Антитіло, яке специфічно зв’язується з людським рецептором глюкагону

Реферат: Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з людським рецептором глюкагону (hGCGR), способу одержання антитіла та фармацевтичної композиції, що його містить. Винахід також стосується способу зниження рівнів глюкози або кетонів у крові або лікування захворювання, що асоціюється або що частково характеризується високими рівнями глюкози або кетонів у крові, та застосування виділеного антитіла для одержання лікарського засобу для лікування захворювань, що асоціюються з hGCGR, включаючи лікування діабету, діабетичного кетоацидозу і довготривалих ускладнень, обумовлених діабетом, або інших метаболічних порушень, що частково характеризуються підвищеним рівнем глюкози або кетонів у крові. UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область техніки, якої стосується винахід Цей винахід стосується людських антитіл і антигензв'язуючих фрагментів людських антитіл, які специфічно зв'язуються з рецептором глюкагону, і терапевтичних методів застосування цих антитіл. Відомості про попередній рівень техніки Глюкагон є гормоном з 29 амінокислот, що продукується альфа-клітинами панкреатичних острівців. Глюкагон підтримує нормальні рівні глюкози у тварин, включаючи людей, урівноважуючи дію інсуліну. Саме дисбаланс глюкагону і інсуліну може відігравати важливу роль в деяких захворюваннях, таких як цукровий діабет і діабетичний кетоацидоз. Зокрема, дослідження показали, що підвищені базальні рівні глюкагону і недостатнє пригнічення постпрандіальної секреції глюкагону сприяють діабетичним захворюванням у людей (Muller et al., N Eng J Med 283: 109-115 (1970)). Вважають, що дія глюкагону на підвищення рівня глюкози в крові частково опосередковується активацією деяких клітинних шляхів після зв'язування глюкагону (GCG) з його рецептором (що позначається GCGR). GCGR є членом підсемейства секретину (сімейство B) рецепторів, пов'язаних з G-білками, і експресується, переважно, в печінці. Зв'язування глюкагону з його рецептором запускає каскад реакцій сигнальної трансдукції по шляху, що опосередковується G-білками і який активує внутрішньоклітинний циклічний АМФ і призводить до підвищення виходу глюкози в синтезі de novo (глюконеогенез) і розпаду глікогену (глікогенолізу) (Wakelam et al., Nature, (1986) 323: 68-71; Unson et al., Peptides, (1989), 10: 11711177; і Pittner and Fain, Biochem. J. (1991)277: 371-378). Щурячий рецептор глюкагону уперше був виділений і очищений Jelinek et al (Jelinek, L.J. et al. (1993) Science 259(5101): 1614-1616). Потім послідовність щурячого рецептора використовували для ідентифікації і клонування послідовності людського рецептора глюкагону, що містить 477 амінокислот (Lok, S. et al. (1994) Gene 140: 203-209; MacNeil, D.J. et al. (1994) Biochem. and Biophys. Res. Comm). У патенті США № 5,776,725 розкривається виділена нуклеотидна послідовність, що кодує людський або щурячий рецептор глюкагону. Націлювання на продукування або функцію глюкагону за допомогою антагоніста рецептора глюкагону, такого як антитіло до GCGR, може бути одним із способів регуляції або зниження рівня глюкози в крові і через це може виявитися корисним для лікування таких захворювань, як цукровий діабет або діабетичний кетоацидоз. Крім того, можливо, за допомогою зниження рівнів глюкози вдасться попередити або ослабити деякі з довготривалих ускладнень, обумовлених підвищеними рівнями глюкози у пацієнтів з діабетичними захворюваннями. Перші дослідження показали, що поліклональні антитіла до щурячого рецептора глюкагону були здатні блокувати зв'язування глюкагону (Unson, C.G. (1996) PNAS 93(1): 310-315). Моноклональні антитіла до людського рецептора глюкагону були описані Buggy et al. (Buggy, J.J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(13): 7474; Buggy, J.J. et al. (1996) Horm Metab Res. 28(5): 2159). Антитіло, описане Buggy et al., конкурувало з глюкагоном за сайт зв'язування з рецептором і розпізнавало як людський, так і щурячий рецептори глюкагону, але не мишачий рецептор. Wright et al. відкрили моноклональне антитіло, продуковане в миші, проти людського рецептора глюкагону і здійснили детальне дослідження структури білка моноклонального антитіла до рецептора (Wright, L.M. (2000) Acta Crystallographica Section D. 56(5): 573-580). Інші антитіла до рецептора глюкагону описані в патентах США 5,770,445 і 7,947,809; європейській патентній заявці EP2074149A2; європейському патенті EP0658200B1; опублікованих заявках на патент США 2009/0041784; 2009/0252727; і 2011/0223160; і опублікованій Міжнародній заявці WO2008/036341. Суть винаходу У першому аспекті винахід передбачає повністю людські моноклональні антитіла (mAbs) і їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються з людським рецептором глюкагону (hGCGR) і інгібують або блокують його активність, наприклад, блокують зв'язування глюкагону з його рецептором, тим самим блокуючи підвищення рівнів глюкози в крові. Антитіла або їх антигензв'язуючі фрагменти можуть застосовуватися для зниження рівнів глюкози в крові суб'єкта, який страждає на захворювання, що характеризується підвищеними рівнями глюкози в крові, таким як цукровий діабет. Антитіла можна застосовувати також для лікування широкого ряду захворювань і порушень, при яких необхідно блокувати взаємодію глюкагону з рецептором глюкагону, тобто вони виявляють лікувальну дію. Нарешті, антитіла можна застосовувати для попередження довготривалих ускладнень, обумовлених підвищеними рівнями глюкози в крові хворих діабетичними захворюваннями, або для зменшення інтенсивності щонайменше одного симптому, обумовленого підвищеними рівнями глюкози в крові хворих діабетичними захворюваннями. 1 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла за винаходом можуть бути повнорозмірними (наприклад, антитіло IgG1 або IgG4) або можуть містити тільки антигензв'язуючу ділянку (наприклад, фрагмент Fab, F(ab")2 або scFv), і можуть бути модифікованими з метою вплинути на функціональність, наприклад, виключити залишкові ефекторні функції (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164: 1925-1933). Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає виділене людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке(який) специфічно зв'язує людський рецептор глюкагону (hGCGR), причому антитіло зв'язується з ектодоменом і/або з позаклітинною (EC) петлею людського GCGR, де ектодомен являє собою N-кінцевий домен рецептора GCGR, а EC петля являє собою одну або більше позаклітинних петель EC1, EC2 і EC3. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає антитіло, або його фрагмент, яке(який) зв'язується з N-кінцевим доменом, що містить амінокислотні залишки, починаючи з амінокислотного залишку номер 27, приблизно, до амінокислотного залишку 144 послідовності SEQ ID NO: 153, або зв'язується з EC петлею рецептора hGCGR, де EC петля означає одну або більше позаклітинних петель EC1, EC2 і EC3, і EC1 включає амінокислотні залишки, починаючи, приблизно, з амінокислотного залишку 194, приблизно, до амінокислотного залишку 226 послідовностей SEQ ID NO: 153; EC2 включає амінокислотні залишки, починаючи, приблизно, з амінокислотного залишку 285, приблизно, до амінокислотного залишку 305 послідовностей SEQ ID NO: 153; і EC3 включає амінокислотні залишки, починаючи, приблизно, з амінокислотного залишку 369, приблизно, до амінокислотного залишку 384 послідовності SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент людського антитіла, яке(який) зв'язує hGCGR, містить варіабельну область важкого ланцюга (HCVR), що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130 і 146, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з певними варіантами здійснення здійснення винаходу антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке зв'язує hGCGR, містить HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 34, 70, 86, 110 і 126, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент людського антитіла, яке(який) зв'язує hGCGR, містить варіабельну область легкого ланцюга (LCVR), що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138 і 148, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке(який) зв'язує hGCGR, містить LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 42, 78, 88, 118 і 128, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу людське антитіло, або його фрагмент, яке(який) зв'язує hGCGR, містить пару амінокислотних послідовностей HCVR/LCVR, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138 і 146/148. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу пара амінокислотних послідовностей HCVR/LCVR вибрана з групи, яка складається з SEQ ID NO: 34/42, 70/78, 86/88, 110/118 і 126/128. Згідно із спорідненим варіантом здійснення винахід включає антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке(який) специфічно зв'язує hGCGR, причому антитіло, або його фрагмент, має CDR домени важкого і легкого ланцюгів, що містяться в парах послідовностей важкого і легкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138 і 146/148. Методи і технічні прийоми ідентифікації CDR в амінокислотних послідовностях HCVR і LCVR добре відомі в цій області техніки і їх можна застосовувати для ідентифікації CDR в конкретних амінокислотних послідовностях HCVR і/або LCVR, що розкриваються в цій заявці. Типові правила, які можна застосовувати для визначення меж CDR, включають, наприклад, визначення по Kabat, визначення по Chothia і визначення AbM. У загальних рисах визначення Kabat засноване на варіабельній послідовностей, визначення Chothia засноване на локалізації областей структурних петель, а визначення AbM є компромісом між підходами Kabat і Chothia. Див, наприклад, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of 2 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); і Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272 (1989). Також відкриті загальнодоступні бази даних для ідентифікації CDR послідовностей антитіла. Згідно з певними варіантами здійснення цей винахід передбачає виділене людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке(який) специфічно зв'язується з hGCGR, причому антитіло містить HCVR, що включає три області CDR важкого ланцюга (HCDR1, HCDR2 і HCDR3) в послідовності HCVR, вибраній з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130 і 146; і LCVR, що містить три області CDR легкого ланцюга (LCDR1, LCDR2 і LCDR3) в LCVR послідовностях, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138 і 148. Згідно з одним варіантом здійснення цей винахід передбачає виділене людське антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент людського антитіла, яке(який) зв'язує hGCGR, що містить HCDR3 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 і 136, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; і LCDR3 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 і 144, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає антитіло, або його фрагмент, яке(який) додатково містить HCDR1 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 і 132, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; HCDR2 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 і 134, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; LCDR1 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 і 140, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; і LCDR2 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 і 142, або по суті подібну їм послідовність, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, містить: (а) HCDR3 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 і 136; і (б) LCDR3 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 і 144. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, містить далі: (в) HCDR1 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 і 132; (г) HCDR2 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 і 134; (д) LCDR1 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 і 140; і (е) LCDR2 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 і 142. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить HCVR, що включає HCDR1 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з однієї з послідовностей SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 і 132; HCDR2 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з однієї з послідовностей SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 і 134; HCDR3 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з однієї з послідовностей SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 і 136; і LCVR, що включає LCDR1 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з однієї з послідовностей SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 і 140; LCDR2 домен, що має амінокислотну послідовність, вибрану з однієї з послідовностей SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 і 142; і LCDR3 домен, що має 3 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність, вибрану з однієї з послідовностей SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 і 144. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу людське антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент людського антитіла, яке(який) специфічно зв'язується з людським GCGR, містить пару амінокислотних послідовностей, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 76/84, 96/104, 116/124 і 136/144. Необмежувальними прикладами антитіл до GCGR, що мають ці пари HCDR3/LCDR3, є антитіла, позначені H4H1345N, H4H1617N, H4H1765N, H4H1321B і H4H1321P, H4H1327B і H4H1327P, H4H1328B і H4H1328P, H4H1331B і H4H1331P, H4H1339B і H4H1339P, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 4, 6 і 8, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 12, 14 і 16, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 20, 22 і 24, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 28, 30 і 32, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 36, 38 і 40, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 44, 46 і 48, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 52, 54 і 56, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 60, 62 і 64, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 72, 74 і 76, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 80, 82 і 84, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 92, 94 і 96, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 100, 102 і 104, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 112, 114 і 116, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 120, 122 і 124, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу людське антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить домени HCDR1, HCDR2 і HCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 132, 134 і 136, відповідно, і домени LCDR1, LCDR2 і LCDR3, що мають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 140, 142 і 144, відповідно. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло проти hGCGR, або його 1 2 3 4 антигензв'язуючий фрагмент, містить послідовність HCDR1, що має формулу X – X – X – X – 5 6 7 8 1 2 3 4 X – X – X – X (SEQ ID NO: 202), де X означає Gly, X означає Phe, X означає Thr, X означає 5 6 7 8 Phe або Ser, X означає Ser, X означає Ser або Asn, X означає Tyr або Phe, і X означає Asp, 1 2 3 4 5 6 7 8 Leu або Gly; послідовність HCDR2, що має формулу X – X – X – X – X – X – X – X (SEQ ID 1 2 3 4 NO: 203), де X означає Ile, X означає Ser, Gln, Asp або Trp, X означає Ser, Glu, Thr або Phe, X 5 6 7 означає Asp або Ala, X означає Gly або Glu, X означає Arg, Ile або відсутній, X означає Asp 8 1 2 3 4 5 або Glu і X означає Lys або Thr; послідовність HCDR3, що має формулу X – X – X – X – X – 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 X – X – X – X – X – X – X – X – X – X – X – X – X – X – X – X (SEQ ID NO: 1 2 3 4 204), де X означає Ala або Thr, X означає Lys або Arg, X означає Glu, X означає Met, Pro, Gly 5 6 7 або Asp, X означає Val, Ser, Lys, Arg або відсутній, X означає Tyr, His, Asn або відсутній, X 8 9 10 11 12 означає Tyr, X означає Asp або Glu, X означає Ile, X означає Leu, X означає Thr, X означає 13 14 15 Gly, X означає Tyr, Asp або His, X означає His, Asp, Tyr або відсутній, X означає Asn, Tyr, 16 17 18 19 His або відсутній, X означає Tyr, X означає Tyr або His, X означає Gly або Ala, X означає 20 21 1 2 Met, X означає Asp і X означає Val або Ile; послідовність LCDR1, що має формулу X – X – 3 4 5 6 1 2 3 4 X – X – X –X (SEQ ID NO: 205), де X означає Gln, X означає Gly або Ala, X означає Ile, X 5 6 означає Asn або Arg, X означає Asn і X означає Tyr або Asp; послідовність LCDR2, що має 1 2 3 1 2 3 формулу X – X – X (SEQ ID NO: 206), де X означає Thr або Ala, X означає Ala або Thr, і X 1 2 3 4 5 6 7 означає Ser або Phe; і послідовність LCDR3, що має формулу X – X – X – X – X – X – X – 4 UA 112168 C2 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9 1 2 3 X – X (SEQ ID NO: 207), де X означає Gln або Leu, X означає Gln, X означає Tyr, His або Asp, 4 5 6 7 8 X означає Asn або Tyr, X означає Thr або Ser, X означає Tyr, Asn або His, X означає Pro, X 9 означає Leu, Phe, Arg або відсутній і X означає Thr. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, зв'язує людський, мавпячий, мишачий і щурячий GCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, зв'язує людський, мавпячий і мишачий GCGR, але не зв'язує щурячий GCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, зв'язує людський, мавпячий і щурячий GCGR, але не зв'язує мишачий GCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, зв'язує людський і мавпячий GCGR, але не зв'язує щурячий або мишачий GCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, зв'язує людський GCGR, але не зв'язує мавпячий, мишачий або щурячий GCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає повністю людське моноклональне антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке(який) нейтралізує активність hGCGR, причому антитіло, або його фрагмент, має один або більше таких ознак: (i) містить область HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130 і 146; (ii) містить область LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138 і 148; (iii) містить домен HCDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 і 136, або по суті подібну їй послідовність, причому ступінь ідентичності послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; і домен LCDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 і 144, або по суті подібну їй послідовність, причому ступінь ідентичності послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; (iv) містить домен HCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 і 132, або по суті подібну їй послідовність, причому ступінь ідентичності послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен HCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 і 134, або по суті подібну їй послідовність, причому ступінь ідентичності послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен LCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 і 140, або по суті подібну їй послідовність, причому ступінь ідентичності послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; і домен LCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 і 142, або по суті подібну їй послідовність, причому ступінь ідентичності послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; (v) зв'язує будь-який один або більше GCGR: людський, мавпячий, мишачий або щурячий GCGR; (vi) може або не може блокувати активність GCGR щонайменше у одного з видів, відмінних від людини; (v) демонструє KD в інтервалі від близько 10-8 до близько 10-12; (vi) знижує рівні глюкози в крові щонайменше, приблизно, на 25 % – 75 % у ссавця, у якого спостерігаються підвищені рівні глюкози в крові; (vii) може або не може знижувати рівні тригліцеридів до рівнів, що спостерігаються у здорового ссавця; або (viii) не справляє жодного шкідливого впливу на рівні LDL, HDL або загального холестерину в крові ссавця. Згідно з іншим спорідненим варіантом здійснення винахід передбачає антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке(який) конкурує за специфічне зв'язування з hGCGR з антитілом, або його антигензв'язуючим фрагментом, що містить домени CDR важкого і легкого ланцюгів, наявні в парах послідовностей важкого і легкого ланцюгів, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138 і 146/148. Згідно з іншим спорідненим варіантом здійснення винахід передбачає антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке(який) зв'язує той самий епітоп на hGCGR, який розпізнається антитілом, що містить пари послідовностей важкого і легкого ланцюгів, вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/68, 70/78, 86/88, 90/98, 106/108, 110/118, 126/128, 130/138 і 146/148. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає антитіло до hGCGR, що має одне або більше нижченаведених властивостей: 5 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 а) здатне знижувати рівні глюкози в крові, приблизно, на 25 % – 75 % на період щонайменше протягом 7 днів при введенні в інтервалі доз від близько 1 мг/кг до близько 30 мг/кг; б) здатне призводити до зниження маси тіла щонайменше на 10 % при введенні ссавцю, що потребує такого лікування; в) здатне знижувати рівні кетонів у крові, приблизно, на 25 % – 75 % при введенні в інтервалі доз від близько 1 мг/кг до близько 30 мг/кг; чи г) здатне знижувати рівні глюкози в крові, приблизно, на 20 % – 40 %, не викликаючи помітного підвищення вмісту в крові ліпідів або холестерину при введенні з антитілом, специфічним до пропротеїн-конвертази субтилізин-кексину типу 9 (PCSK)-9, і зберігаючи знижені рівні глюкози в крові щонайменше протягом 7 днів після введення. У другому аспекті винахід передбачає молекули нуклеїнових кислот, кодуючі антитіла до hGCGR або їх фрагменти. Рекомбінантні вектори експресії, що несуть нуклеїнові кислоти за винаходом, і клітини-хазяї, в яких введені такі вектори, також охоплюються цим винаходом, як і методи одержання антитіл шляхом культивування клітин-хазяїв в умовах, що сприяють продукуванню антитіл і виділенню продукованих антитіл. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає антитіло, або його фрагмент, що містить область HCVR, яка кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 69, 85, 89, 105, 109, 125, 129 і 145, або по суті ідентичною послідовністю, гомологічною цим послідовностям щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 %. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу область HCVR кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 33, 69, 85, 109 і 125. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло, або його фрагмент, додатково містить область LCVR, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137 і 147, або по суті ідентичною послідовністю, гомологічною цим послідовностям щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 %. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу область LCVR кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 41, 77, 87, 117 і 127. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає також антитіло, або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке(який) містить домен HCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 75, 95, 115 і 135, або по суті подібною їм послідовністю, з ступенем ідентичності цих послідовностей щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; і домен LCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 83, 103, 123 і 143, або по суті подібною їм послідовністю, з ступенем ідентичності цих послідовностей щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає антитіло, або його фрагмент, який(яке) додатково містить домен HCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 71, 91, 111 і 131, або по суті подібною їм послідовністю, з ступенем ідентичності цих послідовностей щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен HCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 73, 93, 113 і 133, або по суті подібною їм послідовністю, з ступенем ідентичності цих послідовностей щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен LCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 79, 99, 119 і 139, або по суті подібною їм послідовністю, з ступенем ідентичності цих послідовностей щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; і домен LCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 81, 101, 121 і 141, або по суті подібною їм послідовністю, з ступенем ідентичності цих послідовностей щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Згідно з третім аспектом винахід включає людське антитіло до hGCGR, або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке(який) містить область HCVR, що кодується нуклеотидними послідовностями сегментів, одержаних з VH, DH і JH послідовностей зародкової лінії, і область LCVR, що кодується нуклеотидними послідовностями сегментів, одержаних з VK і JK послідовностей зародкової лінії, в комбінаціях, показаних в Таблиці 2. Винахід охоплює антитіла до hGCGR, що мають модифікований патерн глікозилювання. У деяких сферах застосування може бути корисна модифікація з видаленням непотрібних сайтів 6 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 глікозилювання, або, наприклад, з видаленням фукозного фрагмента для підвищення функції антитіло-залежної клітинної цитотоксичності (ADCC) (див. Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). Для інших сфер застосування можна здійснити модифікацію галактозилювання з метою модифікувати комплемент-залежну цитотоксичність (CDC). У четвертому аспекті винахід включає фармацевтичну композицію, що містить рекомбінантне людське антитіло, або його фрагмент, яке(який) специфічно зв'язує hGCGR, і фармацевтично прийнятний носій або розчинник. Згідно з одним варіантом здійснення винахід включає композицію, яка є комбінацією антитіла або антигензв'язуючого фрагмента антитіла за винаходом і другого терапевтичного агента. Другим терапевтичним агентом може бути будь-який агент, який зв'язується переважно з антитілом або його фрагментом за винаходом. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу другим терапевтичним агентом може бути агент, здатний знижувати рівні глюкози в крові або зменшувати інтенсивність щонайменше одного симптому у пацієнта, що страждає на захворювання або стан, що характеризується підвищеними рівнями глюкози в крові, таким як цукровий діабет. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу другий терапевтичний агент може бути агентом, який сприяє нейтралізації або послабленню будь-якого(-х) можливого(-х) побічного(-х) ефекту(-ів), який(які) асоційований(і) з антитілом або з антигензв'язуючим фрагментом антитіла за винаходом, у разі виникнення побічного(-х) ефекту(-ів). Наприклад, у разі, якщо будь-яке або антитіло до hGCGR підвищує рівні ліпіду або холестерину, може бути доцільним введення другого агента, який ефективно знижує рівні ліпіду або холестерину. Другий терапевтичний агент може являти собою низькомолекулярний лікарський засіб, білок/поліпептид, антитіло, нуклеотидну молекулу, таку як антисмислова молекула або siРНК. Другий терапевтичний агент може бути синтетичним або натуральним. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу другий терапевтичний агент може являти собою антагоніст глюкагону, або антагоніст другого рецептора глюкагону, такий як інше антитіло до рецептора глюкагону, яке відрізняється від антитіл за цим винаходом. Слід також брати до уваги, що антитіла і фармацевтично прийнятні композиції за цим винаходом можна застосовувати в комбінованій терапії, тобто антитіла і фармацевтично прийнятні композиції можна вводити одночасно з введенням, до або після введення одного або більше інших необхідних лікарських засобів або проведення медичних процедур. При здійсненні конкретної комбінації методів лікування (лікарських засобів або медичних процедур) для застосування в комбінованій схемі беруть до уваги сумісність заданих лікарських засобів і/або медичних процедур з досягненням необхідного терапевтичного ефекту. Також слід брати до уваги, що застосовувані лікарські засоби можуть забезпечити потрібний ефект по відношенню до одного і того самого порушення (наприклад, антитіло можна вводити одночасно з іншим агентом, що застосовується для лікування того самого порушення), або вони можуть забезпечувати досягнення різних ефектів (наприклад, регуляцію будь-яких побічних ефектів). У цьому контексті додаткові терапевтичні агенти, які зазвичай застосовують для лікування або попередження конкретного захворювання або стану, призначені (адекватні) для захворювання або стану, що підлягають лікуванню. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіла до hGCGR за винаходом можна застосовувати в комбінації з одним або більше нижченаведених лікарських засобів, що зараз випускаються, для лікування діабету типу 2. Ці лікарські засоби включають бігуанід (метформін), сульфонілсечовини (такі як глібурид, гліпізид), агоністи гамма-рецепторів, активовані проліфераторами пероксисом (PPAR) (піоглітазон, розиглітазон); і інгібітори альфа-глюкозидази (акарбоза, воглібоза). Додаткові лікарські засоби включають препарати для ін'єкцій, такі як ексенатид (EXENATIDE® (глюкагоноподібний пептид 1)) і симлін (SYMLIN® (прамлінтид)). Згідно з певними варіантами здійснення винаходу композиція може включати другий агент, вибраний з групи, яка складається із стимуляторів секреції, що не відносяться до класу сульфонілсечовин, інсуліну, аналогів інсуліну, поліпептиду ексендину-4, агоністів бета-3 адренорецепторів, агоністів PPAR, інгібіторів дипептидил-пептидази IV, статинів і статинвмісних комбінацій, інгібіторів всмоктування холестерину і/або жовчних кислот, антагоністів LDLхолестерину, антагоністів білка-переносника ефірів холестерину, антагоністів рецепторів ендотеліну, антагоністів гормону росту, сенсибілізаторів інсуліну, миметиків або агоністів аміліну, антагоністів канабіоїдних рецепторів, агоністів глюкагоноподібного пептиду-1, меланокортинів, агоністів рецепторів меланін-концентруючого гормону, SNRIs, міметика фактора росту фібробластів 21 (FGF21) (див., наприклад, патенти США US20110002845 і US20080261236), агоніста рецептора типу 1с фактора росту фібробластів (FGF1с) (див., наприклад, патент США US20110150901), інгібітору надлишкового утворення кінцевих продуктів 7 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гликозилювання, таких як, але без обмеження, аміногуанідин, і інгібіторів протеїнтирозинфази. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу композиція може містити другий агент, що сприяє зниженню рівнів ліпідів і холестерину, і може включати такий агент, як інгібітор 3гидрокси- 3-метилглутарилкофермента A (HMG-CoA) редуктази (наприклад, статин, такий як аторвастатин (Ліпітор, LIPITOR®), флувастатин (Лескол, LESCOL®), ловастатин (Мевакор, MEVACOR®), пітавастатин (LIVALO®), правастатин (Правахол, PRAVACHOL®), розувастатин (Крестор, CRESTOR®) і симвастатин (Зокор, ZOCOR®) тощо. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу може бути доцільним введення антитіла за винаходом в комбінації з будь-яким одним або декількома з агентів, перелік яких наводиться нижче: (1) ніацином, який підвищує катаболізм ліпопротеїнів; (2) фібратами або амфіпатичними карбоновими кислотами, які знижують рівень ліпопротеїнів низької щільності (LDL), покращують рівень ліпопротеїнів високої щільності (HDL) і рівні TG та знижують число серцевих нападів без летального результату; і (3) активаторами фактора транскрипції LXR, який відіграє роль в елімінації холестерину, такими як 22-гідроксихолестерин або комбіновані препарати, такі як VYTORIN®) (віторин, езетиміб плюс симвастатин); статин плюс секвестранти жовчних кислот (іонообмінна смола) (наприклад, колестирамін, колестипол, колесевелам), комбінований препарат ніацин плюс статин (наприклад, ніацин плюс ловастатин); або агентами, що знижують вміст ліпідів, такими як етилові ефіри омега-3-жирних кислот (наприклад, омакор). Окрім цього, другий терапевтичний агент може являти собою один або більше інгібіторів глюкагону або GCGR, а також інгібіторів молекул інших речовин, таких як ангіопоетин-подібний білок 3 (ANGPTL3), ангіопоетин-подібний білок 4 (ANGPTL4), ангіопоетин-подібний білок 5 (ANGPTL5), ангіопоетин-подібний білок 6 (ANGPTL6), які беруть участь у метаболізмі ліпідів, зокрема, в гомеостазі холестерину і/або тригліцеридів. Інгібітори цих молекул включають низькомолекулярні речовини або антитіла, які специфічно зв'язуються з цими молекулами і блокують їх активність. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу може бути доцільним ведення антитіл до GCGR за винаходом в комбінації з нуклеїновою кислотою, яка інгібує активність hPCSK9, такий як антисмислова молекула, молекула дволанцюжкової РНК або молекула siРНК. Приклади нуклеїнових кислот, які інгібують активність PCSK9, описані в патентах США US2011/0065644, US2011/0039914, US2008/0015162 і US2007/0173473. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу може бути доцільним введення антитіл до hGCGR за винаходом в комбінації з антитілом, яке специфічно зв'язується з hPCSK9 (людською пропротеїн конвертазою субтилізин/кексин) і інгібує її активність, тим самим інгібуючи її активність, при цьому таке антитіло знижує рівні ліпідів або холестерину. Приклади антитіл до hPCSK9 описані в патенті США US2010/0166768. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людською PCSK9, або його антигензв'язуючий фрагмент, можна вводити в інтервалі доз від близько 0,01 мг/кг до близько 30 мг/кг. Його можна вводити у вигляді разової дози або у вигляді багатократних доз. Антитіло до hPCSK9 можна вводити одночасно з антитілом до GCGR або його можна вводити до або після введення антитіла до GCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу друге терапевтичне антитіло для застосування в комбінації з антитілом за винаходом, є виділеним антитілом, яке специфічно зв'язується з людською PCSK9, або його антигензв'язуючий фрагмент, де антитіло до hPCSK9 містить три домени CDR важкого ланцюга (HCDR1, HCDR2 і HCDR3) в одній з будь-яких HCVR послідовностей, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID NO: 173 і 177; і три домени CDR легкого ланцюга (LCDR1, LCDR2 і LCDR3) в одній з будь-яких LCVR послідовностей, вибраних з групи, яка складається з SEQ ID NO: 175 і 185. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людською PCSK9, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить варіабельну область важкого ланцюга (HCVR), вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 173 і 177. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людською PCSK9, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить варіабельну область легкого ланцюга (LCVR), вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 175 і 185. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людською PCSK9, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 173 і 177, і LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 175 і 185. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людською PCSK9, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить варіабельну область важкого ланцюга (HCVR) і варіабельну область легкого ланцюга (LCVR), причому пари послідовностей HCVR/ LCVR вибрані з групи, яка складається з SEQ ID NO: 173/175; і SEQ ID 8 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO: 177/185. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з людською PCSK9, або його антигензв'язуючий фрагмент, містить: домен HCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 161 і 179; домен HCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 163 і 181; домен HCDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 165 і 183; домен LCDR1, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 167 і 187; домен LCDR2, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 169 і 189, і домен LCDR3, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 171 і 191. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіла до hPCSK9 для застосування в комбінації з антитілами до GCGR за винаходом кодуються молекулами нуклеїнових кислот за цим описом. Наприклад, згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає антитіло до hPCSK9, або його фрагмент, яке(який) містить область HCVR, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 172 і 176, або по суті ідентичною їм послідовністю, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 % гомологічною їм, і область LCVR, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 174 і 184, або по суті ідентичною їм послідовністю, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 98 % або щонайменше на 99 % гомологічною їм. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає антитіло до hPCSK9 для застосування в комбінації з антитілами до GCGR за винаходом, причому антитіло до hPCSK9, або його фрагмент, містить домен HCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 160 і 178, або по суті подібною їм послідовністю, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен HCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 162 і 180, або по суті подібною їм послідовністю, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен HCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 164 і 182, або по суті подібною їм послідовністю, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен LCDR1, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 166 і 186, або по суті подібною їм послідовністю, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; домен LCDR2, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 168 і 188, або по суті подібною їм послідовністю, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %; і домен LCDR3, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з SEQ ID NO: 170 і 190, або по суті подібною їм послідовністю, причому ступінь ідентичності цих послідовностей складає щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %. Якщо спільно вводять декілька лікарських засобів, дози можна коригувати відповідно до того, як це прийнято в цій області техніки. У п'ятому аспекті винахід включає методи інгібування активності hGCGR із застосуванням антитіла до hGCGR, або антигензв'язуючої ділянки антитіла за винаходом, причому терапевтичні методи включають введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент. Антитіла за винаходом можна застосовувати для лікування будь-якого стану або порушення, яке покращується, полегшується, інгібується або попереджається за допомогою виключення, інгібування або зниження hGCGR активності. Передбачається, що антитіла за винаходом можна застосовувати самостійно або як допоміжну терапію у поєднанні з іншими агентами або методами, що завідомо є стандартною терапією при лікуванні пацієнтів, що страждають на захворювання або стани, що характеризуються, частково, підвищеними рівнями глюкози або кетонів в крові, наприклад, але без обмеження, такими як діабет. Така стандартна терапія може включати інфузійну терапію або введення будь-яких інших фармацевтичних агентів, що знижують вміст глюкози, кетонів або ліпідів у крові або зменшують масу тіла. Антитіла до hGCGR за винаходом можуть блокувати взаємодію між глюкагоном і його рецептором, тим самим інгібуючи дію глюкагону, яка підвищує рівень глюкози. Застосування антагоністів рецептора глюкагону, таких як антитіла за цим описом, може бути ефективним 9 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способом досягнення нормальних рівнів глюкози, тим самим зменшується інтенсивність або попереджаються один або більше симптомів або довготривалі ускладнення, обумовлені, наприклад, діабетом. Застосування антагоністів рецептора глюкагону, таких як антитіла за цим описом, може також бути ефективним способом досягнення нормальних рівнів глюкози в крові недіабетичних пацієнтів, у яких спостерігається гіперглікемія в результаті станів або порушень, не пов'язаних з діабетом, таких як периопераційна гіперглікемія (гіперглікемія, що спостерігається у пацієнтів безпосередньо перед хірургічною операцією або після хірургічної операції). Згідно з певними варіантами здійснення винаходу пропонуються методи зниження рівнів глюкози або кетонів в крові при діабетичному кетоацидозі із застосуванням антитіл за винаходом. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу пропонуються також методи лікування пацієнтів з метою зменшення маси тіла, або попередження збільшення маси тіла, або збереження нормальної маси тіла із застосуванням антитіл за винаходом. Антитіла за цим винаходом можна також застосовувати для зменшення інтенсивності патологічних станів, наприклад, таких як порушена толерантність до глюкози, ожиріння, або для лікування діабетичних станів, або для попередження і зменшення тяжкості будь-якого одного або більше довготривалих ускладнень, що асоціюються з діабетом, таких як нефропатія, невропатія, ретинопатія, катаракта, удар, атеросклероз, уповільнене загоєння ран, та інших відомих спеціалістам у цій області техніки ускладнень, пов'язаних з діабетом. Інші патологічні стани або порушення, що піддаються лікуванню терапевтичними методами за винаходом, включають діабетичний кетоацидоз, гіперглікемію (включаючи периопераційну гіперглікемію, гіперглікемію у пацієнта у відділенні інтенсивної терапії і синдром гіперосмолярної гіперглікемії), гіперінсулінемію, метаболічний синдром, синдром резистентності до інсуліну, порушену глікемію натщесерце або глікемію, що асоціюється з гіперхолістеринемією, гіпертригліцеридемію, гіперліпідемію і дисліпідемії в цілому. Згідно з певними варіантами здійснення винахід передбачає виділене антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, специфічний до GCGR, за цим описом з метою застосування для зниження рівнів глюкози або кетонів в крові або для лікування пацієнта, що страждає на захворювання або стан, що обумовлені або характеризуються, частково, високими рівнями глюкози або кетонів в крові, причому цей стан або захворювання вибрані з діабету, порушеної толерантності до глюкози, ожиріння, нефропатії, невропатії, ретинопатії, катаракти, удару, атеросклерозу, уповільненого загоєння ран, діабетичного кетоацидозу, гіперглікемії, синдрому гіперосмолярної гіперглікемії, пері операційної гіперглікемії, гіперглікемії у хворого у відділенні інтенсивної терапії, гіперінсулінемії, метаболічного синдрому, синдрому резистентності до інсуліну і порушеної глікемії натщесерце. Згідно з певними варіантами здійснення розглядається застосування виділеного антитіла або антигензв'язуючого фрагмента за винаходом з метою приготування лікарського засобу для зниження рівнів глюкози або кетонів у крові або для лікування пацієнта, що страждає на захворювання або стан, що обумовлені або характеризуються, частково, високими рівнями глюкози або кетонів у крові, або для зменшення інтенсивності щонайменше одного симптому такого захворювання або стану, причому цей стан або захворювання вибрані з вищеперелічених захворювань або станів. Антитіла можуть також застосовуватися для лікування пацієнтів з неоперабельною глюкагономою (панкреатичною ендокринною пухлиною, що супроводжується або не супроводжується некротичною мігруючою еритемою і гіперглікемією). Інші варіанти винаходу стануть очевидними з наступного детального опису. Короткий опис креслень На Фіг. 1 показана зміна у відсотках рівнів глюкози в крові мишей C57BL6 після введення H4H1327P (антитіла проти GCGR) і/або H1H316P (антитіла проти PCSK9), індивідуально або у вигляді комбінації. Контроль (X суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг ( суцільна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг (▲ суцільна лінія); H1H316P в дозі 10 мг/кг (τсуцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг (υ пунктирна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг ( пунктирні лінії). На Фіг. 2 показані рівні LDL-C в плазмі мишей C57BL6 після введення H4H1327P і/або H1H316P, індивідуально або в комбінації. Контроль (X суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг ( суцільна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг (▲ суцільна лінія); H1H316P в дозі 10 мг/кг (τ суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг (υ пунктирна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг ( пунктирні лінії). На Фіг. 3 показані рівні HDL-C в плазмі мишей C57BL6 після введення H4H1327P і/або H1H316P, індивідуально або у вигляді комбінації. Контроль (X суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг ( суцільна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг (▲ суцільна лінія); H1H316P в дозі 10 мг/кг (τ суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг (υ пунктирна лінія); H4H1327P 10 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в дозі 10 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг ( пунктирні лінії). На Фіг. 4 показані рівні загального холестерину в плазмі мишей C57BL6 після введення H4H1327P і/або H1H316P, індивідуально або у вигляді комбінації. Контроль (X суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг ( суцільна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг (▲ суцільна лінія); H1H316P в дозі 10 мг/кг (τ суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг (υ пунктирна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг ( пунктирні лінії). На Фіг. 5 показані рівні гліцеридів у плазмі мишей C57BL6 після введення H4H1327P і/або H1H316P, індивідуально або в комбінації. Контроль (X суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг ( суцільна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг (▲ суцільна лінія); H1H316P в дозі 10 мг/кг (τ суцільна лінія); H4H1327P в дозі 3 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг (υ пунктирна лінія); H4H1327P в дозі 10 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг ( пунктирні лінії). На Фіг. 6 показані рівні печінкових тригліцеридів у мишей C57BL6 після введення H4H1327P і/або H1H316P, індивідуально або в комбінації. Контроль (X); H4H1327P в дозі 3 мг/кг (); H4H1327P в дозі 10 мг/кг (▲); H1H316P в дозі 10 мг/кг (τ); H4H1327P в дозі 3 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг (υ); H4H1327P в дозі 10 мг/кг + H1H316P в дозі 10 мг/кг (). Детальний опис винаходу Перш ніж описувати методи за цим винаходом, слід сказати, що цей винахід не обмежується конкретними описаними методами і умовами експерименту, оскільки такі методи і умови можуть змінюватися. Слід також враховувати, що термінологія вживається в цьому описі тільки з метою опису конкретного варіанта винаходу і не передбачається як обмежувальна, оскільки об'єм цього винаходу обмежується лише Формулою винаходу, яка додається. Якщо не зазначається інакше, усі технічні і наукові терміни, вживані в цьому описі, мають таке саме значення, яке зазвичай розуміє під ним середній спеціаліст в області техніки, якої стосується цей винахід. Хоча при практичному застосуванні або перевірці цього винаходу використовуються будь-які методи і матеріали, подібні або еквівалентні представленим в цьому описі, тут описуються переважні методи і матеріали. Визначення "Рецептор глюкагону", "глюкагоновий рецептор", також в цій заявці званий "GCGR", відноситься до сімейства зв'язаних з G-білком рецепторів класу 2 і складається з довгого амінокінцевого позаклітинного домену (см SEQ ID NO: 158 для ДНК, що кодує N-кінцевий позаклітинний домен, і SEQ ID NO: 159 для амінокислотної послідовності N- кінцевого позаклітинного домену), семи трансмембранних сегментів і внутрішньоклітинного C- кінцевого домену (Jelinek et al., Science 259: 1614-1616 (1993), Segre et al., Trends Endocrinol. Metab 4:309314 (1993)). Рецептори глюкагону експресуються, зокрема, на поверхні гепатоцитів, де вони зв'язуються з глюкагоном, і передають сигнал, що виникає при цьому, в клітину. Відповідно, термін "рецептор глюкагону" відноситься також до одного або більше рецепторів, які специфічно взаємодіють з глюкагоном, внаслідок чого виникає сигнал. Послідовності ДНК, що кодують рецептори глюкагону щурячого і людського походження, були виділені і описані в рівні техніки (європейський патент EP0658200B1). Були виділені і секвеновані мишачий і мавпячий (мавпи циномолгус) гомологи (Burcelin, et al., Gene 164 (1995) 305-310; McNally et al., Peptides 25 (2004) 1171-1178). Терміни "рецептор глюкагону", "глюкагоновий рецептор" і "GCGR" вживаються взаємозамінно. Вираз "GCGR", "hGCGR" або його фрагменти, за цим описом, відноситься до людського GCGR білка або його фрагментів, якщо спеціально не обумовлюється, що цей білок нелюдського походження, наприклад, "мишачий GCGR", "щурячий GCGR" або "мавпячий GCGR". Крім того, "GCGR", або "hGCGR", за цим описом відноситься до людського GCGR, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною в SEQ ID NO: 157, і має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 153, або його біологічно активного фрагменту. Існує цілий ряд послідовностей, що відносяться до GCGR гену, і мають нижченаведені номери доступу в Genbank: NP_000151.1 (людський), NP_742089.1 (щурячий), XP_001111894.1 (макак резус) і NP_032127.2 (мишачий). Інші послідовності, що розкриваються в цьому описі, включають людський GCGR (SEQ ID NO: 153), мишачий GCGR (SEQ ID NO: 154), мавпи циномолгус (SEQ ID NO: 155), щурячий GCGR (SEQ ID NO: 156). Згідно з певними варіантами здійснення винаходу злиті (гібридні, химерні) білки в цьому винаході можуть включати SEQ ID NO: 149 (фрагмент hGCGR-hFc, залишки 27-144 білка NP_000151.1, злитий з Fc фрагментом людського IgG) SEQ ID NO: 150 (фрагмент hGCGR-hFc, залишки 27-144 білка NP_000151.1, злитий з Fc фрагментом людського IgG), SEQ ID NO: 151 (фрагмент hGCGR-mmH, залишки 27144 білка NP_000151.1, злитий з myc-myc-his tag (хвостом)), і SEQ ID NO: 152 (фрагмент MfGCGR-hFc, що містить N-кінцеву послідовність Mf, мавпи циномолгус, ідентичний залишкам 27-144 GCGR макака резус, Macaca mulatta, що має номер доступу XP_001111894.1, і злитий з Fc фрагментом людського IgG). 11 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "людська пропротеїн-конвертаза субтилізин/кексину типу 9", або "hPCSK 9", за цим описом, відноситься до hPCSK9, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною в SEQ ID NO: 192, і має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:193, або її біологічно активний фрагмент. Передбачається, що термін "антитіло" за цим описом відноситься до молекул імуноглобуліну з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох важких (H) ланцюгів і двох легких (L) ланцюгів, пов'язаних між собою дисульфідними зв'язками (тобто "молекул повного антитіла"), а також до їх мультимерів (наприклад, IgM) або їх антигензв'язуючих фрагментів. Кожен важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга ("HCVR" або "VH") і константної області важкого ланцюга (що містить домени CH1, CH2 і CH3). Кожен легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга ("LCVR або "VL") і константної області легкого ланцюга (CL). Області VH і VL можуть додатково підрозділятися на гіперваріабельні області, що звуться областями (доменами), які визначають комплемент (CDR), упереміж з консервативнішими областями, що звуться каркасними областями (FR). Кожна область V H і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в такому порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу FR ділянки антитіла до GCGR (чи його антигензв'язуючого фрагмента) можуть бути ідентичними послідовностям людської зародкової лінії або можуть бути модифіковані природним або штучним чином. Амінокислотну консенсусну послідовність можна визначити на підставі аналізу сусідніх (розташованих "пліч-о-пліч") двох або більше CDR. Також можливі заміна одного або більше CDR залишків або виключення однієї або більше областей (однієї або більше ділянок, доменів) CDR. У науковій літературі описані антитіла, в яких одну або більше областей CDR можна замінити зв'язком (обійтися без цих областей). Padlan et al. (1995 FASEB J. 9: 133-139) аналізували області контакту між антитілами і їх антигенами на підставі опублікованих кристалічних структур і зробили висновок, що тільки від однієї п'ятої частини до однієї третини залишків CDR дійсно контактує з антигеном. Padlan також виявив безліч антитіл, в яких одна або більше областей CDR не містили амінокислот, що контактували з антигеном (див. також Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320: 415-428). Залишки CDR, що не контактують з антигеном, можна ідентифікувати, спираючись на більш ранні дослідження (наприклад, залишки H60-H65 в CDRH2 часто бувають не потрібні), з CDR ділянок по Kabat, які лежать поза ділянками CDR по Chothia, за допомогою молекулярного моделювання і/або емпіричним шляхом. Якщо CDR або його залишок (залишки) виключаються, їх зазвичай замінюють на амінокислоту, що займає відповідне положення в послідовності іншого людського антитіла або їх консенсусної послідовності. Положення для заміни в CDR і амінокислот для заміни можна також вибирати дослідним шляхом. Емпіричні заміни можуть бути консервативними і неконсервативними замінами. Повністю людські антитіла до GCGR за цим описом можуть містити одну або більше амінокислотних замін, інсерцій і/чи делецій в каркасній і/чи CDR областях варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга в порівнянні з відповідними послідовностями зародкової лінії. Такі мутації можна легко виявити, порівнюючи амінокислотні послідовності за цим описом з послідовностями зародкової лінії, наприклад, із загальнодоступної бази даних по послідовностях антитіл. Цей винахід включає антитіла, їх антигензв'язуючі фрагменти, які одержані з будь-якої амінокислотної послідовності, що розкривається в цій заявці, де одна або більше амінокислот в одній або більше каркасних і/чи CDR областей мутувала у відповідний(-і) залишок (залишки) послідовності зародкової лінії, з якої одержано антитіло, або у відповідний(-і) залишок (залишки) іншої людської послідовності зародкової лінії, або в консервативну амінокислотну заміну відповідного(-їх) залишку(ів) (такі зміни в послідовності в цій заявці в сукупності називаються "мутаціями зародкової лінії"). Середній спеціаліст в цій області техніки, виходячи з послідовностей варіабельних областей важкого і легкого ланцюга, що розкриваються в цій заявці, зможе легко одержати безліч антитіл і антигензв'язуючих фрагментів, які містять одну або більше індивідуальних мутацій або їх комбінації в зародковій лінії. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу усі залишки в каркасній і/або CDR областях в VH і/або VL доменах domains мутують "назад" в залишки початкової послідовності зародкової лінії, з якої одержано це антитіло. Згідно з іншими варіантами здійснення винаходу тільки деякі залишки мутують "назад" в залишки початкової послідовності зародкової лінії, наприклад, тільки мутації залишків виявлені серед перших 8 амінокислот FR1 або серед останніх 8 амінокислот FR4, або тільки мутації залишків виявлені серед CDR1, CDR2 або CDR3. Згідно з іншими варіантами здійснення винаходу один або більше залишків в каркасній і/чи CDR областях мутують у відповідний(-і) залишок (залишки) іншої послідовності зародкової лінії (тобто послідовності зародкової лінії, що відрізняється від послідовності зародкової лінії, з якої 12 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 було спочатку одержано антитіло). Крім того, антитіла за цим винаходом можуть містити будьяку комбінацію двох або більше мутаційзародкової лінії в каркасній і/чи CDR областях, наприклад, коли деякі окремі залишки мутували у відповідний залишок конкретної послідовності зародкової лінії, тоді як деякі інші залишки, які відрізняються від залишків в початковій послідовності зародкової лінії, зберігаються або мутують у відповідний залишок іншої послідовності зародкової лінії. Одержані антитіла і антигензв'язуючі фрагменти, які містять одну або більше мутацій зародкової лінії, можна легко перевірити на одну або більше потрібних властивостей, таких як підвищена специфічність зв'язування, підвищена афінність зв'язування, поліпшені або посилені антагоністичні або агоністичні біологічні властивості (залежно від ситуації), знижену імуногенність і так далі. Антитіла і антигензв'язуючі фрагменти, одержані таким загальним методом, охоплюються цим винаходом. Цей винахід включає також антитіла до hGCGR, що містять будь-які варіанти HCVR, LCVR і/або CDR амінокислотних послідовностей, які розкриваються в цій заявці, і мають одну або більше консервативних замін. Наприклад, цей винахід включає антитіла до hGCGR, що мають амінокислотні послідовності областей HCVR, LCVR і/або CDR, і містять, наприклад, 10 або менше, 8 або менше, 6 або менше, 4 або менше і так додатково консервативних амінокислотних замін в порівнянні з будь-якими з амінокислотних послідовностей HCVR, LCVR і/або CDR, що розкриваються в цьому описі. Передбачається, що термін "людське антитіло" за цим описом включає антитіла, що мають варіабельні і константні області людських імуноглобулінових послідовностей зародкової лінії. Людські mAbs за винаходом можуть включати амінокислотні залишки, що не кодуються нуклеотидними послідовностями для людських імуноглобулінових послідовностей зародкової лінії (наприклад, мутації, що вводяться при використанні випадкового або сайт-специфічного мутагенезу in vitro або за допомогою соматичної мутації in vivo), наприклад, в CDRs і, зокрема, в CDR3. Проте не передбачається, що термін "людське антитіло" за цим описом включає mAbs, в яких CDR послідовності, утворені із зародкової лінії самця іншого виду (наприклад, миші), були щеплені до людських FR послідовностей. Антитіла до людських GCGR за винаходом можуть позначатися як "анти-hGCGR" або "анти-GCGR". Термін "специфічно зв'язується" або подібний термін, означає, що антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, утворює комплекс з антигеном, порівняно стійкий у фізіологічних умовах. Специфічне зв'язування можна характеризувати рівноважною константою дисоціації -6 щонайменше близько 1 × 10 M або менше (наприклад, менша величина KD вказує на міцніше зв'язування). Методи визначення факту специфічного зв'язування двох молекул добре відомі в рівні техніки і включають, наприклад, рівноважний діаліз, поверхневий плазмонний резонанс і тому подібне. Проте, виділене антитіло, яке специфічно зв'язує hGCGR, може проявляти перехресну реактивність по відношенню до інших антигенів, таких як молекули GCGR від іншого виду. Більше того, у даному контексті мультиспецифічні антитіла, які зв'язуються з hGCGR і одним або більше інших антигенів, або біспецифічні антитіла, які зв'язуються з двома різними областями hGCGR, проте розглядаються як антитіла, які "специфічно зв'язують" hGCGR. Термін "високоафінне" антитіло відноситься до тих mAbs, афінність зв'язування яких з -9 -10 hGCGR, що виражається як KD, складає щонайменше 10 M; переважно, 10 M; прийнятніше, -11 -12 10 M, ще прийнятніше, 10 M, за визначенням методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, BIACORE™, рідкофазним ELISA. Під терміном "повільна (низька) швидкість дисоціації", "Koff" або "kd" розуміють, що антитіло -3 -1 дисоціює з комплексу з hGCGR з константою швидкості 1 × 10 сек або менше, переважно, 1 × -4 -1 10 сек або менше, за визначенням методом поверхневого плазмонного резонансу, наприклад, BIACORE™. Терміни "антигензв'язуюча ділянка" антитіла, "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла і тому подібне у даному контексті включає будь-який натуральний, одержуваний за допомогою ферментів (ферментативний), синтетичний або генно-інженерний поліпептид або глікопротеїн, який специфічно зв'язує антиген з утворенням комплексу. Терміни "антигензв'язуюча ділянка" антитіла, "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла і тому подібне у даному контексті відносяться до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з hGCGR. Згідно з конкретними варіантами здійснення винаходу антитіло або фрагменти антитіла за винаходом можуть бути пов'язані з терапевтичним агентом ("імунокон'югат"), таким як другий антагоніст GCGR, або бігуанід (метформін), сульфонілсечовина (така як глібурид, гліпізид), агоніст PPAR гамма (такий як піоглітазон або розиглітазон), інгібітор альфа глюкозидази (такий як акарбоза або воглібоза), EXENATIDE® (ексенатид, глюкагоноподібний пептид 1), SYMLIN® (симлін (прамлінтид)), хіміотерапевтичний агент, радіоізотоп або будь-який інший 13 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 терапевтичний агент, що застосовується для лікування захворювання або стану, викликаного, частково, небажаною активністю глюкагону. Передбачається, що термін "виділене антитіло" за цим описом відноситься до антитіла, яке по суті не містить інші антитіла (Abs), що мають відмінні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язує hGCGR, або його фрагмент, по суті не містить Abs, які специфічно зв'язують антигени, відмінні від hGCGR). Передбачається, що термін "блокуюче антитіло" або "нейтралізуюче антитіло" (чи "антитіло, яке нейтралізує GCGR активність") відноситься до антитіла, зв'язування якого з hGCGR призводить до інгібування щонайменше однієї біологічної активності GCGR. Наприклад, антитіло за винаходом може сприяти попередженню підвищенню рівнів глюкози в крові, обумовленому підвищенням рівнів глюкагону. Або ж антитіло за винаходом може проявляти здатність блокувати продукування cAMP у відповідь на глюкагон. Це інгібування біологічної активності GCGR можна оцінити, визначаючи кількісно один або більше параметрів біологічної активності GCGR одним або більше з деяких стандартних методів аналізу in vitro або in vivo, відомих в рівні техніки (розділ Приклади, див. нижче). Термін "поверхневий плазмонний резонанс" у даному контексті відноситься до оптичного явища, яке дозволяє аналізувати в реальному часі біомолекулярні взаємодії за допомогою детекції змін концентрації білка в матриці біосенсора, наприклад, використовуючи систему BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Передбачається, що термін "KD" у даному контексті відноситься до конкретної взаємодії антиген-антитіло. Термін "епітоп" відноситься до антигенної детермінанти, яка взаємодіє із специфічним сайтом зв'язування у варіабельній області молекули антитіла, відомої як паратоп. Один антиген може мати більше одного епітопа. Так, різні антитіла можуть зв'язуватися з різними областями на антигені і можуть виявляти різну біологічну дію. Термін "епітоп" також відноситься до сайту на антигені, на який відповідають B і/або T клітини. Він також відноситься до області антигена, який зв'язується антитілом. Епітопи можуть визначатися як структурні або функціональні. Функціональні епітопи зазвичай є набором структурних епітопів і містять залишки, які вносять безпосередній вклад до афінності взаємодії. Епітопи можуть також бути конформаційними, тобто складатися з нелінійних амінокислот. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу епітопи можуть включати детермінанти, які є хімічно активними групами на поверхні молекул, такі як амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні групи або сульфонільні групи, і, згідно з певними варіантами здійснення винаходу, можуть мати специфічні характеристики тривимірної структури, і/або специфічні характеристики заряду. Термін "по суті (практично) ідентичність" або "по суті (практично) ідентичний" по відношенню до нуклеїнової кислоти або її фрагмента вказує на те, що при оптимальному вирівнюванні, з відповідними нуклеотидними інсерціями або делеціями, з іншою нуклеїновою кислотою (чи комплементарним їй ланцюгом) ідентичність нуклеотидних послідовностей спостерігається щонайменше, приблизно, для 90 %, і, прийнятніше, щонайменше, приблизно, для 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % нуклеотидних основ, за визначенням з використанням будь-якого загальновідомого алгоритму ідентичності послідовностей, такого як FASTA, BLAST або GAP, які обговорюються нижче. Нуклеотидна молекула, по суті ідентична еталонній нуклеотидній молекулі, може в деяких випадках кодувати поліпептид, який має таку саму або по суті подібну амінокислотну послідовність, що й поліпептид, що кодується еталонною нуклеотидною молекулою. У застосуванні до поліпептидів термін "по суті (практично) подібність (схожість)» або "по суті (практично) подібний (схожий)» означає, що дві пептидні послідовності при оптимальному вирівнюванні, такому, як вирівнювання по програмах GAP або BESTFIT, із застосуванням гепа ваги за замовчуванням мають ступінь ідентичності послідовностей щонайменше 90 %, ще прийнятніше, ступінь ідентичності послідовностей щонайменше 95 %, 98 % або 99 %. Переважно, положення залишків, які не є ідентичними, відрізняються консервативними амінокислотними замінами. "Консервативна амінокислотна заміна" представляє таку заміну, при якій амінокислотний залишок замінюється на інший амінокислотний залишок, що має бічний ланцюг (R групу) з аналогічними хімічними властивостями (наприклад, заряд або гідрофобність). Як правило, консервативна амінокислотна заміна по суті не змінює функціональні властивості білка. У тих випадках, коли дві або більше амінокислотних послідовностей відрізняються одна від одної консервативними замінами, відсоток або ступінь подібності можна регулювати у бік підвищення з метою коригування консервативної природи заміни. Способи здійснення такого регулювання добре відомі спеціалістам в цій області техніки. Див, наприклад, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Приклади груп амінокислот, що 14 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мають бічні ланцюги з подібними хімічними властивостями, включають 1) аліфатичні бічні ланцюги: гліцин, аланін, валін, лейцин і ізолейцин; 2) аліфатичні гідроксилвмісні бічні ланцюги: серин і треонін; 3) амідвмісні бічні ланцюги: аспарагін і глутамін; 4) ароматичні бічні ланцюги: фенілаланін, тирозин і триптофан; 5) основні бічні ланцюги: лізин, аргінін і гістидин; 6) кислі бічні ланцюги; аспартат і глутамат, і 7) сірковмісні бічні ланцюги: цистеїн і метіонін. Переважними групами амінокислот для консервативних замін є: валін-лейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізин-аргінін, аланін-валін, глутамат-аспартат і аспарагін-глутамін. Або ж консервативна заміна є будь-якою зміною, що має позитивну величину в матриці PAM250 логарифмічної функції правдоподібності, що розкривається в статті Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-45. "Помірно консервативна" заміна є будь-якою зміною, що має не-негативне значення в матриці PAM250 логарифмічної функції правдоподібності. Подібність послідовностей поліпептидів звичайно кількісно визначають, застосовуючи програму для аналізу послідовностей. Програма для аналізу білків дозволяє підбирати пари подібних послідовностей, використовуючи показники подібності, задані різним замінам, делеціям і іншим модифікаціям, що включають консервативні амінокислотні заміни. Наприклад, пакет програм GCG містить такі програми, як GAP і BESTFIT, які можна застосовувати з параметрами за замовчуванням для визначення гомології послідовностей або ідентичності послідовностей близькоспоріднених поліпептидів, таких як гомологічні поліпептиди з організмів різних видів або білок дикого типу і його мутеїн. Див, наприклад, GCG Version 6.1. Послідовності поліпептидів можна також порівнювати, застосовуючи FASTA з параметрами за замовчуванням або з рекомендованими параметрами; програма GCG Version 6.1. FASTA (наприклад, FASTA2 і FASTA3) передбачає вирівнювання і ідентичність (у відсотках) послідовностей областей найбільшого перекривання запитуваною і шуканою послідовностей (Pearson (2000) supra). Іншим переважним алгоритмом порівняння послідовності за винаходом з базою даних, що включає велике число послідовностей різних організмів, є комп'ютерна програма BLAST, особливо BLASTP або TBLASTN, в яких використовуються параметри за замовчуванням. См, наприклад, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 і (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 402. Згідно з конкретними варіантами здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла для застосування в способі за винаходом може бути моноспецифічним, біспецифічним або мультиспецифічним. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними до різних епітопів на цільовому поліпептиді або можуть містити антигензв'язуючі домени, специфічні до епітопів більш ніж одного цільового поліпептиду. Типовий формат біспецифічного антитіла, яке можна застосовувати в контексті цього винаходу, включає застосування першого імуноглобулінового (Ig) CH3 домену і другого імуноглобулінового Ig CH3 domain, де перший і другий Ig C H3 домени відрізняються один від одного щонайменше однією амінокислотою, і де відмінність щонайменше однієї амінокислоти послабляє зв'язування біспецифічного антитіла з Білком A в порівнянні з біспецифічним антитілом, що не має такої відмінності між амінокислотами. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу перший Ig CH3 домен зв'язує Білок А, а другий Ig CH3 домен містить мутацію, яка послабляє або анулює зв'язування з Білком А, таку як модифікація H95R (згідно з нумерацією екзона IMGT; H435R нумерація EU). Другий C H3 може додатково містити модифікацію Y96F (нумерація IMGT; Y436F згідно з EU нумерацією). Інші модифікації, які можуть знаходитися в другому CH3, включають: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M і V82I (IMGT нумерація; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M і V422I EU нумерація) у разі IgG1 mAbs; N44S, K52N і V82I (IMGT; N384S, K392N, і V422I; EU) у разі IgG2 mAbs; і Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q і V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, і V422I згідно EU) у разі IgG4 mAbs. Варіанти формату біспецифічного антитіла, описані вище, розглядаються в об'ємі цього винаходу. Під висловом "терапевтично ефективна кількість" розуміють кількість, яка дає потрібний ефект, для досягнення якого вона вводиться. Точна кількість залежить від мети лікування і встановлюється спеціалістом в цій області техніки із застосуванням відомих методів (див, наприклад, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding). Термін "нормальні рівні глюкози" відноситься до середніх плазматичних рівнів глюкози у людини менше, приблизно, 80 мг/дл для глюкози натщесерце, менше, приблизно, 110-120 мг/дл для постпрандіальних рівнів глюкози. Рівні глюкози в плазмі можна визначити відповідно до Etgen et al., (Metabolism 2000; 49(5): 684-688) або розрахувати шляхом переведення з концентрації глюкози в цілісній крові по D'Orazio et al., (Clin. Chem. Lab. Med. 2006; 44(12): 14861490). Терміни "нормалізація холестерину" або "нормальні рівні холестерину" відносяться до рівня загального холестерину у людини менше, приблизно, 200 мг/дл, при цьому інтервал близько 200-240 мг/дл вважається верхньою межею. З урахуванням нормального значення загального холестерину середнє значення LDL у людини, приблизно, від 100, приблизно, до 129 15 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мг/дл вважається нормальним, а для HDL нормальним вважається значення 45 мг/дл. Нормальний рівень тригліцеридів у людей складає менше 150 мг/дл. Нормальне співвідношення загального холестерину/HDL складає менше 4,5, а нормальне співвідношення LDL/HDL менше 3. Ці величини можна визначати відповідно до стандартної лабораторної практики (див також Friedewald, WT, Clin. Chem (1972), 18: 499-502; Chen, Y. et al. Lipids Health Dis. (2010); 9: 52; Keevil, JG, et al., Circulation (2007), 115: 1363-1370; і Bairaktari, E. et al., Clin. Biochem. (2000)33: 549-555). Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіла до GCGR можна застосовувати для зниження рівнів глюкози в крові до нормальних значень. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіла до GCGR можна застосовувати для підвищення рівнів HDL-C. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіла до GCGR можна застосовувати для зниження рівня тригліцеридів Загальний опис Оскільки глюкагон викликає фізіологічні ефекти шляхом передачі сигналу через рецептор глюкагону, рецептор глюкагону може бути потенційною мішенню при лікуванні діабету і інших метаболічних порушень, пов'язаних з глюкагоном. Застосування антагоністів рецептора глюкагону, таких як антитіла за цим винаходом, може бути ефективним способом досягнення нормальних рівнів глюкози, тим самим зменшується інтенсивність або попереджаються довготривалі ускладнення, обумовлені діабетом. Антитіла за цим винаходом можуть застосовуватися також для поліпшення станів, що асоціюються, наприклад, з порушеною толерантністю до глюкози, для лікування ожиріння, для попередження збільшення маси тіла, для лікування метаболічного синдрому, для лікування діабетичних станів, включаючи діабетичний кетоацидоз, або для попередження і/або зниження ризику розвитку одного або більше ускладнень, обумовлених діабетом, таких як нефропатія, невропатія, ретинопатія, катаракти, удар, атеросклероз, уповільнене загоєння ран і інші ускладнення, що асоціюються з діабетом, відомі спеціалістам в цій області техніки. Антитіла до hGCGR, описані в цій заявці, можуть застосовуватися також для лікування інших станів, включаючи гіперглікемію, синдром гіперосмолярної гіперглікемії (Stoner, G.D., American Family Physician, (2005), 71(9): 1723-1730; Diabetes Spectrum, Umpierrez, G.E., (2002)15(1): 28-36; Nugent, B.W., Emergency Medicine Clinics of North America, (2005), 23: 629648)), периопераційної гіперглікемії (Frisch, A. et al. Diabetes Care, (2010), 33(8): 1783-1788; Hanazaki, K. et al. World J Gastroenterol, (2009), 15(33): 4122-4125; Smiley, D.D. et al. Southern Medical Journal, (2006), 99(6): 580-589; Hermanides, J. et al., The Netherlands J. of Med. 67(6): 226229; Maerz, L.L. et al., Current Opinion in Critical Care, (2011), 17: 370-375), гіперглікемії у пацієнтів відділення інтенсивної терапії (Gunst, J. et al., Seminars in Dialysis, (2010), 23(2): 157-162; Losser, M-R., Critical care, (2010), 14: 231), гіперінсулінемії і синдрому резистентності до інсуліну і глюкагономи (панкреатичної ендокринної пухлини, що супроводжується або не супроводжується некротичною мігруючою еритемою і гіперглікемією (див, наприклад, Boden, G. et al., N Engl J Med (1986); 314: 1686-1689). Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіла за винаходом одержували від мишей, імунізованих первинним імуногеном, з наступною імунізацією вторинним імуногеном. Імуноген може бути клітинною лінією, що експресує GCGR білок або його біологічно активний фрагмент, або ДНК, кодуючу GCGR білок або його активний фрагмент, або GCGR білок або його активний фрагмент. Наприклад, згідно з певними варіантами здійснення здійснення винаходу, первинний імуноген може бути клітинною лінією, одержаною стандартними методами, яка, як відомо в рівні техніки, надекспресує повнорозмірний hGCGR (наприклад, мишачу MG87 клітинну лінію). Або ж можна здійснювати імунізацію за допомогою ДНК, використовуючи ДНК, що кодує повнорозмірний hGCGR (наприклад, конструкції hGCGR, одержані з використанням білка з номером доступу NP_000151.1), або ДНК, що кодує його біологічно активний фрагмент, наприклад, ДНК, кодуючу N-кінцевий домен GCGR (див, наприклад, SEQ ID NO: 158, яка кодує SEQ ID NO: 159), або розчинний N- кінцевий білок, включаючи білок з послідовністю SEQ ID NO: 159, або амінокислоти, що охоплюють залишки 27-144 в SEQ ID NO: 153. Вторинний імуноген може являти собою GCGR білок, або його біологічно активний фрагмент, або злитий білок, такий як hGCGR-mmH (REGN547, SEQ ID NO: 151) або hGCGR-hFc (REGN315, SEQ ID NO: 150; REGN316, SEQ ID NO: 149). Згідно з певними варіантами здійснення цього винаходу N-кінцевий домен, що має амінокислотну послідовність, показану в SEQ ID NO: 159 (без сигнальної послідовності), або будь-який один або більше ектодоменів GCGR, наприклад, будь-яку одну або більше позаклітинних областей (чи їх фрагментів) можна застосовувати для одержання антитіл, які зв'язують GCGR і інгібують його функцію, наприклад, його здатність зв'язувати глюкагон, що спричинило б в результаті зниження рівнів глюкози в крові. 16 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Повнорозмірна амінокислотна послідовність людського GCGR показана як SEQ ID NO: 153. Сигнальний пептид охоплює амінокислотні залишки 1-26 послідовностей SEQ ID NO: 153; Nкінцевий домен охоплює залишки 27-144 SEQ ID NO: 153; позаклітинна область 1 (EC1) охоплює амінокислотні залишки 194-226 SEQ ID NO: 153; позаклітинна область 2 (EC2) охоплює амінокислотні залишки 285-305 SEQ ID NO: 153; і позаклітинна область 3 (EC3) охоплює амінокислотні залишки 369-384 SEQ ID NO: 153. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіла, які специфічно зв'язуються з GCGR, можна одержувати, використовуючи фрагменти вищезгаданих позаклітинних областей або пептиди, які знаходяться поза названими областями, подовжуючи їх, приблизно, на 5 – 20 амінокислотних залишків від будь-якого N або C кінця або від обох кінців областей за цим описом. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу для одержання антитіл, специфічних до GCGR, можна використовувати будь-яку комбінацію вищезгаданих областей або їх фрагментів. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу для одержання моноспецифічних, біспецифічних або мультиспецифічних антитіл можна використовувати будьяку одну або більше вищеописаних областей або їх фрагментів. Антигензв'язуючі фрагменти антитіл Якщо конкретно не вказано інакше, слід розуміти, що термін "антитіло" у даному контексті охоплює молекули антитіла, що містять два важкі ланцюги імуноглобуліну і два легкі ланцюги імуноглобуліну (тобто "молекули повного антитіла"), а також їх антигензв'язуючі фрагменти. Терміни "антигензв'язуюча ділянка" антитіла або "антигензв'язуючий фрагмент" антитіла і тому подібне у даному контексті включає будь-який натуральний, одержуваний ферментативними методами, синтетичний або генно-інженерний поліпептид або глікопротеїн, який специфічно зв'язує антиген з утворенням комплексу. Терміни "антигензв'язуюча ділянка" антитіла або "антигензв'язуючий фрагмент" і тому подібне у даному контексті відноситься до одного або більше фрагментів антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з hGCGR. Фрагмент антитіла може включати фрагмент Fab, фрагмент F(ab') 2, фрагмент Fv, фрагмент dAb, фрагмент, що містить CDR, або виділену CDR ділянку. Антигензв'язуючі фрагменти антитіла можуть бути одержані, наприклад, з молекул повного антитіла відповідними стандартними методами, такими як протеолітичне розщеплення, або методами рекомбінантної ДНК (методами генної інженерії), що включають маніпуляції з ДНК і експресію ДНК, що кодує варіабельний і (необов'язково) константний домени антитіла. Такі ДНК відомі і/або є легкодоступними, наприклад, з комерційних джерел, бібліотек ДНК (включаючи, наприклад, фагові бібліотеки антитіл), або їх можна синтезувати. ДНК можна секвенувати і обробляти хімічними методами або методами молекулярної біології, наприклад, з метою повідомити одному або більше варіабельних і/або константних доменів відповідної конфігурації, або ввести кодони, створити цистеїнові залишки, модифікувати, додати або виключити амінокислоти і т. д. Необмежувальні приклади антигензв'язуючих фрагментів включають: (i) фрагменти Fab; (ii) фрагменти F(ab') 2; (iii) фрагменти Fd; (iv) фрагменти Fv; (v) одноланцюгові Fv (scFv) молекули; (vi) фрагменти dAb; і (vii) мінімальні узнавальні елементи, що складаються з амінокислотних залишків, які імітують гіперваріабельну область антитіла (наприклад, виділену область, що визначає комплемент (CDR), таку як CDR3 пептид), або загальмований (просторово ускладнений) пептид FR3-CDR3-FR4. Інші створені молекули, такі як домен-специфічні антитіла, однодоменні антитіла, антитіла з видаленими доменами, химерні антитіла, CDR-щеплені антитіла, діатіла, триатіла, тетратіла, міні-антитіла, наноантитіла (наприклад, одновалентні наноантитіла, бівалентні наноантитіла і так далі), малі модульні імунофармацевтичні білки (SMIPs) і варіабельні домени антитіла (нового рецептора антигенів) акули (IgNAR), також охоплюються висловом "антигензв'язуючий фрагмент" за цим описом. Антигензв'язуючий фрагмент антитіла, як правило, містить щонайменше один варіабельний домен. Варіабельний домен може бути будь-якого розміру і амінокислотного складу і зазвичай містить щонайменше одну область CDR, яка прилягає до або знаходиться в рамці зчитування з однією або більше каркасною послідовністю. У антигензв'язуючих фрагментах, що мають VH домен, асоційований з VL доменом, VH і VL домени можуть бути розташовані один відносно одного в будь-якому відповідному порядку. Наприклад, варіабельна область може бути димерною і містити димери VH-VH, VH-VL або VL-VL. Або ж, антигензв'язуючий фрагмент антитіла може містити мономірний домен VH або VL. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антигензв'язуючий фрагмент антитіла може містити щонайменше один варіабельний домен, пов'язаний ковалентним зв'язком щонайменше з одним константним доменом. Необмежувальні типові конфігурації варіабельних і константних доменів, які можуть знаходитися в антигензв'язуючому фрагменті антитіла, включають: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2 17 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VLCH2-CH3; и (xiv) VL-CL. У будь-якій конфігурації варіабельного і константного доменів, включаючи будь-яку з типових конфігурацій, перерахованих вище, варіабельні і константні домени можуть бути або безпосередньо пов'язані один з одним, або можуть зв'язуватися за допомогою повної або часткової шарнірної або лінкерної області. Шарнірна область може складатися щонайменше з 2 (наприклад, з 5, 10, 15, 20, 40, 60 або більше) амінокислот, що в результаті забезпечує гнучкий або напівгнучкий зв'язок між сусідніми варіабельними і/або константними доменами в одній поліпептидній молекулі. Крім того, антигензв'язуючий фрагмент антитіла за цим винаходом може містити гомодимер або гетеродимер (чи інший мультимер) будь-яких конфігурацій вaріабельного і константного доменів, перерахованих вище, пов'язаних нековалентними зв'язками один з одним і/або з одним або більше мономірним V H або VL доменом (наприклад, дисульфідним(-ими) зв'язком (зв'язками)). Як і у разі молекул повних антитіл, антигензв'язуючі фрагменти можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними (наприклад, біспецифічними). Мультиспецифічний антигензв'язуючий фрагмент антитіла зазвичай містить щонайменше два різні варіабельні домени, причому кожен варіабельний домен здатний специфічно зв'язуватися з окремим антигеном або з різними епітопами на одному і тому самому антигені. Будь-який формат мультиспецифічного антитіла, включаючи типові формати біспецифічного антитіла за цим винаходом, можна адаптувати для застосування в контексті антигензв'язуючого фрагмента антитіла за цим винаходом, використовуючи стандартні методи, відомі в цій області техніки. Одержання людських антитіл Методи одержання моноклональних людських антитіл в трансгенних мишах відомі в рівні техніки. Будь-які такі відомі методи можна застосовувати в контексті цього винаходу для одержання людських антитіл, які специфічно зв'язуються з людським GCGR. При використанні технології VELOCIMMUNE™ (див, наприклад, патент США US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) або будь-якого іншого методу одержання моноклональних антитіл спочатку виділяли високоафінні химерні антитіла до GCGR, що мають людську варіабельну область і мишачу константну область. Технологія VELOCIMMUNE™ включає одержання трансгенної миші, геном якої містить варіабельні області важкого і легкого ланцюга, функціонально пов'язані з ендогенними локусами мишачої константної області, так що у відповідь на антигенну стимуляцію у миші виробляється антитіло, що містить людську варіабельну область і мишачу константну область. ДНК, що кодує варіабельні області важкого і легкого ланцюгів антитіла, виділяють і функціонально зв'язують з ДНК, що кодує людські константні області важкого і легкого ланцюгів. Потім ДНК експресують в клітині, що здатна експресувати повністю людське антитіло. Як правило, мишу VELOCIMMUNE™ імунізують потрібним антигеном і лімфатичні клітини (такі як В-клітини) беруть у мишей, які експресують антитіла. Лімфатичні клітини можна зливати з лінією клітин мієломи з метою одержання іморталізованих ліній клітин гібридоми, і такі лінії клітин гібридоми піддають скринінгу з метою визначити лінії клітин гібридоми, які продукують антитіла, специфічні до цільового антигена. ДНК, що кодує варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга, можна виділяти і зв'язувати з ізотипічними, що є схожими, константними областями важкого ланцюга і легкого ланцюга. Такий антитільний білок можна продукувати в клітині, такій як клітина СНО. Або ж ДНК, кодуючу антиген специфічні химерні антитіла або варіабельні домени легкого і важкого ланцюгів, можна виділяти безпосередньо з антигенспецифічних лімфоцитів. Спочатку виділяють високоафінні химерні антитіла, що містять людську варіабельну область і мишачу константну область. Як показано нижче, в експериментальній частині, антитіла характеризують і здійснюють відбір за потрібними характеристиками, включаючи афінність, селективність, епітоп і так далі. Мишачі константні області замінюють на потрібну людську константну область, щоб одержати повністю людське антитіло за винаходом, наприклад, дикого типу або модифікований IgG1 або IgG4. Тоді як вибрана константна область може змінюватися відповідно до конкретного застосування, за такі характеристики, як високоафінне зв'язування з антигеном і специфічність по відношенню до мішені, відповідає варіабельна область. Як правило, антитіла за цим винаходом мають дуже високу аффінність, зазвичай величина KD, яку визначають за допомогою зв'язування з антигеном, імобілізованим або на твердій, або в -12 -9 рідкій фазі (розчині), дорівнює, приблизно, від 10 , приблизно, до 10 M. Мишачі константні області замінювали на потрібні людські константні області, одержуючи повністю людські антитіла за винаходом. Тоді як вибрана константна область може змінюватися відповідно до конкретного застосування, за такі характеристики, як високоафінне зв'язування з антигеном і 18 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 специфічність по відношенню до мішені, відповідає варіабельна область. Біоеквіваленти Антитіла до GCGR і фрагменти антитіл за цим винаходом охоплюють білки, що мають амінокислотні послідовності, які відрізняються від послідовностей описаних антитіл, але зберігають здатність зв'язувати людський GCGR. Такі варіанти антитіл і фрагментів антитіл містять одне або більше додавань, одну або більше делецій або замін амінокислот в порівнянні з початковою послідовністю, але проявляють біологічну активність, яка по суті еквівалентна біологічній активності описаних антитіл. Аналогічно, послідовності ДНК за цим винаходом, кодуючі антитіла до GCGR, охоплюють послідовності, які містять одне або більше додавань, одну або більше делецій або замін нуклеотидів в порівнянні з досліджуваною послідовністю, але які кодують антитіло до GCGR або фрагмент антитіла, які по суті біоеквівалентні антитілу до GCGR або фрагменту антитіла за винаходом. Два антигензв'язуючих білка, або антитіла, вважаються біоеквівалентними, якщо, наприклад, вони є фармацевтично еквівалентними або фармацевтично альтернативними, швидкість і ступінь всмоктування яких дещо відрізняються при введенні в тій самій молярній дозі в аналогічних експериментальних умовах або у вигляді одиничної дози, або у вигляді багатократної дози. Деякі антитіла вважаються еквівалентними або фармацевтично альтернативними, якщо еквівалентний ступінь їх всмоктування, але не швидкість всмоктування, та все-таки вони можуть вважатися біоеквівалентними, оскільки така різниця швидкості всмоктування є навмисною і відображається в етикетці, несуттєва для досягнення ефективних концентрацій, що викликають звикання, наприклад, при постійному прийомі, і вважається незначною з медичної точки зору для конкретного лікарського продукту, що вивчається. Згідно з одним варіантом здійснення два антигензв'язуючих білка є біоеквівалентними, якщо відсутня клінічно значуща різниця в їх безпеці, чистоті і ефективності (активності). Згідно з одним варіантом здійснення два антигензв'язуючих білка є біоеквівалентними, якщо пацієнтові можна замінювати, один або більше разів, еталонний продукт на біологічний продукт без очікуваного збільшення ризику шкідливих побічних ефектів, включаючи клінічно значущу зміну імуногенності або знижену ефективність в порівнянні з безперервною терапією без такої зміни (переключення). Згідно з одним варіантом здійснення два антигензв'язуючих білка є біоеквівалентними, якщо вони обидва діють за загальним механізмом або загальними механізмами на стан або стани, в тій мірі, в якій ці механізми вивчені. Біоеквівалентність можна продемонструвати методами in vivo і in vitro. Методи кількісного визначення біоеквівалентності включають, наприклад, (a) in vivo тест на людях або інших ссавців, в якому визначають концентрацію антитіла або його метаболітів в крові, плазмі, сироватці або іншій біологічній рідині залежно від часу; (б) тест in vitro, що корелюється з in vivo даними щодо біодоступності і що дозволяє обґрунтовано прогнозувати ці дані; (в) in vivo тест на людях або інших ссавців, у яких відповідний гострий (короткочасний, різкий) фармакологічний ефект антитіла (чи його мішені) визначають як функцію часу; і (г) суворо контрольоване клінічне випробування, в якому встановлюють безпеку, ефективність або біодоступність або біоеквівалентність антитіла. Біоеквівалентні варіанти антитіл до GCGR за винаходом можна конструювати, наприклад, вводячи різні заміни залишків або послідовностей або здійснюючи делеції кінцевих або внутрішніх залишків або послідовностей, що не є обов'язковими з точки зору біологічної активності. Наприклад, цистеїнові залишки, що не є істотними для біологічної активності, можна видалити або замінити на інші амінокислоти з метою попередити утворення при ренатурації необов'язкових або некоректних внутрішньо-молекулярних дисульфідних містків. У іншому контексті біоеквівалентні антитіла можуть включати варіанти антитіл до GCGR, що містять амінокислотні заміни, які модифікують характеристики глікозилювання антитіл, наприклад, мутації, які виключають або видаляють глікозилювання. Біологічні характеристики антитіл Як правило, антитіла за цим винаходом можуть діяти, зв'язуючись щонайменше з однією з позаклітинних областей hGCGR. Згідно з певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть зв'язуватися з епітопом, локалізованим щонайменше в одній N-кінцевій області, або з епітопом, локалізованим щонайменше в одній з позаклітинних (EC) петель hGCGR. Згідно з певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть діяти, блокуючи або інгібуючи GCGR активність шляхом зв'язування з позаклітинною N-кінцевою областю, амінокислотна послідовність якої наводиться в SEQ ID NO: 159, і яка кодується нуклеотидною послідовністю, наведеною в SEQ ID NO: 158. 19 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Згідно з певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть діяти, блокуючи або інгібуючи GCGR активність шляхом зв'язування щонайменше однієї з EC петель або сегментів петель в цілому рецепторі. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з епітопом, локалізованим в EC1, приблизно, між амінокислотним залишком 194 і амінокислотним залишком 226 послідовностей SEQ ID NO: 153. Або ж, додатково, антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з епітопом, що знаходиться в EC2, локалізованим, приблизно, між амінокислотним залишком 285 і амінокислотним залишком 302 послідовності SEQ ID NO: 153. Або ж, або крім того, антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з епітопом, що знаходиться в EC3, локалізованим, приблизно, між амінокислотним залишком 369 і амінокислотним залишком 384 послідовності SEQ ID NO: 153. Згідно з певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом можуть бути біспецифічними антитілами. Біспецифічні антитіла за винаходом можуть зв'язувати один епітоп в EC1 і можуть також зв'язувати один епітоп в області hGCGR, відмінній від EC1. Згідно з певними варіантами здійснення біспецифічні антитіла за винаходом можуть зв'язувати один епітоп в EC1 і можуть також зв'язувати один епітоп в EC2 або EC3, або в N-кінцевій області, або в будь-якій іншій області в EC1, EC2, EC3 рецептора hGCGR, або будь-яку їх комбінацію. Згідно з певними варіантами здійснення біспецифічні антитіла за винаходом можуть зв'язуватися з двома різними сайтами в одній і тій самій позаклітинній області. Конкретніше, антитіла до GCGR за винаходом можуть проявляти одну або більше нижченаведених властивостей: (1) здатність зв'язуватися з людським GCGR або його фрагментом і з GCGR, відмінним від людського (наприклад, мишачим, мавпячим, щурячим, кролячим, собаки, свині і так далі) або його фрагментом; (2) здатність зв'язуватися з людським GCGR або його фрагментом, але не з GCGR, відмінним від людського (наприклад, мишачим, мавпячим, щурячим, кролячим, собачим, свинячим і так далі), або його фрагментом; (3) здатність зв'язуватися з людським GCGR або його фрагментом і з GCGR примату, відмінного від людини (наприклад, мавпячим), або його фрагментом, але не з мишачим, щурячим, кролячим, собачим або свинячим GCGR або фрагментом GCGR; (4) здатність зв'язуватися з людським GCGR або його фрагментом і з GCGR примату, відмінного від людини (наприклад, мавпячим), або його фрагментом, і з мишачим GCGR або його фрагментом, але не з щурячим GCGR; (5) здатність зв'язуватися з людським GCGR або його фрагментом і з GCGR примату, відмінного від людини (наприклад, мавпячим), або його фрагментом, і з щурячим GCGR або його фрагментом, але не з мишачим GCGR; 6) блокує зв'язування глюкагону з GCGR; 7) блокує індуковане глюкагоном продукування cAMP (цАМФ); 8) демонструє здатність знижувати рівні глюкози в крові людей, що страждають діабетом, і на тваринних моделях діабету; 9) може знижувати або не знижувати рівні тригліцеридів до рівнів у здорових ссавців; або 10) не справляє шкідливої дії на рівні ліпідів в плазмі. Певні антитіла до (проти) GCGR за цим винаходом здатні інгібувати або послабляти GCGR активність в аналізах in vitro або in vivo. Здатність антитілза винаходом зв'язуватися з GCGR і інгібувати зв'язування глюкагону з GCGR можна визначати кількісно будь-яким стандартним методом, відомим спеціалістам в цій області техніки, включаючи аналізи зв'язування, аналіз по гену-репортеру, такий як аналіз з використанням репортера люциферази. Необмежувальні приклади in vitro аналізів з метою кількісного визначення GCGR активності проілюстровані в Прикладах 4 і 5, в цій заявці. У Прикладі 4 афінності зв'язування і кінетичні константи людських антитіл до hGCGR визначали методом поверхневого плазмонного резонансу і вимірювання проводили на приладі T100. У Прикладі 5 біоаналіз проводили на лініях клітин HEK293, експресуючих повнорозмірний людський, мавпячий і мишачий GCGR разом з репортером люциферазою з метою детектувати активацію за допомогою Gαs, і наступне підвищення рівнів cAMP і активації транскрипції. У Прикладах 6, 7, 8, 9 і 10 показана in vivo дія антитіл на зниження рівнів глюкози в крові, рівнів кетонів у крові і на втрату у вазі на різних тваринних моделях. Цей винахід також включає антитіла до GCGR і їх антигензв'язуючі фрагменти, які зв'язуються щонайменше з одним біологічно активним фрагментом будь-якого з нижченаведених білків або пептидів: SEQ ID NO: 153 (повнорозмірний hGCGR), залишки 27-144 послідовності SEQ ID NO: 153 (N-кінцевий домен hGCGR); залишки 194-226 послідовностей SEQ ID NO: 153; залишки 285-305 послідовностей SEQ ID NO: 153; залишки 369-384 послідовності SEQ ID NO: 153. Будь-який з GCGR пептидів за цим описом, або його фрагменти, можна застосовувати для одержання антитіл до GCGR. Пептиди можна модифікувати, включаючи додавання або заміну деяких залишків з метою введення мітки або з метою кон'югації з молекулами носія, такого як KLH (гемоціанін лімфи равлика). Наприклад, можна додавати цистеїн або по N-кінцю, або по C-кінцю пептиду, або 20 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можна додавати лінкер для кон'югації, наприклад, з KLH для імунізації. Антитіла, специфічні до GCGR, можуть не містити додаткових міток або агентів, або вони можуть містити мітку або агент на N-кінці або C-кінці. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу мітка або агент являє собою біотин. В аналізі зв'язування положення мітки (якщо така є) може визначати орієнтацію пептиду відносно поверхні, по якій зв'язується пептид. Наприклад, якщо поверхня покрита авідином, пептид, що містить N-кінцевий біотин, буде орієнтований так, щоб C-кінцева ділянка пептиду була б розташована далеко від (дистально до) поверхні. Згідно з одним варіантом здійснення винахід передбачає повністю людське моноклональне антитіло, або його антигензв'язуючий фрагмент, яке(який) специфічно зв'язує hGCGR і нейтралізує активність hGCGR, причому антитіло або його фрагмент має одну або більше нижченаведених характеристик: (i) містить HCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 70, 86, 90, 106, 110, 126, 130 і 146; (ii) містить LCVR, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 68, 78, 88, 98, 108, 118, 128, 138 і 148; (iii) містить будь-яку одну або більше послідовностей CDR1 важкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з 4, 20, 36, 52, 72, 92, 112 і 132; будь-яку одну або більше послідовностей CDR2 важкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з 6, 22, 38, 54, 74, 94, 114 і 134; і будь-яку одну або більше послідовностей CDR3 важкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з 8, 24, 40, 56, 76, 96, 116 і 136; і будь-яку одну або більше послідовностей CDR1 легкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з 12, 28, 44, 60, 80, 100, 120 і 140; будь-яку одну або більше послідовностей CDR2 легкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з 14, 30, 46, 62, 82, 102, 122 і 142; будь-яку одну або більше послідовностей CDR3 легкого ланцюга, вибраних з групи, яка складається з 16, 32, 48, 64, 84, 104, 124 і 144; і їх комбінації; (iv) демонструє специфічність зв'язування по відношенню до будь-якого елемента з нижчепереліченого: N-кінцевої області GCGR, що містить амінокислотні залишки 27-144 послідовності SEQ ID NO: 153, або до однієї або більше позаклітинних петель GCGR, включаючи, наприклад, EC1, EC2 або EC3, де EC1 містить амінокислотні залишки в приблизному інтервалі від залишку 194 до залишку 226 послідовностей SEQ ID NO: 153, і де EC2 містить амінокислотні залишки в приблизному інтервалі від залишку 285 до залишку 305 °F SEQ ID NO: 153; і де EC3 містить амінокислотні залишки в приблизному інтервалі від залишку 369 до залишку 384 послідовності SEQ ID NO: 153; (v) зв'язує один або більш рецепторів, вибраних з людського, мавпячого, мишачого або щурячого GCGR; (vi) блокує зв'язування глюкагону з GCGR; vi) блокує індуковане глюкагоном продукування cAMP (цАМФ); vii) демонструє здатність знижувати рівні глюкози в крові або рівні кетонів в крові людей, що страждають діабетом, і на тваринних моделях діабету; viii) може знижувати або не знижувати рівні тригліцеридів до рівнів, спостережуваних у здорових ссавців; або ix) не справляє шкідливого впливу на рівні ліпідів у плазмі. Картирування епітопа і споріднені методи Для скринінгу на антитіла, які зв'язуються з конкретним епітопом, можна застосовувати аналіз з перехресним блокуванням, такий як аналіз, описаний в Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Інші методи включають аланін-скануючий мутагенез, блотинг пептидів (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248:443-463) або розщеплення пептидів. Крім того, можна застосовувати такі методи, як виключення епітопа, вилучення епітопа і хімічна модифікація антигенів (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496). Термін "епітоп" відноситься до сайту на антигені, на який відповідають В і/або Т-клітини. Вклітинні епітопи можуть бути утворені або з прилеглих амінокислот, або не з прилеглих амінокислот, які зближуються при фолдингу білка з утворенням третинної структури. Епітопи, утворені з прилеглих амінокислот, зазвичай зберігаються при експозиції з денатуруючими розчинниками, тоді як епітопи, утворені при фолдингу в третинну структуру, зазвичай при обробці денатуруючими розчинниками втрачаються. Зазвичай епітоп включає щонайменше 3, і, частіше, 5 або 8-10 амінокислот в унікальній просторовій конформації. Визначення профілю (антитіла) на моделі (MAP), також відоме як визначення профілю антитіла на основі структури антигена (ASAP), є методом, який дозволяє класифікувати (за категоріями) великі кількості моноклональних антитіл (mAbs), специфічних до одного і того самого антигена, на підставі подібності профілю зв'язування кожного антитіла з модифікованими хімічними або ферментативними методами поверхнями антигенів (див. патент США US 2004/0101920). Кожна категорія може представляти унікальний епітоп, що або помітно відрізняється від епітопа, представленого іншою групою, або що частково перекривається з епітопом, представленим іншою групою. Цей метод дозволяє швидко фільтрувати генетично ідентичні антитіла з тим, щоб визначення характеристик було зосереджене на генетично різних антитілах. У застосуванні до скринінгу гібридом MAP може сприяти ідентифікації рідкісних 21 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клонів гібридомних клітин, які продукують mAbs, що мають потрібні характеристики. MAP можна також застосовувати для розподілу антитіл до GCGR по групах антитіл, що зв'язують різні епітопи. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіло до GCGR або антигензв'язуючий фрагмент антитіла зв'язує епітоп щонайменше в одній з позаклітинних областей GCGR, де позаклітинна область є N-кінцевим доменом або однією з EC петель, включаючи EC1, EC2 або EC3, як описано раніше. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло зв'язує епітоп в N-кінцевій області GCGR, або його фрагмент, що містить амінокислотну послідовність в приблизному інтервалі, що включає амінокислотні залишки 27-144 послідовності SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло зв'язує епітоп ЕС1, або його фрагмент, що містить амінокислотну послідовність в приблизному інтервалі, що включає амінокислотні залишки 194226 послідовностей SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло зв'язує епітоп в EC2 GCGR, або його фрагмент, що містить амінокислотну послідовність в приблизному інтервалі, що включає амінокислотні залишки 285-305 послідовностей SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло зв'язує епітоп в EC3, або його фрагмент, що містить амінокислотну послідовність в приблизному інтервалі, що включає амінокислотні залишки 369-384 послідовності SEQ ID NO: 153. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіло або фрагмент антитіла зв'язує епітоп, який включає більш одного з перерахованих епітопів GCGR в N- кінцевому домені або в EC1, EC2 або EC3, і/або в двох або трьох інших позаклітинних областях (наприклад, епітопи в N-кінцевій області, EC1, EC2 і EC3 петлях, або в EC1, EC2 і EC3 петлях, або в N-кінцевій області, EC2 і EC3 петлях, або в N-кінцевій області, EC1 і EC3 петлях. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в одній позаклітинній області GCGR, а другий епітоп в іншій позаклітинній області GCGR, включаючи N-кінцевий домен, або EC1, EC2 або EC3. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в N-кінцевій області hGCGR, а другий епітоп в EC1 hGCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в Nкінцевій області hGCGR, а другий епітоп в EC2 hGCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в N-кінцевій області hGCGR, а другий епітоп в EC3 hGCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в EC1 hGCGR, а другий епітоп в EC2 hGCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в EC1 hGCGR, а другий епітоп в EC3 hGCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в EC2 hGCGR, а другий епітоп в EC3 hGCGR. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в N-кінцевому домені hGCGR, причому цей один епітоп знаходиться в приблизному інтервалі від залишку 27 до залишку 144 послідовності SEQ ID NO: 153, і другий епітоп в EC1 hGCGR, причому цей другий епітоп знаходиться в приблизному інтервалі від залишку номер 194 до залишку номер 226 послідовностей SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в Nкінцевому домені hGCGR, причому цей один епітоп знаходиться у вищезгаданому інтервалі, і другий епітоп в EC2 hGCGR, причому цей другий епітоп знаходиться в приблизному інтервалі від залишку номер 285 до залишку номер 305 послідовностей SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в Nкінцевому домені hGCGR, причому цей один епітоп знаходиться у вищезгаданому інтервалі, і другий епітоп в EC2 hGCGR, причому цей другий епітоп знаходиться в приблизному інтервалі від залишку номер 369 до залишку номер 384 послідовності SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в EC1 hGCGR, приблизно, від залишку 194, приблизно, до залишку 226 послідовностей SEQ ID NO: 153 і другий епітоп в EC2 GCGR, приблизно, від залишку 285, приблизно, до залишку 305 послідовностей SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в EC1 hGCGR, приблизно, від залишку 194, приблизно, до залишку 226 послідовностей SEQ ID NO: 153 і другий епітоп в EC3 GCGR, приблизно, від залишку 369, приблизно, до залишку 384 послідовності SEQ ID NO: 153. Згідно з одним варіантом здійснення винаходу антитіло є біспецифічним антитілом, яке зв'язує один епітоп в EC2 hGCGR, приблизно, від залишку 285, приблизно, до залишку 305 послідовностей SEQ ID NO: 153 і другий епітоп в EC3 GCGR, 22 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приблизно, від залишку 369, приблизно, до залишку 384 послідовності SEQ ID NO:153. Цей винахід включає антитіла до GCGR, які зв'язуються з тим самим епітопом, що й будьяке із специфічних ілюстративних антитіл за цим описом (наприклад, H4H1345N, H4H1617N, H4H1765N, H4H1321B і H4H1321P, H4H1327B і H4H1327P, H4H1328B і H4H1328P, H4H1331B і H4H1331P, H4H1339B і H4H1339P). Цей винахід включає також антитіла до GCGR, які конкурують за зв'язування з GCGR або з фрагментом GCGR з будь-яким із специфічних ілюстративних антитіл за цим описом. Можна легко визначити, або дійсно антитіло зв'язується з тим самим епітопом, що й еталонне антитіло до GCGR, або конкурує за зв'язування з еталонним антитілом до GCGR, застосовуючи стандартні методи, відомі в рівні техніки. Наприклад, щоб визначити, або зв'язується досліджуване антитіло з тим самим епітопом, що й еталонне антитіло до GCGR за винаходом, еталонне антитіло залишають зв'язуватися з білком або пептидом GCGR в умовах насичення. Потім визначають здатність досліджуваного антитіла зв'язуватися з молекулою GCGR. Якщо досліджуване антитіло здатне зв'язуватися з GCGR після насичення зв'язування з еталонним антитілом до GCGR, можна зробити висновок, що досліджуване антитіло зв'язується з іншим епітопом, ніж еталонне антитіло до GCGR. З іншого боку, якщо досліджуване антитіло нездатне зв'язуватися з молекулою GCGR після насичення зв'язування з еталонним антитілом до GCGR, то досліджуване антитіло може зв'язуватися з тим самим епітопом, з яким зв'язується еталонне антитіло до GCGR за винаходом. Щоб визначити, чи дійсно антитіло конкурує за зв'язування з еталонним антитілом до GCGR, вищеописану методику зв'язування здійснюють за двома напрямами: в першому випадку еталонне антитіло залишають зв'язуватися з молекулою GCGR в умовах насичення з подальшою оцінкою зв'язування досліджуваного антитіла з молекулою GCGR. У другому випадку досліджуване антитіло залишають зв'язуватися з молекулою GCGR в умовах насичення з подальшою оцінкою зв'язування еталонного антитіла з молекулою GCGR. Якщо в обох випадках (за двома напрямами) тільки перше (що насичує) антитіло здатне зв'язуватися з молекулою GCGR, то робиться висновок, що досліджуване антитіло і еталонне антитіло конкурують за зв'язування з GCGR. Середньому спеціалісту в цій області техніки зрозуміло, що антитіло, яке конкурує за зв'язування з еталонним антитілом, може не обов'язково зв'язуватися з тим самим (ідентичним) епітопом, що й еталонне антитіло, а може просторово блокувати зв'язування еталонного антитіла, зв'язуючи епітоп, що перекривається, або прилеглий епітоп. Два антитіла зв'язуються з тим самим епітопом або епітопом, що перекривається, якщо кожен з них конкурентно інгібує (блокує) зв'язування з іншим антигеном. Тобто 1-, 5-, 10-, 20або 100-кратний надлишок одного антитіла інгібує зв'язування з іншим щонайменше на 50 %, але, переважно, на 75 %, 90 % або навіть на 99 % за визначенням за допомогою аналізу конкурентного зв'язування (див, наприклад, Junghans et al., Cancer Res. 1990 50: 1495-1502). Або ж, два антитіла мають однаковий епітоп, якщо практично (по суті) усі амінокислотні мутації в антигені, які послабляють або виключають зв'язування одного антитіла, послабляють або виключають зв'язування іншого. Два антитіла мають епітопи, що перекриваються, якщо деякі амінокислотні мутації, які послабляють або виключають зв'язування одного антитіла, послабляють або виключають зв'язування іншого. Потім можна провести додаткові стандартні експерименти (наприклад, аналіз мутацій в пептидах і аналіз зв'язування) з метою підтвердження, або дійсно відсутність зв'язування досліджуваного антитіла спостерігається внаслідок того, що воно насправді зв'язується з тим самим епітопом, з яким зв'язується еталонне антитіло, або ж за відсутність зв'язування в експерименті відповідає просторове блокування (чи інше явище). Такі експерименти можна здійснювати методами ELISA (ІФА), RIA (РІА), поверхневого плазмонного резонансу, проточної цитометрії або будь-яким іншим методом кількісного або якісного аналізу зв'язування антитіл, відомого у області техніки. Видова селективність і видова перехресна реактивність Згідно з певними варіантами здійснення винаходу антитіла до GCGR зв'язуються з людським GCGR, але не з GCGR іншого виду. Або ж, згідно з деякими варіантами, антитіла до GCGR за винаходом зв'язуються з людським GCGR і з GCGR одного або більше видів, відмінних від людини. Наприклад, антитіла до GCGR за винаходом можуть зв'язуватися з людським GCGR і можуть зв'язуватися або не зв'язуватися, відповідно, з одним або більше білками GCGR миші, щура, морської свинки, хом'яка, піщанки, свині, кішки, собаки, кролика, кози, вівці, корови, коня, верблюда, мавпи циномолгус, мармозетки, макака резус або шимпанзе GCGR. Імунокон'югати Винахід охоплює моноклональне антитіло до людського GCGR, кон'юговане терапевтичним 23 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 агентом ("імунокон'югат"), таким як агент, який здатен знижувати рівні глюкози в крові, або радіоізотоп, або хіміотерапевтичний агент. При виборі типу терапевтичного агента, який може бути кон'югований з антитілом до GCGR, беруть до уваги стан, який підлягає лікуванню, і передбачуваний терапевтичний ефект. Наприклад, для лікування діабету або будь-якого іншого стану, де вимагається знизити рівень глюкози в крові і/або зберегти нормальні рівні глюкози в крові, агент, такий як бігуанід (наприклад, метформін), сульфонілсечовину (наприклад, глібурид, гліпізид), агоніст PPAR гамма (наприклад, піоглітазон, розиглітазон); інгібітор альфа глюкозидази (наприклад, акрбозу, воглібозу), інгібітор надлишкового утворення кінцевих продуктів глікозилювання (наприклад, аміногуанідин) або другий інгібітор GCGR можна кон'югувати з антитілом до GCGR. Або ж, якщо бажаним терапевтичним ефектом є лікування ускладнень або симптомів, що асоціюються з діабетом, або будь-яким іншим станом, викликаним високими або неконтрольованими рівнями глюкози, може бути переважним кон'югувати агент, придатний для лікування ускладнень або симптомів захворювання. Приклади агентів, придатних для одержання імунокон'югатів, відомі в рівні техніки, див, наприклад, Міжнародну патентну заявку WO 05/103081. Мультиспецифічні антитіла Антитіла за цим винаходом можуть бути моноспецифічними, біспецифічними або мультиспецифічними. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними до різних епітопів одного цільового поліпептиду або можуть містити антигензв'язуючі домени, специфічні більше ніж до одного цільового поліпептиду. Див, наприклад, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Антитіла до GCGR за цим винаходом можуть бути пов'язані або можутьекспресуватися спільно з іншою функціональною молекулою, наприклад, з іншим пептидом або білком. Наприклад, антитіло або його фрагмент може функціонально зв'язуватися (наприклад, хімічним зв'язком, злиттям методом генної інженерії, нековалентною асоціацією або іншим способом) з однією або більше молекулярних частинок, таких як інше антитіло або фрагмент антитіла, з утворенням біспецифічного або мультиспецифічного антитіла з другою специфічністю зв'язування. Наприклад, цей винахід включає біспецифічні антитіла, в яких одне плече імуноглобуліну є специфічним до людського GCGR або його фрагменту, а друге плече імуноглобуліну є специфічним до другої терапевтичної мішені або кон'юговане з терапевтичним агентом. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу одне плече імуноглобуліну є специфічним до епітопа на N-кінцевому домені hGCGR, або його фрагменті, а інше плече імуноглобуліну є специфічним до епітопа на одній з EC петель hGCGR, або її фрагменті. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу одне плече імуноглобуліну є специфічним до однієї EC петлі, або її фрагменту, а друге плече є специфічним до другої EC петлі, або її фрагмента. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу одне плече імуноглобуліну є специфічним до одного епітопа на одній EC петлі hGCGR, а друге плече є специфічним до другого епітопа на тій самій EC петлі hGCGR. Типовий формат біспецифічного антитіла, який можна використовувати в контексті цього винаходу, включає застосування першого CH3 домену імуноглобуліну (Ig) і другого CH3 домену Ig, де перший і другий CH3 домени Ig відрізняються один від одного щонайменше однією амінокислотою, і при цьому відмінність щонайменше на одну амінокислоту послабляє зв'язування біспецифічного антитіла з Білком A в порівнянні з біспецифічним антитілом, в якому цієї відмінності немає. Згідно з одним варіантом здійснення перший Ig CH3 домен зв'язує Білок А, а другий Ig CH3 домен містить мутацію, яка послабляє або анулює зв'язування Білка А, така як модифікація H95R (згідно з нумерацією екзонів в IMGT; H435R згідно з EU нумерацією). Другий CH3 домен може додатково містити модифікацію Y96F (по IMGT; Y436F по EU). Інші модифікації, які можуть бути в другому домені CH3, включають: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M і V82I (по IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M і V422I по EU) у разі IgG1 антитіл; N44S, K52N і V82I (IMGT; N384S, K392N і V422I по EU) у разі IgG2 антитіл; і Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q і V82I (по IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q і V422I по EU) у разі IgG4 антитіл. Варіанти формату біспецифічних антитіл, описані вище, розглядаються в об'ємі цього винаходу. Лікарські форми і їх введення Винахід передбачає фармацевтичні композиції, що містять антитіла до GCGR або їх антигензв'язуючі фрагменти за цим винаходом. Фармацевтичні композиції за винаходом вводять з відповідними носіями, ексципієнтами та іншими агентами, які включають в композицію з метою забезпечити краще перенесення, кращу доставку, переносимість і тому подібне. Величезну кількість відповідних лікарських форм можна знайти у фармакологічному довіднику, відомому усім хімікам-фармацевтам: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ці лікарські форми включають, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, 24 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 віск, олії, ліпіди, ліпід (катіонний або аніонний) – що містять везикули (такі як ЛІПОФЕКТИН™), ДНК-кон'югати, безводні розсмоктувальні пасти, емульсії олія-у-воді і вода-в-олії, емульсії карбовакс (поліетиленгліколі різної молекулярної маси), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Див також Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311. Доза антитіла може змінюватися залежно від віку і габаритів пацієнта, якому воно вводиться, від захворювання, стану, шляху введення тощо. Якщо антитіло за цим винаходом застосовують для зниження рівнів глюкози в крові, обумовлених активністю GCGR при різних станах або захворюваннях, таких як діабет, у дорослого пацієнта, зазвичай доцільно вводити антитіло за цим винаходом внутрішньовенно у вигляді разової дози від близько 0,01 до близько 30 мг/кг маси тіла, прийнятніше, від близько 0,02 до близько 7, від близько 0,03 до близько 5 або від близько 0,05 до близько 3 мг/кг маси тіла. Залежно від тяжкості стану антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент за винаходом можна вводити в початковій дозі щонайменше від близько 0.1 мг до близько 800 мг, від близько 1 до близько 500 мг, від близько 5 до близько 300 мг, або від близько 10 до близько 200 мг, до близько 100 мг або до близько 50 мг. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу за початковою дозою може йти вступ другої або декількох наступних доз антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента в кількості, яка може приблизно дорівнювати або бути нижче за початкову дозу, причому наступні дози вводяться через проміжки, що складають щонайменше від 1 дня до 3 днів; щонайменше один тиждень, щонайменше 2 тижні; щонайменше 3 тижні; щонайменше 4 тижні; щонайменше 5 тижнів; щонайменше 6 тижнів; щонайменше 7 тижнів; щонайменше 8 тижнів; щонайменше 9 тижнів; щонайменше 10 тижнів; щонайменше 12 тижнів; або щонайменше 14 тижнів. Відомі різні системи доставки, які можуть застосовуватися для введення фармацевтичної композиції за винаходом, наприклад, інкапсулювання в ліпосоми, мікрочастинки, мікрокапсули, рекомбінантні клітини, здатні експресувати віруси мутантів, рецептор-опосередкований ендоцитоз (див, наприклад, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Методи введення включають, але без обмеження, інтрадермальний, трансдермальний, внутрішньом'язовий, інтраперитонеальний, внутрішньовенний, підшкірний, інтраназальний, епідуральний і пероральний шляхи. Композицію можна вводити будь-яким звичайним способом, наприклад, за допомогою інфузії або болюсної ін'єкції, всмоктуванням через епітеліальне або шкірно-слизове вистилання (наприклад, через слизову оболонку рота, ректальну і інтестинальну слизову оболонку тощо) і можна вводити разом з іншими біологічно активними агентами. Введення може бути системним або місцевим. Фармацевтичну композицію можна також доставляти у везикулах, зокрема в ліпосомах (див, наприклад, Langer (1990) Science 249: 1527-1533). В деяких випадках фармацевтичну композицію можна доставляти у вигляді системи з контрольованим вивільненням. Згідно з одним варіантом здійснення можна застосовувати насос. Згідно з іншим варіантом здійснення можна застосовувати полімерні матеріали. Згідно з ще одним варіантом здійснення винаходу систему з контрольованим вивільненням можна поміщати поблизу від мети композиції, при цьому вимагається тільки частина системної дози. Препарати для ін'єкцій можуть включати лікарські форми для внутрішньовенних, підшкірних, внутрішньошкірних і внутрішньом'язових ін'єкцій, краплинних інфузій і тому подібне. Ці препарати для ін'єкцій можна приготувати загальновідомими методами. Наприклад, препарати для ін'єкцій можна приготувати, розчиняючи, суспендуючи або емульгуючи антитіло або його сіль, описані вище, в стерильному водному середовищі або масляному середовищі, що зазвичай вживається для ін'єкцій. Як водне середовище для ін'єкцій застосовуються, наприклад, фізіологічний сольовий розчин, ізотонічний розчин, що містить глюкозу та інші добавки, і так далі, які можна використовувати в комбінації з відповідним солюбілізуючим агентом, таким як спирт (наприклад, етанол), поліол (наприклад, пропіленгліколь, поліетиленгліколь), неіонна поверхнево-активна речовина [наприклад, полісорбат 80, HCO-50 (адукт гідрована касторова олія/поліоксиетилен (50 мол.))], і так далі. Як масляне середовище застосовуються, наприклад, кунжутна олія, соєва олія і так далі, які можна використовувати в комбінації з солюбілізуючим агентом, таким як бензилбензоат, бензиловий спирт і так далі. Одержані при цьому препарати для ін'єкцій, переважно, поміщають у відповідну ампулу. Фармацевтичну композицію за цим винаходом можна вводити підшкірно або внутрішньовенно за допомогою стандартної голки і шприца. Крім того, для підшкірної доставки фармацевтичної композиції за цим винаходом знаходить застосування шприц-ручка. Така шприц-ручка може бути багаторазового або одноразового користування. У шприц-ручці багаторазового користування зазвичай застосовується змінний картридж, який містить фармацевтичну композицію. Після того як уся фармацевтична композиція в картриджі 25 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використана і картридж стає порожнім, порожній картридж легко можна викинути і замінити на новий, що містить фармацевтичну композицію. Після цього шприц-ручку можна знову використовувати. В одноразовій шприц-ручці змінний картридж відсутній. Точніше, одноразова шприц-ручка надходить із заздалегідь заповненим фармацевтичною композицією резервуаром, що знаходиться в пристрої. Після того як фармацевтична композиція в резервуарі буде використана, викидають увесь пристрій. Численні багаторазові шприц-ручки і автоінжектори (шприц-тюбики) знаходять застосування для підшкірної доставки фармацевтичної композиції за цим винаходом. Приклади включають, але, звичайно, без обмеження, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), шприц-ручку DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), шприц-ручку HUMALOG MIX 75/25™, шприц-ручку HUMALOG™, шприц-ручку HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II і III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), шприц-ручку BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ і OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany), і це тільки деякі з них. Приклади одноразових шприц-ручок, що застосовуються для підшкірної доставки фармацевтичної композиції за цим винаходом, включають, але, звичайно, без обмеження, шприц-ручку SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) і KWIKPEN™ (Eli Lilly), автоінжектор SURECLICKTM (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.) і шприц-ручку HUMIRATM (Abbott Labs, Abbott Park IL), і це тільки деякі з них. Доцільно готувати вищеописані фармацевтичні композиції для перорального або парентерального застосування в лікарській формі у вигляді разової дози, залежно від дози активних інгредієнтів. Такі лікарські форми у вигляді разової дози включають, наприклад, таблетки, пігулки, капсули, ампули для ін'єкцій, супозиторії тощо. Кількість вищезгаданого антитіла зазвичай складає від близько 5 до близько 500 мг на лікарську форму у вигляді разової дози; зокрема, переважно, щоб у формі для ін'єкцій містилося від близько 5 до близько 100 мг, а для інших лікарських форм від близько 10 до близько 250 мг вищезгаданого антитіла. Терапевтичне застосування антитіл Завдяки взаємодії з рецептором глюкагону антитіла за цим винаходом можуть застосовуватися для зниження рівнів глюкози в крові, а також для лікування широкого ряду станів і порушень, при яких благотворною є блокада взаємодії глюкагону з його рецептором. Ці порушення і стани можуть бути вибрані з будь-якого обумовленого глюкагоном метаболічного порушення, яке включає передачу сигналу рецептором глюкагону, що призводить, зрештою, до патофізіології порушення або до гомеостатичної реакції організму на порушення. Тому антитіла можуть знайти застосування, наприклад, для попередження, лікування або пом'якшення, полегшення захворювань або станів, або пов'язаних з ними симптомів або ускладнень, ендокринної системи, центральної нервової системи, периферичної нервової системи, серцевосудинної системи, бронхолегеневої системи і шлунково-кишкового тракту за допомогою послаблення або виключення одного або більше небажаних побічних ефектів, обумовлених сучасними лікарськими засобами. Метаболічні порушення, пов'язані з глюкагоном, включають, але без обмеження, діабет типу 1 і типу 2, діабетичний кетоацидоз, гіперглікемію, синдром гіперосмолярної гіперглікемії, периопераційну гіперглікемію, гіперглікемію у хворого у відділенні інтенсивної терапії, гіперінсулінемію, постпрандіальну гіперглікемію, порушену глікемію натщесерце (IFG), метаболічний синдром, гіпер/гіпокаліємію, низьке співвідношення LDL/HDL, порушення харчової поведінки, збільшення ваги, ожиріння як наслідок діабету, дитячий діабет, гестаційний діабет (діабет вагітних), пізні ускладнення діабету, мікро-/макроальбумінурію, нефропатію, ретинопатію, невропатію, синдром діабетичної стопи, загоєння ран, порушену толерантність до глюкози (IGT), синдром резистентності до інсуліну, синдром X, глюкагономи, шлунково-кишкові порушення, ожиріння, діабет як наслідок ожиріння і так далі. Крім того, цей винахід передбачає метод лікування станів, обумовлених надлишком глюкагону у ссавця; метод інгібування рецептора глюкагону у ссавця; метод інгібування у ссавця клітинної реакції, опосередкованої рецептором глюкагону; або метод зниження рівня глюкози (глікемії) у ссавця, що полягає у введенні ссавцеві, що потребує такого лікування, кількості антитіла до GCGR, або його фрагмента, достатнього для інгібування рецептора глюкагону. Антитіла за цим винаходом ефективно знижують рівні глюкози як натщесерце, так і після їжі. Згідно з певними варіантами здійснення антитіла за цим винаходом застосовні для приготування фармацевтичної композиції для лікування діабету типу 2. Згідно з ще одним варіантом здійснення антитіла за цим винаходом застосовні для приготування фармацевтичної композиції для затримки або попередження прогресу захворювання від порушеної толерантності до глюкози до діабету типу 2. Згідно з ще одним варіантом здійснення антитіла за 26 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цим винаходом застосовні для приготування фармацевтичної композиції для затримки або попередження прогресу захворювання від інсуліннезалежного цукрового діабету до інсулінозалежного діабету. Згідно з іншим варіантом здійснення антитіла за цим винаходом застосовні для приготування фармацевтичної композиції для лікування діабету типу 1. Таке лікування зазвичай супроводжується інсулінотерапією. Комбіновані лікарські засоби Комбіновані лікарські засоби можуть включати антитіло до hGCGR за винаходом і будь-який додатковий терапевтичний агент, який, переважно, можна застосовувати з антитілом за винаходом або з біологічно активним фрагментом антитіла за винаходом. Наприклад, другий терапевтичний агент можна застосовувати з метою сприяти подальшому зниженню рівнів глюкози або для зниження інтенсивності щонайменше одного симптому у пацієнта, що страждає на захворювання або стан, що характеризується високими рівнями глюкози в крові, таким як цукровий діабет. Такий другий агент може бути вибраний, наприклад, з антагоніста глюкагону або іншого GCGR антагоніста (наприклад, антитіла до глюкагону або до GCGR або низькомолекулярний інгібітор глюкагону або GCGR), або він може включати інші терапевтичні агенти, застосовні для лікування діабету або інших захворювань або станів, що асоціюються з підвищеними рівнями глюкози в крові або порушеним метаболізмом глюкози, або таких, що є результатом підвищених рівнів глюкози в крові або порушеного метаболізму глюкози. Ці агенти включають бігуаніди, які знижують продукування глюкози в печінці і підвищують чутливість до інсуліну (наприклад, метформін), або сульфонілсечовини, які стимулюють продукування інсуліну (наприклад, глібурид, гліпізид). Інші лікарські засоби, спрямовані на підтримку гомеостазу глюкози, включають агоністи PPAR гамма, які діють як сенсибілізатори інсуліну (наприклад, піоглітазон, розиглітазон); інгібітори альфа глікозидази, які уповільнюють всмоктування крохмалю (вуглеводів) і продукування глюкози (наприклад, акарбозу, воглібозу). Інші лікарські засоби включають лікарські препарати для ін'єкцій, такі як ексенатид ® (глюкагоноподібний пептид 1) і симлін® (прамлінтид). Згідно з певними варіантами здійснення винаходу композиція може включати другий агент, вибраний з групи, яка складається із стимуляторів секреції, що не відносяться до класу сульфонілсечовин, інсуліну, аналогів інсуліну, поліпептидів ексендину-4, агоністів бета-3 адренорецепторів, агоністів PPAR, інгібіторів дипептидил-пептидази IV, статинів і статинвмісних комбінацій, інгібіторів всмоктування холестерину, антагоністів LDL- холестерину, антагоністів білка-переносника ефірів холестерину, антагоністів рецепторів ендотеліну, антагоністів гормону росту, сенсибілізаторів інсуліну, міметиків або агоністів аміліну, антагоністів канабіоїдних рецепторів, агоністів глюкагоноподібного пептиду-1, меланокортинів, агоністів рецепторів меланін-концентруючого гормону, SNRIs, та інгібіторів протеїнтирозинфосфатази. Згідно з іншими певними варіантами здійснення винаходу комбінована терапія може включати введення другого агента, який протидіє будь-якому потенційному побічному ефекту (будь-яким потенційним побічним ефектам), обумовленому(-им) введенням антитіла за винаходом, якщо такий(-і) побічний(-і) ефект(-и) виникає(-ють). Наприклад, у разі коли будь-яке з антитіл до GCGR підвищує рівні ліпідів або холестерину, може бути доцільним введення другого агента для пониження рівнів ліпідів або холестерину, такого як інгібітор HMG-CoA редуктази (наприклад, статину, такого як аторвастатин (Ліпітор, LIPITOR®), флувастатин (Лескол, LESCOL®), ловастатин (Мевакор, MEVACOR®), пітавастатин (LIVALO®), правастатин (Правахол, PRAVACHOL®), розувастатин (Крестор, CRESTOR®) і симвастатин (Зокор, ZOCOR®) тощо. Або ж антитіла за винаходом можна вводити в комбінації з таким агентом, як VYTORIN®) (віторин), який є препаратом статину і іншого агента, таким як комбінація езетиміб/симвастатин. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу може бути доцільним введення антитіла за винаходом в комбінації з будь-яким одним або декількома з агентів, перелік яких наводиться нижче: (1) з ніацином, який підвищує катаболізм ліпопротеїнів; (2) з фабратами або амфіпатичними карбоновими кислотами, які знижують рівень ліпопротеїнів низької щільності (LDL), підвищують рівень ліпопротеїнів високої щільності (HDL) і рівні TG (тригліцеридів) і знижують число серцевих нападів без летального результату; і (3) активаторами фактора транскрипції LXR, який відіграє роль в елімінації холестерину, такими як 22-гідроксихолестерин, або статин плюс секвестранти жовчних кислот (іонообмінна смола) (наприклад, колестирамін, колестипол, колесевелам), комбінований препарат ніацин плюс статин (наприклад, ніацин плюс ловастатин); або з іншими агентами, що знижують вміст ліпідів, такими як етилові ефіри омега3-жирних кислот (наприклад, омакор). Окрім цього, другий терапевтичний агент може являти собою один або більше інших інгібіторів глюкагону або GCGR, а також інгібіторів молекул інших речовин, таких як ангіопоетин 27 UA 112168 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подібний білок 3 (ANGPTL3), ангіопоетин-подібний білок 4 (ANGPTL4), ангіопоетин-подібний білок 5 (ANGPTL5), ангіопоетин-подібний білок 6 (ANGPTL6), які беруть участь у метаболізмі ліпідів, зокрема в гомеостазі холестерину і/або тригліцеридів. Інгібітори цих молекул включають низькомолекулярні речовини або антитіла, які специфічно зв'язуються з цими молекулами і блокують їх активність. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу може бути доцільним введення антитіл за винаходом в комбінації з антитілом, яке знижує рівні ліпідів або холестерину, таких, але без обмеження, як антитіло до PCSK9 (пропротеїн-конвертази субтилізин/кексину типу 9), наприклад, як описані в патенті США US2010/0166768. Інші антитіла до PCSK9 описані в патентах США US2010/0040611, US2010/0041102, US2010/0040610, US2010/0113575, US2009/0232795, US2009/0246192, US2010/0233177, US2009/0142352, US2009/0326202, US2010/0068199, US2011/0033465, US2011/0027287, US2010/0150937, US2010/0136028 і в Міжнародній патентній заявці WO2009/055783. Згідно з певними варіантами здійснення винаходу може бути доцільним введення антитіл до GCGR за винаходом в комбінації з нуклеїновою кислотою, яка інгібує активність hPCSK9 (пропротеїн-конвертази субтилізин/кексину типу 9), такий як антисмислова молекула, дволанцюжкова РНК або молекула siРНК. Приклади нуклеїнових кислот, які інгібують активність PCSK9, описані в патентах США US2011/0065644, US2011/0039914, US2008/0015162 і US2007/0173473. Додатковий(-і) терапевтично активний(-і) компонент(-и) можна вводити до введення, одночасно з введенням або після введення антитіла до GCGR за цим винаходом. Стосовно цього розкриття такі схеми введення розглядаються як введення антитіла до GCGR "в комбінації з" другим терапевтично активним компонентом. Застосування антитіл в діагностиці Антитіла до GCGR за цим винаходом можуть також застосовуватися для виявлення (детекції) і/або кількісного визначення GCGR в зразку, наприклад, з метою діагностики. Наприклад, антитіло до GCGR або його фрагмент можна застосовувати для діагностики стану або захворювання, що характеризується аберантною експресією (наприклад, надекспресією, зниженою експресією або відсутністю експресії і так далі) GCGR. Приклади методів діагностики GCGR можуть включати, наприклад, контактування зразка, одержаного від пацієнта, з антитілом до GCGR за винаходом, причому антитіло до GCGR мічено детектованою міткою або репортерною групою або застосовується як імобілізований ліганд для селективного виділення GCGR із зразків, одержаних від пацієнта. Або ж, немічене антитіло до GCGR можна застосовувати для діагностики в комбінації з вторинним антитілом, яке само по собі є міченим детектованою міткою. Детектована мітка або репортерна група може являти собою радіоізотоп, 3 14 32 35 125 такий як H, C, P, S або I; флуоресцентну або хемілюмінесцентну молекулу, таку як молекула флуоресцеїну, ізотіоціанату або родаміну; або фермент, такий як лужна фосфатаза, β- галактозидаза, пероксидаза хріну або люцифераза. Конкретні приклади аналізів, які можна застосовувати для виявлення або кількісного визначення GCGR в зразку, включають твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA), радіоімуноаналіз (RIA, РІА) і сортинг флуоресцентно-активованих клітин (FACS). Зразки, які можна використовувати в діагностиці GCGR за цим винаходом, включають будьякий зразок тканини або рідини, який містить кількості, що детектуються, білка GCGR, або його фрагмента, який можна одержати від пацієнта в нормальному або патологічному стані. Як правило, рівні GCGR в конкретному зразку, одержаному від здорового пацієнта (наприклад, пацієнта, не ураженого захворюванням або станом, що асоціюється з аномальними рівнями або аномальною активністю GCGR), визначають кількісно з метою спочатку встановити базовий (початковий), або стандартний, рівень GCGR. Цей базовий рівень GCGR можна потім порівняти з рівнями GCGR в зразках, одержаних від індивідуумів з підозрою на захворювання або стан, пов'язаний з GCGR, або з симптомами, пов'язаними з таким захворюванням або станом. Приклади Нижченаведені приклади пропонуються з метою надати середнім спеціалістам в цій області техніки повне розкриття і опис одержання та застосування методів і композицій і за винаходом, і не претендують на обмеження об'єму того, що заявники розглядають як свій винахід. Спроби підтвердити точність вживаних величин (наприклад, кількостей, температури і так далі) робилися, але слід брати до уваги деякі експериментальні помилки і девіації. Якщо не вказано інакше, частини означають вагові частини, молекулярна маса означає середню молекулярну масу, температура дається в градусах Цельсія, а тиск дорівнює або близький до атмосферного. Приклад 1. Одержання людських антитіл до людського GCGR Для одержання антитіл до hGCGR можна застосовувати імуноген, що являє собою будь 28