину стегна за допомогою ін'єктора контрольного вірусу) залозистий шлунок збільшенапівавтоматичного чи шприцом обсягом 1 см 3 ний у 2 рази, жовчний міхур переповнений ПечінШприци і голки перед використанням стерилізувака має крапкові саловидні лімфомки, а тимусли кип'ятінням у дистильованій воді протягом 10саловидні розростання У м'язах стегна виявлені 15хв саловидні пухлини до 2 см у діаметрі Сідничний і Приклад 4 нерв стегна набряклі, потовщені в 2-3 рази За Випробування імуногенності запропонованої патологічними ознаками підтверджено діагноз на вакцини проти хвороби Марека здійснювали на хворобу Марека 110 однодобових курчатах породи "Род-Айланд", які були розділені на 4 групи й утримувались у У курей IV групи (неімунізованих і незаражених віварії Інституту птахівництва УААН контрольним штамом вірусу) патологічні зміни внутрішніх органів не виявлені Першій групі однодобових курчат (40 голів) щепили внутрішньом'язово суміш вірусів зі штамів При контрольному забої курей через 90 діб неSBG і FC-126 в об'ємі 0,2 см 3 в дозі 700 і значні патологічні зміни у вигляді атрофії бурси, 1000 ФУО, ВІДПОВІДНО збільшення залозистого шлунку виявлені у 2 з 3-х курей III групи (контроль патогенності вірусу) При Другій групі однодобових курчат (40 голів) щезабої на 120 по 3 голови і залишку курей на 235 пили внутрішньом'язово в об'ємі 0,2 см 3 суміш відобі патологічні зміни в органах не виявлені русів, штамів SBG і FC-126 в дозі по 1000 ФУО кожного При дослідженнях проб сироватки крові, відібраних від ПІДДОСЛІДНИХ курей і досліджених у Через 14 діб курчата першої, другої та третьої РИГА в лабораторії вивчення хвороб птиці ІЕКВМ, груп були заражені контрольним вірусом хвороби встановлено приріст специфічних антитіл у титрах Марека епізоотичним штамом "Таганрог-2001" у 3 від 1 4 до 1 16 (І-ІІ групи), 1 8-1 32 (III група) при дозі по 1000 ФУО в об'ємі 0,5 см внутрішньочеревідсутності отаких у курей чистого контролю (IV вно дворазово з інтервалом у 24 години група) Четверту групу (20 голів) курчат не імунізували і не заражали вірусом (чистий контроль) Бівалентна вакцина проти хвороби Марека та спосіб и виготовлення знайде використання при Імунізовані та контрольні групи курчат утримурозробці і виготовленні засобів профілактики хвовались в окремих боксах За ними здійснювали роби Марека у птахогосподарствах України, вакпостійний нагляд Через 5 діб після імунізації загицина має високу імуногенність (98%), а технологія нули 2 курчат (по одному з І й II груп) і одне курча з виготовлення вакцини є простіша та надійніша 4 групи (чистий контроль) При патологоанатомічному розтині виявлені ознаки ураження шлунково Комп'ютерна верстка Л Ціхановська Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119