Антитіло, яке специфічно зв’язується з людським білком ron

Реферат: Винахід належить до антитіла або його фрагмента, що специфічно зв’язується з людським білком RON, для лікування захворювань, таких як рак. Також даний винахід належить до фармацевтичної композиції, яка містить дане антитіло, та способу пригнічення ангіогенезу, росту пухлин, проліферації пухлинних клітин за допомогою зазначеного антитіла. UA 99633 C2 (12) UA 99633 C2 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка претендує на пріоритет попередньої заявки на патент США 60/989,558, поданої 21 листопада 2007 року, повний зміст якої у повному обсязі включений у цей опис шляхом посилання. Цей винахід стосується способів та композицій для пригнічення рецептора людського макрофаг-стимулювального білка ("MSP-R" або "RON" {receptor d'origine nantais)). Крім того, цей винахід пропонує способи лікування пухлин та інших захворювань у ссавця, які включають введення специфічних для RON антитіл або фрагментів антитіл, що пригнічують активацію RON. Рецептор макрофаг-стимулювального білка, який нижче позначається також як "RON", належить до родини c-met тирозинкіназних рецепторів. RON являє собою гетеродимерний білок, який містить позаклітинний альфа-ланцюг та трансмембранний бета-ланцюг. RON спочатку експресується як одноланцюговий попередник, з подальшим розщепленням на альфата бета-ланцюги (1). Вважають, що бета-ланцюг є необхідним для зв'язування його ліганду, макрофаг-стимулювального білка ("MSP"; відомого також як HGF-подібний білок (HGF - фактор росту гепатоцитів)), з рецептором, а домени Kringle 2 та 3 макрофаг-стимулювального білка є необхідними для взаємодії RON/MSP. Дивись публікацію заявки на патент США № 2003/0073656. Вважають, що позаклітинний домен RON має незначну гомологію з відповідними доменами рецепторів родини c-met. Дійсно, зв'язування фактора росту гепатоцитів ("HGF"), який стимулює інші рецептори родини c-met, з рецептором RON не стимулює тирозинкіназної активності (WO 02/083,047). Вважають, що RON відіграє певну роль у міграції клітин, зміні форми та проростання тканин пухлинами (1). Однак у попередній публікації повідомляється про обмежену роль RON у індукуванні трансформації, але описується стимулювання інвазивного росту активацією RON (16). [Мутації, делеції, реаранжування генів та альтернативний сплайсинг мРНК можуть спричинювати активацію RON без будь-якого зв'язування ліганду (1). Варіації тирозинкіназного домену RON можуть відігравати важливу роль у активації RON (1). Клонування RON з різних ліній ракових клітин показало активацію RON унаслідок різних дефектів у мРНК, що кодує RON. Макрофаг-стимулювальний білок є членом домену kringle родини плазміноген-асоційованих білків (1). Як вказує його назва, спочатку було встановлено, що макрофаг-стимулювальний білок стимулює макрофаги різноманітними шляхами (огляд дивись у 2, 3). Наприклад, додання макрофаг-стимулювального білка до певних макрофагів, що експресують RON, спричинило зміни форми, хемотаксису, макропіноцитозу, фагоцитозу та продукування імунних медіаторш (4, 5, 6). Було встановлено також, що RON експресується у епітеліальних клітинах, таких як кератиноцити, де, як було показано, макрофаг-стимулювальний білок фосфорилує RON і активує ряд шляхів передавання сигналів, які викликають прикріплення/рухливість клітин, антиапоптозні та проліферативні реакції (7, 8). Впродовж декількох останніх років надекспресію RON спостерігали у декількох епітеліальних пухлин та ліній клітин (наприклад, товста кишка (9, 10, 11), легені (12), молочна залоза (13)). У недавньому дослідженні пухлини легень досліджували у трансгенних мишей, легені яких, в результаті генно-іїіженерного модифікування, надекспресували RON (14, 15). RON експресується у численних лініях людських ракових клітин. Антитіло проти RON може пригнічувати активацію згаданого рецептора (фосфорилований RON), а також активацію сигнальних молекул у прямому напрямку: фосфо-МАРК (мітогенактивована протеїнкіназа) та фосфо-Akt (протеїнкіназа Akt), у багатьох із цих ліній ракових клітин. Показано, що обидва антитіла проти RON (RON6 і RON8), наведені як приклад нижче у цьому описі, значно знижують здатність декількох ліній клітин ракового походження (НТ-29 - товста кишка, Н-292 - легені, ВхРСЗ - підшлункова залоза, JIMT-1 - молочна залоза) до утворення пухлин при їх введенні "безтимусним" мишам. Це підтверджує, що пригнічення тирозинкіназного рецептора RON негативно впливає на проліферацію цих ракових клітин, а також підкреслює корисність пригнічення RON у випадку, наприклад, раку товстої кишки, легень, підшлункової залози та молочної залози. За допомогою традиційного вестерн-блотингу та протоково-цитометричних методів було показано, що RON експресується у багатьох лініях людських клітин, які походять із ракових пухлин різних видів: товстої кишки (НТ-29, Со1о205, НСТ-116, DLD-1, Sw480, Sw620), підшлункової залози (ВХРС-3, CAPAN-2, ASPC-1, HPAF-II, L3.7pl#7, Hs766T), передміхурової залози (DU-145, РС-3), шлунка (AGS, NCI-N87), легень (А549, Н596), печінки (HepG2, SNU-182) та молочної залози (JIMT1, DU4475, AU565). У цій галузі існує постійна потреба у розробці способів лікування різних захворювань, зокрема, раку, які грунтуються на ідентифікуванні RON-мішеней, у тому числі специфічних антигенних детермінант RON. 1 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Отже, цей винахід пропонує антитіла проти RON зі значно вищим ступенем специфічного зв'язування, ніж у відомих раніше доступних антитіл проти RON. Ці антитіла можуть бути виділені та/або очищені. Антитіла за цим винаходом є придатними для зв'язування з RON, що кодується алелями RON дикого типу, які, як правило, знаходяться у людській популяції, або варіантними білками RON, наприклад, білками з незначними варіаціями або мутаціями, які однак зберігають активність RON. У одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіло або антитіла є специфічними для RON і мають значення Кd (тобто константу дисоціації антигену з -10 -1 антитілом у стані рівноваги) приблизно 110 М або менше. У інших варіантах здійснення -10 -1 цього винаходу очищене антитіло демонструє значення Кd на рівні приблизно 110 М або -11 -1 приблизно 110 М чи менше. У інших варіантах здійснення цього винаходу антитіло або його функціональний фрагмент є повністю людським за своєю природою. Цей винахід пропонує, наприклад, антитіло, що специфічно зв'язується з білком RON, яке містить гіперваріабельну ділянку (CDR), одержану з одного або декількох варіабельних доменів антитіла, вибраних із групи, яку складають RON6 VH, RON6 VL, RON8 VH, RON8 VL та їх комбінації, де гіперваріабельні ділянки RON6 VH є послідовностями SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 та SEQ ID NO: 21; гіперваріабельні ділянки RON6 VL є послідовностями SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 та SEQ ID NO: 27; гіперваріабельні ділянки RON8 VH є послідовностями SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 та SEQ ID NO: 33; і гіперваріабельні ділянки RON8 VL є послідовностями SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 та SEQ ID NO: 39. Кожен включений варіабельний домен може додати три CDR. Згадане антитіло може бути, наприклад, моноклональним антитілом, одноланцюговим антитілом, Fab-фрагментом, Fv-фрагментом, діатілом або триатілом. У певних варіантах здійснення цього винаходу згадане антитіло може містити CDR, одержані із щонайменше двох варіабельних доменів антитіла, вибраних із групи, яку складають RON6 VH, RON6 VL, RON8 VH, RON8 VL та їх комбінації. За варіантом, якому віддається більша перевага, антитіло за цим винаходом містить CDR, одержані із щонайменше трьох варіабельних доменів антитіла, вибраних із групи, яку складають RON6 VH, RON6 VL, RON8 VH, RON8 VL та їх комбінації. У певних варіантах здійснення цього винаходу згаданим антитілом є RON6 або RON8. Цей винахід також пропонує ізольовану нуклеїнову кислоту, яка кодує антитіло, а також рекомбінантний вектор, який містить згадану нуклеїнову кислоту, функціонально зв'язану з однією або декількома контрольними послідовностями, які уможливлюють експресію згаданої нуклеїнової кислоти у вибраній клітині-хазяїні. Пропонуються також клітини-хазяї, які містять згаданий рекомбінантний вектор. Цей винахід також пропонує спосіб продукування антитіла проти RON за цим винаходом, який включає культивування клітини-хазяїна в умовах, які уможливлюють експресію згаданого антитіла, та факультативно включає очищення продукованого антитіла. Цей винахід також пропонує фармацевтичну композицію, яка містить антитіло за цим винаходом та фармацевтично прийнятний носій. Згадані фармацевтичні композиції можуть також містити один або декілька інших терапевтично ефективних засобів. Цим винаходом передбачаються також набори, які включають в себе антитіла проти RON за цим винаходом, окремо або у комбінації з іншими засобами, наприклад, хіміотерапевтичними засобами. Пропонуються також способи застосування антитіла за цим винаходом, у тому числі, наприклад, спосіб лікування раку, пригнічення ангіогенезу, росту пухлин, міграції, проліферації або проростання пухлинних клітин, які експресують RON, причому ці способи включають введення в організм ссавця ефективної кількості антитіла за цим винаходом або його фрагмента для пригнічення активації RON. Пухлинними клітинами є, наприклад, пухлинні клітини, що походять із товстої кишки, підшлункової залози, передміхурової залози, шлунка, легень, печінки, яєчника, нирок, молочної залози або головного мозку, чи пухлинні клітини епітеліального або нейроендокринного походження. Способи за цим винаходом також включають введення інших засобів, наприклад, дрібної органічної молекули, спільно з антитілом, де іншим засобом може бути (але без обмеження ними) хіміотерапевтичний засіб, антиангіогенезний засіб або засіб, що пригнічує активацію RON. За факультативним варіантом згадане антитіло може кон'югуватись зі згаданим іншим засобом, наприклад, із дрібною органічною молекулою. Антитіло за цим винаходом може бути застосоване із щонайменше одним іншим протираковим засобом, наприклад, антиангіогенезним засобом, антагоністом FGFR-3 (рецептор фактора росту фібробластів), хіміотерапевтичним засобом, опроміненням, протипухлинним засобом, дрібною молекулою або іншим антитілом. Наприклад, антитіло за цим винаходом може бути введене із щонайменше одним додатковим антитілом, яке пригнічує пухлини, 2 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, антитілом проти EGFR, таким як Erbitux® (Imclone Systems, Inc., Нью-Йорк, штат Нью-Йорк). Антитіло за цим винаходом може мати за мішень або зв'язуватись із RON дикого типу або варіантом RON. До способів за цим винаходом також належить спосіб виявлення RON у зразку, який включає контактування згаданого зразка з антитілом за цим винаходом для одержання специфічного зв'язування та виявлення такого зв'язування. Пропонується також спосіб профілактики або лікування запалення у ссавця, що цього потребує, який включає введення згаданому ссавцю ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Пропонується також спосіб профілактики або лікування захворювання, наприклад, захворювання печінки, жовчних шляхів, жовчних протоків та жовчного міхура у ссавця, що цього потребує, який включає введення згаданому ссавцю ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Пропонується також спосіб пригнічення фосфорилування RON, МАРК та/або Akt у ссавця, що цього потребує, який включає введення згаданому ссавцю ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Стосовно вищезгаданих способів у певних варіантах здійснення цього винаходу антитіло або його фрагмент може бути введене(-ий) ссавцю у дозі від приблизно 1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. У інших варіантах здійснення цього винаходу антитіло або його фрагмент може бути введене(-ий) у дозі від приблизно 3 мг/кг до приблизно 8 мг/кг. Фіг. 1А ілюструє послідовність ДНК (послідовність SEQ ID NO: 1) та трансльовану послідовність (послідовність SEQ ID NO: 2) VH ділянки RON6, де CDR підкреслені однією лінією. Фіг. 1В ілюструє послідовність ДНК (послідовність SEQ ID NO: 3) та трансльовану послідовність (послідовність SEQ ID NO: 4) VL ділянки RON6, де CDR підкреслені однією лінією. Фіг. 1С ілюструє послідовність ДНК (послідовність SEQ ID NO: 5) та трансльовану послідовність (послідовність SEQ ID NO: 6) VH ділянки RON8, де CDR підкреслені однією лінією. Фіг. 1D ілюструє послідовність ДНК (послідовність SEQ ID NO: 7) та трансльовану послідовність (послідовність SEQ ID NO: 8) VL ділянки RON8, де CDR підкреслені однією лінією. Фіг. 2А, Фіг. 2В та Фіг. 2С спільно ілюструють повну послідовність ДНК (послідовність SEQ ID NO: 9) та амінокислотну послідовність (послідовність SEQ ID NO: 10) RON6-H (людський IgGl підгрупа І). Послідовність секреторного сигналу (курсив); варіабельна ділянка (підкреслена подвійною лінією, за виключенням доменів CDR); домени CDR (підкреслені однією лінією): константна ділянка типу гамма (немодифікована). Зірочка (*) вказує стоп-кодон. Фіг. 2D-2E спільно ілюструють повну ДНК (послідовність SEQIDNO:11) та амінокислотну послідовність (послідовність SEQ ID NO: 12) RON6-L (людський легкий ланцюг типу каппа підгрупа НІ). Послідовність секреторного сигналу RON6-L (курсив); варіабельна ділянка (підкреслена появійното лінією, за виключенням доменів CDR); CDR (підкреслені однією лінією); константна ділянка типу каппа (немодифікована). Фіг. 3А-3С спільно ілюструють повну послідовність ДНК (послідовність SEQ ID NO: 13) та амінокислотну послідовність (послідовність SEQ ID NO: 14) RON8-H. Послідовність секреторного сигналу (курсив), варіабельна ділянка (підкреслена подвійною лінією) з CDR (підкреслені однією лінією), константна ділянка типу гамма (немодифікована). Зірочка (*) вказує стоп-кодон. Фіг. 3D-3E ілюструють повну послідовність ДНК (послідовність SEQ ID NO: 15) та амінокислотну послідовність (послідовність SEQ ID NO: 16) RON8-L. Послідовність секреторного сигналу (курсив), варіабельна ділянка (підкреслена подвійною лінією, за виключенням доменів CDR) з CDR (підкреслені однією лінією), константна ділянка типу каппа (немодифікована). Зірочка (*) вказує стоп-кодон. Фіг. 4А та Фіг. 4В ілюструють графіки залежності розміру пухлини від часу, одержані на моделі мишачого ксенотрансплантата Н-292 після введення антитіл проти RON, RON6 (Фіг. 4А) та RON8 (Фіг. 4В). На графіках показано, що антитіла RON6 та RON8 пригнічують ріст пухлинних клітин Н-292 у системі мишачого ксенотрансплантата. Фіг. 4С та Фіг. 4D ілюструють графіки залежності розміру пухлини від часу, одержані на моделі мишачого ксенотрансплантата НТ-29. На графіках показано, що антитіла RON6 (Фіг. 4С) та RON8 (Фіг. 4D) пригнічують ріст пухлинних клітин НТ-29 у системі мишачого ксенотрансплантата. Фіг. 4Е ілюструє графіки залежності розміру пухлини від часу, одержані на моделі мишачого ксенотрансплантата ВхРСЗ для: лише антитіла RON8, антитіла RON8 з Erbitux® (ERB), лише Erbitux® та Erbitux® у комбінації з контрольними IgG (антитіла hulgG). На графіках показано, що 3 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лише антитіло RON8 (Фіг. 4Е) пригнічує ріст пухлинних клітин ВхРСЗ у системі мишачого ксенотрансплантата. На графіках також показано, що у випадку комбінації з Erbitux® спостерігається тенденція до зворотного розвитку або пригнічення пухлини. Фіг. 4F показує, що антитіло RON8 пригнічує ріст ксенотрансплантатів пухлини молочної залози у "безтимусних" мишей. Клітини раку молочної залози JIMT-1 вводили "безтимусним" 3 мишам підшкірно, і надавали можливість росту пухлини до розміру приблизно 250 мм . Об'єм пухлини наносять на графік впродовж курсу лікування із застосуванням контролю (фізіологічний розчин), антитіла RON8 (60 мг/кг, 2х/тиждень), доцетакселу (docetaxel) або комбінації доцетаксел+антитіло RON8. На Фіг. 5А, Фіг. 5В та Фіг. 5С зображені вестерн-блоти, які підтверджують пригнічення спричиненого макрофаг-стимулювальним білком фосфорилування антитілами проти RON, RON6 та RON8. Підтверджено, що антитіла RON6 та RON8, відповідно, пригнічують MSP-залежну активацію рецептора RON і активацію шляхів трансдукції сигналу у прямому напрямку відносно рецептора RON. Як видно на Фіг. 5А, клітини NIH3T3-RON витримували на мінімальному живильному середовищі впродовж ночі, обробляли впродовж 2 год. антитілами із зазначеною на фігурі концентрацією, після чого впродовж 10 хв стимулювали 10 нМ розчином макрофагстимулювального білка. Після стимуляції клітини піддавали лізису, усі одержані клітинні лізати відділяли за допомогою SDS-PAGE (електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію), і зондували за допомогою зазначених на фігурі антитіл. Як видно на Фіг. 5В, клітини Н-292 витримували на мінімальному живильному середовищі впродовж ночі, обробляли впродовж 2 год. антитілами із зазначеною концентрацією, після чого впродовж 10 хв стимулювали 10 нМ розчином макрофаг-стимулювального білка. Після стимуляції клітини піддавали лізису, тотальні клітинні лізати відділяли за допомогою SDS-PAGE, і зондували за допомогою зазначених антитіл. Як видно на Фіг. 5С, клітини НТ-29 витримували на мінімальному живильному середовищі впродовж ночі, обробляли впродовж 2 год. антитілами із зазначеною концентрацією, після чого впродовж 10 хв стимулювали 10 нМ розчином макрофагстимулювального білка. Після стимуляції клітини піддавали лізису, усі одержані клітинні лізати відділяли за допомогою SDS-PAGE, і зондували за допомогою зазначених антитіл. На Фіг. 6А зображена крива блокування антитіла RON8 у твердофазному імуноферментному аналізі. Твердофазний імуноферментний аналіз (ELISA) застосовували для визначення ІС50 антитіла RON8, необхідної для блокування взаємодії рекомбінантного людського білка RON з іммобілізованим рекомбінантним людським MSP. Фіг. 6В ілюструє здатність антитіла RON8 до пригнічення міграції клітин раку легень Н596. Фігури 6С ілюструють пригнічення антитілом RON8 спричиненого макрофагстимулювальним білком синтезу ДНК у клітинах раку підшлункової залози ВХРСЗ. Фіг. 6С(1) ілюструє спричинювану макрофаг-стимулювальним білком стимуляцію включення [ЗН]-тимідину, критерій синтезу ДНК. Фіг. 6С(2) ілюструє систему, у якій клітини піддавали попередній обробці антитілом RON8 впродож 1 год. до додання макрофаг-стимулювального білка. Цей винахід пропонує антитіла проти RON, які є придатними, наприклад, для проведення аналізів для виявлення білків RON при діагностуванні та для використання у способах пригнічення активності RON при лікуванні. Крім того, антитіла проти RON за цим винаходом можуть бути введені тварині, наприклад, ссавцю, такому як людина, у терапевтично ефективній кількості, наприклад, у кількості, ефективній для пригнічення росту, проліферації, метастатичної активності (тобто міграції та/або проростання) будь-яких або усіх пухлинних клітин, які експресують RON. Цей винахід пропонує також фармацевтичні композиції, які містять описані у цьому описі антитіла проти RON або їхні фрагменти. Крім того, цей винахід пропонує повністю людські антитіла, що зв'язуються з людським тирозинкіназним рецептором RON. До числа таких антитіл належать (але без обмеження ними) наведені як приклад RON6 та RON8, а також їхні активні або функціональні фрагменти та похідні. Для досягнення більшої ясності опису, мається на увазі, що цільовий білок називається RON, як докладно описано у наведеному вище розділі "Передумови створення винаходу", і наведені у цьому описі як приклад антитіла проти RON, яким віддається перевага, позначаються як "RON6" та "RON8", відповідно. При застосуванні процесу скринінгу, антитіла проти RON за цим винаходом були відібрані з-поміж сотень антитіл-кандидатів проти RON. Антитіла за цим винаходом несподівано виявляють бажані властивості зв'язування RON, кращі ніж у раніше доступних антитіл проти RON, як докладно описано у наведених нижче прикладах. Зокрема, нові антитіла RON6 та RON8 мають спорідненість до рецептора RON, що є у 100 разів більшою ніж спорідненість RON1, повністю людського антитіла проти RON, яке заздалегідь 4 UA 99633 C2 -11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержали з фагової бібліотечної системи. Зокрема, RON6 та RON8 зв'язують RON з K D 4,110 -11 -11 M та 3,210 M, відповідно, у той час як RON1 зв'язує RON з КD 7,710 M. RON1 являє собою поширене позначення відомого антитіла, опис якого наведений у WO 2005/120557, включену у цей опис шляхом посилання. Як зазначено у цьому описі, інформація щодо послідовностей CDR, розкрита у цьому описі для застосування із способами за цим винаходом, може бути "одержаною", тобто грунтуватись, створюватись на основі або походити з інформації про послідовності з будь-якого або усіх можливих джерел варіабельних доменів антитіл, до яких можуть належати форми дикого типу або варіанти, а також природні або синтетично продуковані за способами, відомими фахівцю у цій галузі. Посилання у цьому описі на "пухлину" стосується загалом раку та злоякісного і незлоякісного захворювання, якщо не зазначено інше. У цьому описі мається на увазі, що до злоякісних пухлин належать первинні і вторинні пухлини. Первинні пухлини виникають безпосередньо з тканини, у якій вони знаходяться. Вторинною пухлиною або метастазом є пухлина, що виникла десь у тілі, але зараз розповсюдилась на віддалений орган. Традиційними шляхами для метастазування є безпосереднє проростання до прилеглих структур, розповсюдження через судинну або лімфатичну системи і проходження по площині тканин та через порожнини тіла (перітонеальна рідина, цереброспінальна рідина тощо). До конкретних типів раків або злоякісних пухлин, первинних або вторинних, які можуть бути включені для можливого лікування із застосуванням способів за цим винаходом, належать (але без обмеження ними) лейкози, рак молочної залози, рак шкіри, рак кісток, рак передміхурової залози, рак печінки, рак легень, рак головного мозку, рак гортані, рак жовчного міхура, рак підшлункової залози, рак прямої кишки, рак паращитовидних залоз, рак щитовидної залози, рак надниркової залози, рак нервової тканини, рак голови та шиї, рак товстої кишки, рак шлунка, рак бронхів, рак нирок, базально-клітинний рак, плоскоклітинний рак як виразкового, так і папілярного типу, метастатичний рак шкіри, остеосаркома, саркома Юінга, ретикулоклітинна саркома, мієлома, гігантоклітинна пухлина, дрібноклітинний рак легень, недрібноклітинний рак легень, жовчнокам'яна хвороба, інсулома, первинний рак головного мозку, гострі та хронічні лімфоцитарні та гранулоцитарні пухлини, волосатоклітинний лейкоз, аденома, гіперплазія, медулярна карцинома, феохромоцитома, мукозні невроми, гангліоневроми кишечнику, гіперпластична пухлина рогівкового нерва, пухлина при марфаноїдному хабітусі, пухлина Вільмса, семінома, пухлина яєчника, лейоміоматозна пухлина, дисплазія шийки матки та преінвазивний рак, нейробластома, ретинобластома, саркома м'яких тканин, злоякісна карциноїдна пухлина, місцеве ураження шкіри, грибоподібний мікоз, рабдоміосаркома, саркома Капоші, остеогенні та інші саркоми, злоякісна гшеркальціємія, пухлина клітин ниркового епітелію, справжня поліцитемія, аденокарциноми, поліморфна гліобластома, лімфоми, злоякісні меланоми, епідермоїдні раки та інші карциноми і саркоми. Для ясності слід розуміти також, що вживання однини для зручності у описі жодним чином не є призначеним для такого обмеження. Так, наприклад, посилання на "антитіло" або "пухлину" охоплює посилання на одне(одну) або декілька таких антитіл або пухлин. Вживання множини також не є призначеним для обмеження, якщо не вказується інше. Антитіла за цим винаходом або їх фрагменти, специфічні для RON, нейтралізують активацію рецептора RON. У значенні, вжитому у цьому описі, словосполучення "нейтралізація рецептора" означає інактивацію власної кіназної активності рецептора до трансдукції сигналу. Надійним аналізом для визначення нейтралізації RON є пригнічення фосфорилування рецептора. Цей винахід не обмежується жодним конкретним механізмом нейтралізації RON. Така нейтралізація, наприклад, може здійснюватись антитілом, що блокує доступність певних антигенних детермінант для ліганду, або зміною конформації RON так, що ліганд, зокрема макрофаг-стимулювальний білок, не може активувати рецептор, навіть якщо він може зв'язатись із рецептором. У патенті США № 6,165,464 наведений перелік різних можливих механізмів такої нейтралізації, у тому числі зв'язування антитіл із самим лігандом, інгібування рецептора антитілами, пригнічення антитілами тирозинкіназної активності рецептора або спричинення антитілами цитотоксичної реакції. Інгібування може відбуватись, якщо клітини, що експресують RON, зокрема, клітини, що надекспресують (у тому числі диференційовано експресують) RON, зменшують кількість тирозинкіназних рецепторів RON на своїй поверхні. Таким чином, нейтралізація чинить різний вплив, у тому числі пригнічення, зменшення, інактивацію та/або припинення росту (проліферацію та диференціацію), ангіогенез (рекрутинг, проростання та метастазування у кровоносні судини) та рухливість і метастазування клітин (адгезію та інвазивність клітин). 5 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Нейтралізація RON антитілом проти RON може також включати нейтралізацію варіанта тирозинкіназного рецептора RON, що є активним без зв'язування ліганду або зв'язується з лігандом і не деактивується у результаті цього. Таким чином, нейтралізація RON може включати нейтралізацію RON дикого типу та/або варіантного RON (точкові мутації, делеції, альтернативний сплайсинг тощо). Термін "варіант" RON, вжитий у цьому описі, факультативно охоплює білки RON, що є коротшими або довшими за RON дикого типу, і факультативно буде охоплювати аналоги, що містять амінокислотні заміни. Варіанти RON можуть також бути результатом альтернативного сплайсингу або ініціації та/або точкової(-их) мутації(-ій) мРНК. Одним із корисних критеріїв ступеня нейтралізації RON антитілом проти RON є пригнічення тирозинкіназної активності рецептора. Пригнічення тирозинкіназной активності може бути визначене за допомогою добре відомих способів; наприклад, шляхом визначення ступеня аутофосфорилування рекомбінантного кіназного рецептора та/або фосфорилування природних або синтетичних субстратів. Таким чином, аналізи фосфоритування є придатними для визначення нейтралізуючих антитіл у контексті цього винаходу. Фосфорилування може виявлятись, наприклад, за допомогою антитіла, специфічного для фосфотирозину у твердофазному імуноферментному аналізі або у вестерн-блотингу. Певні аналізи на тирозинкіназну активність описані у статтях Panek et al, J. Pharmacol. Exp. Thera. 283: 1433-1444 (1997) та Batley et al, Life Sci. 62:143-150 (1998). Іншим критерієм нейтралізації RON є пригнічення фосфорилування прямих субстратів RON. Відповідним чином може бути визначений, наприклад, ступінь фосфорилування МАРК або Akt. Природні антитіла, як правило, мають два ідентичні важкі ланцюги та два ідентичні легкі ланцюги, де кожен легкий ланцюг ковалентно зв'язаний з важким ланцюгом міжланцюговим дисульфідним зв'язком, а численні дисульфідні зв'язки додатково зв'язують між собою два важкі ланцюги. Окремі ланцюги можуть укладатись у домени, що мають подібні розміри (110-125 амінокислот) та структури, але різні функції. Легкий ланцюг може містити один варіабельний домен (VL) та/або один константний домен (CL). Важкий ланцюг може також містити один варіабельний домен та/або, у залежності від класу або ізотипу антитіла, три або чотири константні домени (СН1, СН2, СН3 та СН4). У людей згаданими ізотипами є IgA, IgD, IgE, IgG та IgM, де IgA та IgG також підрозділяються на підкласи або підтипи (IgA1-2 та IgG1-4). Загалом варіабельні домени демонструють значну варіабельність амінокислотних послідовностей між антитілами, зокрема, на місцезнаходженні антигензв'язувального центру. Кожен з VL та VH має три ділянки, які називають гіперваріабельними ділянками або ділянками, що обумовлюють комплементарність (CDR), які підтримуються менш варіабельними ділянками, які називають каркасними варіабельними ділянками. До антитіл за цим винаходом, що наводяться як приклад, належать моноклональні антитіла IgG. Передбачається також, що терміни "антитіло" або "антитіла" за цим винаходом можуть охоплювати фрагменти або генно-інженерні форми антитіла. Існують, наприклад, Fv-фрагменти або білки, де CDR та/або варіабельним доменам антитіл, наведеним як приклад, генноінженерними способами надається форма одноланцюгових антигензв'язувальних білків, діатіл та/або триатіл для забезпечення переваг нових антитіл за цим винаходом у альтернативних структурних формах. Коротко кажучи, частина антитіла, що містить VL та VH домени, конструюється як Fvфрагмент (варіабельний фрагмент) і являє собою антигензв'язувальний центр антитіла. Одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv або SCA) являє собою фрагмент антитіла, який містить VL домен та VH домен на одному поліпептидному ланцюзі, де N-кінець одного домену та С-кінець іншого домену з'єднані гнучким лінкером (дивись, наприклад, патент США №4,946,778 (Ladner et al); WO 88/09344, (Huston et al)). WO 92/01047 (McCafferty et al.) описує дисплей scFvфрагментів на поверхні розчинних рекомбінантних генетичних упаковок дисплейного типу, таких як бактеріофаг. Пептидними лінкерами, що застосовуються для продукування одноланцюгових антитіл, можуть бути гнучкі пептиди, вибрані для забезпечення того, щоб відбувалось відповідне тривимірне укладання VL та VH доменів. Лінкер, як правило, складається з 10-50 амінокислотних залишків. За варіантом, якому віддається перевага, лінкер складається з 10-30 амінокислотних залишків. За варіантом, якому віддається більша перевага, лінкер складається з 12-30 амінокислотних залишків. За варіантом, якому віддається найбільша перевага, лінкер складається з 15-25 амінокислотних залишків. Прикладом таких лінкерних пептидів є повтори чотирьох залишків гліцину, за якими йде залишок серину. Одноланцюговим антитілам бракує деяких або усіх константних доменів повних антитіл, з яких вони були одержані. Таким чином, вони можуть долати певні проблеми, пов'язані із 6 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосуванням повних антитіл. Наприклад, у одноланцюгових антитіл не виникає певних небажаних взаємодій між константними ділянками важкого ланцюга та іншими біологічними молекулами. Крім того, одноланцюгові антитіла є значно меншими, ніж повні антитіла, і можуть мати більшу проникність, ніж повні антитіла, завдяки чому одноланцюгові антитіла можуть локалізуватися і зв'язуватися з антигензв'язувальними центрами-мішенями з більшою ефективністю. Крім того, в результаті відносно невеликого розміру одноланцюгові антитіла мають значно меншу ймовірність спричинення небажаної імунної реакції у реципієнта, ніж повні антитіла. Численні одноланцюгові антитіла, де кожен окремий ланцюг має один VH домен і один VL домен, ковалентно з'єднані першим пептидним лінкером, можуть бути ковалентно з'єднані щонайменше одним або декількома пептидними лінкерами з утворенням полівалентних одноланцюгових антитіл, які можуть бути моноспецифічними або мультиспецифічними. Кожен ланцюг полівалентного одноланцюгового антитіла включає в себе варіабельний фрагмент легкого ланцюга та варіабельний фрагмент важкого ланцюга, і приєднаний пептидним лінкером до щонайменше одного іншого ланцюга. Згаданий пептидний лінкер складається із щонайменше п'ятнадцяти амінокислотних залишків. Максимальна кількість амінокислотних залишків становить приблизно одну сотню. Два одноланцюгові антитіла можуть об'єднуватись з утворенням діатіла, відомого також як бівалентний димер. Діатіла мають два ланцюги і два антигензв'язувальні центри, і можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. Кожен ланцюг діатіла включає в себе VH домен, приєднаний до VL домену. Згадані домени приєднані один до одного лінкерами, які є достатньо короткими для запобігання утворенню пар доменів на тому самому ланцюзі, таким чином стимулюючи утворення пар комплементарних доменів на різних ланцюгах із відновленням двох антигензв'язувальних центрів. Як простий приклад, діатіло за цим винаходом може бути біспецифічним і містити зв'язувальний домен як RON6, так і RON8. Три одноланцюгові антитіла можуть об'єднуватись з утворенням триатіл, відомих також як тривалентні димери. Триатіла конструюють так, що амінокислотні кінці VL домену або VH домену безпосередньо зливаються з карбоксильними кінцями VL домену або VH домену, тобто без жодної лінкерної послідовності. Триатіло має три Fv-голови з поліпептидами, розміщеними циклічним ("голова-до-хвоста") чином. Можливою конформацією триатіла є планарна з трьома зв'язувальними центрами, розміщеними на площині під кутом 120° один відносно іншого. Триатіла можуть бути моноспецифічними, біспецифічними або триспецифічними. Термін "Fab-фрагмент" (антигензв'язувальний фрагмент) означає фрагменти антитіла, що містять VL, CL, VH, СНІ домени. Фрагменти, які одержують шляхом розщеплення папаїном, позначають просто Fab, і такі фрагменти не зберігають шарнірної ділянки важкого ланцюга. Шляхом розщеплення пепсином одержують різні Fab-фрагменти, що зберігають шарнірну ділянку важкого ланцюга. Такі фрагменти з непошкодженими міжланцюговими дисульфідними зв'язками позначають як Р(ab')2-фрагменти, тоді як Fab'-фрагмент означає такий фрагмент, у якого дисульфідні зв'язки не збереглись. Р(ab')2-фрагменти мають більш високу авідність до антигену, ніж моновалентні Fab-фрагменти. Термін "Fc-фрагмент" (фрагмент, що кристалізується) означає частину або фрагмент антитіла, що містить спаровані константні домени важкого ланцюга. У антитіла класу IgG, наприклад, Fc-фрагмент містить СН2 та СН3 домени. Fc-фрагмент класу IgA або IgM антитіла також містить СН4 домен. Fc-фрагмент асоціюється зі зв'язуванням рецептора Fc-фрагмента, активацією комплемент-опосередкованої цитотоксичності та антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (ADCC). Для таких антитіл, як IgA та IgM, що являють собою комплекси численних IgG-подібних білків, утворення комплексу потребує константних доменів Fcфрагментів. Нарешті, шарнірна ділянка відокремлює Fab- та Fc-фрагменти антитіла із забезпеченням рухливості Fab-фрагментів один відносно іншого та відносно Fc-фрагмента, а також містить численні дисульфідні зв'язки для ковалентного зв'язування двох важких ланцюгів. Таким чином, до антитіл, специфічних для RON, належать (але без обмеження ними) природні антитіла та їх фрагменти. До таких фрагментів належать, виключно як приклад, бівалентні фрагменти, такі як (FaV)2, моновалентні фрагменти, такі як Fab, одноланцюгові антитіла, одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv), однодоменні антитіла, які зв'язуються саме з RON. За варіантом, якому віддається перевага, такі фрагменти містять одну або декілька CDR антитіл RON6 та/або RON8, наведених як приклад у цьому описі. Визначення антитіл за цим винаходом факультативно також охоплює генно-інженерні антитіла, які зв'язуються саме з RON, такі як полівалентні одноланцюгові антитіла, діатіла, триатіла тощо, які зв'язуються саме з антигенами. За варіантом, якому віддається перевага, такі полівалентні генно-інженерні 7 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла містять одну або декілька CDR антитіл RON6 та/або RON8, наведених як приклад у цьому описі. Кожен домен антитіл за цим винаходом може бути повним антитілом із варіабельним доменом важкого або легкого ланцюга, або він може бути функціонально таким самим чи мутантом або похідною природного домену, або синтетичним доменом, сконструйованим, наприклад, in vitro із застосуванням методу, такого як описаний у WO 93/11236 (Griffiths et al). Можна, наприклад, з'єднати домени, що відповідають варіабельним доменам антитіла, яким бракує щонайменше однієї амінокислоти. Важливою особливістю є здатність кожного домену до асоціювання з комплементарним доменом для утворення антигензв'язувального центру. Відповідно, словосполучення "варіабельний фрагмент важкого та легкого ланцюга" не повинно розглядатись як таке, що виключає варіанти, що не чинять суттєвого впливу на специфічність. Терміни "антитіла" та "фрагменти антитіл", вжиті у цьому описі, охоплюють модифікації, які зберігають специфічність відносно рецептора RON. До таких модифікацій належать (але без обмеження ними) кон'югація з ефекторною молекулою, такою як хіміотерапевтичний засіб (наприклад, цисплатин, таксол, доксорубіцин) або цитотоксин (наприклад, білок або небілковий органічний хіміотерапевтичний засіб). Антитіла можуть бути модифіковані шляхом кон'югації з виявними репортерними складовими. До антитіл належать також антитіла із змінами, що впливають на незв'язувальні властивості, такі як період напіввиведення (наприклад, кон'югація з полімерами поліетиленгліколю). Білки та небілкові засоби можуть бути кон'юговані з антитілами за способами, відомими у цій галузі. До способів кон'югування належать безпосереднє зв'язування, зв'язування через ковалентно приєднані лінкери та специфічне зв'язування членів пар (наприклад, авідин-біотин). Такі способи охоплюють, наприклад, спосіб кон'югування доксорубіцину, описаний у статті Greenfield et al, Cancer Research 50, 6600-6607 (1990), та способи кон'югування сполук платини, описані у статтях Arnon et al, Adv. Exp. Med. Biol. 303, 79-90 (1991) та Kiseleva et al, Моl. Biol. (USSR) 25, 508-514 (1991). Термін "специфічність" антитіла означає вибіркове розпізнавання антитілом конкретної антигенної детермінанти антигену. Термін "антигенна детермінанта" охоплює будь-яку білкову детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або Т-клітинним рецептором чи до будь-якої іншої взаємодії з молекулою. Антигенні детермінанти загалом складаються з хімічно активних поверхневих угруповань молекул, таких як амінокислоти або вуглевод чи бічні ланцюги цукрів, і, як правило, мають специфічні тривимірні структурні властивості, а також специфічні зарядні властивості. Антигенна детермінанта може бути "лінійною" або "конформаційною". У лінійної антигенної детермінанти усі точки взаємодії між білком та взаємодіючою молекулою (такою як антитіло) розміщуються лінійно вздовж первинної амінокислотної послідовності білка. У конформаційної антигенної детермінанти точки взаємодії знаходяться на амінокислотних залишках білка, відокремлених один від одного, тобто на несуміжних амінокислотах, розміщених поряд в результаті третинного укладання білка. Антигенні детермінанти, утворені суміжними амінокислотами, як правило, зберігаються при підданні дії денатуруючих розчинників, у той час як антигенні детермінанти, утворені в результаті третинного укладання, як правило, втрачаються при обробці денатуруючими розчинниками. Антигенна детермінанта, як правило, складається із щонайменше 3 амінокислоти, частіше, щонайменше 5 амінокислот або 8-10 амінокислот, з унікальною просторовою конформацією. Антитіла, що розпізнають ту саму антигенну детермінанту, можуть бути перевірені за допомогою простого імуноаналізу, який показує здатність одного антитіла блокувати зв'язування іншого антитіла з антигеном-мішенню. Після визначення бажаної антигенної детермінанти на антигені, можна продукувати антитіла для цієї антигенної детермінанти, наприклад, із застосуванням способів, опис яких наведений у цьому винаході. За альтернативним варіантом у процесі відкриття, продукування та визначення властивостей антитіл можуть бути визначені властивості бажаних антигенних детермінант. Після цього, грунтуючись на цій інформації, можна здійснити конкурентну перевірку антитіл на зв'язування з тією самою антигенною детермінантою. Варіант підходу до досягнення цієї мети полягає у проведенні перехресно-конкурентних досліджень для знаходження антитіл, що конкурентно зв'язуються одне з другим, наприклад, антитіла конкурують за зв'язування з антигеном. Картування антигенної детермінанти та споріднені методики Для перевірки антитіл, що зв'язуються з конкретною антигенною детермінантою (наприклад, антитіла, що блокують зв'язування IgE з його високоафінним рецептором), можна провести звичайний перехресно-блокувальний аналіз, такий як описаний у Harlow and Lane, ANTIBODIES 8 UA 99633 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1990) Cold Spring Harbor Laboratory Press. До інших способів належать ідентифікування мутантів із заміною аланінових залишків, вестерн-блотинг (Reineke, 2004 Methods Мої. Biol. 248:443-463) (зміст згаданого джерела у повному обсязі включений у цей опис шляхом посилання) або аналіз гідролізу по пептидних зв'язках. Крім того, можуть бути застосовані такі способи як вирізання антигенних детермінант, екстрагування антигенних детермінант та хімічна модифікація антигенів (Tomer, 2000 Protein Science: 9: 487-496, зміст згаданого джерела у повному обсязі включений у цей опис шляхом посилання). Функціональний аналіз Аналіз спектра антитіл із застосуванням модифікацій (МАР), відомий також як аналіз спектра антитіл на основі структури антигенів (ASAP), являє собою метод, за допомогою якого класифікують великі кількості моноклональних антитіл (mAb), спрямованих проти одного й того самого антигену, відповідно до подібностей кривих зв'язування кожного антитіла з хімічно або ферментативно модифікованими поверхнями антигенів (заявка на патент США № 2004/0101920, яка включена у повному обсязі у цей опис шляхом посилання). Кожна категорія може відображати специфічну антигенну детермінанту, яка чітко різниться або частково співпадає з антигенною детермінантою, представленою іншою категорією. Цей метод уможливлює здійснення швидкої перевірки генетично ідентичних антитіл, в результаті чого визначення властивостей може зосереджуватись на генетично різних антитілах. При застосуванні для перевірки гібридом МАР може полегшити ідентифікування рідкісних клонів гібридом, які продукують mAb з бажаними властивостями. МАР може застосовуватись для сортування антитіл RON6 та RON8 за цим винаходом на групи антитіл, здатних до зв'язування різних антигенних детермінант. Антитіла або їх фрагменти за цим винаходом можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. Біспецифічними антитілами (BsAbs) є антитіла, що мають дві різні антигензв'язувальні специфічності або два різні антигензв'язувальні центри (дивись публікацію заявки на патент США № 2004/0259156, поданої 13 лютого 2004 року). Якщо антитіло має більше ніж одну специфічність, то розпізнані антигенні детермінанти можуть асоціюватись з одним антигеном або більше ніж з одним антигеном. Таким чином, цей винахід пропонує біспецифічні антитіла або їх фрагменти, що зв'язуються з двома різними антигенами, із щонайменше однією специфічністю для RON. Специфічність антитіл або їх фрагментів для RON може бути визначена на основі спорідненості та/або авідності. Спорідненість, представлена константою дисоціації антигену з антитілом у стані рівноваги ("Kd"), визначає силу зв'язування між антигенною детермінантою та зв'язувальним центром антитіла. Авідність є критерієм сили зв'язування між антитілом та його антигеном. Авідність пов'язується як із спорідненістю антигенної детермінанти до зв'язувального центра антитіла, так і з валентністю антитіла, яка означає кількість антигензв'язувальних центрів конкретної антигенної детермінанти. Антитіла, як правило, -5 -11 зв'язуються з константою дисоціації (Кd) від приблизно 10 л/моль до приблизно 10 л/моль (наприклад, КD