Химерна конструкція для забезпечення стійкості до виходу у стрілку у цукрового буряка

Реферат: Запропонований винахід стосується забезпечення контролю часу виходу у стрілку та цвітіння у цукрового буряка, зокрема способів і молекул нуклеїнової кислоти, химерних конструкцій і векторів для конструювання стійкості до виходу у стрілку у цукрового буряка. Зокрема, шляхом підвищеної регуляції експресії ендогенного гена BvFT1 в рослині цукрового буряка, забезпечують фенотип відкладеного стрілкування у Beta vulgaris. UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Область техніки, до якої відноситься винахід Даний винахід відноситься до області контролю за виходом у стрілку й цвітінням у цукрового буряка, а саме до генів, що обумовлюють стійкість до виходу у стрілку, до способів конструювання контролю за виходом у стрілку цукрового буряка й до трансгенних рослин цукрового буряка з затримкою виходу у стрілку. Зокрема, даний винахід відноситься до модифікації відповіді на яровизацію цукрового буряка шляхом зміни експресії Beta гомологів BvFT1 і BvFT2 гена FT. Передумови створення винаходу Цукровий буряк вирощували протягом тисячоріч для одержання солодкого продукту, але го його використання як джерело цукру не було відоме до 18 століття. Культивований цукровий буряк (Beta vulgaris ssp. vulgaris L.) є дворічною рослиною з сімейства Chenopodiaceae. У нормі його життєвий цикл становить два роки. У перший рік формується листова розетка й великий соковитий корінь, в якому запасається енергія у формі сахарози. У зв'язку з цим буряк вирощують один рік. На другий рік стебло подовжується (виходить у стрілку) і після закінчення періоду низьких температур починається формування квітів і насіння. Якщо у перший рік період холодів затримується, можуть почати формуватися насіннєносці. Така генетично обумовлена термальна індукція приводить до феномена, який називається виходом у стрілку. Збір урожаю буряка для екстракції цукру відбувається у середині дворічного циклу, коли вміст сахарози максимальний. Традиційно існує два способи збору врожаю цукрового буряка - весняний і осінній, які застосовуються на півдні в умовах м'якого клімату, або у північних широтах, відповідно. Обидва способи залежать від різних ступенів природної стійкості до виходу у стрілку. На стійкість до виходу у стрілку впливає температура, тому тривалість та іррадіація обмежують стійкість до індукції насіннєносців і є ключовим параметром у розведенні цукрового буряка. Для повного контролю за виходом у стрілку й цвітінням за рахунок блокування яровизації, деяровизації яровизованих рослин або придушення цвітіння або одержання життєздатного насіння, культуру цукрового буряка висівають восени у північних широтах без ризику виходу у стрілку й цвітіння у наступному сезоні. Таке зрушення з весни на зиму дозволяє сільгоспвиробникам висівати культуру восени й збирати врожай на наступне літо. Порівняння врожаю зимових варіантів із урожаєм весняних варіантів, наприклад, пшениці й олійного рапсу, показало, що врожаї зимових варіантів постійно вище, ніж весняних. Результатом може бути поліпшення економічної життєздатності й прибутковості культури. Іншою перевагою може бути можливість комбінувати культивування весняних і зимових культур, що може привести до продовження періоду збору врожаю, починаючи на 2-3 місяця раніше, таким чином, здійснюючи поліпшену капіталізацію інвестицій в устаткування й інфраструктуру, необхідну для збору врожаю цукрового буряка, транспорт і переробку. Таке продовження періоду переробки цукрового буряка відповідає одній з потреб галузі промисловості з виробництва цукру. Яровизація холодом як неодмінна частина повного життєвого циклу цукрового буряка індукує вихід у стрілку рослин. Яровизація та її вплив на дворічний цикл цукрового буряка докладно описані (наприклад, Jaggard та ін., 1983). Цукровий буряк реагує на температуру 312 °C. Кілька тижнів при температурі від 3 до 12 °C необхідні, щоб буряк початку виходити у стрілку. Модель виходу у стрілку ITB показує, що у Франції яровизація займає до 90 діб (13 тижнів) після посіву. Сімнадцять діб при 7 °C становлять принципово важливий показник протягом цих 90 діб для ініціації виходу у стрілку. Імовірність виходу у стрілку підвищується залежно від числа доби, протягом яких максимальна температура не перевищує 12 °C. Це може привести до втрати врожаю у випадку ранньої сівби, оскільки при виході у стрілку 1 % рослин у культурі відбувається зниження одержуваного цукру на 0,4-0,7 %. Знання про те, що відповідь на яровизацію представляє найбільше важливий фактор індукції цвітіння, привели до розвитку стійкості до створення різних сортів цукрового буряка, стійких до виходу у стрілку, якими можуть користуватися фермери, що вирощують цукровий буряк. Однак, у цей час неможливе культивування сучасних сортів цукрового буряка у центральній Європі протягом зими (тобто як озима культура), що відповідало б потребі, наявній у галузі промисловості з виробництва цукру. Навіть культивування озимих сортів цукрового буряка з підвищеною продуктивністю як і раніше серйозно ускладнене через випадки виходу у стрілку. Яровизація, викликана впливом холодної температури під час зими, як і раніше приводить до виходу у стрілку й до втрати врожаю, оскільки у цей час немає рослин або способів, які гарантовано затримують яровизацію цукрового буряка. За зазначеними вище причинами досить бажано створити сорт цукрового буряка, що не дає виходу у стрілку, в якому конструюють стійкість до виходу у стрілку, наприклад, трансгенними методами, для модулювання відповіді на яровизацію для надання стійкості проти виходу у 1 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стрілку або для істотної затримки виходу у стрілку після індукції холодом. Таким чином, потрібні нуклеотидні послідовності генів, що беруть участь у відповіді на яровизацію, і трансгенні засоби, що дозволяють використовувати зазначені генні послідовності для модуляції відповіді на яровизацію у цукрового буряка. Даний винахід надає такі нуклеотидні послідовності й такі трансгенні засоби. Функціональний аналіз модельного організму Arabidopsis thaliana дозволив виділити чотири різних метаболічних шляхи цвітіння (Levy і Dean, 1998). Ці чотири метаболічних шляхи можуть бути встановлені за стимулами зовнішнього середовища, наприклад, метаболічні шляхи за фотоперіодизмом й за яровизацією, або вроджені сигнали до розвитку, наприклад, метаболічні шляхи автономного активування й придушення цвітіння. У деяких видів на час цвітіння спочатку впливають фактори зовнішнього середовища, наприклад, фотоперіодизм, якість/кількість світла, яровизація й доступність води або харчування. На інші види впливають у меншому ступені екзогенні сигнали й більшою мірою ендогенні, наприклад, розмір рослини або кількість вузлів. Одним із досліджуваних локусів є локус цвітіння (FLOWERING LOCUS T-FT), виявлений у природних екотипів арабідопсису з пізнім цвітінням (Koorneef та ін., 1991). FT є низькомолекулярним білком з масою 23 кДа й гомологом фосфати- дилетаноламін-єднальних білків, які також називають білками інгібітора RAF кінази (Kardailsky та ін., 1999; Kobayashi та ін., 1999). У даному винаході ідентифіковані ортологи генів FT у цукровому буряку. Конструювання експресії цих генів приводить до модуляції відповіді на яровизацію у цукрового буряка й до одержання рослин цукрового буряка, в яких відповідь на яровизацію відкладена або пригнічена. Короткий опис винаходу Даний винахід включає нуклеотидні послідовності з генів FT цукрового буряка й способи модулювання відповіді на яровизацію цукрового буряка шляхом придушення або підвищення регуляції експресії таких генів FT у цукровому буряку. Один із об'єктів даного винаходу відноситься до послідовностей нуклеїнової кислоти, переважно до виділених послідовностей нуклеїнової кислоти, послідовність яких ідентична щонайменше на 70 % послідовності нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот, представлених нижче у вигляді однієї з послідовностей SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9, або комплементарної ним послідовності, яка включає щонайменше 15 послідовних нуклеотидів послідовності нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот, представлених нижче у вигляді однієї з послідовностей SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9, або комплементарної ним послідовності, або до нуклеїнових кислот, які гібридизуються у суворих умовах із послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот, наведених нижче у вигляді однієї з послідовностей SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9, або комплементарної ним послідовності. У кращому варіанті здійснення даного винаходу послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом включає послідовність нуклеїнової кислоти, наведену нижче, у вигляді однієї з послідовностей SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9. В іншому об'єкті даного винаходу також передбачені поліпептиди, переважно виділені поліпептиди, які кодуються послідовностями нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описаними вище. У кращому варіанті здійснення даного винаходу поліпептид за даним винаходом має амінокислотну послідовність, вибрану з групи амінокислотних послідовностей, представлених у вигляді SEQ ID NO: 7 або 10. У ще одному об'єкті даного винаходу передбачені химерні конструкції, які включають послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описану вище, під контролем регуляторних елементів, переважно під контролем регуляторних елементів, що функціонують у рослинах. В одному з кращих варіантів здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом додатково включає ген селективного маркера, що дозволяє відрізнити трансформований і нетрансформований рослинний матеріал у процесі добору. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу передбачена химерна конструкція за даним винаходом, або для трансгенного зниження регуляції, або для придушення експресії ендогенного гена BvFT2 у цукровому буряку, або для трансгенного підвищення регуляції експресії ендогенного гена BvFT1 у цукровому буряку. Один із об'єктів даного винаходу пов'язаний з химерними конструкціями, передбаченими для трансгенної зниженої регуляції або для придушення експресії ендогенного гена BvFT2 у цукровому буряку. У кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом є 2 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 химерною конструкцією, за допомогою якої знижена регуляція або придушення досягається за допомогою засобів, вибраних із длРНК, антизмістової супресії або спільної супресії. У ще одному кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом включає гетерологічну ДНК, що кодує перший ланцюг РНК і другий ланцюг РНК, і яка при транскрипції дає першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначений перший ланцюг РНК у значній мірі комплементарний щонайменше частині ланцюга РНК ендогенного гена BvFT2 у цукрового буряка для гібридизації або відпалу з ланцюгом РНК, сформованим зазначеним ендогенним геном BvFT2 у такий спосіб, що викликає зниження регуляції або супресію експресії ендогенного гена BvFT2, і в якому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК формують дволанцюгову РНК, причому дволанцюгова РНК при експресії у рослині цукрового буряка бере участь у РНК інтерференції експресії зазначеного ендогенного гена BvFT2, тим самим, викликаючи зниження регуляції або придушення експресії ендогенного гена BvFT2. У ще одному кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом, описана вище, включає інвертований повтор, переважно оперативно пов'язаний з конститутивним промотором, що потім транскрибується, формує молекулу дволанцюгової РНК у рослині цукрового буряка, включаючи зазначені перший й другий ланцюги РНК, причому зазначена молекула дволанцюгової РНК індукує сайленсинг BvFT2. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом включає гетерологічну ДНК, що кодує послідовність нуклеїнової кислоти, яка або ідентична щонайменше на 70 % послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом, представленої вище у вигляді послідовності SEQ ID NO: 8 або 9, або включає щонайменше 15 послідовних нуклеотидів послідовності за даним винаходом, представленої нижче у вигляді послідовностей SEQ ID NO: 8 або 9, або гібридизується у суворих умовах з послідовністю нуклеїнової кислоти за даним винаходом, представленої нижче у вигляді послідовностей SEQ ID NO: 8 або 9. В одному з варіантів здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом включає гетерологічну ДНК, яку одержують з фрагмента кДНК розміром 0,27 т.н., що складається з екзона 4 гена BvFT2, у реакції ПЛР, використовуючи прямий праймер HiNK6382 з нуклеотидною послідовністю 5'- CTATGGATCCGCATTTAATAAAATCTCTTTCAATG-3' (SEQ ID NO: 44) і зворотній праймер HiNK6384 з нуклеотидною послідовністю 5'GTAGAAGCAGAAACTTACCTGCCAAGAAGTTGTCTGCTATG-3' (SEQ ID NO: 45). В іншому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом включає гетерологічну ДНК, обмежену нуклеотидами від 8747 до 9046 у послідовності SEQ ID NO: 33. У ще одному з варіантів здійснення даного винаходу гетерологічна ДНК, включена у химерну конструкцію за даним винаходом, інсертована між промотором і термінатором, причому зазначену гетерологічну ДНК одержують у такий спосіб: а) ампліфікацією фрагмента кДНК розміром 0,27 т.н., похідного від екзона 4 гена BvFT2, у реакції ПЛР, використовуючи прямий праймер HiNK6382 з нуклеотидною послідовністю 5'CTATGGATCCGCATTTAATAAAATCTCTTTCAATG-3' (SEQ ID NO: 44) і зворотній праймер HiNK6384 з нуклеотидною послідовністю 5'GTAGAAGCAGAAACTTACCTGCCAAGAAGTTGTCTGCTATG-3' (SEQ ID NO: 45), а також кДНК цукрового буряка як матриця, причому кДНК цукрового буряка одержують з сумарної РНК, екстрагованої з листя цукрового буряка у реакції зворотньої транскриптази, використовуючи 3' RACE адаптер з нуклеотидною послідовністю 5'GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGT12VN-3' (SEQ ID NO: 35) як праймер; б) ампліфікацією фрагмента кДНК розміром 0,19 т.н., що включає інтрон ST-LS1 і фланкуючий сайти сплайсингу, використовуючи прямий праймер HiNK6383 з нуклеотидною послідовністю 5'-CATAGCAGACAACTTCTTGGCAGGTAAGTTTCTGCTTCTAC-3' (SEQ ID NO: 46) і зворотній праймер HiNK529 з нуклеотидною послідовністю 5'ATCCAACCGCGGACCTGCACATCAACAA-3' (SEQ ID NO: 40), а також ДНК картоплі, що містить інтрон картоплі St-LS1 як матрицю; в) гібридизацією продуктів ампліфікації, отриманих на стадіях a) і б), один з одним за допомогою другого кола ПЛР, використовуючи праймери HiNK6382 і HiNK529 і використовуючи суміш обох продуктів ампліфікації як матрицю, одержуючи продукт гібридизації довжиною 0,47 т.н.; г) ампліфікацією фрагмента BvFT2 розміром 0,27 т.н., використовуючи прямий праймер HiNK6385 з нуклеотидною послідовністю 5'-TAAATCCGCGGGCCAAGAAGTTGTCTGCTATG-3' (SEQ ID NO: 47) і зворотній праймер HiNK6386 з нуклеотидною послідовністю 5' 3 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CTATTTGTCGACGCATTTAATAAAATCTCTTTC-3' (SEQ ID NO: 48) і кДНК цукрового буряка, отриманої відповідно до зазначеного вище підпункту а), як матриця; д) гібридизацією обох фрагментів за сайтами рестрикції Sac II для створення інвертованого повтору послідовності BvFT2, відділеного інтроном від гена картоплі ST-LS1. В іншому варіанті здійснення даного винаходу об'єктом є химерна конструкція за даним винаходом, що включає послідовність, представлену нижче у вигляді нуклеотидної послідовності SEQ ID NO: 332. Інший об'єкт за даним винаходом пов'язаний з химерними конструкціями, створеними для трансгенного підвищення регуляції експресії ендогенного гена BvFT1 у цукровому буряку. В іншому варіанті здійснення даного винаходу об'єктом є химерна конструкція за даним винаходом для трансгенного підвищення регуляції експресії ендогенного гена BvFT1, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує ген BvFT1 або його частини, причому зазначена нуклеотидна послідовність, яка кодує ген BvFT1 або його частини, має нуклеотидну послідовність, яка або ідентична щонайменше на 70 % або гібридизується у суворих умовах з послідовністю нуклеїнової кислоти за даним винаходом, представленою нижче у вигляді послідовностей SEQ ID NO: 5 або 6, причому зазначена нуклеотидна послідовність, яка кодує ген BvFT1 або його частини, оперативно пов'язана з регуляторними послідовностями таким чином, що при експресії у рослині індукується підвищена регуляція експресії ендогенного гена BvFT1. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу нуклеотидну послідовність, яка кодує ген BvFT1 і включена у химерну конструкцію за даним винаходом, має нуклеотидну послідовність, зазначену нижче у вигляді послідовності SEQ ID NO: 6. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом, описана вище, включає нуклеотидну послідовність, представлену нуклеотидами від 2076 до 2615 у послідовності SEQ ID NO: 34. У ще одному кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом, описана вище, включає нуклеотидну послідовність, представлену у послідовності SEQ ID NO: 34. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу гетерологічна ДНК, включена у химерну конструкцію за даним винаходом, оперативно пов'язана з конститутивним промотором, переважно промотором Ubi3 з Arabidopsis. Інший об'єкт за даним винаходом відноситься до вектора для трансформації рослини й/або до рослинного вектора експресії, що включає химерну конструкцію за даним винаходом, описану вище. В одному з кращих варіантів здійснення даного винаходу вектор для трансформації рослин за даним винаходом є вектором експресії РНКі, що включає химерну конструкцію за даним винаходом, описану вище, і/або вектором експресії рослин, що включають химерну конструкцію за даним винаходом. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу вектор експресії РНКі за даним винаходом включає химерну конструкцію, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO: 33, представлену нижче. У ще одному кращому варіанті здійснення даного винаходу вектор експресії за даним винаходом включає химерну конструкцію з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO: 34, представленою нижче. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу передбачена трансгенна рослина цукрового буряка, в якій модулюють експресію ендогенного гена BvFT1 і/або гена BvFT2, або його клітини, тканини або насіння, причому знижена регуляція або супресована експресія ендогенного гена BvFT2 у зазначеній трансгенній рослині цукрового буряка, і/або підвищена регуляція експресії ендогенного гена BvFT1 у зазначеній трансгенній рослині цукрового буряка. В одному кращому варіанті здійснення даного винаходу передбачена трансгенна рослина, або клітини, або насіння цукрового буряка, в яких знижена регуляція або супресована експресія ендогенного гена BvFT2 способом, вибраним із групи, що складається з длРНК, антизмістової супресії або спільної супресії. У ще одному кращому варіанті здійснення даного винаходу трансгенна рослина цукрового буряка за даним винаходом, або її клітини, тканини або насіння, включають химерну конструкцію за даним винаходом або послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом, причому зазначена трансгенна рослина цукрового буряка, або її клітини, тканини або насіння, що експресують длРНК, стійкі до виходу у стрілку й проявляють фенотип відкладеного виходу у стрілку, переважно фенотип відсутності виходу у стрілку. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу трансгенна рослина цукрового 4 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 буряка, або її клітини, тканини або насіння за даним винаходом містять химерну конструкцію за даним винаходом або послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом, причому у зазначеній трансгенній рослині цукрового буряка ендогенний BvFT1 надекспресується й рослина проявляє фенотип відкладеного виходу у стрілку, переважно фенотип відсутності виходу у стрілку. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу трансгенну рослину цукрового буряка одержують з клітин, тканин або насіння за даним винаходом, відповідно до описаного вище. Інший кращий варіант здійснення даного винаходу відноситься до кореня або до потомства трансгенної рослини цукрового буряка за даним винаходом. Інший об'єкт за даним винаходом відноситься до способу одержання гібридного насіння, з якого можуть бути вирощені рослини цукрового буряка з фенотипом стійкості до виходу у стрілку, причому зазначений спосіб включає наступні стадії: а. одержання лінії цукрового буряка з фенотипом стійкості до виходу у стрілку, особливо трансгенної рослини цукрового буряка за даним винаходом, описаної вище, в якості першої батьківської лінії, б. одержання в якості другої батьківської лінії лінію цукрового буряка з генотипом, відмінним від генотипу лінії цукрового буряка, отриманої на стадії а.; причому однією з батьківських ліній, отриманих на стадії а) або стадії б), є лінія ЦЧС з чоловічою стерильністю, а іншою батьківською лінією - лінія з чоловічою фертильністю, і в. запилення рослинами батьківської фертильної чоловічої лінії квітів рослин батьківської лінії з чоловічою стерильністю, що приводить до одержання насіння, і збору насіння, причому зібране гібридне насіння є насінням рослини цукрового буряка з фенотипом відкладеного виходу у стрілку, переважно з фенотипом стійкості до виходу у стрілку. В одному з варіантів здійснення даного винаходу передбачений спосіб одержання гібридного насіння цукрового буряка за даним винаходом, в якому чоловіча стерильна батьківська лінія ЦЧС цукрового буряка є інбредною лінією цукрового буряка, що включає химерну конструкцію за даним винаходом, описану вище. Ще один кращий варіант здійснення даного винаходу відноситься до гібридного насіння рослини цукрового буряка з фенотипом відкладеного виходу у стрілку, переважно з фенотипом відсутності виходу у стрілку. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу гібридне насіння за даним винаходом одержують способом одержання гібридного насіння цукрового буряка за даним винаходом, описаним вище. У ще одному кращому варіанті здійснення даного винаходу гібридні рослини цукрового буряка з фенотипом відкладеного виходу у стрілку, переважно з фенотипом відсутності виходу у стрілку, одержують вирощуванням гібридного насіння за даним винаходом, описаним вище. Інший об'єкт за даним винаходом відноситься до частин рослин, вибраних із групи, що складається з насіння, зародків, мікроспор, пильовиків, зигот, протопластів, клітин, зав'язей, насінних зачатків, пилка, коренеплодів, сім'ядоль, екстрактів або біологічних зразків, причому зазначені частини рослин отримані з рослини або клітин, тканин або насіння трансгенного цукрового буряка за даним винаходом, описаного вище, або з гібридного насіння за даним винаходом, описаних вище, або з гібридних рослин цукрового буряка за даним винаходом, описаних вище. Ще один об'єкт даного винаходу відноситься до застосування послідовності нуклеїнової кислоти, або химерної конструкції за даним винаходом, описаної вище, або їхніх фрагментів для трансформації клітин цукрового буряка. В іншому варіанті здійснення даного винаходу передбачений спосіб трансформації клітин цукрового буряка, що включає застосування послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описаної вище, або химерної конструкції за даним винаходом, або вектора за даним винаходом, описаного вище. Інший варіант здійснення даного винаходу відноситься до застосування трансгенної рослини цукрового буряка за даним винаходом, гібридної рослини цукрового буряка за даним винаходом або частин рослин за даним винаходом у способі, вибраному з групи, що включає способи одержання цукру, способи аеробної ферментації й способи анаеробної ферментації, особливо у способі одержання цукру. У кращому варіанті здійснення даного винаходу передбачений спосіб одержання цукру, в якому рослини, клітини або тканини цукрового буряка за даним винаходом, описані вище, переробляють для одержання цукру. Ще один об'єкт за даним винаходом відноситься до цукру, отриманому з рослин, клітин або 5 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тканин цукрового буряка за даним винаходом. Короткий опис фігур і послідовностей Фігури: Фіг. 1 представляє вирівнювання послідовностей іРНК ортологів FT з Arabidopsis (AtFT, номер у каталозі NM_105222), Citrus (CiFT, номер у каталозі AB027456), пшениці (TaFT, номер у каталозі AY705794) і рису (OsHd3a, номер у каталозі NM_001063395). Положення вироджених праймерів HiNK581 (SEQ ID No. 1) і HiNK860 (SEQ ID No. 2) виділені рамками. Фіг. 2 схематично представляє структуру гена BvFT1. Фіг. 3 схематично представляє структуру гена BvFT2. Фіг. 4 представляє порівняння амінокислотних послідовностей білків BvFT1 і AtFT. Консервативні амінокислоти відзначені темно-сірим кольором, близькі - сірим, що відрізняються - білим. Фіг. 5 представляє порівняння амінокислотних послідовностей білків BvFT2 і AtFT. Консервативні амінокислоти відзначені темно-сірим кольором, близькі - сірим, що відрізняються - білим. Фіг. 6 представляє філогенетичний аналіз безлічі представників сімейства гена FT від різних видів рослин, включаючи гомологи FT з цукрового буряка. Філогенетичне дерево побудоване методом Neighbor-Joining, використовуючи гени Beta vulgaris BvFT1 і BvFT2, Arabidopsis thaliana (FT, номер у каталозі NP_176726; TFL1, номер у каталозі NP_196004; MFT, номер у каталозі NP_173250; ATC, номер у каталозі NP_180324; TSF, номер у каталозі NP_193770 і BFT, номер у каталозі NP_201010), виноградної лози (VvFT, номер у каталозі ABI99465; VvTFL1A, номер у каталозі ABI99466; VvTFL1B, номер у каталозі ABI99467; VvTFL1C, номер у каталозі abi99468; і VvMFT, номер у каталозі ABI99469), цитруса (CiFT, номер у каталозі BAA77836; і CiTFL1, номер у каталозі AAR04683), яблука (MdFT, номер у каталозі BAD08340; MdTFL1-1, номер у каталозі BAD10961; і MdTFL1-2, номер у каталозі BAD10967), Pharbitis (PhFT1, номер у каталозі ABW73562; і PhFT2, номер у каталозі ABW73563), томату (SP, номер у каталозі AAC26161; SP2G, номер у каталозі AAO31791; SP3D, номер у каталозі AAO31792; SP5G, номер у каталозі AAO31793; SP6A, номер у каталозі AAO31794; і SP9D, номер у каталозі AAO31795), пшениці (TaFT, номер у каталозі ABK32205), рису (OsHd3a, номер у каталозі NP_001056860; і OsRFT, номер у каталозі BAF92712), Brassica napus (BnTFL1, номер у каталозі BAA33415) і тополі (PnFTL1, номер у каталозі BAD08339; PnTFL1, номер у каталозі BAD22599; PnFTL3, номер у каталозі BAD22601; PnFTL4, номер у каталозі BAD22677; PnFT1, номер у каталозі BAD01612; PnFT2, номер у каталозі BAD01561; PnFT3, номер у каталозі BAD02371; і PnFT4, номер у каталозі BAG12904). Безкореневі дендрограми одержують з вирівнювання амінокислотних послідовностей, використовуючи програму ClustalW, і філогенетичне дерево представляють за допомогою програмного пакета MEGA4 (Tamura та ін., 2007). Величини бутстрапів для повторних вибірок у 1000 зразків показані на кожній гілці. Шкала показує середнє число заміщень на сайт. Гомологи Beta vulgaris FT відзначені трикутником. Фіг. 7 представляє генетичні карти хромосом цукрового буряка IX і IV. Маркери наведені праворуч від хромосоми; сукупна генетична відстань показана ліворуч. Генетичні карти будують, використовуючи програму JoinMap 3.0. Генетичні положення BvFT1 і BvFT2, відповідно, підкреслюють. Фіг. 8 представляє відносну експресію генів BvFT1 і BvFT2 у різних органах рослин дворічного цукрового буряка. Зразки відбирають у дворічних рослин цукрового буряка, вирощених в умовах 16 год. світла/8 год. темряви при температурі 18ºC. Рівні виявлених ампліконів нормалізують за продуктами ампліфікації, які відповідають гену бетаізоцитратдегідрогенази (beta isocitrate dehydrogenase – BvICDH). Базові координати представляють середні величини трьох біологічних повторів. Фіг. 9 представляє відносні рівні генної експресії BvFT1 і BvFT2 на різних стадіях розвитку дворічного й однорічного цукрового буряка. Затінена смуга представляє період яровизації. Рівні ампліконів, що виявляються для BvFT1 і BvFT2, нормалізують за продуктами ампліфікації, що відповідає гену бета-ізоцитратдегідро- генази (beta isocitrate dehydrogenase – BvICDH), який використовують як внутрішні гени калібрування (див. приклад 3). Базові координати представляють середню величину двох біологічних повторів. Фіг. 10 представляє добове коливання генів BvFT1 і BvFT2 в однорічних, дворічних і яровизованих дворічних рослин. Транскрипти із тканин листя, що збиралися кожні 2 год. протягом 24 год., оцінюють кількісно за допомогою кількісної ПЛР. Проводять три незалежних експерименти в умовах короткого дня (КД) (10 год. світла/14 год. темряви), або в умовах довгого дня (ДД) (16 год. світла/8 год. темряви), або в умовах КДДД, причому рослини вирощують один тиждень в умовах КД, а потім переносять в умови ДД. Рівні виявлених ампліконів нормалізують 6 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за продуктами ампліфікації, що відповідає гену BvICDH1, який використовують як внутрішній ген калібрування. Базові координати представляють середню величину трьох біологічних повторів. Фіг. 11 представляє час виходу у стрілку в однорічних, дворічних і яровизованих дворічних рослин, вирощених у різних умовах фотоперіодизму. Умови КД означають 10 год. світла/14 год. темряви. Умови ДД означають 16 год. світла/8 год. темряви. Час виходу у стрілку вимірюють, ґрунтуючись на загальному числі листя від 6 незалежних рослин. Фіг. 12 представляє відносну експресію BvFT1 і BvFT2 в однорічних рослин протягом 72 год. Перші 24 год. складаються з 10 год. світла/14 год. темряви, потім протягом 48 год. висвітлення міняють на 16 год. світла/8 год. темряви. Рівні ампліконів, що виявляються, нормалізують для ампліфікації продуктів, які відповідають гену BvICDH. Базові координати представляють середню величину трьох біологічних повторів. Фіг. 13 представляє вплив ектопічної експресії генів BvFT1 і BvFT2 на час цвітіння в Arabidopsis. (A) – фенотип 30-добових рослин Arabidopsis дикого типу (Col-0) і трансгенних рослин Arabidopsis, що експресують BvFT1 і BvFT2, вирощених в умовах ДД. (Б) - фенотип 20добових мутантів ft-10 і трансгенних мутантів ft-10, що експресують BvFT2, вирощених в умовах ДД (16 год. світла/8 год. темряви). Фіг. 14 представляє картування специфічної дії BvFT1 і BvFT2 на сегмент B екзона 4, що кодує зовнішню петлю білків PEBP. (A) – структура різних химер, які використовують у даному дослідженні, та їх вплив на час цвітіння в Arabidopsis. Екзонні частини генів BvFT1 і BvFT2 показані чорними й білими прямокутниками, відповідно. BvFT1112 (SEQ ID No. 29) представляють химеру, в якій екзони 1, 2 і 3 з BvFT1 і екзон 4 з BvFT2. BvFT2221 (SEQ ID No. 30) представляють химеру, в якій екзони 1, 2 і 3 з BvFT2, а екзон 4 з BvFT1. BvFT1E4B2 (SEQ ID No. 31) представляють химеру, засновану на BvFT1, в якій сегмент B екзона 4 походить з BvFT2. BvFT2E4B1 (SEQ ID No. 32) представляють химеру, засновану на BvFT2, в якій сегмент B екзона 4 походить з BvFT1. (Б) – час цвітіння рослин Arabidopsis, що експресують BvFT1, BvFT2 або химери BvFT1/BvFT2. Рослини T1 вирощують в умовах ДД. Число листя представлене у вигляді середньої величини щонайменше з 15 незалежних рослин T1 ± стандартне відхилення. Фіг. 15 представляє плазмідну карту бінарного вектора pHiNK525 (SEQ ID No. 33), що несе РНКі генну касету для BvFT2 під контролем конститутивного промотору UBQ3 з Arabidopsis у комбінації з селективним маркером PMI. Фіг. 16 представляє вплив супресії гена BvFT2 на час виходу у стрілку в однорічного цукрового буряка T0, вирощеного в умовах індукції виходу у стрілку (18ºC; 18 год. світла/ 6 год. темряви). (A) - фенотип нетрансгенної однорічної лінії й трансгенної однорічної рослини BvFT2 длРНКi. (Б) - фенотип відсутності виходу у стрілку, однорічна трансгенна рослина BvFT2 длРНКі у віці 400 діб. Фіг. 17 представляє вплив супресії гена BvFT2 на час виходу у стрілку в однорічного цукрового буряка T1, вирощеного в умовах індукції виходу у стрілку (18ºC; 18 год. світла/ 6 год. темряви). Три рослини з виходом у стрілку ліворуч не є трансгенними рослинами (НT), а три рослини без виходу у стрілку є рослинами BvFT2 длРНКі (подія 2A). Фотографія зроблена на 36 добу експерименту. Фіг. 18 представляє плазмідну карту бінарного вектора Ubi3:BvFT1 (SEQ ID No. 34), що несе генну касету Ubi3:BvFT1 для BvFT1 у комбінації з геном селективного маркера PMI під контролем промотору superMAS. Фіг. 19 представляє відносну експресію BvFT1 у коріннях PMI-позитивної рослини T0, що несе генну касету Ubi3:BvFT1. Рівні виявлених ампліконів нормалізують за продуктами ампліфікації, які відповідають гену BvICDH. Дані по нетрансгенній контрольній рослині T0 представляють середню величину трьох біологічних повторів. Фіг. 20 представляє плазмідну карту бінарного вектора pHiNK498 (SEQ ID No. 53), що несе ген селективного маркера PMI донизу за ланцюгом від промотору pOp6 і об'єднаного з генною касетою для конститутивної експресії LhG4Ato під контролем промотору Ubi3 з Arabidopsis. Фіг. 21 представляє плазмідну карту бінарного вектора (SEQ ID No. 54), що несе інвертований повтор, також присутній у pHiNK525 (див. приклад 7), донизу за ланцюгом від фрагмента промотору pOp6 і об'єднаний з геном селективного маркера PMI під контролем промотору SuperMAS. Фіг. 22 представляє плазмідну карту бінарного вектора (SEQ ID No. 55), що несе кодуючу область повної довжини BvFT1 донизу за ланцюгом від фрагмента промотору pOp6 і об'єднаний з геном селективного маркера PMI під контролем промотору SuperMAS. Послідовності SEQ ID No: 1 представляє нуклеотидну послідовність виродженого праймера HiNK581. 7 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID No: 2 представляє нуклеотидну послідовність виродженого праймера HiNK860. SEQ ID No: 3 представляє фрагмент гена FT1 цукрового буряка (називається фрагментом BvFT1), отриманий у реакції ПЛР, використовуючи вироджені праймери відповідно до опису у прикладі 1. SEQ ID No: 4 представляє фрагмент гена FT2 цукрового буряка (називається фрагментом BvFT2), отриманий у реакції ПЛР, використовуючи вироджені праймери відповідно до опису у прикладі 1. SEQ ID No: 5 представляє геномну послідовність гена FT1 цукрового буряка, отриману секвенуванням BAC SBA066-G04. SEQ ID No: 6 представляє відповідну кодуючу послідовність гена FT1 цукрового буряка, показану у SEQ ID No: 5. SEQ ID No: 7 представляє білкову послідовність білка, що кодує кодуючою послідовністю цукрового буряка FT1, представленою у вигляді SEQ ID NO: 6. SEQ ID No: 8 представляє геномну послідовність гена FT2 цукрового буряка, отриману секвенуванням BAC SBA077-N02. SEQ ID No: 9 представляє відповідну кодуючу послідовність гена FT2 цукрового буряка, показану у SEQ ID No: 8. SEQ ID No: 10 представляє послідовність білка, що кодує послідовністю гена FT2 цукрового буряка, представленою у вигляді SEQ ID NO: 9. SEQ ID No: 11 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера SELA3770 для BvFT1. SEQ ID No: 12 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера SELA3771 для BvFT1. SEQ ID No: 13 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера SELA3776 для BvFT2. SEQ ID No: 14 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера SELA3777 для BvFT2. SEQ ID No: 15 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера SELA 4259 для FT1(T1). SEQ ID No: 16 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера SELA4260 для FT1(T1). SEQ ID No: 17 представляє нуклеотидну послідовність SELA4261 зонда №1 для FT1(T1). SEQ ID No: 18 представляє нуклеотидну послідовність SELA4262 зонда №2 для FT1(T1). SEQ ID No: 19 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера SELA4263 для FT2(T1). SEQ ID No: 20 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера SELA4264 для FT2(T1). SEQ ID No: 21 представляє нуклеотидну послідовність SELA4265 зонда №1 для FT2(T1). SEQ ID No: 22 представляє нуклеотидну послідовність SELA4266 зонда №2 для FT2(T1). SEQ ID No: 23 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера SELA3730 для BvFT1. SEQ ID No: 24 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера SELA3731 для BvFT1. SEQ ID No: 25 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера SELA3732 для BvFT2. SEQ ID No: 26 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера SELA3733 для BvFT2. SEQ ID No: 27 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера SELA3724 для гена бета-ізоцитратдегідрогенази BvICDH1. SEQ ID No: 28 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера SELA3725 для гена бета-ізоцитратдегідрогенази BvICDH1. SEQ ID No: 29 представляє послідовність химерного гена, позначеного BvFT1112. SEQ ID No: 30 представляє послідовність генної химери, позначеної BvFT2221. SEQ ID No: 31 представляє послідовність генної химери, позначеної BvFT1E4B2. SEQ ID No: 32 представляє послідовність генної химери, позначеної BvFT2E4B1. SEQ ID No: 33 представляє нуклеотидну послідовність бінарного вектора pHiNK525, що несе касету експресії, яка включає інвертований повтор екзона 4 гена BvFT2. SEQ ID No: 34 представляє нуклеотидну послідовність бінарного вектора 17602 (Ubi3:BvFT1), що несе касету експресії, яка включає кодуючу послідовність BvFT1 під контролем конститутивного промотору. 8 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID No: 35 представляє нуклеотидну послідовність 3' RACE адаптера, який використовують у реакції зворотної транскриптази. SEQ ID No: 36 представляє нуклеотидну послідовність 3' RACE зовнішній праймер. SEQ ID No: 37 представляє нуклеотидну послідовність 3' RACE внутрішній праймер. SEQ ID No: 38 представляє нуклеотидну послідовність прямого праймера HiNK6371 для BvFT1. SEQ ID No: 39 представляє нуклеотидну послідовність зворотнього праймера HiNK6372 для BvFT1. SEQ ID No: 40 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK529. SEQ ID No: 41 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6373 для BvFT1. SEQ ID No: 42 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6374 для BvFT1. SEQ ID No: 43 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6375 для BvFT1. SEQ ID No: 44 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6382 для BvFT2. SEQ ID No: 45 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6384 для BvFT2. SEQ ID No: 46 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6383 для BvFT2. SEQ ID No: 47 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6385 для BvFT2. SEQ ID No: 48 представляє нуклеотидну послідовність праймера HiNK6386 для BvFT2. SEQ ID No: 49 представляє амінокислотну послідовність амінокислотного мотиву "KPRVEIGG", локалізованого в екзоні 1 (амінокислотні залишки з 51 по 58) гена Arabidopsis FT. SEQ ID No: 50 представляє амінокислотну послідовність амінокислотного мотиву "LVTDIPATT" (амінокислотні залишки з 89 пo 98) в екзоні 3 відразу донизу за ланцюгом від сайту сплайсування інтрона 2 гена FT Arabidopsis. SEQ ID No: 51 представляє нуклеотидну послідовність праймера SELA267 для PMI. SEQ ID No: 52 представляє нуклеотидну послідовність праймера SELA 268 для PMI. SEQ ID No: 53 представляє нуклеотидну послідовність бінарного вектора pHiNK498, що несе касету експресії, яка включає ген селективного маркера PMI донизу за ланцюгом від промотору pOp6 і об'єднаний з генною касетою для конститутивної експресії LhG4Ato під контролем промотору Ubi3 з Arabidopsis. SEQ ID No: 54 представляє нуклеотидну послідовність бінарного вектора, що несе касету експресії, яка включає інвертований повтор, також присутній у pHiNK525 (див. приклад 7) донизу за ланцюгом від фрагмента промотору pOp6 і об'єднаний з геном селективного маркера PMI під контролем промотору SuperMAS. SEQ ID No: 55 представляє нуклеотидну послідовність бінарного вектора, що несе касету експресії, яка включає кодуючу область повної довжини гена BvFT1 донизу за ланцюгом від фрагмента промотору pOp6 і об'єднану з геном селективного маркера PMI під контролем промотору SuperMAS. Визначення Технічні терміни й вираження, які використовуються у рамках даного винаходу, у цілому мають значення, звичайно застосовувані в області рослинництва, якщо у даному винаході нижче не зазначено інше. У даному описі й у формулі винаходу мається на увазі, що поняття у формі однини також означають множину, якщо з контексту даного винаходу чітко не випливає інше. Наприклад, поняття "рослина" відноситься до однієї або декількох рослин, а поняття "клітина" включає суміш клітин, тканин тощо. Поняття "цукровий буряк" відноситься до всіх видів і підвидів роду Beta, а також до всіх типів культивованих представників виду Beta vulgaris. Культивований буряк розділяють на чотири групи: листовий буряк, садовий буряк, кормовий буряк і цукровий буряк. "Цукровий буряк" також відноситься до всіх культивованих типів буряка, включаючи вирощений для інших потреб буряк, а не для одержання цукру, наприклад, для одержання етанолу, пластику або інших промислових продуктів. Зокрема, поняття "цукровий буряк" відноситься до кормового буряка й до цукрового буряка, але особливо до цукрового буряка. Цей термін також включає рослини цукрового буряка, адаптовані для росту у тропічних або субтропічних регіонах. Поняття "дворічний цукровий буряк" відноситься до рослини цукрового буряка, в якої повний біологічний життєвий цикл становить два роки. Поняття "однорічний цукровий буряк" відноситься до рослини цукрового буряка, що проростає, цвіте й гине за один рік. Поняття "виходу у стрілку" відноситься до переходу від стадії вегетативної розетки до стадії цвітіння й репродуктивного росту. Поняття "створення стійкості до виходу у стрілку" у контексті даного винаходу відноситься до модулювання експресії генів FT Beta vulgaris у цукровому буряку методами генної інженерії. Такі сконструйовані рослини цукрового буряка показують фенотип стійкості до виходу у стрілку, 9 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в якого реакція виходу у стрілку у відповідь на яровизацію затримується або повністю придушується. У рослин цукрового буряка зі стійкістю до виходу у стрілку також відсутнє цвітіння (тобто у них проявляється стійкість до цвітіння), оскільки без виходу у стрілку у нормі не формуються квітки. Поняття "затримка реакції виходу у стрілку" або у короткому вираженні "затримка виходу у стрілку" у контексті даного винаходу означає модулювання природної реакції виходу у стрілку у рослин цукрового буряка у відповідь на яровизацію. У рослин цукрового буряка з затримкою виходу у стрілку (тобто рослини зі стійкістю до виходу у стрілку), подовження стебла, що служить показником першої видимої стадії виходу у стрілку, починається пізніше, ніж у рослин дикого типу. Реакція виходу у стрілку може бути відкладена всього лише на декілька діб (тобто, наприклад, на 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 або 14 діб) і до декількох тижнів (тобто на 2, 3, 4, 5, 6, 7 або 8 тижнів) або декількох місяців (тобто 1, 2, 3, 5 або 6 місяців). Затримка виходу у стрілку також може привести до повного придушення відповіді у вигляді виходу у стрілку; такі рослини не виходять у стрілку після яровизації й проявляють фенотип відсутності виходу у стрілку, при якому триває вегетативний ріст. Поняття "яровизація" відноситься до процесу, за допомогою якого індукція цвітіння у деяких рослин індукується шляхом впливу на рослини холоду протягом певного періоду часу. У контексті даного винаходу поняття "фенотипова особливість" відноситься до зовнішньої ознаки або іншої характеристики індивідуума, що виявляється, яка виникає з взаємодії його геному з навколишнім середовищем. Поняття "фенотип" у контексті даного винаходу відноситься до відмітної властивості (властивостей) генетично контрольованої ознаки. Поняття "кодуюча послідовність" означає послідовність нуклеїнової кислоти, що транскрибується у РНК, наприклад, іРНК, рРНК, тРНК, малі ядерні РНК (мяРНК), змістову РНК або антизмістову РНК. Переважно РНК потім транслюється в організмі для вироблення білка. Вона може становити "безперервну кодуючу послідовність", тобто втратити інтрон, наприклад, у кДНК, або вона може включати один або декілька інтронів, зв'язаних сплайсованих сполук. Поняття "інтрон" означає послідовність РНК, що міститься у первинному транскрипті, але яка видаляється шляхом розщеплення й повторного лігування РНК у клітині для створення зрілої іРНК, що може бути трансльована у білок. Поняття "ген" означає область, локалізовану у геномі, яка за винятком вищезгаданої кодуючої послідовності нуклеїнової кислоти включає інші спочатку регуляторні послідовності нуклеїнової кислоти, відповідальні за контроль експресії, інакше кажучи, транскрипції й трансляції частини, що кодує. Ген також може включати інші 5' і 3' нетрансльовані послідовності й кінцеві послідовності. Також можуть бути присутніми додаткові елементи, наприклад, інтрони. Поняття "досліджуваний ген" відноситься до якого-небудь гена, що при переносі у рослину надає йому необхідну властивість або фенотип, наприклад, стійкість до антибіотика, стійкість до вірусу, стійкість до комах, стійкість до хвороб або стійкість до інших шкідників, переносимість гербіцидів, поліпшені харчові властивості, поліпшені експлуатаційні якості при виробничій діяльності або зміненій репродуктивній здатності. Поняття "генотип" у контексті даного винаходу відноситься до генетичного матеріалу, успадкованому від батьківських рослин цукрового буряка, що не повною мірою може експресуватися у наступних поколіннях рослин цукрового буряка. Генотип відноситься до гетерологічного генетичного матеріалу, фланкованого інсертованою послідовністю. Поняття "полінуклеотидний" у такий спосіб відноситься до полімеру ДНК або РНА. Поняття "нуклеїнова кислота" відноситься до дезоксирибонуклеотидів і рибонуклеотидів і їх полімерів, які можуть бути одно- і дволанцюговими, що необов'язково містять синтетичні, неприродні або змінені нуклеотидні основи, які можуть бути інкорпоровані у полімери ДНК або РНК, що складаються з мономерів (нуклеотидів), що містять цукор, фосфат і основу, що є пурином або піримідином. Незважаючи на специфічні обмеження, поняття охоплює нуклеїнові кислоти, що містять відомі аналоги природних нуклеотидів, які мають схожі єднальні властивості з контрольною нуклеїновою кислотою й метаболізуються подібним чином із природними нуклеотидами. Якщо не зазначено інакше, певна послідовність нуклеїнової кислоти також повністю охоплює її консервативно модифіковані варіанти (наприклад, заміщення вироджених кодонів), комплементарні послідовності й чітко зазначені послідовності. Конкретно вироджені заміщення кодонів можуть бути досягнуті шляхом вироблення послідовностей, в яких третє положення одного або декількох вибраних (або всіх) кодонів заміщене змішаною основою й/або дезоксіінозиновими залишками (Batzer та ін., 1991; Ohtsuka та ін., 1985; Rossolini та ін., 1994). Поняття "фрагмент нуклеїнової кислоти" є фракцією даної молекулою нуклеїнової кислоти. У вищих рослин дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) є генетичним матеріалом, хоча 10 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рибонуклеїнова кислота (РНК) залучена у перенос інформації, що міститься у ДНК, на білки. Поняття "нуклеотидна послідовність" або "послідовність нуклеїнової кислоти" відноситься до полімеру ДНК або РНК, які можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими, що необов'язково містять синтетичні, неприродні або змінені нуклеотидні основи, здатні інкорпоруватися у полімери ДНК або РНК. Поняття "нуклеїнова кислота" або "послідовність нуклеїнової кислоти" також можуть застосовуватися взаємозамінно з геном, кДНК, ДНК і РНК, що кодується геном. Поняття "виділена", яке використовується у контексті молекул нуклеїнових кислот за даним винаходом, відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти, яку ідентифікували й виділили/відокремили від навколишньої послідовності хромосомальної нуклеїнової кислоти у відповідному організмі-джерелі. Виділена нуклеїнова кислота не є тією нуклеїновою кислотою, що існує у природі, якщо вона має природний аналог. Навпроти, невиділеними нуклеїновими кислотами є нуклеїнові кислоти, наприклад, ДНК і РНК, які виявлені у тому стані, в якому вони існують у природі. Наприклад, дана послідовність ДНК (наприклад, ген) виявлена у хромосомі клітини-хазяїна поруч із сусідніми генами. Послідовність виділеної нуклеїнової кислоти може бути в одноланцюговій або дволанцюговій формі. В іншому варіанті вона може містити й змістовий, і антизмістовий ланцюг (тобто, послідовність нуклеїнової кислоти може бути дволанцюговою). У кращому варіанті здійснення даного винаходу мається на увазі, що молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом є виділеними. Поняття "гетерологічний" стосовно до гена або нуклеїнової кислоти означає ген, що кодує фактор, який перебуває у неприродньому для нього середовищі (тобто, змінений зусиллями людини). Наприклад, гетерологічний ген може включати ген одного виду, впроваджений в інший вид. Гетерологічний ген також може включати ген, нативний для організму, що був змінений деяким чином (наприклад, мутований, доданий у вигляді багатьох копій, пов'язаний з промотором, що не є нативним, або з енхансерною послідовністю тощо). Гетерологічні гени додатково можуть включати послідовності гена рослини, які включають форми кДНК гена рослини; послідовності кДНК можуть експресуватися у змістовій (для одержання іРНК) або в антизмістовій орієнтації (для одержання транскрипта антизмістової РНК, комплементарної транскрипту іРНК). В одному з об'єктів даного винаходу гетерологічні гени відрізняються від ендогенних генів рослин тим, що послідовності гетерологічного гена звичайно з'єднані з нуклеотидними послідовностями, включаючи регуляторні елементи, наприклад, промотори, які у природі не виявлені асоційованими з геном білка, що кодується гетерологічним геном або з послідовностями генів рослин у хромосомі, або асоційованими з частинами хромосоми, не знайденими у природі (наприклад, гени, що експресуються у локусах, в яких гени у нормі не експресуються). Крім того, "гетерологічна" нуклеотидна послідовність є нуклеотидною послідовністю, що природно не асоційована з клітиною-хазяїном, у яку вона інтродукована, включаючи неприродні множинні копії природних послідовностей нуклеїнової кислоти. Поняття "гомологічна" нуклеотидна послідовність означає нуклеотидну послідовність, у нормі пов'язану з клітиною-хазяїном, у яку вона інтродукована. Поняття "химерна конструкція" у контексті даного винаходу відноситься до конструкції двох або декількох послідовностей нуклеїнової кислоти різного походження, зібраних в одну молекулу нуклеїнової кислоти. Поняття "химерна конструкція" відноситься до якої-небудь конструкції, що містить (1) послідовності ДНК, включаючи регуляторні й кодуючі послідовності, які не зустрічаються разом у природі (тобто щонайменше одна з нуклеотидних послідовностей гетерологічна відносно щонайменше однієї з інших нуклеотидних послідовностей), або (2) послідовності, що кодують частини білків, які у природі не граничать один з одним, або (3) частини промоторів, які у природі не граничать один з одним. Крім того, химерна конструкція може включати регуляторні послідовності й кодуючі послідовності, які походять з різних джерел, або включати регуляторні послідовності й кодуючі послідовності, які відбуваються з одного джерела, але зібрані іншим способом, відмінним від природного. У кращому об'єкті за даним винаходом химерна конструкція включає касету експресії, що містить послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом під контролем регуляторних елементів, зокрема під контролем регуляторних елементів, що функціонують у рослинах. Поняття "касета експресії" у контексті даного винаходу означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну направляти експресію певної нуклеотидної послідовності або послідовностей у відповідній клітині-хазяїні, що включає промотор, оперативно пов'язаний з нуклеотидними послідовностями або досліджуваними послідовностями, які оперативно пов'язані з сигналами термінації. Касета експресії звичайно включає послідовності, необхідні для належної трансляції нуклеотидної послідовності (послідовностей). Касета експресії також може включати послідовності, що не є необхідними для прямої експресії досліджуваної нуклеотидної 11 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовності, але які містяться за відповідними сайтами рестрикції для видалення касети з вектора експресії. Касета експресії, що включає досліджувану нуклеотидну послідовність (послідовності), може бути химерною, що означає, що принаймні один з її компонентів є гетерологічним у відношенні щонайменше одного з інших компонентів. Касета експресії також може бути природною, але отриманою у рекомбінантній формі, придатній для гетерологічної експресії. Однак звичайно касета експресії гетерологічна стосовно хазяїна, тобто певна послідовність нуклеїнової кислоти касети експресії не міститься природно у клітині-хазяїні й повинна бути інтродукована у клітину-хазяїна або у клітину - попередницю клітини-хазяїна за допомогою процесу трансформації, відомого у даній області. Експресія нуклеотидної послідовності (послідовностей) у касеті експресії звичайно перебуває під контролем промотору. У випадку багатоклітинного організму, наприклад, рослини, промотор може бути також специфічним для певної тканини або органа, або стадії розвитку. Касета експресії або її фрагмент також може бути названа "інсертованою послідовністю" або "послідовністю інсерції" після трансформації у рослину. Поняття "білок", "пептид" і "поліпептид" у даному винаході використовуються взаємозамінно. Поняття "промотор" відноситься до нуклеотидної послідовності, звичайно розташованої вище за ланцюгом (5') його послідовності, що кодує, яка контролює експресію кодучої послідовності, забезпечуючи розпізнавання для РНКполімерази й інших факторів, необхідних для правильної транскрипції. Поняття "конститутивний промотор" відноситься до промотору, що може експресувати відкриту рамку зчитування (open reading frame-ORF), яку він контролює у всіх або майже у всіх рослинних тканинах протягом всіх або майже всіх стадій розвитку рослини (так звана "конститутивна експресія"). Кожний з елементів активації транскрипції не проявляє абсолютної тканинноспецифічності, але опосередковує активацію транскрипції у більшості частин рослини на рівні 1 % від рівня, що досягається у тій частині рослини, в якій транскрипція найбільше активна. Поняття "регульований промотор" відноситься до промоторів, які направляють генну експресію не конститутивно, а тимчасово- і/або просторово-регульованим чином, і включає й тканинноспецифічні, та індуковані промотори. До них відносяться й природні, і синтетичні послідовності, а також послідовності, які можуть сполучити у собі синтетичні й природні послідовності. Різні промотори можуть направляти експресію гена у різних типах тканин або клітин, або на різних стадіях розвитку, або у відповідь на різні умови зовнішнього середовища. Поняття "тканинноспецифічний промотор" відноситься до регульованих промоторів, які не експресуються у клітинах рослин, а тільки в одному або декількох типах клітин у певних органах (наприклад, у листях або насіннях), певних тканинах (наприклад, ембріональних або у тканинах сім'ядоль), або у певних типах клітин (наприклад, у паренхімі листя або у клітинах, що запасають, насіння). До них також відносяться промотори, які регулюються тимчасово, наприклад, у ранньому або пізньому ембріогенезі, при дозріванні фруктів при розвитку насіння або фруктів, у повністю сформованих листях або на початку старіння. Поняття "індукований промотор" відноситься до тих регульованих промоторів, які можуть бути задіяні у клітинах одного або декількох типів під впливом зовнішніх стимулів, наприклад, хімічних стимулів, світла, гормону, стресу або патогену. Поняття "оперативно зв'язані" відноситься до асоціації послідовностей нуклеїнових кислот в одному фрагменті нуклеїнової кислоти таким чином, що функція однієї впливає на функцію іншої. Наприклад, промотор, оперативно пов'язаний з послідовністю, що кодує, або функціональною РНК, якщо він може впливати на експресію цієї послідовності, що кодує, або функціональної РНК (тобто, що кодуюча послідовність або функціональна РНК перебувають під контролем транскрипції промотором). Кодуючі послідовності у змістовій або антизмістовій орієнтації можуть бути оперативно пов'язані з регуляторними послідовностями. Поняття "праймери" у контексті даного винаходу відноситься до виділених нуклеїнових кислот, здатних вирівнюватися з комплементарним ланцюгом ДНК-мішені шляхом гібридизації нуклеїнової кислоти для формування гібриду між праймером і ланцюгом ДНК-мішені, потім стає протяжним за ланцюгом ДНК-мішені полімеразою, наприклад, ДНКполімеразою. Пари праймерів або їх сукупності можуть застосовуватися для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), або за допомогою інших методів ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти. У контексті даного винаходу поняття "полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)» відноситься до способу одержання відносно великих кількостей специфічних областей ДНК, тим самим роблячи здійсненним проведення різних аналізів, заснованих на цих областях. Поняття "праймер ПЛР" або "праймер" у контексті даного винаходу відноситься до коротких 12 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фрагментів виділеної одноланцюгової ДНК, яка використовується у ПЛР ампліфікації специфічних областей ДНК. Їх відпалюють з комплементарним ланцюгом ДНК-мішені шляхом гібридизації нуклеїнової кислоти для формування гібриду між праймером і ланцюгом ДНКмішені, і простягають за ланцюгом ДНК-мішені полімеразою, наприклад, ДНКполімеразою. Пари праймерів або їх сукупності можуть застосовуватися для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) або за допомогою інших відомих методів ампліфікації нуклеїнових кислот. Праймери звичайно містять від 10 до 15 нуклеотидів або більше у довжину. Праймери також можуть мати у довжину щонайменше 20 нуклеотидів або більше, або щонайменше 25 нуклеотидів або більше, або щонайменше 30 нуклеотидів або більше. Такі праймери гібридизуються специфічно з цільовою послідовністю в умовах гібридизації високої твердості. Праймери за даним винаходом можуть мати послідовність, повністю комплементарну цільовій послідовності. Варто враховувати, що довжина праймерів за даним винаходом може бути яким-небудь чисельним значенням, вибраним зі значень, описаних у даному винаході. Таким чином, праймери звичайно містять від 10 до 15 нуклеотидів або більше у довжину, включаючи праймери довжиною 10, 11, 12, 13, 14 або 15 нуклеотидів, оскільки експресія "щонайменше 20 нуклеотидів" додатково включає праймер довжиною у 16, 17, 18, 19 або більше нуклеотидів. Те ж застосовно для експресій "щонайменше 25 нуклеотидів або більше" і "щонайменше 30 нуклеотидів або більше" у довжину. У контексті даного винаходу поняття "ампліфікований" означає конструкцію з безлічі копій молекули нуклеїнової кислоти або безлічі копій комплементарної молекули нуклеїнової кислоти, використовуючи щонайменше одну з молекул нуклеїнової кислоти як матриця. Системи ампліфікації включають систему полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), систему лігазної ланцюгової реакції (ЛЛР), ампліфікацію на основі послідовності нуклеїнової кислоти (nucleic acid based sequence amplification – NASBA, фірма Cangene, Mississauga, Онтаріо), системи Q-бета реплікази, систему ампліфікації на основі транскрипції (transcription-based amplification system – TAS) і ампліфікацію шляхом витиснення ланцюга (strand displacement amplification – SDA). Див., наприклад, кн.: "Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications", Persing та ін., 1993, вид-во American Society for Microbiology, Вашингтон, округ Колумбія. Продукт ампліфікації називається ампліконом. Поняття "зонд" означає виділену нуклеїнову кислоту, до якої приєднана звичайна мітка, що виявляється, або репортерна молекула, наприклад, радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний агент або фермент. Такий зонд комплементарний ланцюгу цільової нуклеїнової кислоти. Зонди за даним винаходом включають не тільки дезоксирибонуклеїнову або рибонуклеїнову кислоти, але також поліаміди й інші матеріали зондів, які специфічно зв'язуються з послідовністю-мішенню ДНК і можуть застосовуватися для виявлення наявності такої послідовності-мішені ДНК. Праймери й зонди звичайно містять у довжину 10-15 нуклеотидів або більше. Праймери й зонди також можуть бути у довжину щонайменше з 20 нуклеотидів або більше, або щонайменше 25 нуклеотидів або більше, або щонайменше 30 нуклеотидів або більше. Такі праймери й зонди гібридизуються специфічно з послідовністю-мішенню у суворих умовах гібридизації. Праймери й зонди за даним винаходом можуть мати повну послідовність, комплементарну послідовності-мішені, хоча зонди, що відрізняються від послідовності-мішені й зберігають здатність гібридизуватися з послідовностями-мішенями, можуть бути сконструйовані традиційними методами. Варто враховувати, що довжина праймерів і зондів за даним винаходом може бути якою-небудь величиною з числа величин, зазначених у даному винаході. Таким чином, праймери й зонди, що звичайно складаються у довжину з 10-15 нуклеотидів або більше, включають праймер і зонди, довжиною 10, 11, 12, 13, 14 або 15 нуклеотидів, причому експресія "щонайменше 20 нуклеотидів" додатково включає праймер і зонди довжиною 16, 17, 18, 19 або більше нуклеотидів. Те ж застосовно до експресій "щонайменше 25 нуклеотидів або більше" і "щонайменше 30 нуклеотидів або більше" у довжину. Істотна ідентичність або гомологія у контексті двох послідовностей нуклеїнової кислоти або білка відноситься до двох або більше послідовностей або субпослідовностей, які ідентичні щонайменше на 60 %, переважно щонайменше на 80 %, більше переважно щонайменше на 90 %, ще більше переважно щонайменше на 95 %, і найбільше переважно щонайменше на 99 % нуклеотидній послідовності або амінокислотних залишків, при порівнянні й вирівнюванні на максимальну відповідність, що визначають, використовуючи один із наведених нижче алгоритмів порівняння послідовностей, або шляхом візуального аналізу. Зокрема, міцна ідентичність існує протягом областей послідовностей, що складаються щонайменше приблизно з 50 залишків у довжину, більше міцна ідентичність існує протягом областей послідовностей, що складаються щонайменше приблизно з 100 залишків, і особливо послідовності у високому 13 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ступені ідентичні протягом щонайменше приблизно 150 залишків. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу послідовності в істотному ступені ідентичні за всією довжиною областей, що кодують. Більше того, у значній мірі ідентичні послідовності нуклеїнової кислоти або білка проявляють у значній мірі ту ж функцію. Для порівняння послідовностей одна послідовність звичайно діє як контрольна послідовність, з якою порівнюють досліджувані послідовності. При використанні алгоритму порівняння послідовностей досліджувану й контрольну послідовності вводять у комп'ютер, координати субпослідовності при необхідності встановлюють і також установлюють параметри програми алгоритму послідовності. За допомогою алгоритму порівняння послідовностей потім розраховують відсоток ідентичності послідовностей для досліджуваної послідовності (послідовностей) щодо контрольної послідовності, ґрунтуючись на встановлених параметрах програми. Оптимальне вирівнювання послідовностей для порівняння може бути проведене, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології Smith & Waterman (1981), алгоритму вирівнювання гомології Needleman & Wunsch (1970), методу пошуку подібності Pearson & Lipman (1988), шляхом комп'ютерної реалізації цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA у Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Медісон, Вісконсін), або візуальним контролем (див. Ausubel та ін., нижче). Одним із прикладів алгоритму, що може бути використаний для визначення відсотка ідентичності послідовностей і подібності послідовностей, є алгоритм BLAST, що описаний Altschul та ін. (1990). Інший показник істотної ідентичності послідовностей двох нуклеїнових кислот полягає у тому, що дві молекули гібридизуються одна з одною у суворих умовах гібридизації. Поняття "суворі умови гібридизації" і "суворі умови гібридизації з промиванням" у контексті експериментів по гібридизації нуклеїнових кислот, наприклад, саузерн- і норзен-гібридизації, залежать від послідовностей і відрізняються при різних зовнішніх параметрах. Більше довгі послідовності гібридизуються специфічно при підвищених температурах. Докладний посібник із гібридизації нуклеїнових кислот приводиться у роботі Tijssen (1993). У контексті даного винаходу поняття "гібридизувати" відноситься до традиційних умов гібридизації, переважно до умов гібридизації, при яких використовують 5×SSPE, 1 % SDS, 1×розчин Денхарда як розчин і/або температуру для гібридизації від 35 °C до 70 °C, переважно 65 °C. Після гібридизації переважно проводять промивання спочатку за допомогою 2×SSC, 1 % SDS і потім за допомогою 0,2×SSC при температурі від 35 °C до 75 °C, особливо від 45 °C до 65 °C, але особливо при 59 °C (залежно від SSPE, SSC і розчину Денхарда; див. Sambrook та ін.). Умови гібридизації, особливо високої твердості, наприклад, описані Sambrook та ін, див. вище, особливо кращі. Особливо кращі суворі умови гібридизації, наприклад, якщо гібридизацію й промивання проводять при 65 °C, відповідно до зазначеного вище. Несуворі умови гібридизації, наприклад, з гібридизацією й промиванням, проведені при 45 °C, є менше кращими, а при 35 °C ще менше кращими. Інший показник істотної ідентичності послідовностей двох нуклеїнових кислот або білків полягає у тому, що білок, який кодується першою нуклеїновою кислотою, імунологічно перехресно реактивний або специфічно зв'язується з білком, який кодується другою нуклеїновою кислотою. Таким чином, білок звичайно у значній мірі ідентичний другому білку, наприклад, якщо два білки відрізняються тільки консервативними заміщеннями. Поняття "трансформація" означає процес інтродукції гетерологічної нуклеїнової кислоти у клітину-хазяїна або в організм. Зокрема, поняття "трансформація" означає стабільну інтеграцію молекули ДНК у геном досліджуваного організму. Поняття "трансформований/трансгенний/рекомбінантний" відноситься до організму хазяїна, наприклад, бактерії або рослині, в якій гетерологічна молекула нуклеїнової кислоти була інтродукована. Молекула нуклеїнової кислоти може бути стабільно інтегрованою у геном хазяїна або у молекулу нуклеїнової кислоти, а також може бути представлена в якості позахромосомної молекули. Така позахромосомна молекула може бути самореплікованою. До трансформованих клітин, тканин або рослин також відносяться не тільки кінцеві продукти процесу трансформації, але і їхнє потомство. Поняття "нетрансформованого", "нетрансгенного" або "нерекомбінантного" хазяїна відноситься до організму дикого типу, наприклад, до бактерії або рослини, що не містить молекули гетерогенної нуклеїнової кислоти. Поняття трансгенна "подія" відноситься до рекомбінантної рослини, отриманої трансформацією й регенерацією однієї рослинної клітини гетерологічної ДНК, наприклад, касетою експресії, що включає досліджуваний ген. Поняття "подія" відноситься до первісного трансформанту й/або потомству трансформанту, які включають гетерологічну ДНК. Поняття "подія" також відноситься до потомства, отриманого у результаті статевого ауткросу між 14 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансформантом й іншою лінією цукрового буряка. Навіть після повторного зворотного схрещування з поворотним батьком інсертована ДНК і фланкуюча ДНК з трансформованого батька присутня у нащадків цього схрещування при тій же хромосомній локалізації. У нормі трансформація рослинної тканини приводить до безлічі подій, кожна з яких представляє інсерцію конструкції ДНК у різній локалізації у геном рослинної клітини. Ґрунтуючись на експресії трансгена або на інших необхідних властивостях, вибирають певну подію. Поняття "трансген" відноситься до гена, який інтродукований у геном організму шляхом генетичної маніпуляції для зміни цього генотипу. Трансгени можуть включати, наприклад, гени, які або гетерологічні, або гомологічні генам конкретної рослини, що піддається трансформації. Крім того, трансгени можуть включати нативні гени, інсертовані в організм, що не є нативним, або химерні гени. У контексті даного винаходу поняття "стекингу" гена або ознаки означає комбінування потрібних генів або ознак в одній лінії трансгенної рослини. Селекціонери збирають разом трансгенні ознаки шляхом схрещувань між батьками, з яких кожний несе необхідну ознаку, і наступної ідентифікації потомства, що має обидві необхідні ознаки (так зване "складування ознак схрещуванням"). Інший спосіб стекингу генів полягає у переносі двох або більше генів в ядро клітини рослини одночасно під час трансформації. Інший спосіб стекингу генів полягає у повторній трансформації трансгенної рослини іншим цільовим геном. Наприклад, стекинг генів може застосовуватися для комбінування двох різних ознак стійкості до комах і стійкості до захворювань або стійкості до гербіцидів (наприклад, Bt11). Застосування селективного маркера крім цільового гена також можна розглядати в якості генного стекингу. Поняття "трансгенна рослина" відноситься до якої-небудь рослини з однією або декількома рослинними клітинами, що містять вектор експресії. Поняття "рослина" відноситься до якої-небудь рослини або якої-небудь стадії розвитку, особливо до насінної рослини. Поняття "культивовані" відноситься до рослин певних видів, які вирощують на комерційній основі через їхні корисні властивості. Поняття "культивовані рослини" включає ті рослини, які були введені у культуру і які селективно розмножують для вирощування. До культивованих рослин відносяться ті види дикого типу, які включають ознаку за даним винаходом як природну ознаку й/або частини їх природних генетичних властивостей. Поняття "рослинна клітина" є структурною й фізіологічною одиницею рослини, що включає протопласт і клітинну стінку. Рослинна клітина може бути у формі виділеної однієї клітини або культивованої клітини, або може бути частиною більше високо організованої структури, наприклад, рослинної тканини, органа рослини або цілої рослини. Поняття "культура клітин рослин" означає культури одиниць рослин, наприклад, протопластів, клітин культур клітин, клітин у рослинних тканинах, пилок, пилкові трубки, насінні зачатки, оболонки зародкового мішка, зиготи й зародки на різних стадіях розвитку. Поняття "рослинний матеріал" відноситься до листя, стебел, коріння, квітів або частин квітів, фруктів, пилка, яйцеклітин, пильовиків, насінних зачатків, зигот, насіння, покрив, клітин і культур тканин, або яких-небудь інших частин або продуктів рослини. Це поняття також включає калюс або калюсну тканину, а також екстракти (наприклад, екстракти коренеплодів) або зразки. Звичайне поняття "рослинний матеріал" відноситься до відносно неопрацьованого рослинного матеріалу, що містить інтактні рослинні клітини. Поняття "орган рослини" означає певну й зорово структуровану й диференційовану частину рослини, наприклад, коріння, стебло, лист, бутон або зародок. Поняття "тканина рослини" у контексті даного винаходу означає групу рослинних клітин, організованих у структурну й функціональну одиницю. До цього поняття відноситься яка-небудь тканина рослини всередині рослини або у культурі. Це поняття також включає, але ними не обмежується, цілі рослини, органи рослин, насіння рослин, культури тканин і які-небудь групи рослинних клітин, організованих у структурні й/або функціональні одиниці. Застосування такого терміна разом зі згадуванням якого-небудь специфічного типу рослинної тканини, зазначеної вище, або без такого спільного згадування, або, по-іншому, охопленої цим визначенням, не є винятковим для якого-небудь іншого типу рослинних тканин. Поняття "інформаційна РНК" або "іРНК" відноситься до РНК, що не містить інтронів і з якої у результаті трансляції у клітині може бути отриманий білок. Поняття "кДНК" відноситься до одноланцюгової або дволанцюгової ДНК, що комплементарна іРНК і отримана з неї. Поняття "експресія" стосовно до послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, до гена, ORF або їх частини, або до трансгенної рослини, що відноситься до процесу конверсії генетичної інформації, закодованої у гені й у РНК (наприклад, іРНК, рРНК, тРНК або оцРНК), через 15 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "транскрипцію" гена (тобто, через ферментативну дію РНКполімерази) у білок, де це застосовно (наприклад, якщо ген кодує білок), через "трансляцію" іРНК. Генна експресія може регулюватися на багатьох стадіях процесу. Наприклад, у випадку антизмістових або длРНК конструкцій, відповідно, експресія може відноситися до транскрипції тільки антизмістової РНК або тільки длРНК. Крім того, експресія відноситься до транскрипції й стабільного накопичення змістової (іРНК) або функціональної РНК. Експресія також може відноситися до одержання білка. Поняття "зниження регуляції" відноситься до рівня експресії у трансгенних клітинах або організмах, що нижче рівнів експресії у нормальних або нетрансформованих (нетрансгенних) клітинах або організмах. Зокрема, "зниження регуляції" відноситься до зниження рівня білка й/або продукту іРНК від гена-мішені у діапазоні 20-100 %, особливо 40-80 %, більше переважно 50-90 %, ще більше переважно 60-95 %, але особливо переважно 75-100 %. Поняття "супресія" відноситься до відсутності білка й/або продукту іРНК від гена-мішені (тобто, повне зниження регуляції експресії гена-мішені). Наслідок супресії може бути підтверджений аналізом зовнішніх властивостей клітини або організму або методами біохімічного аналізу й виявлення генної експресії, відомими фахівцям у даній області. Наприклад, зниження регуляції й/або супресія експресії гена FT проявляється за відсутністю або відстрочкою відповіді на яровизацію у зростаючої рослини цукрового буряка. Поняття "надекспресія" або "підвищена регуляція" відносяться до рівня експресії у трансгенних клітинах або організмах, які перевищують рівні експресії у нормальних або нетрансформованих (нетрансгенних) клітинах або організмах. Зокрема, поняття "надекспресії" або "підвищеної регуляції" відносяться до підвищення рівня білка й/або продукту іРНК з генамішені на 20-100 %, особливо на 40-80 %, більше переважно на 50-90 %, ще більше переважно на 60-95 %, але особливо на 75-98 % і до 100 %. Поняття "спільна супресія" відноситься до трансгенного підходу для сайленсингу генної експресії, який також називають "зниженням регуляції змістової послідовності". При такому підході експресія цільового гена придушується експресією трансгенної послідовності, гомологічної цільовому гену через взаємодію нативної і трансгенної іРНК. Поняття "тілінгу" (або TILLING – Targeting-Induced Local Lesions IN Genomes – індуковане націлюванням локальне ушкодження геному) відноситься до нетрансгенного підходу для формування недіючих або нокаутних алелей певного цільового гена (McCallum та ін., 2000). Поняття "антизмістове придушення" відноситься до формування антизмістових транскриптів РНК, здатних придушувати експресію білка ендогенного гена або трансгена. Поняття "генний сайленсинг" відноситься до залежної від гомології супресії генів, трансгенів, або ендогенних генів ядра. Генний сайленсинг може бути транскрипціональним, якщо супресія відбувається через знижену транскрипцію уражених генів, або пост-транскрипціональним, якщо супресія відбувається через підвищений обмін (руйнування) видів РНК, які гомологічні ураженим генам. Генний сайленсинг включає індукований вірусом генний сайленсинг. Поняття "РНК інтерференції (РНКі)» відноситься до процесу специфічного відносно послідовності посттранскрипціонального сайленсингу генів у рослин і тварин, опосередкованому малими інтерферуючими РНК (міРНК), включаючи длРНК. Різні важливі поняття, наприклад, міРНК, молекула РНК-мішені, фермент дайсер або рибонуклеаза III, відомі фахівцям у даній області й повний опис цих понять та інших подань, застосовних для РНКі, можуть бути виявлені у літературі. Для порівняння, декілька понять, застосовних для РНКі, описані нижче. Однак очевидно, що яка-небудь певна гіпотеза, що описує механізми РНКі, не є необхідною для здійснення даного винаходу. Поняття "дволанцюгової РНК (длРНК)» означає РНК з двома комплементарними ланцюгами, що направляє специфічне для послідовності руйнування іРНК у ході процесу, називаного РНК інтерференцією (РНКі). Молекула длРНК нарізається на молекули малої інтерферуючоїРНК (міРНК), інтерферуючі з експресією певного гена. Поняття "інвертований повтор" відноситься до нуклеотидної послідовності, наявної у двох місцях однієї й тієї ж послідовності нуклеїнової кислоти, але у протилежній орієнтації. Абревіатура "міРНК" означає малі інтерферуючі РНК. У деяких варіантах здійснення даного винаходу міРНК включають дуплекс - дволанцюгову область, довжиною приблизно у 21-23 нуклеотиди; часто міРНК містять приблизно від двох до чотирьох непарних нуклеотидів з 3' кінці кожного ланцюга. Щонайменше один ланцюг дуплекса, або дволанцюгової області міРНК, в істотному ступені гомологічна або в істотному ступені комплементарна цільовій молекулі РНК. Ланцюг, комплементарний молекулі цільової РНК, є "антизмістовим ланцюгом"; ланцюг, гомологічний молекулі цільової РНК, є "змістовим ланцюгом" і комплементарний антизмістовому ланцюгу міРНК. Молекули міРНК також можуть містити додаткові послідовності; до необмежувальних прикладів таких послідовностей відносяться єднальні послідовності, або 16 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 петлі, а також стовбурні та інші структури, які піддаються укладанню. Молекули міРНК проявляються за дією в якості ключових інтермедіантів в індукції РНК інтерференції у безхребетних і хребетних, і в індукції специфічного за послідовністю руйнування РНК протягом посттранскрипційного генного сайленсингу у рослин. Поняття "цільова молекула РНК (молекула-мішень)» відноситься до молекули РНК, стосовно якої щонайменше один ланцюг короткої дволанцюгової області міРНК є гомологічною або комплементарною. Звичайно якщо така гомологія й комплементарність становить приблизно 100 %, міРНК здатна заглушити або придушити експресію цільової молекули РНК. Хоча вважають, що процесована іРНК є мішенню для міРНК, даний винахід не обмежується якою-небудь певною гіпотезою, і такі гіпотези не є необхідними у практиці даного винаходу. Таким чином, висловлюють припущення про те, що інші молекули РНК можуть також бути мішенями для міРНК. Такі молекули РНК включають непроцесовану іРНК, рибосомальну РНК і геноми РНК вірусів. Не є необхідним, щоб було 100 % гомології між молекулою цільової РНК і длРНК за всією довжиною длРНК, але шпильки длРНК можуть включати відрізки щонайменше з 21 нуклеотиду, переважно щонайменше з 23 нуклеотидів, більше переважно щонайменше з 50 нуклеотидів, ще більше переважно щонайменше з 500 нуклеотидів, найбільше переважно щонайменше з 700 нуклеотидів, і до 1000 нуклеотидів, що мають щонайменше 95 %, переважно 100 % гомологію з цільовою молекулою РНК. Поняття "РНК-індукуючий комплекс сайленсингу (RNA-inducing silencing complex – RISC)» опосередковує одноланцюгову РНК з послідовністю, комплементарною антизмістовим ланцюгам дуплекса міРНК. Розщеплення цільової РНК відбувається у середині області, комплементарної до антизмістового ланцюга дуплекса міРНК (Elbashir та ін., 2001). Поняття "в істотному ступені комплементарна" означає, що перший і другий ланцюги послідовності РНК, інтродукованої у клітини рослини, здатні в істотному ступені гібридизуватися або відпалювати РНК, утворену на гені-мішені (іРНК), в умовах, виявлених у цитоплазмі зазначених клітин рослин, таким чином, що індукується придушення експресії гена-мішені. Наприклад, послідовність першого або другого ланцюга послідовності РНК, що зв'язується з іРНК, утвореної на гені-мішені, щонайменше на 50 % ідентична послідовності відповідної іРНК гена-мішені, переважніше ідентична щонайменше на 70 %, ще більше бажано ідентична щонайменше на 90 % і ще більше бажано ідентична щонайменше на 95 %. Варто врахувати, що відсоток ідентичності між послідовностями першого й другого ланцюгів РНК та іРНК, утвореної на гені-мішені, перебуває у діапазоні між щонайменше 70 % ідентичності й щонайменше 95 % ідентичності, і може бути якою-небудь величиною у зазначеному діапазоні. Поняття "ферментація" у контексті даного винаходу відноситься до процесу трансформації органічної молекули в іншу молекулу, використовуючи мікроорганізм. Якщо не зазначено інакше, до поняття "ферментація" відносяться анаеробна й аеробна ферментації. Поняття "біопаливо" у контексті даного винаходу відноситься до якого-небудь палива, яке виробляється анаеробною або аеробною ферментацією рослинного матеріалу. Прикладом біопалива, отриманого шляхом аеробної ферментації, є біоетанол, і цей приклад не єдиний. Різні види біопалива можуть бути отримані анаеробною ферментацією, включаючи, але ними не обмежуючись, біогаз й/або біодизель. Способи аеробної й/або анаеробної ферментації відомі фахівцям у даній області. Поняття "цукор" відноситься до підданих ферментації моносахаридів, дисахаридів і трисахаридів, особливо до моно- і дисахаридів. Таким чином, цукри за даним винаходом включають, але ними не обмежуються, сахарозу, фруктозу, глюкозу, галактозу, мальтозу, лактозу й манозу. Поняття "біопластик" відноситься до пластику, одержуваному з біологічного джерела. "Біологічним джерелом" у цьому контексті є й пластики, одержувані безпосередньо у трансгенних рослинах, і пластики, одержувані з біомаси, наприклад, рослинного масла, крохмалю або цукру за допомогою хімічного процесу, або на хімічних заводах, або у мікроорганізмах. До поняття "біопластик" відносяться, але ними перелік не обмежується, пластики на основі крохмалю, полімасляної кислоти (ПМК), полі-3-гідробутирату (ПГБ), поліаміду 11 (ПА11), біопохідного поліетилену й біопластики, одержувані з генетично модифікованих організмів (наприклад, бактерій або рослин). Докладний опис винаходу Даний винахід описує нуклеотидні послідовності генів FT цукрового буряка (які також називають генами Beta FT), залученими у відповідь цукрового буряка на яровизацію, а також трансгенних рослин цукрового буряка, і способи модуляції стійкості цукрового буряка до виходу у стрілку шляхом супресії експресії гена FT у цукрового буряка. 17 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Культивований цукровий буряк (Beta vulgaris ssp. vulgaris L.) є дворічною рослиною, що формує коренеплід і листову розетку у перший рік. Подовження пагона (вихід у стрілку) і формування квітки починається після періоду низької температури. Така індукована холодом яровизація, що приводить рослини до виходу у стрілку, є неодмінною частиною повного життєвого циклу цукрового буряка. Подробиці яровизації та її впливу на дворічний цукровий буряк описані у літературі (наприклад, Jaggard та ін., 1983). Однак деталі генетичної основи відповіді на яровизацію й виходу у стрілку у цукрового буряка все ще в основному залишаються невстановленими. Зокрема, гени, що є ключовими факторами відповіді на яровизацію у цукрового буряка, дотепер не ідентифіковані. Функціональний аналіз, виконаний на модельному організмі Arabidopsis thaliana, дозволив виділити чотири різних метаболічних шляхи цвітіння (Levy & Dean, 1998). Ці чотири метаболічних шляхи можуть бути визначені за факторами навколишнього середовища, наприклад, метаболічний шлях фотоперіодизму й метаболічний шлях активування виходу у стрілку, або за вродженимисигналами розвитку, наприклад, метаболічний шлях автономної індукції й метаболічний шлях придушення цвітіння. У деяких видів на строки цвітіння в основному впливають зовнішні фактори, наприклад, фотоперіодизм, кількість/якість світла, яровизація й наявність води або живильних речовин. Один досліджуваний локус, ідентифікований у рослини Arabidopsis, називається локусом цвітіння (FLOWERING LOCUS T – FT). Цей локус був відкритий у природних екотипів пізнього цвітіння рослини Arabidopsis (Koorneef та ін., 1991). FT є низькомолекулярним білком з масою 23 кДа й гомологом фосфатидилетаноламін-єднальних білків, які також називаються білками інгібіторами RAFкінази (Kardailsky та ін., 1999; Kobayashi та ін., 1999). Для ідентифікації генів, залучених у вихід у стрілку у цукрового буряка у відповідь на яровизацію, даний винахід був зосереджений на ідентифікації ортолога гена FT з Arabidopsis у цукрового буряка. Консервативні нуклеотидні послідовності у послідовностях кДНК ортологів FT Arabidopsis (AtFT), Citrus (CiFT), пшениці (TaFT) і рису (OsHd3a) ідентифікують шляхом вирівнювання цих послідовностей (фіг. 1). Використовуючи вироджені праймери, що націлюють консервативний мотив амінокислотної послідовності "KPRVEIGG", локалізованої в екзоні 1 (амінокислотні залишки з 51 пo 58), за послідовністю білка FT з Arabidopsis, а також в екзоні 3 відразу донизу за ланцюгом від сайту сплайсингу інтрона 2, націлюючи мотив амінокислотної послідовності "LVTDIPATT" (амінокислотні залишки з 89 пo 98), ампліфікують два нуклеотидних фрагменти у реакції ПЛР, використовуючи загальну РНК, екстраговану з листя цукрового буряка, як матриця (див. приклад 1). Наступний аналіз послідовностей ампліфікованих фрагментів виявив два гомологи BvFT, що мають різні послідовності. Ці гомологи позначені фрагментом BvFT1 (SEQ ID NO: 3) і фрагментом BvFT2 (SEQ ID NO: 4), відповідно. Обидва у високому ступені гомологічні послідовності білка FT з Arabidopsis (фіг. 4 і 5). Ґрунтуючись на обох фрагментах, фрагменті BvFT1 і фрагменті BvFT2, відповідно, ідентифікують клони BAC, що включають ці послідовності й секвенують (див. приклад 1). Ґрунтуючись на вирівнюванні геномних послідовностей до обох фрагментів кДНК і на гомології послідовності до гена FT з Arabidopsis, прогнозують передбачувану структуру генів Beta FT, що включають інтрони й екзони (фіг. 2 і 3). Кодуюча послідовність і амінокислотна послідовність BvFT1 показані у вигляді SEQ ID NO: 6 і 7, відповідно. Кодуюча послідовність і амінокислотна послідовність BvFT2 представлені нижче у вигляді послідовностей SEQ ID NO: 9 і 10, відповідно. Вирівнювання амінокислотних послідовностей BvFT1 і BvFT2 повної довжини з білковою послідовністю FT з Arabidopsis додатково підтверджує сувору гомологію послідовності з ідентичністю 72 % і схожістю 82 % (для BvFT1) і з ідентичністю 75 % і схожістю 88 % (для BvFT2), відповідно (фіг. 4 і 5; приклад 1). Аналіз експресії зненацька показав протилежні варіанти експресії цих двох генів у листях цукрового буряка протягом різних стадій розвитку дворічних і однорічних рослин цукрового буряка (див. приклад 3). Транскрипти BvFT1 легко виявити у листях на ранніх вегетативних стадіях у дворічних рослин, але рівні експресії падають після яровизації й залишаються низькими при переході від вегетативної стадії до стадій репродуктивних, причому експресія гена BvFT2 різко підвищується перед проявом перших візуальних ознак виходу у стрілку. Таке підвищення експресії BvFT2, спостережуване перед цвітінням, дуже нагадує профіль експресії гена FT в Arabidopsis, отже, ген BvFT2 дійсно є ортологом гена FT цукрового буряка з Arabidopsis. Аналіз експресії цих генів протягом добового циклу з різними фотоперіодами (див. приклад 4) також підтверджує це припущення. З іншої сторони дослідження експресії у рослинах Arabidopsis, надекспресуючих області BvFT1, що кодують, (див. приклад 5), зненацька показали, що BvFT1 додатково діє на зразок AtTFL1 (Ratcliffe та ін., 1998) – інгібітора цвітіння в Arabidopsis. Це показує, що BvFT1 зненацька 18 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 діє більшою мірою подібно репресору, ніж промотору цвітіння, незважаючи на його кластерування у FT-подібним скарбом філогенетичного древа сімейства генів FT (фіг. 6). Ектопічна експресія BvFT2 в Arabidopsis, з іншого боку, приводить до фенотипу надзвичайно раннього цвітіння. Такі зазначені протилежні функції BvFT1 і BvFT2, тобто репресія цвітіння, обумовленої геном BvFT1, проти індукції цвітіння, обумовленої геном BvFT2, погодиться з їхніми протилежними профілями експресії, зненацька виявленими у цукрового буряка, відповідно до описаного вище. У даному винаході показано, що обидва гени FT у цукрового буряка мають профілі експресії, які активно регулюються залежно від стадії розвитку рослини з у високому ступені протилежними профілями експресії й додатково відіграють ключову роль у відповіді цукрового буряка на яровизацію. Таким чином, обидва гени використовують для конструювання стійкості до виходу у стрілку у рослин цукрового буряка шляхом затримки або придушення відповіді на яровизацію. Перший об'єкт даного винаходу відноситься до послідовностей нуклеїнової кислоти генів FT з Beta vulgaris, які по ідентичності щонайменше на 70 % збігаються з послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот, представлених нижче у вигляді SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9, або які включають щонайменше 15 послідовних нуклеотидів послідовності нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот, представлених нижче у вигляді SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9, або які гібридизуються у суворих умовах з послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот, представлених нижче у вигляді SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9. Переважно послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом є виділеною нуклеїновою кислотою. У кращому варіанті здійснення даного винаходу послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом мають ідентичність щонайменше на 70 %, переважно щонайменше на 80 %, більше переважно щонайменше на 85 %, ще більше переважно щонайменше на 90 %, ще більше переважно щонайменше на 95 % і найбільше переважно щонайменше на 98 % з послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот, представлених нижче у вигляді SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9. З приводу ідентичності послідовностей очевидно, що у даному винаході всі окремі чисельні значення, що попадають у заявлені діапазони, також можуть бути відбиті у даному винаході. Наприклад, експресія "щонайменше на 70 %», зазначена вище, означає також експресію на 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, а експресія "щонайменше на 80 %», зазначена вище, означає також експресію на 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %. Той же підхід застосовний до позначення експресій "щонайменше на 85 %», "щонайменше на 90 %», "щонайменше на 95 %» і "щонайменше на 98 %». У кращому варіанті здійснення даного винаходу послідовності нуклеїнових кислот за даним винаходом включають щонайменше 20, переважно щонайменше 25, більше переважно щонайменше 35, ще більше переважно щонайменше 50, ще більше переважно щонайменше 75, і найбільше переважно щонайменше 100 дотичних нуклеотидів у послідовності якої-небудь нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнової кислоти, представлених нижче у вигляді SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9. Варто враховувати, що у даному винаході поняття "щонайменше з x нуклеотидів" охоплює молекули нуклеїнової кислоти, що мають яке-небудь чисельне значення, починаючи з х і вище. Наприклад, поняття "щонайменше з 15 нуклеотидів" означає молекули нуклеїнової кислоти, що містять 15, 16, 17, 18, 19, 20 і більше нуклеотидів в якій-небудь з нуклеотидних послідовностей, представлених нижче у вигляді SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9. Подібним чином поняття "щонайменше з 20 нуклеотидів" відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що складається з 21, 22, 23, 24, 25, 26 і більше нуклеотидів, наявних у послідовності нуклеїнової кислоти, представлених нижче у вигляді SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9. Той же підхід застосовний до інших діапазонів, зазначених вище. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу послідовність нуклеїнової кислоти за даним винаходом, описана вище, гібридизується у суворих умовах, більше переважно у високому ступені суворих умовах, з якою-небудь послідовністю нуклеїнової кислоти, вибраної з групи послідовностей нуклеїнових кислот SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу нуклеїнова кислота за даним винаходом представляє одну зі зазначених нижче послідовностей SEQ ID NO: 5, 6, 8 або 9 і комплементарні ним послідовності. Послідовності нуклеїнових кислот за даним винаходом, включаючи які-небудь відповідні 19 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антизмістові конструкції, можуть бути оперативно пов'язані з яким-небудь промотором, що функціонує у рослині-хазяїні, включаючи промоторні послідовності, описані у даному винаході нижче або їхні мутанти. У даному винаході додатково передбачені поліпептиди, які кодовані послідовностями нуклеїнових кислот за даним винаходом, описаними вище. У кращому варіанті здійснення даного винаходу поліпептид за даним винаходом має амінокислотну послідовність, вибрану з представленої нижче групи амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 7 або 10. Модуляція експресії нуклеїнових кислот за даним винаходом приводить до стійкості до виходу у стрілку у цукрового буряка, особливо при експресії у трансгенній рослині, наприклад, у трансгенній рослині цукрового буряка (див, наприклад, приклади 7 і 8). В іншому об'єкті нуклеотидні послідовності за даним винаходом можуть у такий спосіб використовуватися для трансгенного підходу до одержання трансгенних рослин цукрового буряка, що включають зазначені полінуклеотиди, стабільно інтегровані у геном цукрового буряка. Зокрема при експресії геному продукт експресії може застосовуватися для створення стійкості до виходу у стрілку шляхом модулювання відповіді на яровизацію рослини цукрового буряка. Ґрунтуючись на протилежних профілях експресії, зазначених вище, це може бути досягнуто або придушенням, або зниженням регуляції експресії гена BvFT2 або шляхом підвищення експресії гена BvFT1, або комбінацією обох. В іншому об'єкті нуклеотидні послідовності за даним винаходом зібрані у химерні конструкції, які містять послідовність нуклеїнової кислоти для експресії у трансгенній рослині під контролем регуляторних елементів, переважно під контролем регуляторних елементів, що функціонують у рослинах. Способи складання таких химерних конструкцій відомі фахівцям у даній області. Химерні конструкції за даним винаходом є послідовністю нуклеїнової кислоти, здатної до прямої експресії певної нуклеотидної послідовності (тобто нуклеотидних послідовностей за даним винаходом) у відповідних клітинах-хазяїнах, наприклад, рослинних клітинах. Експресія нуклеотидних послідовностей, включених у химерні конструкції за даним винаходом, приводять у цукрового буряка до модуляції експресії BvFT1 і/або BvFT2, у такий спосіб підтверджуючи стійкість до виходу у стрілку за рахунок відкладення або супресії відповіді на яровизацію. У химерних конструкціях за даним винаходом нуклеїнові кислоти переважно включені у касети експресії, що включають регуляторні елементи для експресії нуклеотидних послідовностей у клітинах-хазяїнах, здатних експресувати нуклеотидні послідовності. До таких регуляторних елементів звичайно відносяться промотор і сигнали термінації, а також переважно елементи, що допускають ефективну трансляцію поліпептидів, які кодуються нуклеїновими кислотами за даним винаходом. Химерні конструкції за даним винаходом, що включають нуклеїнові кислоти за даним винаходом, здатні реплікуватися у певних клітинах-хазяїнах, переважно в якості позахромосомних молекул, і тому їх використовують для ампліфікації нуклеїнових кислот за даним винаходом у клітинах-хазяїнах. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу такі химерні конструкції є вірусними векторами й використовуються для реплікації нуклеотидних послідовностей у певних клітинах-хазяїнах, наприклад, у клітинах рослин. Рекомбінантні вектори також використовують для трансформації нуклеотидних послідовностей за даним винаходом у клітинах-хазяїнах, у результаті чого нуклеотидні послідовності є стабільно інтегрованими у ДНК трансгенного хазяїна. В одному з кращих варіантів здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом додатково включає ген селективного маркера, що дозволяє проводити розмежування між трансформованим і нетрансформованим рослинним матеріалом у процесі добору. Гени маркерів, які можна використовувати для добору, і їхнє застосування відомі фахівцям у даній області. Передбачена химерна конструкція в якості одного з об'єктів за даним винаходом для трансгенного зниження регуляції або придушення експресії ендогенного гена BvFT2 у цукрового буряка. Зниження регуляції або придушення експресії BvFT2 приводить до затримки відповіді на яровизацію у зростаючої рослини цукрового буряка або викликає у рослини цукрового буряка формування фенотипу з відсутністю виходу у стрілку, що означає, що рослина цукрового буряка більше не відповідає на період звичайної яровизації тривалістю 18 тижнів виходом у стрілку й наступне цвітіння, а навпроти продовжує вегетативний ріст (без виходу у стрілку) і розвиток нормального коренеплоду. Рослини, які експресують зазначену відкладену відповідь на 20 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яровизацію або зазначений фенотип без виходу у стрілку, можуть бути легко ідентифіковані й вибрані шляхом застосування експерименту за фенотиповим аналізом, у якому використовують стандартизовані умови росту. Даний винахід включає різні підходи до зниження експресії, кількості, активностій/або функції ендогенного гена BvFT2 у цукрового буряка. Фахівцеві у даній області очевидно, що може бути застосовний ряд різних методів для впливу на експресію, кількість, активність і/або функцію генів у рослини необхідним чином. Як приклади, якими перелік не обмежується, можуть бути зазначені наступні: "Змістова" супресія Зміни експресії гена у рослини (тобто гена BvFT2 у цукрового буряка), переважно зниження його експресії, домагаються "змістовою" супресією (описаною, наприклад, Jorgensen та ін., Plant Mol. Biol. 31, 1996, сс. 957-973). У цьому випадку вся або частина нуклеотидної послідовності за даним винаходом включена у молекулу ДНК. Молекула ДНК переважно оперативно пов'язана з функцією промотору у клітині, що включає цільовий ген, переважно клітині рослини, та інтродукована у клітину, в якій нуклеотидна послідовність може експресуватися. Нуклеотидна послідовність інсертована у молекулу ДНК у "змістовій" орієнтації, тому кодуючий ланцюг нуклеотидної послідовності може транскрибуватися. У кращому варіанті здійснення даного винаходу нуклеотидна послідовність може транслюватися повністю й вся генетична інформація, включена у нуклеотидну послідовність, або її частина, транслюється у поліпептид. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу нуклеотидна послідовність може транслюватися частково й короткий пептид транслюється. У кращому варіанті здійснення даного винаходу це досягається інсерцією щонайменше одного передчасного стоп-кодону у нуклеотидній послідовності, що приводить до трансляції наполовину. В іншому більше кращому варіанті здійснення даного винаходу нуклеотидна послідовність транскрибується, але продукт трансляції не утворюється. Це звичайно досягається видаленням стартового кодону, наприклад, "ATG", у поліпептиді, який кодується нуклеотидною послідовністю. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу молекула ДНК, що представляє нуклеотидну послідовність, або її частину, що стабільно інтегрована у геном рослинної клітини. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу молекула ДНК, що представляє нуклеотидну послідовність, або її частину, включена у молекулу, що реплікується позахромосомально. У трансгенних рослин, що містять одну з молекул ДНК, описаних безпосередньо вище, експресія нуклеотидної послідовності, що відповідає нуклеотидній послідовності, включеній у молекулу ДНК, переважно знижена. Переважно нуклеотидна послідовність у молекулі ДНК щонайменше на 80 % ідентична нуклеотидній послідовності, експресія якої знижена, більше переважно ідентична щонайменше на 90 %, ще більше переважно ідентична щонайменше на 95 % і найбільше переважно ідентична щонайменше на 99 %. "Антизмістова" супресія В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу зміна експресії гена у рослини (тобто, гена BvFT2 у цукрового буряка), краще зниження його експресії, одержують шляхом "антизмістової" супресії. Вся або частина нуклеотидної послідовності за даним винаходом включена у молекулу ДНК. Молекула ДНК переважно оперативно пов'язана з промоторною функцією у рослинній клітині й впроваджується у рослинну клітину, в якій експресується нуклеотидна послідовність. Нуклеотидну послідовність інсертують у молекулу ДНК "в антизмістовій орієнтації", що означає, що зворотна комплементарна послідовність (яку також іноді називають ланцюгом, що не кодує) до нуклеотидної послідовності може бути транскрибована. У кращому варіанті здійснення даного винаходу молекула ДНК, що включає нуклеотидну послідовність, або її частину, стабільно інтегрована у геном рослинної клітини. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу молекула ДНК, що включає нуклеотидну послідовність, або її частину включена в екстрахромасомально репліковану молекулу. Декілька публікацій, що описують такий підхід, приводяться для додаткового пояснення (Green та ін., Ann. Rev. Biochem. 55, 1986, сс. 569-597; van der Krol та ін., Antisense Nuc. Acids & Proteins, 1991, сс. 125-141; Abel та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 6949-6952; Ecker та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, сс. 5372-5376). У трансгенних рослинах, що містять одну з описаних вище молекул ДНК, експресія нуклеотидної послідовності, що відповідає нуклеотидній послідовності, включеній у молекулу ДНК, переважно знижена. Переважно нуклеотидна послідовність у молекулі ДНК щонайменше на 80 % ідентична нуклеотидній послідовності, експресія якої знижена, більше переважно вона щонайменше на 90 % ідентична, ще більше переважно щонайменше на 95 % ідентична, і найбільше переважно щонайменше на 99 % ідентична. Гомологічна рекомбінація 21 UA 108736 C2 5 10 1520 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу щонайменше одна геномна копія, що відповідає нуклеотидній послідовності за даним винаходом, модифікована у геномі рослини шляхом гомологічної рекомбінації, описаної як приклад у роботі Paszkowski та ін., EMBO Journal 7, 1988, сс. 4021-4026. У цьому методі використовують властивість гомологічних послідовностей розпізнавати одна одну й обмінюватися нуклеотидними послідовностями між собою у ході процесу, який називають гомологічною рекомбінацією. Гомологічна рекомбінація може відбуватися між хромосомальною копією нуклеотидної послідовності у клітині й копією, що надійшла, нуклеотидної послідовності, впровадженої у клітину у результаті трансформації. Певні модифікації у такий спосіб безпомилково інтродукують у хромосомальну копію нуклеотидної послідовності. В одному з варіантів здійснення даного винаходу регуляторні елементи гена відповідної рослини (тобто, гена BvFT2 цукрового буряка) модифіковані. Такі регуляторні елементи можуть бути легко отримані скринінгом геномної бібліотеки, використовуючи нуклеотидну послідовність за даним винаходом або її частину як зонд. Наявні регуляторні елементи заміщають на інші регуляторні елементи, у такий спосіб змінюючи експресію нуклеотидної послідовності, або вони мутовані або делетовані, у такий спосіб скасовуючи експресію нуклеотидної послідовності. В іншому варіанті здійснення даного винаходу нуклеотидну послідовність модифікують делецією частини нуклеотидної послідовності, або цілої нуклеотидної послідовності, або мутацією. У даному винаході також розглядають експресію мутантного поліпептиду у рослинних клітинах. Були описані попередні вдосконалення цього методу для руйнування ендогенних генів рослин (Kempin та ін., Nature 389, 1997, сс. 802-803, і Miao & Lam, Plant J., 7, 1995, сс. 359-365). Фахівцям відомі численні можливі способи модифікації геномних послідовностей спрямованим чином. До них відносяться зокрема, наприклад, процеси вироблення мутацій типу нокаут шляхом спрямованої гомологічної рекомбінації, наприклад, створенням стоп-кодонів, переміщеннями у рамці зчитування й ін. (Hohn & Puchta, Proc Natl Acad Sci USA 96, 1999, сс. 8321-8323) або спрямованою делецією або інверсією послідовностей за допомогою, наприклад, рекомбіназ або нуклеаз, специфічних за послідовностями. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу мутація у хромосомальній копії нуклеотидної послідовності інтродукується шляхом трансформації клітини химерним олігонуклеотидом, що містить безперервний відрізок залишків РНК і ДНК у дуплексній конформації з подвійними шпильками на кінцях. Додатковою властивістю олігонуклеотиду є, наприклад, наявність 2’-O-метилування за залишками РНК. Послідовність РНК/ДНК конструюють для вирівнювання з послідовністю хромосомальної копії нуклеотидної послідовності за даним винаходом й для включення необхідної нуклеотидної зміни. Наприклад, цей метод додатково описаний в US 5501967 і Zhu та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1999, сс. 8768-8773. Рибозими В іншому варіанті здійснення даного винаходу РНК, що кодує поліпептид за даним винаходом, розщеплюється каталітичною РНК, або рибозимом, специфічним у відношенні такої РНК. Рибозим експресується у трансгенних рослинах і приводить до знижених кількостей РНК, що кодує поліпептид за даним винаходом у клітинах рослин, у такий спосіб приводячи до знижених кількостей поліпептиду, що накопичується у клітинах. Цей метод додатково описаний в US 4987071. Домінантні негативні мутанти В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу дія поліпептиду, який кодується нуклеотидними послідовностями за даним винаходом, змінена. Ця зміна досягається експресією домінантних негативних мутацій у білків у трансгенних рослинах, приводячи до втрати активності ендогенного білка. Аптамери В іншому варіанті здійснення даного винаходу дія поліпептиду за даним винаходом придушується експресією у трансгенних рослинах лігандів нуклеїнових кислот, так званих аптамерів, які специфічно зв'язуються з білком. Аптамери в основному одержують методом SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment - системною еволюцією лігандів шляхом експонентного збагачення). У методі SELEX досліджувана суміш одноланцюгових нуклеїнових кислот, що мають області рандомізованої послідовності, контактує з білком і ті нуклеїнові кислоти, які мають підвищену спорідненість з мішенню, відокремлюють від залишившихся у досліджуваній суміші. Відділені нуклеїнові кислоти ампліфікуються для одержання збагаченої лігандами суміші. Через декілька повторів одержують нуклеїнову кислоту з оптимальною спорідненістю до поліпептиду й використовують для експресії у трансгенних рослинах. Цей спосіб додатково описаний в US 5270163. Білки - цинкові пальці 22 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Білок типу цинкового пальця, що зв'язує нуклеотидну послідовність за даним винаходом або його регуляторну область, також використовують для зміни експресії нуклеотидної послідовності. Переважно транскрипцію нуклеотидної послідовності знижують або збільшують. Білки – цинкові пальці описані, наприклад, у роботах Beerli та ін., PNAS 95, 1998, сс. 1462814633, або у WO 95/19431, WO 98/54311 або WO 96/06166, які всі включені у даний винахід у вигляді посилань на їх сутність. У кращому варіанті здійснення даного винаходу трансгенна знижена регуляція або супресія експресії ендогенного гена BvFT2 цукрового буряка досягається способом, вибраним із длРНК, антизмістової супресії або спільної супресії. Зміна експресії цільового гена рослини (наприклад, BvFT2 у цукрового буряка) також одержують методом длРНК інтерференції (РНКі). Процес генної регуляції за допомогою дволанцюгової РНК (дволанцюгової РНК інтерференція – длРНКі) був багато разів описаний для тварин і рослин (наприклад, Matzke та ін., Plant Mol Biol 43, 2000, сс. 401-415; Fire та ін., Nature 391, 1998, сс. 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364; всі зазначені публікації включені у даний винахід у вигляді посилань). Процеси й методи, описані у цитованих джерелах, приводяться винятково у вигляді посилань. Способи зі застосуванням длРНКі засновані на феномені, який полягає у тому, що одночасна інтродукція комплементарного ланцюга й контурного ланцюга транскрипта гена супресує експресію відповідного гена високо ефективним способом. У цей час установлено, що длРНК процесується ферментом дайсер шляхом нарізування длРНК на короткі інтерферуючі РНК (міРНК). Переважно, отриманий фенотип досить схожий з фенотипом відповідного нокаутного мутанта (Waterhouse та ін., Proc Natl Acad Sci USA 95, 1998, сс. 1395913964). Процес длРНКі підтвердив свою особливу ефективність і корисність у зниженні експресії маркерного білка. Інтерферуючи з іРНК гена BvFT2 цукрового буряка, генна експресія приведе до супресії або відкладення відповіді на яровизацію цукрового буряка. Відкладення відповіді на яровизацію приводить до рослини цукрового буряка, що продовжує вегетативний ріст, і до розвитку нормального коренеплоду. У рамках охоплення даного винаходу молекула дволанцюгової РНК (длРНК) означає переважно одну або більше послідовностей рибонуклеїнових кислот, які завдяки комплементарним послідовностям, теоретично (наприклад, відповідно до правила основ Уотсона і Крику) і/або у дійсності (наприклад, через експерименти по гібридизації in vitro і/або in vivo) здатні формувати структури дволанцюгової РНК. Фахівець у даній області обізнаний про те, що формування структур дволанцюгової РНК перебуває у стані рівноваги. Краще співвідношення дволанцюгових молекул до відповідних диссоційованих форм становить щонайменше 1:10, переважно 1:1, особливо переважно 5:1, найбільше переважно 10:1. Один із об'єктів даного винаходу відноситься до молекул дволанцюгової РНК, які при інтродукції у рослину цукрового буряка (або у клітини, тканини, органи або у розмножений матеріал з них) викликають зниження експресії щонайменше ендогенного BvFT2. Дволанцюгова молекула РНК для зниження експресії щонайменше ендогенного BvFT2 у даному винаході переважно включає (a) ланцюжок "змістової" РНК, що включає щонайменше одну рибонуклеотидну послідовність, яка у значній мірі ідентична щонайменше частині транскрипта "змістової" РНК щонайменше з ендогенного BvFT2, і (б) ланцюжок "антизмістової" РНК, що у значній мірі, переважно повністю, комплементарна ланцюжку "змістової" РНК за пунктом (a). Поняття "в істотному ступені ідентична" означає, що послідовність длРНК також може мати інсерції, делеції й окремі точкові мутації при порівнянні з послідовністю гена-мішені й проте викликає істотне зниження експресії. Гомологія (обумовлена у даному винаході нижче) між "змістовим" ланцюгом інгібуючої длРНК і щонайменше однією частиною транскрипта "змістової" РНК послідовності нуклеїнової кислоти гена-мішені (або між "антизмістовим" ланцюгом комплементарного ланцюга послідовності нуклеїнової кислоти гена-мішені) переважно становить щонайменше 75 %, переважно щонайменше 80 %, особливо переважно щонайменше 90 %, найбільше переважно 100 %. 100 % ідентичність послідовностей між длРНК і транскриптом гена маркера не є абсолютно необхідною для індукції ефективного зниження експресії гена-мішені.Тому процес переважно стійкий до відхилень у послідовностях, які можуть бути через генетичні мутації, поліморфізми або еволюційну дивергенцію. Таким чином, можна, наприклад, використовуючи длРНК, що була отримана, починаючи з послідовності гена-мішені першого організму, для придушення експресії гена-мішені у другого організму. Для цієї мети длРНК переважно включає області послідовності транскриптів гена-мішені, які відповідають консервативним областям. Зазначені консервативні області можуть бути легко визначені при порівнянні послідовностей. В іншому варіанті поняття "в істотному ступені ідентична" длРНК також може бути 23 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосоване до послідовності нуклеїнової кислоти, здатної гібридизуватися з частиною транскрипта гена-мішені. Поняття "у значній мірі комплементарна" означає, що "антизмістовий" ланцюг РНК може також мати інсерції, делеції й окремі точкові мутації у порівнянні з комплементарним "змістовим" ланцюгом РНК. Гомологія між ланцюгом "антизмістової" РНК і ланцюгом "змістової" РНК переважно становить щонайменше 80 %, переважно щонайменше 90 %, особливо переважно щонайменше 95 %, найбільше переважно 100 %. Поняття "частини транскрипта "змістової" РНК" послідовності нуклеїнової кислоти генамішені означає фрагменти РНК або іРНК, транскрибовані або транскрибуємі з послідовності нуклеїнової кислоти гена-мішені. У зв'язку з цим фрагменти мають довжину послідовності, що складається переважно щонайменше з 20 основ, переважно щонайменше з 50 основ, особливо переважно щонайменше з 100 основ, досить переважно щонайменше з 200 основ, найбільше переважно щонайменше з 500 основ. Повністю транскрибуємі РНК або іРНК також включені. Включеними також є послідовності, наприклад, ті, які можуть транскрибуватися у штучних умовах з областей гена-мішені, які з іншої сторони у природних умовах, не транскрибуються, наприклад, промоторні області. Молекула длРНК може складатися з одного або декількох ланцюгів полірибонуклеотидів. Природно для досягнення тієї ж мети також можна інтродукувати безліч окремих молекул длРНК, які включають у кожному випадку одну зі зазначених вище деталей рибонуклеотидних послідовностей у клітини або організми. Структура дволанцюгової РНК (длРНК) може бути сформована, починаючи з двох комплементарних окремих ланцюгів РНК, або переважно починаючи з єдиного ауто-комплементарного ланцюга РНК. У цьому випадку "змістовий" ланцюг РНК і "антизмістовий" ланцюг РНК переважно ковалентно з'єднані один з одним у формі інвертованого "повтору". Відповідно до опису у WO 99/53050, наприклад, длРНК може також включати структуру шпильки шляхом з'єднання "змістового" і "антизмістового" ланцюгів шляхом з'єднання послідовності ("лінкер"; наприклад, інтрон). Перевагу мають ауто-комплементарні структури длРНК, оскільки вони вимагають тільки експресії послідовності РНК і завжди включають комплементарні ланцюги РНК в еквімолярному співвідношенні. Послідовність, що з'єднується, переважно може бути інтроном (наприклад, інтроном гена картоплі ST-LS1; Vancanneyt та ін. (1990)). Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує длРНК, може включати додаткові елементи, наприклад, сигнали термінації транскрипції або сигнали поліаденілювання. Взяті разом, коли це роблять спеціально, два ланцюги длРНК у клітині або у рослині можуть бути отримані, наприклад, наступним шляхом: (a) трансформацією клітини або рослини вектором, що включає обидві касети експресії, (б) спільною трансформацією клітин або рослини двома векторами, один із яких включає касети експресії, що містять "змістовий" ланцюг, а інший включає касети експресії, що містять "антизмістовий" ланцюг. Формування дуплекса РНК може бути ініційоване або всередині клітини, або поза клітиною. Молекула длРНК може бути синтезована або in vivo, або in vitro. Для цього послідовність ДНК, що кодує длРНК, може бути інсертована у касету експресії під контролем щонайменше одного генетичного контрольного елемента (наприклад, промотору). Поліаденілювання не є необхідним і не має потреби в яких-небудь елементах для ініціації трансляції. Перевага віддається касеті експресії для націлювання длРНК на ген-мішень, наявний у конструкції для трансформації або векторі для трансформації. Для цієї мети касети експресії, що кодують "антизмістовий" ланцюг і/або "змістовий" ланцюг длРНК, що націлюються на ген-мішень або аутокомплементарний ланцюг длРНК, переважно інсертовані у вектор трансформації й інтродуковані у рослинну клітину, використовуючи спосіб, описаний нижче. Стабільна інсерція у геном може бути корисною для способу даного винаходу, але не є безумовно необхідною. Оскільки длРНК викликає тривалий ефект, короткочасна експресія також у багатьох випадках є достатньою. Молекула длРНК також може бути частиною РНК, яка експресується послідовністю нуклеїнової кислоти, інсертованою шляхом злиття, наприклад, з 3'-нетрансльованої частини зазначеної РНК. Молекула длРНК може бути інтродукована у кількості, що уможливлює наявність щонайменше однієї копії на клітину. Підвищені кількості (наприклад, щонайменше 5, 10, 100, 500 або 1000 копій на клітину) може, при необхідності, викликати більш ефективне зниження. У кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом включає гетерологічну ДНК, що кодує перший ланцюг РНК і другий ланцюг РНК, і яка при транскрипції робить першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначений перший ланцюг РНК у значній мірі комплементарний щонайменше 24 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частині ланцюга РНК ендогенного гена BvFT2 у цукрового буряка для гібридизації або вирівнювання з ланцюгом РНК, формованої зазначеним ендогенним геном BvFT2 таким чином, що викликають зниження регуляції або супресію експресії ендогенного гена BvFT2, і зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК формують дволанцюгову РНК, причому дволанцюгова РНК при експресії у рослині цукрового буряка бере участь у РНК інтерференції експресії зазначеного ендогенного гена BvFT2, тим самим викликаючи зниження регуляції або супресію експресії ендогенного гена BvFT2. В одному з варіантів здійснення даного винаходу передбачена химерна конструкція, що включає інвертований повтор, який при транскрипції у клітинах цукрового буряка формує молекулу дволанцюгової РНК у зазначених клітинах рослини цукрового буряка, включаючи зазначені перший й другий ланцюги РНК, причому зазначена молекула дволанцюгової РНК індукує сайленсинг BvFT2. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу інвертований повтор переважно оперативно пов'язаний з конститутивним промотором. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу послідовності першого й другого ланцюгів РНК, які кодовані гетерологічною ДНК, включеною у химерну конструкцію за даним винаходом, є в істотному ступені комплементарними або ідентичними нуклеотидній послідовності РНК, виробленій геном BvFT2, для індукції сайленсингу РНК. Поняття "у достатньому ступені комплементарна" означає, що послідовності першого й другого ланцюгів РНК можуть гібридизуватися або вирівнюватися істотно за РНК, отриманою ендогенним геном BvFT2 (іРНК) в умовах, виявлених у цитоплазмі, таким чином, що РНКі індукується й приводить до придушення експресії ендогенного гена BvFT2. Така супресія гена BvFT2 викликає у рослини цукрового буряка фенотип, при якому відсутній вихід у стрілку, що означає, що рослина цукрового буряка більше не відповідає на типовий період яровизації тривалістю 18 тижнів виходом у стрілку й наступним цвітінням, а навпроти, продовжує вегетативний ріст (без виходу у стрілку) і формування нормального коренеплоду. В іншому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом включає гетерологічну ДНК, що кодує ланцюг нуклеїнової кислоти, яка у достатній мері комплементарна або ідентична щонайменше частині гена BvFT2. Відомо, що якщо ланцюг міРНК ідентичний, цільова іРНК нарізається на непридатні фрагменти РНК. Однак, якщо спарювання не можна вважати ідентичним, комплекс RISC зв'язується з іРНК і може блокувати рух рибосоми уздовж нативної іРНК, але не може нарізати іРНК на малі фрагменти. Проте, у кожному випадку експресія гена, з якого транскрибується іРНК, є такою, що мовчить, і тому не формується білок, який кодується геном-мішенню (наприклад, BvFT2). Даний винахід, отже, додатково включає один ланцюг міРНК, що в істотному ступені комплементарна або ідентична відповідній послідовності іРНК, транскрибованої з ендогенного гена BvFT2, експресія якого змінена. Наприклад, ланцюг міРНК, що зв'язується з іРНК, переважно щонайменше на 50 % ідентичний послідовності іРНК ендогенного гена BvFT2, більше переважно щонайменше на 70 % ідентичний, ще більше переважно щонайменше на 80 % ідентичний, ще більше переважно щонайменше на 90 % ідентичний й найбільше переважно щонайменше на 95 % ідентичний. Варто враховувати, що відсоток ідентичності між ланцюгом міРНК, що в істотному ступені комплементарна або ідентична відповідній послідовності іРНК, транскрибованої з ендогенного гена BvFT2, чия експресія змінена, та іРНК, яка вироблена ендогенним геном BvFT2, що перебуває в інтервалі ідентичності щонайменше від 50 % ідентичності й щонайменше до 95 % ідентичності, може бути якою-небудь чисельною величиною у цьому діапазоні. Відомо, що послідовності РНК з інсерціями, делеціями й точковими мутаціями щодо цільової послідовності також ефективні у супресії експресії гена-мішені. Ідентичність послідовностей молекул міРНК і продукту транскрипції гена-мішені (наприклад, іРНК гена-мішені) може бути оптимізована шляхом алгоритмів вирівнювання, відомих у даній області й підрахунку відсотка схожості нуклеотидних послідовностей. В іншому варіанті молекула міРНК за даним винаходом може бути ідентифікована не за близькістю її послідовності з молекулою-мішенню, але за її здатністю гібридизуватися й припиняти експресію цільової послідовності. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу химерна конструкція за даним винаходом включає гетерологічну ДНК, що кодує послідовність нуклеїнової кислоти з ідентичністю, що становить щонайменше 70 % з послідовністю нуклеїнової кислоти за даним винаходом, представлену нижче у вигляді послідовностей SEQ ID NO: 8 або 9, або включає щонайменше 15 послідовних нуклеотидів послідовності нуклеїнової кислоти за даним винаходом, представлену нижче у вигляді послідовностей SEQ ID NO: 8 або 9, або гібридизується у суворих умовах з послідовністю нуклеїнової кислоти за даним винаходом, представленою нижче у вигляді послідовностей SEQ ID NO: 8 або 9. В інших варіантах здійснення даного винаходу ідентичність послідовностей нуклеїнової 25 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти, що кодує гетерологічну ДНК, включену у химерну конструкцію за даним винаходом, переважно щонайменше на 80 %, ще більше переважно щонайменше на 85 %, ще більше переважно щонайменше на 90 % ідентична й найбільше переважно щонайменше на 95 %. В одному з варіантів здійснення даного винаходу химерна конструкція включає гетерологічну ДНК, що кодує першу нуклеотидну послідовність РНК, яка має 18-30 нуклеотидів у довжину, і другу нуклеотидну послідовність РНК, яка гібридизується з першою послідовністю у біологічних умовах, наприклад, таких умовах, які є у клітині, особливо у цитоплазмі й/або ядрі клітини. Зазначена перша молекула РНК має ступінь комплементарності до частини РНК ендогенного гена BvFT2 цукрового буряка, що дозволяє зазначеному першому ланцюгу РНК гібридизуватися або вирівнюватися з частиною зазначеного гена BvFT2, наприклад, приводячи до супресії експресії ендогенного гена BvFT2. У ще одному з варіантів здійснення даного винаходу химерна конструкція включає гетерологічну ДНК, що кодує першу нуклеотидну послідовність РНК, яка складається з 21-25 нуклеотидів у довжину, і другий ланцюг РНК, що гібридизується з першою послідовністю у біологічних умовах, наприклад, таких умовах, які є у клітині, особливо у цитоплазмі й/або ядрі клітини. Зазначена перша молекула РНК має ступінь комплементарності до частини РНК ендогенного гена BvFT2 цукрового буряка, що дозволяє зазначеному першому ланцюгу РНК гібридизуватися або вирівнюватися з частиною зазначеного гена BvFT2, наприклад, приводячи до супресії експресії ендогенного гена BvFT2. У ще одному з варіантів здійснення даного винаходу химерна конструкція включає гетерологічну ДНК, що кодує нуклеотидну послідовність першої РНК, яка має 21-23 нуклеотиди у довжину, і ланцюг другої РНК, що гібридизується з першою послідовністю у біологічних умовах, наприклад, таких умовах, які є у клітині, особливо у цитоплазмі й/або ядрі клітини. Зазначена перша молекула РНК має ступінь комплементарності до частини РНК ендогенного гена BvFT2 цукрового буряка, що дозволяє зазначеному першому ланцюгу РНК гібридизуватися або вирівнюватися з частиною зазначеного гена BvFT2, наприклад, приводячи до супресії експресії ендогенного гена BvFT2. Звичайно даний винахід включає химерні конструкції якої-небудь довжини за умови, що гетерологічна ДНК, включена у химерні конструкції, відіграє роль у запуску РНК інтерференції (іРНК) гена цукрового буряка BvFT2. В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до химерної конструкції, описаної у даному винаході вище, що включає гетерологічну ДНК, отриману з фрагмента кДНК розміром 0,27 т.н., що складається з екзона 4 гена BvFT2, відповідно до наведеного вище опису, у реакції ПЛР, використовуючи прямий праймер HiNK6382 з нуклеотидною послідовністю 5'ctatggatccGCATTTAATAAAATCTCTTTCAATG-3' (SEQ ID NO: 44) і зворотній праймер HiNK6384 з нуклеотидною послідовністю 5'-gtagaagcagaaacttacctGCCAAGAAGTTGTCTGCTATG-3' (SEQ ID NO: 45). Цей варіант додатково описаний у прикладі 7. В одному з варіантів здійснення даного винаходу химерна конструкція переважно включає гетерологічну ДНК, представлену нуклеотидами з 8747 по 9046 у послідовності SEQ ID NO: 33. В іншому варіанті здійснення даний винахід відноситься до химерної конструкції за даним винаходом, описаної у даному винаході вище для гена BvFT2, причому зазначена гетерологічна ДНК, включена у зазначену химерну конструкцію, інсертована між промотором і термінатором, причому зазначену гетерологічну ДНК одержують у такий спосіб: а. ампліфікують фрагмент кДНК розміром 0,27 т.н., що відбувається від екзона 4 гена BvFT2 у реакції ПЛР, використовуючи прямий праймер HiNK6382 з нуклеотидною послідовністю 5'ctatggatccGCATTTAATAAAATCTCTTTCAATG-3' (SEQ ID NO: 44) і зворотній праймер HiNK6384 з нуклеотидною послідовністю 5'-gtagaagcagaaacttacctGCCAAGAAGTTGTCTGCTATG-3' (SEQ ID NO: 45), а також кДНК цукрового буряка як матриця, причому кДНК цукрового буряка одержують з сумарної РНК, екстрагованої з листя цукрового буряка у реакції зворотньої транскриптази, використовуючи 3' RACE адаптер з нуклеотидною послідовністю 5'GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGT12VN-3' (SEQ ID NO: 33) як праймер; б. ампліфікують фрагмент кДНК розміром 0,19 т.н., включаючи інтрон ST-LS1 і фланкуючи сайти сплайсування, використовуючи прямий праймер HiNK6383 з нуклеотидною послідовністю 5'-catagcagacaacttcttggcAGGTAAGTTTCTGCTTCTAC-3' (SEQ ID NO: 46) і зворотній праймер HiNK529 з нуклеотидною послідовністю 5'-ATCCAACCGCGGACCTGCACATCAACAA-3' (SEQ ID NO: 40) і ДНК картоплі, що містить інтрон картоплі St-LS1 як матриця; в. гібридизують продукти ампліфікації, отримані на стадіях a) і б), один з одним за допомогою другого циклу ПЛР використовуючи праймери HiNK6382 і HiNK529 і використовуючи суміш обох продуктів ампліфікації як матриця, одержуючи продукт гібридизації розміром 0,47 т.н. у довжину; 26 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 г. ампліфікують фрагмент BvFT2 розміром 0,27 т.н. другий раз, використовуючи прямий праймер HiNK6385 з нуклеотидною послідовністю 5'-taaatccgcggGCCAAGAAGTTGTCTGCTATG3' (SEQ ID NO: 47) і зворотній праймер HiNK6386 з нуклеотидною послідовністю 5'ctatttgtcgacGCATTTAATAAAATCTCTTTC-3' (SEQ ID NO: 48) і кДНК цукрового буряка, отриманої вище у підрозділі a) як матриця; д. гібридизують обидва фрагменти за сайтами рестрикції Sac II для створення інвертованого повтору для послідовності BvFT2, відділеної інтроном від гена картоплі ST-LS1. Подробиці складання кращого варіанта здійснення даного винаходу наведені нижче у прикладі 7. Послідовність інтрона гена ST-LS1 можна легко одержати з ДНК картоплі методами, відомими фахівцям у даній області. Сайти рестрикції Sac II, які використовували для складання гетерологічної ДНК, впроваджують, використовуючи специфічні праймери, описані вище. В одному з варіантів здійснення даного винаходу передбачена химерна конструкція за даним винаходом для сайленсингу BvFT2, що включає нуклеотидну послідовність, представлену у SEQ ID NO: 33. В інших специфічних варіантах здійснення даного винаходу інвертований повтор, включений у химерну конструкцію, оперативно пов'язаний з конститутивним промотором, особливо промотором CaMV. Крім застосування послідовностей, що кодують, для придушення генної експресії за допомогою пост-транскрипційного генного сайленсингу (post-transcriptional gene silencing-PTGS) або РНКі, описаних вище, застосування послідовності, що не кодує, особливо промоторних послідовностей, описане для зниження регуляції генної експресії. Трансгенна експресія длРНК, що містить промоторні послідовності, індукує de novo метилування області цільового промотору й супутній сайленсинг промотору; спосіб також називається транскрипційним придушенням експресії генів (transcriptional gene silencing – TGS) (Mette та ін., 2000; Sijen та ін., 2001; Heilersig та ін., 2006). Складання фрагментів промотору у генні касети для їх антизмістової, змістової або длРНК експресії показали ефективність у зниженні регуляції транскрипції родинного гена у декількох видів рослин. Фахівцям у даній області очевидно, що послідовності промоторних областей обох генів BvFT1 і BvFT2, представлених у вигляді послідовностей SEQ ID No: 5 і SEQ ID No: 8, відповідно, можуть також використовуватися для конструювання химер і наступного транскрипційного сайленсингу гена відповідного гомолога BvFT. Іншою стратегією придушення експресії гена BvFT2 є застосування штучної мікроРНК, спочатку описаної Schwab та ін. (2006) і Alvarez та ін. (2006). Штучні молекули мікроРНК є одноланцюговими РНК з 21 мономеру, які у нормі не виявляються у рослин і які одержують з ендогенних попередників мікроРНК. Їх послідовності конструюють за детермінантами добору рослинних цільових мікроРНК таким чином, що ланцюг з 21 мономеру забезпечує специфічний сайленсинг певного гена-мішені, тобто BvFT2 у даному винаході. Більше докладне застосування й конструювання штучної мікроРНК як інструмент, наприклад, для супресії гена BvFT2 у цукрового буряка, описані Ossowski та ін., (2008) з посиланням на вебсайт Web MicroRNA Designer (http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi). Іншими прикладами (якими перелік не обмежується) стратегій зниження експресії, кількості, активності й/або функції ендогенного гена BvFT2 у цукрового буряка, що відносяться до даного винаходу, є наступні: Інсерція молекули ДНК (інсерційний мутагенез) В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу молекула ДНК інсертована у хромосомальну копію нуклеотидної послідовності за даним винаходом або в її регуляторну область. Переважно така молекула ДНК включає рухливий генетичний елемент, здатний до переміщення у рослинну клітину, наприклад, Ac/Ds, Em/Spm, мутатор. В іншому варіанті молекула включає край T-ДНК з T-ДНК Agrobacterium. Молекула ДНК також може включати сайт розпізнавання рекомбінази або інтегрази, що може застосовуватися для видалення частини молекули ДНК з хромосоми рослинної клітини. Також охоплюються методи інсерційного мутагенезу, що використовують T-ДНК, транспозони, олігонуклеотиди, або інші методи, відомі фахівцям у даній області. Методи застосування T-ДНК і транспозону для інсерційного мутагенезу описані у роботах Winkler та ін., Methods Mol. Biol. 82, 1989, сс. 129-136, і Martienssen, PNAS 95, 1998, сс. 2021-2026, сутність яких включена у даний винахід у вигляді посилань. Іншим відповідним методом є інтродукція нонсенс мутацій в ендогенні гени-мішені, наприклад, за допомогою інтродукції олігонуклеотидів РНК/ДНК у рослину (Zhu та ін., Nat Biotechnol 18(5), 2000, сс. 555-558). Точкові мутації також можуть бути отримані за допомогою гібридів ДНК-РН, які називаються "химеропластикою" (Cole-Strauss та ін., Nucl Acids Res 27(5), 1999, сс. 1323-1330; Kmiec (1999) Gene therapy American Scientist 87(3), 1999, сс. 240-247). Делеційний мутагенез 27 UA 108736 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У ще одному варіанті здійснення даного винаходу мутація молекули нуклеїнової кислоти за даним винаходом створюється у геномній копії послідовності у клітині або рослині шляхом делеції частини нуклеотидної послідовності або регуляторної послідовності. Способи делеційного мутагенезу відомі фахівцям у даній області. Див., наприклад, Miao та ін. (1995) Plant J. 7, 1995, с. 359. Активність або інтенсивність експресії гена-мішені також може бути знижена спрямованою делецією у гені-мішені, наприклад, шляхом специфічної відносно послідовностей індукцією дволанцюгових розривів ДНК у послідовності розпізнавання для специфічної індукції дволанцюгових розривів ДНК у послідовності нуклеїнової кислоти генамішені або поруч із нею. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу такі делеції створюють випадковим чином у великій популяції рослин хімічним мутагенезом або опроміненням, і рослину з делецією у гені за даним винаходом виділяють прямою або зворотною генетичною стратегією. Відомо, що опромінення швидкими нейтронами або гамма-променями викликає мутації за типом делецій у рослин (Silverstone та ін., Plant Cell, 10, 1998, сс. 155-169; Bruggemann та ін., Plant J., 10, 1996, сс. 755-760; Redei & Koncz у кн.: "Methods in Arabidopsis Research", 1992, вид-во World Scientific Press, сс. 16-82). Мутації за типом делецій у гені за даним винаходом можуть бути відновлені шляхом генетичної стратегії реверсії, використовуючи ПЛР з об'єднаними наборами молекул геномної ДНК, що була показана у C. elegans (Liu та ін., Genome Research, 9, 1999, сс. 859-867.). Пряма генетична стратегія може включати мутагенез лінії, що проявляє PTGS, з наступним скринінгом потомства M2 на відсутність PTGS. Очікується, що серед таких мутантів можуть бути мутанти з порушеним геном за даним винаходом. Це можна оцінити саузерн-блоттингом або ПЛР для гена за даним винаходом з геномної ДНК з цих мутантів. Крім процесів інтродукції мутацій, зазначених вище, фахівцям у даній області відомо, що численні методи мутагенезу доступні для одержання нульових або нокаутних алелей для певного гена. Методи можуть бути розділені на категорії за фізичними властивостями і за їх мутагенним проявом. Гамма-радіація й швидкі нейтрони викликають хромосомні розриви, що часто приводять до транслокацій і делецій, хоча етилметансульфонат (ЕМС) з високою інтенсивністю індукує транзиції шляхом алкілування основ гуаніну. Стратегія TILLING (TargetingInduced Local Lesions IN Genomes – TILLING) ґрунтується на великих популяціях оброблених мутагеном рослин, що піддаються скринінгу на точкові мутації у даній послідовності (McCallum та ін., 2000). За останні роки були успішно початі програми TILLING для декількох основних сільськогосподарських культур, включаючи цукровий буряк (Hohmann та ін., 2005). При клонуванні й аналізі послідовності досліджуваного гена (наприклад, генів BvFT2 за даним винаходом), підходи спрямованого мутагенезу, наприклад, TILLING, у цей час стають реально здійсненними як джерело мутантних алелей цих генів. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу експресію нуклеотидної послідовності за даним винаходом змінюють у кожній клітині рослини. Це досягається, наприклад, гомологічною рекомбінацією або інсерцією у хромосомі. Це також досягається, наприклад, експресією змістової або антизмістової РНК, білка цинковий палець або рибозиму під контролем промотору, здатного експресувати змістову або антизмістову РНК, білка цинковий палець або рибозиму у кожній клітині рослини. Конструкції для експресії змістової або антизмістової РНК, білка цинковий палець або рибозиму, або для надекспресії нуклеотидної послідовності за даним винаходом, одержують і трансформують у клітини рослин за способами даного винаходу, наприклад, описаними нижче. Також можливе комбіноване застосування. Інші методи відомі фахівцям і можуть включати затримку або зупинку процесингу гена-мішені, транспорту білка, який кодується геном-мішенню, або його іРНК, інгібування приєднання до рибосоми, інгібування сплайсингу РНК, індукцію ферментативного руйнування РНК гена-мішені й/або інгібування елонгації трансляції або термінації. В одному з об'єктів за даним винаходом передбачена химерна конструкція для підвищеної регуляції експресії трансгенного ендогенного гена BvFT1 у цукрового буряка. Підвищена регуляція експресії ендогенного гена BvFT1 приводить до відкладення відповіді на яровизацію у зростаючої рослини цукрового буряка або викликає у рослини цукрового буряка розвиток фенотипу відсутності виходу у стрілку, що означає, що рослина цукрового буряка більше не відповідає на типовий період яровизації тривалістю 18 тижнів шляхом виходу у стрілку й наступного цвітіння, але навпроти продовжують вегетативний ріст (без виходу у стрілку) і формування нормального коренеплоду. Рослини, що експресують зазначену відкладену відповідь на яровизацію або зазначений фенотип відсутності виходу у стрілку, можуть бути легко ідентифіковані й вибрані шляхом застосування експерименту за фенотиповим аналізом, використовуючи стандартизовані умови росту. 28