Трансгенна рослина цукрового буряка і спосіб керування стрілкуванням у цукрового буряка

Реферат: Винахід належить до трансгенної клітини та рослини цукрового буряка, геном яких включає першу та другу гетерологічні генні конструкції, де перша гетерологічна генна конструкція включає кодуючу область гетерологічного або ендогенного гена FLC, причому експресія вказаної першої гетерологічної генної конструкції викликає надекспресію продукту гена FLC, а друга гетерологічна генна конструкція містить гетерологічну ДНК, що включає інвертований повтор, де вказана гетерологічна ДНК кодує першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому вказана перша нуклеотидна послідовність РНК містить фрагмент послідовності довжиною щонайменше 21 нуклеотид, який щонайменше на 90 % ідентичний нитці РНК ендогенного гена AGL20 вказаних клітини або рослини цукрового буряка, і гібридизується або відпалюється з РНК, яка виробляється геном AGL20 в умовах, що існують в цитоплазмі вказаної клітини рослини цукрового буряка, де двониткова РНК, утворювана вказаною першою нуклеотидною послідовністю РНК і вказаною другою UA 98766 C2 (12) UA 98766 C2 нуклеотидною послідовністю РНК, бере участь у РНК-інтерференції експресії вказаного ендогенного гена AGL20, чим пригнічує експресію вказаного ендогенного гена AGL20, причому вказана трансгенна рослина цукрового буряка демонструє синергічну затримку реакції яровизації, як наслідок спільної експресії вказаних першої та другої гетерологічних генних конструкцій. Зазначена гетерологічна конструкція у рослині цукрового буряка дозволяє керувати викиданням стрілки і цвітінням, а також пригнічувати реакцію яровизації. UA 98766 C2 Даний винахід належить до проблеми керування викиданням стрілки і цвітінням у цукрового буряка, особливо до способів пригнічення яровизації і трансгенних рослин цукрового буряка з пригніченим стрілкуванням. Цукровий буряк тисячоріччями оброблювався як солодка рослина, але його потенціал як джерела цукру не був відкритий аж до 18-го сторіччя. Цукровий буряк це дворічна рослина, яка належить до сімейства Chenopodiaceae (лободових). Звичайний життєвий цикл цукрового буряка завершується за два роки. На першому році у рослини розвивається соковитий м'ясистий корінь, який запасає енергію у вигляді сахарози. З цієї причини буряк обробляють як однорічну рослину. На другому році життєвого циклу вона цвіте і дає насіння. Якщо на першому році життя рослини видаються тривалі періоди похолодань, то у буряка може передчасно утворитися насіннєносець. Ця генетично детермінована температурна індукція приводить до феномена, відомого під назвою стрілкування (викидання стрілки). Обрізування бадилля у буряка для екстракції цукру наполовину скорочує дворічний життєвий цикл, поки накопичення сахарози знаходиться на піку. Як вже згадувалося, неодмінною частиною повного життєвого циклу цукрового буряка є індукована холодом яровизація, яка викликає стрілкування рослин. Імовірність яровизації буряка підвищується залежно від числа днів, коли максимальна температура не перевищує 12 °C. Це явище веде до втрат врожаю при ранній сівбі, оскільки за експертними оцінками 1 % рослин, що стрілкуються, знижує врожай цукру на 0,4-0,7 %. Існують два способи обрізування цукрового буряка, весняне й осіннє, котрі практикуються в південних країнах з м'яким кліматом і в північних широтах, відповідно. Обидва способи основані на наявності у рослин варіабельності за такою ознакою як ступінь стійкості до стрілкування. Стійкість до стрілкування залежить від температури, тривалості і переносимих меж опромінення для індукції насіннєносця і є ключовою ознакою в селекції цукрового буряка. Для того, щоб повністю стримати стрілкування і цвітіння за допомогою блокування яровизації, деяровизації яровизованих рослин або пригнічення цвітіння і вироблення життєздатного насіння сівбу цукрового буряка в північних широтах варто проводити восени, що виключає ризик стрілкування і цвітіння на наступний сезон. Цей зсув з весняної на підзимову сівбу дозволяє буряківникам проводити сівбу восени і збирати врожай на наступне літо. Порівняння озимих і ярових сортів культурних рослин, наприклад, пшениці й олійних культур, показало, що озимі сорти стабільно дають більш високий врожай у порівнянні з яровими. Очікуваний результат полягає в підвищенні економічної життєздатності і рентабельності сільськогосподарських культур. Ще одна перевага полягає в можливості комбінувати вирощування ярових і озимих культур з розширенням терміну компанії зі збору врожаю, яка може починатися на два-три місяці раніше, що підвищує ефективність капіталовкладень в устаткування й інфраструктуру, які необхідні для збирання врожаю, транспортування і переробки цукрового буряка. Функціональний аналіз арабідопсиса (Arabidopsis thaliana) дозволив розрізнити чотири різних шляхи цвітіння (Levy and Dean, 1998). Ці чотири шляхи можна зв'язати зі стимулами із зовнішнього середовища, наприклад, з фотоперіодичними і яровизуючими шляхами стимуляції, або з уродженими сигналами розвитку, наприклад, зі шляхами автономної стимуляції і пригнічення цвітіння. У деяких видів час цвітіння, насамперед, залежить від факторів зовнішнього середовища, наприклад, від світлового періоду, якості/кількості світла, яровизації і доступності води або живильних речовин. Інші види рослин менше залежать від екзогенних сигналів і в більшій мірі покладаються на ендогенні, наприклад, на розмір рослини або кількість вузлових точок. В літературі описаний один важливий локус, FLOWERING LOCUS С (FLC), який зустрічається в природі у екотипів арабідопсиса (Koornneef et al, 1994; Lee et al. 1994). FLC - це регулятор транскрипції із сімейства генів MADS-box (Michaels, SD and RM Amasino, 1999), який пригнічує цвітіння. На відміну від цього, існують гени, які викликають переключення з вегетативного росту на репродуктивний ріст, включаючи "локус цвітіння Т" (FT), "локус облиствіння" (LFY) і "супресор надекспресії констант", згадуваний в літературі під назвою "Agamous-like 20" (AGL20), (Nilsson et al, 1998; Kobayashi et al. 1999; Blazquez et al., 2000; Lee et al, 2000; Sarmach et al., 2000; Borner et al., 2000). Надлишкова експресія AGL20 викликає раннє цвітіння у арабідопсиса, у той час як знижувальна регуляція цього гена викликає пізнє цвітіння. Застосовно до цукрового буряка було показано, що реакція яровизації є одним з найбільш важливих факторів індукції цвітіння. Хоча буряківникам відомі і доступні різновиди цукрового буряка, стійкі до стрілкування, дотепер не вирішені серйозні проблеми з культивуванням високоврожайних озимих сортів, що пов'язане зі спалахами стрілкування. В даний час не існує рослин або способів, здатних забезпечити гарантовану затримку яровизації цукрового буряка. 1 UA 98766 C2 Яровизація і її вплив на дворічний цукровий буряк досить докладно описані в літературі (див., наприклад, Jaggard et al, 1983). Цукровий буряк реагує на температури в діапазоні від 3 до 12 °C, накопичуючи ефекти похолодань. Для того, щоб буряк почав викидати стрілку необхідно кілька тижнів з температурою 3-12 °C. Модель стрілкування ІТВ показує, що у Франції яровизація може відбуватися в період до 90 днів (13 тижнів) після рядової сівби. Критичним числом для ініціації стрілкування з цих 90 днів є сімнадцять днів з температурою 7 °C. Даний винахід включає рослини цукрового буряка і способи модулювання реакції яровизації за рахунок надекспресії гена FLC або пригнічення експресії гена AGL20 у цукрового буряка. В одному з варіантів реалізації винахід належить до рослин цукрового буряка і способів модулювання реакції яровизації за рахунок надекспресії гена FLC і пригнічення експресії гена AGL20 у однієї і тієї ж рослини цукрового буряка. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР І ІДЕНТИФІКАТОРІВ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (SEQ ID) Фігура 1 представляє плазмідну карту бінарного вектора pHiNK260. Фігура 2 представляє вивірення послідовностей кДНК гомологічних варіантів гена AGL20 від рослин Arabidopsis thaliana (AtAGL20), Nicotiana tabacum (NtAGL20) і Sinapsis alba (SaAGL20). Вироджені праймери HiNK624 і HiNK619, які були сконструйовані для консервативних регіонів і позначені підкресленням. Фігура 3 представляє філогенетичне древо, умоглядно побудоване по вивіренню кодуючого регіону гомолога AGL20 цукрового буряка в порівнянні з гомологами AGL20 рослин Arabidopsis thaliana, Pinus taeda, Pisum sativum, Sinapsis alba I Nicotiana tabacum. Фігура 4 представляє плазмідну карту бінарного вектора pHiNK382. Фігура 5 представляє таблицю, яка містить фенотипічні результати подій у гені FLC. Фігура 7 представляє таблицю, яка містить фенотипічні результати подій у гені AGL20. Фігура 7 представляє плазмідну карту бінарного вектора pHiNK440. Фігура 8 представляє плазмідну карту бінарного вектора pHiNK441. Фігура 9 відображає вивірення трьох білкових послідовностей гена FLC Beta vulgaris (BvFLC), що показує розходження INDEL між трьома різними варіантами сплайсингу. Фігура 10 відображає приріст трьох варіантів сплайсингу передбачуваного гомолога FLC цукрового буряка, який демонструє наявність двох INDEL усередині рамки зчитування. Послідовність виродженого праймера HiNK5279, використаного для ампліфікації цих трьох фрагментів кДНК, поміщена в рамку. Фігура 11 показує результат експресії компонентів RNAi pHiNK 440 і 441, контрольного гена GAPC і ендогенного гена цукрового буряка BvAGL20 за допомогою RT-PCR. Ендогенний ген BvAGL20 був підданий знижувальній регуляції у гібриду (А), але не у рослин, трансгенних тільки по одному компоненту dsPHK (В і С), але не по NT (D). W=вода; D=ДНК; R=РНК; 0,5, 1 і 2=кількість кДНК у мкл на реакцію RT-PCR. SEQ ID NO:1 відображає нуклеотидну послідовність бінарного вектора pHiNK260, що несе експресуючу касету, в якій міститься ген FLC арабідопсиса. SEQ ID NO:2 відображає нуклеотидну послідовність бінарного вектора pHiNK382, що несе експресуючу касету, в якій міститься інвертований повтор гомолога AGL20 цукрового буряка. SEQ ID NO:3 відображає нуклеотидну послідовність кДНК гена FLC арабідопсиса (інвентарний номер AF537203). SEQ ID NO:4 відображає нуклеотидну послідовність частини геномної послідовності гомолога AGL20 цукрового буряка. SEQ ID NO:5 відображає нуклеотидну послідовність фрагмента кДНК розміром 0,28 Kb, що складається з екзонів з 3 по 7 гомолога AGL20 цукрового буряка. SEQ ID NO:6 відображає нуклеотидну послідовність гомолога AGL20 цукрового буряка (BvAGL20). SEQ ID NO:7 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK529. SEQ ID NO:8 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK792. SEQ ID NO:9 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK793. SEQ ID NO:10 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK794. SEQ ID NO:11 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK795. SEQ ID NO:12 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK796. SEQ ID NO:13 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK624. SEQ ID NO:14 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK619. SEQ ID NO:15 відображає нуклеотидну послідовність праймера НiNК725. SEQ ID NO:16 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK729. SEQ ID NO:17 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK2617. SEQ ID NO:18 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK2618. 2 UA 98766 C2 SEQ ID NO:19 відображає нуклеотидну послідовність бінарного вектора pHiNK440, що несе експресуючу касету, в якій міститься фрагмент гомолога AGL20 цукрового буряка в смисловій орієнтації. SEQ ID NO:20 відображає нуклеотидну послідовність бінарного вектора pHiNK441, що несе експресуючу касету, в якій міститься фрагмент гомолога AGL20 цукрового буряка в антисмисловій орієнтації. SEQ ID NO:21 відображає нуклеотидну послідовність contig_71+EST, що ідентифікує кодуючий регіон варіанта сплайсингу 1 ендогенного гена FLC цукрового буряка. SEQ ID NO:22 відображає амінокислотну послідовність продукту експресії кодуючого регіону варіанта сплайсингу 1 ендогенного гена FLC цукрового буряка. SEQ ID NO:23 відображає нуклеотидну послідовність contig_78+EST, що ідентифікує кодуючий регіон варіанта сплайсингу 2 ендогенного гена FLC цукрового буряка. SEQ ID NO:24 відображає амінокислотну послідовність продукту експресії кодуючого регіону варіанта сплайсингу 2 ендогенного гена FLC цукрового буряка. SEQ ID NO:25 відображає нуклеотидну послідовність contig_79+EST, що ідентифікує кодуючий регіон варіанта сплайсингу 3 ендогенного гена FLC цукрового буряка. SEQ ID NO:26 відображає амінокислотну послідовність продукту експресії кодуючого регіону варіанта сплайсингу 3 ендогенного гена FLC цукрового буряка. SEQ ID NO:27 відображає нуклеотидну послідовність contig_71+EST. SEQ ID NO:28 відображає нуклеотидну послідовність contig_78+EST. SEQ ID NO: 29 відображає нуклеотидну послідовність contig_79+EST. SEQ ID NO:30 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK5277. SEQ ID NO:31 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK5279. SEQ ID NO:32 відображає нуклеотидну послідовність праймера AGL20 А. SEQ ID NO:33 відображає нуклеотидну послідовність праймера AGL20 В. SEQ ID NO:34 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK023. SEQ ID NO:35 відображає нуклеотидну послідовність праймера gapCex5/6F. SEQ ID NO:36 відображає нуклеотидну послідовність праймера gapCex8R. SEQ ID NO:37 відображає нуклеотидну послідовність праймера HiNK819. ВИЗНАЧЕННЯ Технічні терміни і вирази, використані в рамках цієї заявки, як правило, мають те ж розуміння, що звичайно надається їм у даній галузі техніки, тобто в галузі знань, що належить до розведення і культивації рослин, якщо далі в цьому тексті не буде спеціально зазначене інше. При використанні в тексті цієї заявки і прикладених пунктів формули винаходу форми однини мають на увазі посилання на множину, якщо з контексту явно не випливає інше. Так, наприклад, посилання на "рослину" включає одну і більше рослин, а посилання на "клітину" включає суміші клітин, тканини і т. п. Термін "цукровий буряк" належить до усіх видів і підвидів роду Beta, a також до всіх сортів культивованого буряка біологічного виду Beta vulgaris. Культивований буряк підрозділяється на чотири групи: листовий буряк, столовий буряк, кормовий буряк і цукровий буряк. Термін "цукровий буряк" належить також до всіх оброблюваних різновидів буряка, які вирощують в інших цілях, ніж одержання цукру, наприклад, для виробництва етилового спирту, пластмас або інших промислових продуктів. Однак, більшою мірою термін "цукровий буряк" належить до кормового буряка і цукрового буряка, особливо до цукрового буряка. Термін "стрілкування" належить до переходу рослини зі стадії вегетативної розетки в стадію цвітіння або репродуктивного росту. Термін "яровизація" належить до процесу, в якому у деяких рослин за рахунок впливу холодних температур протягом визначеного часу індукується перехід до цвітіння. "Кодуюча послідовність" - це така послідовність нуклеїнової кислоти, яка транскрибується в РНК, тобто у мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смислову РНК або антисмислову РНК. У переважному варіанті в організмі відбувається подальша трансляція РНК, під якою розуміється вироблення білка. "Ген" це визначений регіон, що має визначену локалізацію в межах геному і крім вищезгаданої кодуючої послідовності нуклеїнової кислоти включає інші, головним чином, регуляторні послідовності нуклеїнової кислоти, відповідальні за контроль експресії, інакше кажучи за транскрипцію і трансляцію кодуючої частини. Ген також може включати інші 5' і 3' нетрансльовані послідовності і термінуючі послідовності. Іншими елементами, які можуть бути представлені в гені, є, наприклад, інтрони. 3 UA 98766 C2 Термін "нуклеїнова кислота" належить до дезоксирибонуклеотидів або рибонуклеотидів, а також до їх полімерів в однонитковій або двонитковій формі, яка складається з мономерів (нуклеотидів), що містять цукор, фосфат і азотисту основу, яка являє собою або пурин, або піримідин. Якщо не представлено спеціальних обмежень, цей термін охоплює нуклеїнові кислоти, які містять відомі аналоги природних нуклеотидів, що мають такі ж здатності зв'язування, як і еталонна нуклеїнова кислота, і метаболізуються подібним чином з нуклеотидами, які зустрічаються в природі. Якщо немає інших вказівок, то специфічна послідовність нуклеїнової кислоти також неявно охоплює консервативно модифіковані варіанти (наприклад, вироджені заміщення кодонів) і комплементарні послідовності, а також явно зазначені послідовності. Конкретно, вироджені заміщення кодонів можуть бути досягнуті за рахунок генерування послідовностей, у яких третє положення одного або більше вибраних (або усіх) кодонів заміщається залишками змішаних основ і/або дезоксіінозину. "Фрагмент нуклеїнової кислоти" - це частина молекули даної нуклеїнової кислоти. У вищих рослин генетичним матеріалом є дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК), тоді як рибонуклеїнова кислота (РНК) задіяна в перенесенні інформації, що міститься в ДНК, у білки. Термін "нуклеотидна послідовність" належить до полімеру ДНК або РНК, який може бути однонитковим або двонитковим і, на вибір, містити синтетичні, неприродні або змінені нуклеотидні основи, здатні вбудовуватися в полімери ДНК або РНК. Терміни "нуклеїнова кислота" або "послідовність нуклеїнової кислоти" можуть також бути використані взаємозамінно з термінами ген, кДНК, ДНК і РНК, кодована геном. Термін "гетерологічний" при його використанні застосовано до гена або нуклеїнової кислоти належить до гена, який кодує фактор, що не є його природним середовищем (тобто був змінений рукою людини). Наприклад, гетерологічний ген може включати ген одного біологічного виду, введений у геном іншого біологічного виду. Гетерологічний ген також може включати ген, споконвічно властивий організму, який був змінений яким-небудь чином (наприклад, мутований, доданий у множинних копіях, зчеплений з неприродною промоторною або енхансерною послідовністю і т. д.). Крім того, гетерологічні гени можуть включати послідовності генів рослин у вигляді кДНК, причому ці послідовності кДНК можуть експресувати або в смисловій орієнтації (з виробленням мРНК) або в антисмисловій орієнтації (з виробленням антисмислового транскрипту РНК, комплементарного транскрипту мРНК). В одному з аспектів винаходу гетерологічні гени відрізняються від ендогенних генів рослин тим, що послідовності гетерологічних генів типово зв'язані з нуклеотидними послідовностями, які містять регуляторні елементи, наприклад, промотори, які у природних умовах не асоційовані з геном білка, кодованого гетерологічним геном, або з послідовностями генів рослин у хромосомі, або асоційовані з такими частинами хромосом, які не зустрічаються в природі (наприклад, гени, експресовані в локусах, де вони в нормі не експресуються). Поняття "інвертований повтор" належить до нуклеотидної послідовності, яка виявляється в двох сайтах однієї і тієї ж послідовності нуклеїнової кислоти, що мають протилежну орієнтацію. Поняття "експресуюча касета" при використанні тут означає молекулу нуклеїнової кислоти, здатну до прямої експресії специфічної нуклеотидної послідовності або послідовностей у відповідній клітині-хазяїні, яка містить промотор, функціонально зв'язаний з важливою нуклеотидною послідовністю або послідовностями, функціонально зв'язаною/зв'язаними із сигналами термінації, крім того, експресуюча касета типово включає послідовності, необхідні для правильної трансляції нуклеотидної послідовності (послідовностей). Експресуюча касета може також включати послідовності, які не є необхідними для прямої експресії важливої нуклеотидної послідовності, але представлені в близьких сайтах рестрикції для видалення касети з вектора експресії. Експресуюча касета, яка включає важливу нуклеотидну послідовність (послідовності), може бути химерною, що означає гетерологічність щонайменше одного з її компонентів відносно до одного з інших її компонентів. Експресуюча касета також може мати природне походження, але при цьому її одержують у рекомбінантній формі, корисній для гетерологічної експресії. Однак, у типовому випадку експресуюча касета гетерологічна відносно хазяїна, тобто специфічна послідовність нуклеїнової кислоти експресуючої касети не представлена природним чином у клітині-хазяїні і повинна бути введена в цю клітину або в її клітинний попередник за допомогою процесу трансформації, відомого в даній галузі знань. Експресія нуклеотидної послідовності (послідовностей) у експресуючій касеті може знаходитися під контролем конститутивного промотору або індукованого промотору, який ініціює транскрипцію тільки тоді, коли на клітину-хазяїна впливає деякий специфічний стимул, який може бути зовнішнім стимулом або внутрішнім стимулом, що походить від самого хазяїна. У випадку багатоклітинного організму, наприклад, рослини, промотор також може бути специфічний для особливої тканини або органа, або стадії розвитку. Під експресуючою касетою 4 UA 98766 C2 або її фрагментом також може матися на увазі "вставна послідовність" або "інсерційна послідовність", трансформована в геном рослини. Поняття "функціонально зв'язаний (зв'язана)" належить до такої асоціації послідовностей нуклеїнової кислоти на одиничному фрагменті нуклеїнової кислоти, коли функція однієї з них впливає на функцію іншої. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю або функціональною РНК, якщо він здатний впливати на експресію цієї кодуючої послідовності або функціональної РНК (тобто кодуюча послідовність або функціональна РНК знаходиться під транскрипційним контролем промотору). Кодуючі послідовності у смисловій або антисмисловій орієнтації можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями. Термін "праймери" при використанні тут означає виділені нуклеїнові кислоти, здатні відпалюватися з комплементарною цільовою ниткою ДНК за допомогою гібридизації нуклеїнових кислот з утворенням гібриду між праймером і цільовою ниткою ДНК, а потім нарощуватися уздовж цільової нитки ДНК за допомогою полімерази, наприклад, ДНКполімерази. Пари або набори праймерів можна використовувати для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, у полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР/PCR) або на основі інших традиційних методів ампліфікації нуклеїнових кислот. Термін "супресія" належить до відсутності або спостережуваного зниженню рівня білка і/або продукту мРНК, кодованого цільовим геном. Особливо "супресія" належить до зниження рівня білка і/або продукту мРНК, кодованого цільовим геном, у діапазоні від 20 % до 100 %, особливо від 40 % до 80 %, більш переважно від 50 % до 90 %, ще переважніше від 60 % до 95 %, але особливо переважно від 75 % до 98 % і до 100 %. Наслідки інгібування можна підтвердити дослідженням зовнішніх властивостей клітини або організму або застосовуючи біохімічні методики і методики виявлення експресії генів, відомі компетентному фахівцю. Наприклад, на супресію експресії гена AGL20 вказує відсутність або затримка реакції яровизації у культивованих рослин цукрового буряка. Поняття про суттєву ідентичність або гомологію в контексті двох послідовностей нуклеїнових кислот або білків належить до двох або більше послідовностей або підпослідовностей, які ідентичні щонайменше на 60 %, переважніше на 80 %, більш переважно на 90 %, ще переважніше на 95 % і найбільше переважно щонайменше на 99 % нуклеотидних або амінокислотних залишків при їх порівнянні або вивіренні на максимальну відповідність із застосуванням одного з зазначених нижче алгоритмів порівняння послідовностей або візуального контролю. Зокрема, суттєва ідентичність існує відносно тих ділянок послідовностей, довжина яких складає щонайменше приблизно 50 залишків, більш переважно відносно ділянок довжиною щонайменше 100 залишків, і особливо, якщо послідовності по суті ідентичні щонайменше приблизно по 150 залишкам. У специфічному варіанті послідовності по суті ідентичні по всій довжині кодуючих регіонів. Більше того, суттєво ідентичні послідовності нуклеїнових кислот або білків по суті виконують одну і ту саму функцію. При порівнянні послідовностей у типовому випадку одна послідовність вважається еталонною, з якою порівнюється інша послідовність, так звана тестована. При використанні алгоритму порівняння послідовностей тестовану й еталонну послідовності вводять у комп'ютер, позначаючи за необхідності координати підпослідовності і вводячи параметри програми алгоритму секвенування. Після цього алгоритм порівняння послідовностей розраховує процентний показник ідентичності тестованої послідовності (послідовностей) з еталонною послідовністю на основі введених параметрів програми. Можна провести оптимальне вивірення послідовностей для їх порівняння, наприклад, застосовуючи алгоритм локальної гомології (Smith & Waterman (1981)), алгоритм вивірення гомології (Needleman & Wunsch (1970)), пошук за методом подібності (Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85: 2444 (1988)) з комп'ютерною реалізацією цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA у пакеті програм Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Медісон, штат Вісконсін) або з візуальним контролем (див. у цілому, Ausubel et al., нижче). Один із прикладів алгоритму, придатного для визначення процентної ідентичності послідовностей і подібності послідовностей, це алгоритм BLAST, описаний у посиланні Altschul et al. (1990). Ще однією вказівкою на те, що дві послідовності нуклеїнових кислот по суті ідентичні, служить те, що дві молекули гібридизуються одна з одною у жорстких умовах. Фраза "специфічна гібридизація з…" належить до зв'язування, дуплексування або гібридизації молекули тільки зі специфічною нуклеотидною послідовністю в строгих умовах, коли ця послідовність представлена в складній суміші (наприклад, тотальній клітинний) ДНК або РНК. Поняття "зв'язування по суті" належить до комплементарної гібридизації між нуклеїновою кислотою-зондом і цільовою нуклеїновою кислотою, охоплюючи мінорні невідповідності, які 5 UA 98766 C2 можуть спостерігатися при зменшенні строгості середовища для гібридизації з метою бажаного виявлення послідовності цільової нуклеїнової кислоти. Поняття "строгі умови гібридизації" і "строгі умови відмивання після гібридизації" у контексті таких експериментів по гібридизації нуклеїнових кислот як гібридизація з використанням саузерн-блотингу і нозерн-блотингу знаходяться в залежності від послідовностей і розрізняються при різних . параметрах навколишнього середовища. Більш довгі послідовності специфічно гібридизуються при більш високих температурах. Великий посібник з гібридизації нуклеїнових кислот можна знайти в посиланні Tijssen (1993). Подальша вказівка на те, що дві послідовності нуклеїнових кислот або білків по суті ідентичні, полягає в тому, що білок, кодований першою нуклеїновою кислотою, дає перехресну імунологічну реакцію або специфічно зв'язується з білком, кодованим другою нуклеїновою кислотою. Таким чином, у типовому випадку білок по суті ідентичний другому білку, наприклад, якщо обидва білки відрізняються тільки по консервативних заміщеннях. Термін "синтетична" належить до нуклеотидної послідовності, яка має такі структурні характеристики, які не представлені в природній послідовності. Наприклад, можна сказати, що синтетичною є така штучна послідовність, яка по вмісту Г+Ц і по нормальному розподілу кодонів більшою мірою нагадує гени однодольних і/або дводольних рослин. "Трансформація" - це процес введення гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину або організм хазяїна. Поняття "трансформація" особливо означає стабільну інтеграцію молекули ДНК у геном цільового організму. Поняття "трансформований/трансгенний/рекомбінантний" належить до організму хазяїна, наприклад, бактерії або рослини, у який була введена молекула гетерологічної нуклеїнової кислоти. Молекула нуклеїнової кислоти може бути стабільно вбудована в геном хазяїна або також може бути представлена як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може самовідтворюватися. Мається на увазі, що трансформовані клітини, тканини або рослини охоплюють не тільки кінцевий продукт процесу трансформації, але і його трансгенне потомство. Поняття "нетрансформований", "нетрансгенний" або "нерекомбінантний" хазяїн належать до організму дикого типу, наприклад, до бактерії або рослини, який не містить молекули гетерологічної нуклеїнової кислоти. Термін "трансгенне явище" належить до рекомбінантної рослини, одержаної за допомогою трансформації і регенерації єдиної рослинної клітини із застосуванням гетерологічної ДНК, наприклад, експресуючої касети, яка включає цільовий ген. Термін "явище" належить до первісного трансформанта і/або потомства трансформанта, що включає гетерологічну ДНК. Термін "явище" також належить до потомства, одержаного в результаті полового ауткросингу (неспорідненого схрещування) між трансформантом і іншою лінією цукрового буряка. Навіть після повторного зворотного схрещування з тією ж вихідною батьківською лінією цільова ДНК і фланкуюча ДНК трансформованого батька представлені в гібридному потомстві, маючи ту ж хромосомну локалізацію. В нормі трансформація рослинної тканини породжує множинні явища, кожне з який являє собою інсерцію структурного компонента ДНК у різні локуси геному рослинної клітини. Специфічне явище вибирають на основі експресії трансгена або по інших бажаних характеристиках. Термін "трансген" належить до гена, введеного в геном організму за допомогою генетичної маніпуляції з метою зміни його (організму) генотипу. "Трансгенна рослина" - це рослина, яка має одну або більше рослинних клітин, у яких міститься вектор експресії. Термін "матрична РНК (мРНК)" належить до РНК, у якій немає інтронів і яка може транслюватися клітиною в білок. Термін "кДНК" належить до однониткової або двониткової ДНК, яка одержана з мРНК і комплементарна ній. Термін "експресія" при його використанні застосовно до послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, до гена, належить до процесу перетворення генетичної інформації, що закодована в гені, у РНК (наприклад, у мРНК, рРНК, тРНК або мяРНК) через "транскрипцію" гена (тобто через ферментативну дію РНК-полімерази), а також у білок, де це застосовно (якщо ген кодує білок), через "трансляцію" мРНК. Експресію гена можна регулювати на багатьох стадіях процесу. Поняття "надекспресія" належить до такого рівня експресії в трансгенних клітках або організмах, який перевищує рівень експресії в нормальних або не трансформованих (не трансгенних) клітинах або організмах. Поняття "антисмислове інгібування" належить до вироблення антисмислових транскриптів РНК, здатних пригнічувати експресію білка, кодованого ендогенним геном або трансгеном. 6 UA 98766 C2 Поняття "мовчання гена" належить до залежної від гомології супресії вірусних генів, трансгенів або ендогенних ядерних генів. Мовчання генів може бути транскрипційним, коли супресія є наслідком зниженої транскрипції уражених генів, або посттранскрипційним, коли супресія є наслідком посиленого обороту (деградації) різновидів РНК, гомологічних ураженим генам. Мовчання гена включає індуковане вірусом мовчання гена. Поняття "РНК-інтерференція" (iРНК) належить до процесу специфічного відносно послідовності посттрансляційного мовчання гена у рослин і тварин, опосередкованого малими (або короткими) інтерферуючими РНК (міРНК). Компетентному фахівцю відомі концептуальні поняття різних термінів, наприклад, міРНК, цільова молекула РНК, дайсер або фермент рибонуклеаза III, а повний опис цих термінів і інших концептуальних понять, що належать до РНКі, можна знайти в літературі. Для довідки деякі терміни, що належать до РНКі, визначені нижче. Однак варто розуміти, що в рамках практичної реалізації даного винаходу жодна окрема гіпотеза, що описує механізми РНКі, не повинна розглядатися як необхідна. Термін "міРНК" належить до малих (коротких) інтерферуючих РНК. У деяких варіантах реалізації винаходу міРНК включає дуплекс або двонитковий регіон довжиною приблизно 21-23 нуклеотиди, часто міРНК містить приблизно від двох до чотирьох неспарених нуклеотидів на 3'кінці коленої нитки. Щонайменше одна нитка дуплекса або двониткової ділянки міРНК по суті гомологічна або по суті комплементарна цільовій молекулі РНК. Нитка, комплементарна цільовій молекулі РНК, є "антисмисловою ниткою", нитка, гомологічна цільовій молекулі РНК, є "смисловою ниткою" і також комплементарна антисмисловій нитці міРНК. Молекула міРНК може також містити додаткові послідовності, які не обмежують приклади таких послідовностей включають сполучні послідовності або петлі, а також стебла й інші складчасті структури. Конструкції типу міРНК, очевидно, функціонують як ключові посередники в пусковій РНКінтерференції у безхребетних і хребетних, а також у пусковій деградації РНК, специфічній відносно послідовності, у період посттрансляційного мовчання гена у рослин. Термін "цільова молекула РНК" належить до такої молекули РНК, відносно якої гомологічна або комплементарна щонайменше одна нитка короткої двониткової ділянки міРНК. У типовому випадку, якщо гомологія або комплементарність складає приблизно 100 %, то міРНК здатна заглушити або пригнітити експресію цільової молекули РНК. Хоча вважається, що ціллю для міРНК є мРНК, яка пройшла процесинг, даний винахід не обмежується якою-небудь окремою гіпотезою, і така гіпотеза не повинна розглядатися як необхідна для практичної реалізації даного винаходу. Таким чином, передбачається, що цілями для міРНК також можуть бути інші молекули РНК. Такі цільові молекули РНК включають мРНК, що не пройшла процесинг, рибосомну РНК і геноми вірусної РНК. "РНК-індукуючий комплекс мовчання" (RISC) опосередковує розщеплення однониткової РНК із послідовністю, комплементарною антисмисловим ниткам дуплекса міРНК. Розщеплення цільової РНК відбувається в середині ділянки, комплементарної антисмисловій нитці дуплекса міРНК (Eibashier et al. 2001). Термін "в достатній мірі комплементарний" означає, що послідовність першої або другої нитки РНК, введеної в рослинну клітину, здатна практично повністю гібридизуватися або відпалюватися з РНК, вироблюваної цільовим геном (мРНК) у цитоплазмі зазначеної рослинної клітини, запускаючи пригнічення експресії цільового гена. Наприклад, послідовність першої або другої нитки РНК, яка зв'язується з мРНК, вироблюваною цільовим геном, ідентична відповідній послідовності мРНК цільового гена щонайменше на 50 %, переважніше щонайменше на 70 %, ще переважніше щонайменше на 90 % і ще переважніше щонайменше на 95 %. Необхідно розуміти, що процентний показник ідентичності між послідовністю першої або другої нитки РНК і мРНК, вироблюваною цільовим геном, що знаходиться в діапазоні між ідентичністю щонайменше 70 % і ідентичністю щонайменше 95 %, може являти собою будь-яку числову величину в цьому діапазоні. Даний винахід включає трансгенні рослини цукрового буряка і способи модулювання реакції яровизації у цукрового буряка за рахунок надекспресії гена FLC і/або пригнічення експресії гена AGL20 у цукрового буряка. Один з варіантів реалізації винаходу включає конститутивну експресію гена FLC, результатом якої є модулювання стійкості до стрілкування у цукрового буряка. Відповідно до даного винаходу трансгенні рослини цукрового буряка з надекспресією гена FLC перестають реагувати на типовий 18-тижневий період яровизації викиданням стрілки і цвітінням, а на відміну від цього продовжують вегетативний ріст (без викидання стрілки) розвитком нормального стрижневого кореня. Винахід включає трансгенну рослину цукрового буряка, у геномі якої є кодуюча область гетерологічного гена FLC, причому експресія гена FLC викликає надекспресію продукту гена 7 UA 98766 C2 FLC, завдяки чому відбувається пригнічення реакцій яровизації у рослини цукрового буряка. Ген вважається таким, що надекспресується, якщо його експресія перевищує нормальний рівень експресії у нативної (нетрансформованої) рослини цукрового буряка, особливо, поняття надекспресії належить до таких ситуацій, коли експресія перевищує вихідний рівень експресії у нативної (нетрансформованого) рослини цукрового буряка щонайменше на 10 %, переважніше щонайменше на 20 %, ще переважніше щонайменше на 30 %, ще переважніше щонайменше на 40 %, але особливо переважно щонайменше від 50 % до 100 % або більше. У специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується рослина цукрового буряка, у якої зазначений гетерологічний ген FLC включає гетерологічну кодуючу область FLC, яка складається з кДНК, зареєстровану під інвентарним номером AF537203 (http://ftp.dna.affrc.go.jp/pub/dna_all/A/F5/37/20/AF537203/AF537203), особливо під контролем гетерологічного конститутивного промотору, який викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Даний винахід також включає трансгенну рослину цукрового буряка, у геномі якої є присутнім гетерологічний ген FLC, структура якого описана в SEQ ID NO:3, причому експресія гена FLC викликає надекспресію продукту гена FLC, тим самим пригнічуючи реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Даний винахід також включає трансгенну рослину цукрового буряка, у геномі якої є присутнім ендогенний ген FLC, структура якого описана в SEQ ID NO:27, 28 і 29, або кодуюча частина цього гена, особливо під контролем. гетерологічного конститутивного промотору, який викликає надекспресію продукту ендогенного гена і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Даний винахід також включає трансгенну рослину цукрового буряка, у геномі якої є присутнім ендогенний ген FLC, структура якого описана в SEQ ID NO:21, 23 і 25, або кодуюча частина цього гена, особливо під контролем гетерологічного конститутивного промотору, який викликає надекспресію продукту ендогенного гена і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Винахід також включає трансгенну рослину цукрового буряка, у геномі якої є присутнім гетерологічний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю кДНК FLC, зареєстрованою під інвентарним номером AF537203, особливо під контролем гетерологічного конститутивного промотору, який викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. У специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується гетерологічний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю кДНК FLC, описаною в SEQ ID N0:3, причому експресія гена FLC викликає надекспресію продукту гена FLC, тим самим пригнічуючи реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Винахід також включає трансгенну рослину цукрового буряка, у геномі якої є присутнім ендогенний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, описаною в SEQ ID NO: 27, 28 і 29, або кодуюча частина цього гена, причому ця кодуюча частина може знаходитися під контролем гетерологічного конститутивного промотору, коли експресія гена FLC викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Винахід також включає трансгенну рослину цукрового буряка, у геномі якої є присутнім ендогенний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, описаною в SEQ ID NO: 21, 23 і 25, або кодуюча частина цього гена, причому ця кодуюча частина може знаходитися під контролем гетерологічного конститутивного промотору, коли експресія гена FLC викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Винахід також включає насінний матеріал трансгенного цукрового буряка, у геномі якого є присутнім гетерологічний ген FLC, який включає кодуючий регіон, що складається з кДНК FLC, зареєстрованої під інвентарним номером AF537203, особливо під контролем гетерологічного конститутивного промотору, який викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. У специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується гетерологічний ген FLC, описаний у SEQ ID NO:3, причому експресія гена FLC у рослини, вирощеної з зазначеного насінного матеріалу, викликає надекспресію продукту гена FLC, тим самим пригнічуючи реакції яровизації у рослини цукрового буряка. 8 UA 98766 C2 Винахід також включає насінний матеріал трансгенної рослини цукрового буряка, у геномі якого є присутнім ендогенний ген FLC, що описаний у SEQ ID NO: 27, 28 і 29, або кодуюча частина цього гена, особливо за тієї умови, що ця кодуюча частина ендогенного гена FLC знаходиться під контролем гетерологічного конститутивного промотору, коли експресія гена FLC у рослини, вирощеної з зазначеного насінного матеріалу, викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Винахід також включає насінний матеріал трансгенної рослини цукрового буряка, у геномі якого є присутнім ендогенний ген FLC, що описаний у SEQ ID NO:21, 23 і 25, або кодуюча частина цього гена, особливо за тієї умови, що ця кодуюча частина ендогенного гена FLC знаходиться під контролем гетерологічного конститутивного промотору, коли експресія гена FLC у рослини, вирощеної з зазначеного насінного матеріалу, викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Винахід також включає насінний матеріал трансгенної рослини цукрового буряка, у геномі якого є присутнім гетерологічний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю кДНК FLC, зареєстрованою під інвентарним номером AF537203, особливо під контролем гетерологічного конститутивного промотору, який викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрової буряка. У специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується гетерологічний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю кДНК FLC, описаною в SEQ ID NO:3, причому експресія гена FLC у рослини, вирощеної з зазначеного насінного матеріалу, викликає надекспресію продукту гена FLC, тим самим пригнічуючи реакції яровизації у рослини цукрової буряка. Винахід також включає насінний матеріал трансгенної рослини цукрового буряка, у геномі якого є присутнім ендогенний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, описаною в SEQ ID NO:27, 28 і 29, або кодуюча частина цього гена, причому ця кодуюча частина може знаходитися під контролем гетерологічного конститутивного промотору, коли експресія гена FLC у рослини, вирощеної з цього насінного матеріалу, викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Винахід також включає насінний матеріал трансгенної рослини цукрового буряка, причому в геномі цього насінного матеріалу присутній ендогенний ген FLC, що має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, описаною в SEQ ID NO:21, 23 і 25, або кодуюча частина цього гена, причому ця кодуюча частина може знаходитися під контролем гетерологічного конститутивного промотору, коли експресія гена FLC у рослини, вирощеної з цього насінного матеріалу, викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у рослини цукрового буряка. Один з варіантів реалізації винаходу включає пропоновану винаходом трансгенну рослину цукрового буряка, яка несе у своєму геномі гетерологічний ген FLC, як це розкрито тут, причому цей ген був попередньо вбудований у експресуючу касету, особливо в експресуючу касету з нуклеотидною послідовністю 786-2817 з SEQ ID NO:1. Один з варіантів реалізації винаходу включає пропоновану винаходом трансгенну рослину цукрового буряка, яка несе у своєму геномі гетерологічний ген FLC, як це розкрито тут, причому цей ген був попередньо вбудований у експресуючу касету, особливо в експресуючу касету з нуклеотидною послідовністю 786-2817 з SEQ ID NO:1, причому ця експресуюча касета включає конститутивний промотор. Один з варіантів реалізації винаходу включає пропоновану винаходом трансгенну рослину цукрового буряка, яка несе у своєму геномі гетерологічний ген FLC, як це розкрито тут, причому цей ген був попередньо вбудований у експресуючу касету, особливо в експресуючу касету з нуклеотидною послідовністю 786-2817 з SEQ ID NO:1, причому ця експресуюча касета включає промотор CaMV35S. В іншому специфічному варіанті реалізації винахід належить до трансгенної рослини цукрового буряка, геном якої включає гетерологічний ген FLC, як це розкрито тут вище, особливо вбудований у експресуючу касету під контролем конститутивного промотору, переважно конститутивного промотору CaMV35S, а також термінатора, переважно, манопінсинтетази (mas) з Agrobacterium tumefaciens. В одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної рослини цукрового буряка, в якій міститься експресуюча касета з кодуючим регіоном ендогенного гена FLC, переважно гена FLC, структура якого описана в SEQ ID NO:27, 28 і 29. 9 UA 98766 C2 В одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної рослини цукрового буряка, в якій міститься експресуюча касета з кодуючим регіоном ендогенного гена FLC, переважно гена FLC, структура якого описана в SEQ ID NO:21, 23 і 25. У специфічному варіанті реалізації винаходу зазначена кодуюча область ендогенного гена FLC знаходиться під контролем конститутивного промотору, переважно конститутивного промотору CaMV35S, але найбільше переважно під контролем конститутивного промотору CaMV35S і термінатора, переважно, манопін-синтетази (mas) з Agrobacterium tumefaciens. Ще в одному варіанті реалізації винахід пов'язаний зі способом одержання пропонованої цим винаходом трансгенної рослини цукрового буряка, причому зазначений спосіб включає: - трансформування клітини рослини цукрового буряка трансгеном, що включає регуляторні послідовності, які функціонально зв'язані з кодуючою областю гетерологічного або ендогенного гена рослин FLC; - ідентифікацію клітини рослини цукрового буряка, яка несе вбудований трансген, і - регенерацію трансгенної рослини з рослинної клітини, ідентифікованої в попередньому пункті. Далі, даний винахід включає виробництво біопалива, зокрема етанолу, бутанолу, метанолу, біогазу і дизельного палива, одержуваного із запропонованої винаходом трансгенної рослини цукрового буряка, яка, як це описано вище, містить у своєму геномі кодуючу область гетерологічного або ендогенного гена FLC, причому експресія зазначеного гена FLC викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у зазначеної рослини цукрового буряка. Далі, даний винахід включає виробництво в промислових масштабах інших корисних матеріалів, наприклад, пластиків, одержуваних із запропонованої винаходом трансгенної рослини цукрового буряка, яка, як це описано вище, містить у своєму геномі кодуючу область гетерологічного або ендогенного гена FLC, причому експресія зазначеного гена FLC викликає надекспресію продукту гена FLC і тим самим пригнічує реакції яровизації у зазначеної рослини цукрового буряка. Даний винахід також включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 у клітині рослини цукрового буряка, який включає введення в зазначену рослинну клітину першої нитки РНК і другої нитки РНК, причому зазначена перша нитка РНК або в альтернативному варіанті зазначена друга нитка РНК по суті комплементарні щонайменше частині нитки РНК зазначеного ендогенного гена AGL20 і здатні гібридизуватися або відпалюватися з РНК, вироблюваної геном AGL20, викликаючи пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нитка РНК і зазначена друга нитка РНК утворюють двониткову РНК, яка бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20. Один з варіантів реалізації винаходу включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 у рослини цукрового буряка, який полягає у введенні в зазначену рослинну клітину першої нитки РНК і другої нитки РНК, причому введення в зазначену рослинну клітину першої нитки РНК і другої нитки РНК приводить до трансформування зазначеної клітини за участі гетерологічної ДНК, яка при транскрибуванні в рослинній клітині дає вихід нуклеотидній послідовності, що відповідає зазначеній першій нитці РНК, і нуклеотидній послідовності, що відповідає зазначеній другій нитці РНК. Ще в одному варіанті реалізації винаходу зазначена гетерологічна ДНК включає інвертований повтор, який при транскрибуванні дає вихід нуклеотидній послідовності, що відповідає зазначеній першій нитці РНК, і нуклеотидній послідовності, що відповідає зазначеній другій нитці РНК. У специфічному варіанті реалізації винахід належить до пропонованого способу пригнічення експресії ендогенного гена, як це описано вище, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК має ступінь комплементарності з частиною РНК фрагмента гена AGL20 цукрового буряка розміром приблизно 0,6 кб, одержуваного з кДНК цукрового буряка, яка, у свою чергу, одержана з тотальної РНК, екстрагованої з листя цукрового буряка в реакції зі зворотною транскриптазою і з використанням праймера , причому одержана кДНК використовується як шаблон у ПЛР (полімеразній ланцюговій реакції), де задіяний вироджений прямий праймер з нуклеотидною послідовністю , яка суміщає гомологію послідовності з крайньою кінцевою ділянкою NH2, починаючи від кодону ATG з охопленням кодонів з 1 по 9, а також вироджений зворотний праймер з нуклеотидною послідовністю , яка комплементарна кінцевій ділянці СООН, гібридизуючись безпосередньо вверх від стоп-кодону в екзоні 8, що дозволяє зазначеній першій 10 UA 98766 C2 нитці РНК гібридизуватися або відпалюватися з ниткою РНК, зазначеного фрагмента гена AGL20, приводячи до пригнічення експресії ендогенного гена AGL20. Ще один варіант реалізації винаходу включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, як це описано тут вище, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК по суті комплементарна частині РНК фрагмента гена AGL20 цукрового буряка, структура якого описана в SEQ ID NO:6, що дозволяє їй гібридизуватися або відпалюватися з РНК, вироблюваною геном AGL20 і тим самим викликати супресію експресії ендогенного гена AGL20. Ця супресія гена AGL20 приводить до затримки реакцій яровизації у зростаючого цукрового буряка або викликає у цукрового буряка розвиток фенотипу, що не стрілкується, а це означає, що рослина цукрового буряка перестає реагувати на типовий 18-тижневий період яровизації викиданням стрілки і наступним цвітінням, продовжуючи вегетативний ріст (без викидання стрілки) і розвиваючи нормальний стрижневийкорінь. Рослини, експресуючі зазначене уповільнення реакцій яровизації або зазначений фенотип, що не стрілкується, можна досить просто ідентифікувати і відбирати, застосовуючи експерименти з фенотипічним аналізом при стандартизованих умовах вирощування піддослідних рослин. Винахід також включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, як це описано тут вище, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК включає фрагмент послідовності довжиною приблизно від 21 до 23 нуклеотидів, який по суті комплементарний частині РНК зазначеного гена AGL20 цукрового буряка, завдяки чому і відбувається пригнічення експресії ендогенного гена AGL20. Винахід включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, як це описано тут вище, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК включає фрагмент послідовності довжиною приблизно від 21 до 25 нуклеотидів, який по суті комплементарний частині РНК зазначеного гена AGL20 цукрового буряка, завдяки чому і відбувається пригнічення експресії ендогенного гена AGL20. Винахід додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК включає фрагмент послідовності довжиною приблизно від 21 до 30 нуклеотидів, який по суті комплементарний частині РНК зазначеного гена AGL20 цукрового буряка, завдяки чому і відбувається пригнічення експресії ендогенного гена AGL20. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК включає фрагмент послідовності довжиною приблизно від 18 до 23 нуклеотидів, який по суті комплементарний частині РНК зазначеного гена AGL20 цукрового буряка, завдяки чому і відбувається пригнічення експресії ендогенного гена AGL20. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК включає фрагмент послідовності довжиною приблизно від 18 до 25 нуклеотидів, який по суті комплементарний частині РНК зазначеного гена AGL20 цукрового буряка, завдяки чому і відбувається пригнічення експресії ендогенного гена AGL20. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначена перша нитка РНК включає фрагмент послідовності довжиною приблизно від 18 до 30 нуклеотидів, який по суті комплементарний частині РНК зазначеного гена AGL20 цукрового буряка, завдяки чому і відбувається пригнічення експресії ендогенного гена AGL20. В одному з варіантів реалізації винахід належить до пропонованого способу пригнічення експресії гена AGL20, як це описано вище, причому в цьому способі гетерологічна ДНК, яка транскрибує зазначену першу нитку РНК, одержана з фрагмента кДНК розміром 0,26 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 фрагмента гена AGL20 цукрового буряка розміром приблизно 0,6 кб, одержуваного з кДНК цукрового буряка, яка, у свою чергу, одержана з тотальної РНК, екстрагованої з листя цукрового буряка в реакції зі зворотною транскриптазою і з застосуванням праймера , причому одержана кДНК використовується як шаблон у ПЛР (гюлімеразній ланцюговій реакції), де задіяний вироджений прямий праймер з нуклеотидною послідовністю , яка суміщає гомологію послідовності з крайньою кінцевою ділянкою NH2, починаючи від кодону ATG з охопленням кодонів з 1 по 9, а також вироджений зворотний праймер з нуклеотидною послідовністю , яка комплементарна СООН-кінцю, гібридизуючись безпосередньо вверх від стоп-кодону в екзоні 8, у реакції ПЛР із застосуванням 11 UA 98766 C2 прямого праймера, який має нуклеотидну послідовність , і зворотного праймера з нуклеотидною послідовністю . Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії гена AGL20, у якому структура гетерологічної ДНК, яка транскрибує зазначену першу нитку РНК, описана в SEQ ID NO:5. В одному з аспектів винахід належить до експресуючої касети, що включає гетерологічну ДНК, яка, у свою чергу, включає першу нитку РНК і другу нитку РНК, причому зазначена перша нитка РНК має такий ступінь комплементарності щонайменше з частиною нитки РНК, транскрибованої ендогенним геном AGL20, яка дозволяє зазначеній першій нитці РНК гібридизуватися або відпалюватися з ниткою РНК, транскрибованою зазначеним ендогенним геном AGL20, а зазначена перша нитка РНК і зазначена друга нитка РНК утворюють двониткову РНК, яка, експресуючись у рослині викликає супресію ендогенного гена AGL20. У специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується експресуюча касета, що включає інвертований повтор, який, транскрибуючись в клітині цукрового буряка, формує в зазначеній рослинній клітині молекулу двониткової РНК, яка включає зазначені першу і другу нитки РНК. Ще в одному специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується експресуюча касета, у якій зазначений інвертований повтор функціонально зв'язаний з конститутивним промотором, переважно із промотором CaMV. В одному з варіантів реалізації винахід належить до експресуючої касети, що описана тут вище, яка містить гетерологічну ДНК, що транскрибує зазначену першу нитку РНК, причому ця гетерологічна ДНК одержана з фрагмента кДНК розміром 0,28 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 фрагмента гена AGL20 цукрового буряка розміром приблизно 0,6 кб, одержуваного з кДНК цукрового буряка, яка, у свою чергу, одержана з тотальної РНК, екстрагованої з листя цукрового буряка в реакції зі зворотною транскриптазою і з застосуванням праймера , причому одержана кДНК використовується як шаблон у ПЛР (полімеразній ланцюговій реакції), де задіяний вироджений прямий праймер з нуклеотидною послідовністю , яка суміщає гомологію послідовності з крайньою кінцевою ділянкою NH2, починаючи від кодону ATG з охопленням кодонів з 1 по 9, а також вироджений зворотний праймер з нуклеотидною послідовністю , яка комплементарна СООНкінцю, гібридизуючись безпосередньо вверх від стоп-кодону в екзоні 8, у реакції ПЛР із застосуванням прямого праймера, який має нуклеотидну послідовність , і зворотного праймера з нуклеотидною послідовністю . Ще в одному специфічному варіанті реалізації винаходу експресуюча касета містить гетерологічну ДНК, описану в SEQ ID NO:5. В одному з варіантів реалізації винаходу пропонований винаходом експресуюча касета, описана тут вище, включає інвертований повтор, який, транскрибуючись в клітині цукрового буряка, формує в зазначеній рослинній клітині молекулу двониткової РНК, яка включає зазначені першу і другу нитки РНК. У специфічному варіанті реалізації винаходу зазначений інвертований повтор функціонально зв'язаний з конститутивним промотором, переважно із промотором CaMV. В одному з варіантів реалізації винахід належить до описаної тут вище експресуючої касети, у якій зазначена гетерологічна ДНК вставлена між промотором і термінатором, причому ця гетерологічна ДНК може бути одержана за допомогою: a) ампліфікації фрагмента кДНК розміром 0,28 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 фрагмента гена AGL20 розміром 0,6 кб, який відповідає винаходу й описаний тут вище, у ПЛР із використанням прямого праймера, який має нуклеотидну послідовність , і зворотного праймера з нуклеотидною послідовністю ; b) ампліфікації фрагмента 0,19 кб, що включає інтрон ST-LS1 і фланкуючі сайти сплайсингу, з використанням прямого праймера і зворотного праймера c) злиття продуктів ампліфікації, одержаних на етапах а) і b), одного з одним за допомогою повторної ПЛР із застосуванням праймерів, описаних у SEQ ID NO:8 і SEQ ID NO:7, а також з використанням суміші обох продуктів ампліфікації як шаблона, що дає на виході гібридний продукт довжиною 0,47 кб; 12 UA 98766 C2 d) ампліфікації фрагмента BvAGL20 розміром 0,28 кб вдруге із застосуванням прямого праймера і зворотного праймера , які відрізняються від праймерів, використаних на етапі а) відносно їх лінкерів; e) злиття обох фрагментів у сайтах рестрикції Sac II для створення інвертованого повтору послідовності BvAGL20, відділеного інтроном від гена картоплі ST-LS1. У специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується експресуюча касета, описана нуклеотидною послідовністю 233-2657 з SEQ ID NO:2. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі введення зазначених першої і другої ниток РНК здійснюється за допомогою вставки в геном зазначеної рослинної клітини експресуючої касети, пропонованої винаходом і описаної вище, яка включає зазначену гетерологічну ДНК. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначена експресуюча касета описана нуклеотидною послідовністю 233-2657 з SEQ ID NO:2. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі введення зазначених першої і другої ниток РНК здійснюється за допомогою інсерції (вставки) зазначених ниток у рослинну клітину через ін'єкцію. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, який додатково включає введення в геном рослини експресуючої касети, що включає інвертований повтор, який при транскрибуванні утворює молекулу двониткової РНК у зазначеній рослинній клітині, яка включає зазначені першу і другу нитки РНК. Один з варіантів реалізації винаходу додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначена експресуюча касета описана нуклеотидною послідовністю 233-2657 з SEQ ID NO:6. Винахід додатково включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначений інвертований повтор функціонально зв'язаний з конститутивним промотором. Винахід включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, що додатково включає інтрон, розташований між першою і другою нитками РНК. Винахід також включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, причому в цьому способі зазначений інтрон описаний нуклеотидною послідовністю 817-1009 з SEQ ID NO:2. Винахід включає трансгенную клітину цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, яка включає гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної зазначеним ендогенним геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися з РНК, вироблюваної геном AGL20, тобто викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, яка бере участь у РНКінтерференції, що пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20. В одному з варіантів реалізації винаходу пропонується трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, у якій гетерологічна ДНК може бути одержана з фрагмента кДНК розміром 0,28 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 фрагмента гена AGL20 розміром 0,6 кб, який відповідає винаходу й описаний тут вище, у ПЛР із використанням прямого праймера, який має нуклеотидну послідовність , і зворотного праймера з нуклеотидною послідовністю . У специфічному варіанті реалізації винаходу трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, відповідно до винаходу включає гетерологічну генну конструкцію, причому гетерологічна ДНК описується SEQ ID NO:5. Ще в одному специфічному варіанті реалізації винаходу трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, відповідно до винаходу включає гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена генна конструкція включає інвертований повтор, який при транскрибуванні утворює у зазначеній рослинній клітині молекулу двониткової 13 UA 98766 C2 РНК, що включає зазначені першу і другу нитки РНК, причому зазначена молекула двониткової РНК є пусковим фактором мовчання гена AGL20. У специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, яка включає гетерологічну ДНК, що вставлена між промотором і термінатором, причому зазначена гетерологічна ДНК одержана за допомогою: a) ампліфікації фрагмента кДНК розміром 0,28 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 фрагмента гена AGL20 розміром 0,6 кб, який відповідає винаходу й описаний тут вище, у рекомбінантній ПЛР із використанням прямого праймера, який має нуклеотидну послідовність , і зворотного праймера з нуклеотидною послідовністю ; b) ампліфікації фрагмента 0,19 кб, який включає інтрон ST-LS1 і фланкуючі сайти сплайсингу, з використанням прямого праймера і зворотного праймера ; c) злиття продуктів ампліфікації, одержаних на етапах а) і b), одного з одним за допомогою повторної ПЛР із застосуванням праймерів, описаних у SEQ ID NO:8 і SEQ ID NO:7, і використання суміші обох продуктів ампліфікації як шаблона з одержанням на виході гібридного продукту розміром 0,47 кб; d) ампліфікації фрагмента BvAGL20 розміром 0,28 кб вдруге із застосуванням прямого праймера і зворотного праймера які відрізняються від праймерів, використаних на етапі а) відносно їх лінкерів; e) злиття обох фрагментів у сайтах рестрикції Sac II для створення інвертованого повтору послідовності BvAGL20, відділеного інтроном від гена картоплі ST-LS1. Ще в одному специфічному варіанті реалізації винаходу трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, відповідно до винаходу включає гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена генна конструкція включає експресуючу касету, описану у SEQ ID NO:2. В іншому специфічному варіанті реалізації винаходу пропонується трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, яка включає експресуючу касету, що відповідає винаходу, яка була описана тут вище. В одному з варіантів реалізації винахід пов'язаний зі способом одержання пропонованої цим винаходом і описаної вище трансгенної рослини цукрового буряка, причому зазначений спосіб включає: a) трансформацію клітини цукрового буряка експресуючою касетою відповідно до винаходу, як це було описано тут вище, b) ідентифікацію клітини цукрового буряка, яка містить гетерологічну ДНК, c) регенерацію трансгенної рослини з зазначеної рослинної клітини, ідентифікованої на етапі b), d) ідентифікацію рослини цукрового буряка, що демонструє затримку реакцій яровизації або повне пригнічення реакцій яровизації, проявом чого є фенотип, що не стрілкується (NB). e) на вибір, підтвердження присутності в геномі рослинної клітини гетерологічної ДНК, введеної на етапі а). Винахід також включає спосіб пригнічення експресії гена AGL20 у клітині рослини цукрового буряка, який включає введення в рослинну клітину першого фрагмента РНК, що по суті ідентичний або комплементарний частині гена AGL20, другого фрагмента РНК, що по суті комплементарний першому фрагменту РНК, для одержання в результаті цих дій пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, причому в цьому способі перший і другий фрагменти РНК утворюють у рослинній клітині молекулу двониткової РНК, і ця молекула двониткової РНК пригнічує експресію гена AGL20 через міРНК-опосередковане мовчання гена. Винахід також включає спосіб пригнічення експресії ендогенного гена AGL20 у рослині цукрового буряка, причому зазначений спосіб включає: a) введення в клітину рослини цукрового буряка першої нитки РНК; b) вирощування зазначеної рослинної клітини в першій рослині; c) введення в другу клітину рослини цукрового буряка другої нитки РНК, причому зазначена перша нитка РНК повинна бути по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, вироблюваної зазначеним ендогенним геном AGL20, і здатна гібридизуватися або 14 UA 98766 C2 відпалюватися з РНК, вироблюваної геном AGL20. приводячи до пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нитка РНК і зазначена друга нитка РНК повинні бути здатними утворювати двониткову РНК; d) вирощування зазначеної другої клітини цукрового буряка в другій рослині; e) схрещування зазначеної першої рослини з зазначеною другою рослиною для одержання насіння; і f) вирощування рослини з зазначеного насіння, причому в цій рослині зазначені перша і друга нитки РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНК-інтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20. У специфічному аспекті винахід належить до трансгенної клітини цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, геном якої включає: і) першу гетерологічну генну конструкцію, що включає кодуючу область гетерологічного або ендогенного гена FLC, і іі) другу гетерологічну генну конструкцію, здатну кодувати композицію РНК, причому зазначена конструкція включає гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної зазначеним ендогенним геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися з РНК, вироблюваної геном AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНК-інтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20. В одному з варіантів реалізації винаходу пропонується трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, у якій зазначена перша гетерологічна генна конструкція включає кодуючу область гена, яка складається з кДНК, зареєстрованої під інвентарним номером AF537203. У специфічному варіанті реалізації винаходу зазначений ген FLC описаний y SEQ ID NO:3. Ще в одному варіанті реалізації винаходу пропонується трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, у якій зазначений ген FLC включає кодуючу область гена FLC, яка має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю кДНК FLC з інвентарним номером AF537203. У специфічному варіанті реалізації винаходу зазначений ген FLC має щонайменше 93 %99 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю, описаною в SEQ ID NO:3. Ще в одному специфічному варіанті реалізації винаходу зазначений ген FLC включає кодуючу область ендогенного гена FLC, описану в SEQ ID NO: 21, 23 і 25. Ще в одному специфічному варіанті реалізації винаходу зазначений ген FLC включає кодуючу область FLC, яка має щонайменше 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 % або 93 % ідентичність послідовності з нуклеотидною послідовністю кодуючої області FLC ендогенного гена FLC, описаною в SEQ ID NO:21, 23 і 25. В одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної клітини цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка (відповідно до винаходу, як це було описано тут вище), причому зазначена гетерологічна ДНК, включена в другу генну конструкцію, може бути одержана з фрагмента кДНК розміром 0,28 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 фрагмента гена AGL20 розміром 0,6 кб, який відповідає винаходу й описаний тут вище, у ПЛР із використанням прямого праймера, який має нуклеотидну послідовність , і зворотного праймера з нуклеотидною послідовністю . В одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної клітини цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка (відповідно до винаходу, як це було описано тут вище), причому гетерологічна ДНК, яка транскрибує зазначену першу нитку РНК, описана в SEQ ID NO:5. В одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної клітини або трансгенної рослини цукрового буряка (відповідно до винаходу, як це було описано тут вище), причому зазначена гетерологічна ДНК, включена в другу генну конструкцію, включає інвертований повтор, який при транскрибуванні утворює у зазначеній рослинній клітині молекулу двониткової РНК, яка включає зазначені першу і другу нитки РНК, причому зазначена молекула двониткової РНК є пусковим фактором мовчання гена AGL20. В одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної клітини або трансгенної рослини цукрового буряка, що відповідають винаходу й описані тут вище, які включають у другій 15 UA 98766 C2 генній конструкції гетерологічну ДНК, вставлену між промотором і термінатором, причому ця гетерологічна ДНК може бути одержана за допомогою: а) ампліфікації фрагмента кДНК розміром 0,28 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 фрагмента гена AGL20 розміром 0,6 кб, який відповідає винаходу й описаний тут вище, у ПЛР із використанням прямого праймера, який має нуклеотидну послідовність , і зворотного праймера з нуклеотидною послідовністю ; b) ампліфікації фрагмента довжиною 0,19 кб, який включає інтрон ST-LS1 і фланкуючі сайти сплайсингу, з використанням прямого праймера і зворотного праймера ; c) злиття продуктів ампліфікації, одержаних на етапах а) і b), одного з одним за допомогою повторної ПЛР із застосуванням праймерів, описаних у SEQ ID NO:8 і SEQ ID NO:7, і з використанням суміші обох продуктів ампліфікації як шаблона з одержанням на виході гібридного продукту розміром 0,47 кб; d) ампліфікації фрагмента BvAGL20 розміром 0,28 кб вдруге із застосуванням прямого праймера і зворотного праймера , які відрізняються від праймерів, використаних на етапі а) відносно їх лінкерів; e) злиття обох фрагментів у сайтах рестрикції Sac II для створення інвертованого повтору послідовності BvAGL20, відділеного інтроном від гена картоплі ST-LS1. В одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної клітини або трансгенної рослини цукрового буряка, що відповідають винаходу й описані тут вище, у яких зазначена гетерологічна ДНК, включена в другу генну конструкцію, описана нуклеотидною послідовністю 233-2657 з SEQ ID NO:2. В одному з варіантів реалізації винаходу пропонується трансгенна клітина цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, у якій зазначена друга гетерологічна генна конструкція включена в експресуючу касету, що відповідає винаходу, описану тут вище. У специфічному аспекті винахід належить до трансгенної рослини цукрового буряка, як це описано тут вище, причому спільна експресія першої і другої гетерологічних генних конструкцій приводить до синергічної затримки реакцій яровизації у зазначеної рослини цукрового буряка. Таким чином, в одному з варіантів реалізації винахід належить до трансгенної клітини цукрового буряка, переважно трансгенного цукрового буряка, яка включає продукти експресії генів AGL20 і FLC у синергічно ефективній кількості. Ще в одному специфічному аспекті винахід належить до трансгенної рослини цукрового буряка, як це описано тут вище, причому спільна експресія першої і другої гетерологічних генних конструкцій приводить до повного пригнічення реакцій яровизації у зазначеної рослини цукрового буряка, що виражається в розвитку фенотипу, що не стрілкується (NB). Ще в одному специфічному аспекті винахід належить до трансгенної рослини цукрового буряка, як це описано тут вище, причому ця рослина одержана в результаті схрещування двох батьківських рослин, коли перша гетерологічна генна конструкція успадкована від одного батька, а друга гетерологічна генна конструкція успадкована від іншого батька, причому щонайменше одна з батьківських рослин не виявляє фенотип, що не стрілкується (NB). В одному з варіантів реалізації винахід належить до способу одержання пропонованої цим винаходом трансгенної рослини цукрового буряка, причому зазначений спосіб включає: a) трансформацію клітини цукрового буряка експресуючою касетою, яка включає гетерологічний ген FLC, причому зазначений ген FLC функціонально зв'язаний з регуляторними послідовностями, і/або експресуюча касета відповідно до винаходу, і так, як це описано тут вище, включає гетерологічну генну конструкцію, здатну пригнічувати експресію ендогенного гена AGL20; b) ідентифікацію клітини цукрового буряка, яка містить гетерологічну ДНК, c) на вибір, трансформацію клітини цукрового буряка, ідентифікованої на етапі b), експресуючою касетою, яка включає гетерологічний ген FLC, причому зазначений ген FLC функціонально зв'язаний з регуляторними послідовностями, або експресуючою касетою, яка відповідає винаходу, як це описано тут вище, причому ця експресуюча касета включає гетерологічну генну конструкцію, здатну пригнічувати експресію ендогенного гена AGL20 і ідентифікувати клітину цукрового буряка, яка містить обидві введені гетерологічні ДНК; 16 UA 98766 C2 d) регенерацію трансгенної рослини з зазначеної рослинної клітини, ідентифікованої на етапі b), e) ідентифікацію рослини цукрового буряка, яка демонструє затримку реакцій яровизації або повне пригнічення реакцій яровизації, проявом чого є фенотип, що не стрілкується (NB), f) на вибір, підтвердження присутності в геномі рослинної клітини гетерологічних ДНК, введених на етапі а) і, на вибір, на етапі с). У специфічному варіанті реалізації винаходу спосіб одержання трансгенної рослини цукрового буряка включає схрещування двох батьківських рослин, причому перша гетерологічна генна конструкція успадковується від одного батька (1), що являє собою рослину цукрового буряка, що включає ген FLC відповідно до винаходу, як це описано тут вище, а друга гетерологічна генна конструкція успадковується від іншого батька (2), що являє собою рослину цукрового буряка, яка включає гетерологічну генну конструкцію, що здатна пригнічувати експресію ендогенного гена AGL20 відповідно до винаходу, як це описано тут вище. В результаті такого схрещування одержують рослину, яка містить генну конструкцію, успадковану як від першого, так і від другого батька, більш конкретно рослину, яка успадкувала генну конструкцію як від першого, так і від другого батька і проявляє затримку реакцій яровизації або фенотип, що не стрілкується. У специфічному варіанті реалізації винахід належить до способу одержання трансгенної рослини цукрового буряка, причому в цьому способі щонайменше одна з батьківських рослин не виявляє фенотип, що не стрілкується (NB). Даний винахід включає корінь трансгенного цукрового буряка, що відповідає винаходу, як це описано тут вище, причому зазначений корінь одержаний від рослини, вирощеної з трансгенної клітини цукрового буряка, яка включає: а) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної геном AGL20, завдяки чому вона здатна викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20, b) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічний або ендогенний ген FLC, c) комбінацію а) і b). Даний винахід включає рослину, вирощену з трансгенної клітини цукрового буряка відповідно до винаходу, як це описано тут вище, причому зазначена клітина включає гетерологічну генну конструкцію, а гетерологічна генна конструкція, у свою чергу, включає: a) гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися в РНК, вироблюваній геном AGL20, тобто викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20, b) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічний або ендогенний ген FLC, c) комбінацію а) і b). Даний винахід також включає потомствену рослину, одержану від трансгенної рослини цукрового буряка відповідно до винаходу, як це описано тут вище, причому зазначена рослина включає гетерологічну генну конструкцію, а гетерологічна генна конструкція, у свою чергу, включає: а) гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися в РНК, вироблюваній геном AGL20, тобто викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20, 17 UA 98766 C2 b) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічний або ендогенний ген FLC, c) комбінацію а) і b). Даний винахід включає цукор, одержаний з кореня трансгенного цукрового буряка, який включає гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція, у свою чергу, включає: a) гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися в РНК, вироблюваній геном AGL20, тобто викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20, b) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічний або ендогенний ген FLC, c) комбінацію а) і b). Даний винахід включає біопаливо, зокрема етанол, бутанол, метанол, біогаз (метан) і дизельне паливо, яке одержане з кореня трансгенного цукрового буряка, який включає гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція, у свою чергу, включає: а) гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися в РНК, вироблюваній геном AGL20, тобто викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20, b) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічний або ендогенний ген FLC, c) комбінацію а) і b). Даний винахід включає інші промислові продукти, наприклад пластмаси, одержані з кореня трансгенного цукрового буряка, який включає гетерологічну геннуконструкцію, причому зазначена конструкція, у свою чергу, включає: a) гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися в РНК, вироблюваній геном AGL20, тобто викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20, b) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічний або ендогенний ген FLC, c) комбінацію а) і b). Даний винахід також включає спосіб промислового виробництва цукру, етанолу, біогазу і/або дизельного палива, який включає обробку рослини цукрового буряка відповідно до кожного з попередніх домагань, а також одержання цукру з рослини цукрового буряка, яка включає гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція, у свою чергу, включає: a) гетерологічну ДНК, яка при транскрибуванні в клітині цукрового буряка дає на виході першу нуклеотидну послідовність РНК і другу нуклеотидну послідовність РНК, причому зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК по суті комплементарна щонайменше частині нитки РНК, відтворюваної геном AGL20, завдяки чому вона здатна гібридизуватися або відпалюватися в РНК, вироблюваній геном AGL20, тобто викликати пригнічення експресії ендогенного гена AGL20, а зазначена перша нуклеотидна послідовність РНК і зазначена друга нуклеотидна послідовність РНК утворюють двониткову РНК, що бере участь у РНКінтерференції, яка пригнічує експресію зазначеного ендогенного гена AGL20, b) гетерологічну генну конструкцію, причому зазначена конструкція включає гетерологічний або ендогенний ген FLC, c) комбінацію а) і b). 18 UA 98766 C2 Далі, даний винахід спрямований на нові композиції і способи, які мають відношення до РНК-інтерференції (RNAi). Композиції включають дволанцюгову РНК (длРНК), що містить нитки РНК, які по суті комплементарні або ідентичні цільовій мРНК, наприклад мРНК, відтворюваній геном AGL20. Як прийнято розуміти зараз, длРНК піддаються процесингу по типу куборозрізування з розрізуванням длРНК на малі інтерферуючі РНК (міРНК). Відповідно до різних варіантів реалізації даного винаходу нові композиції міРНК вбудовуються в комплекс RISC для РНК-інтерференції відносно мРНК цільового гена, наприклад, мРНК гена AGL20 цукрового буряка. Інтерференція з експресією мРНК гена AGL20 приводить до пригнічення або затримки реакцій яровизації у цукрового буряка. Затримка яровизації виявляється в тому, що рослина цукрового буряка продовжує вегетативний ріст із розвитком нормального стрижневого кореня. В одному з варіантів реалізації винаходу міРНК включає першу нитку РНК, довжина якої складає від 21 до 23 нуклеотидів, і другу нитку РНК, яка гібридизується з першою послідовністю в біологічних умовах, наприклад, у таких умовах, які існують усередині клітини, особливо в цитоплазмі і/або в ядрі клітини. Ще в одному варіанті реалізації винаходу міРНК включає першу нитку РНК, довжина якої складає від 19 до 30 нуклеотидів, і другу нитку РНК, яка гібридизується з першою послідовністю в біологічних умовах, наприклад, у таких умовах, які існують усередині клітини, особливо в цитоплазмі і/або в ядрі клітини. Винахід включає міРНК будь-якої довжини за тієї умови, що нова міРНК відіграє пускову роль у РНК-інтерференції, спрямованій на мРНК цільового гена, наприклад, мРНК гена AGL20 цукрового буряка. Ще в одному варіанті реалізації винаходу перша або друга нитки міРНК по суті комплементарні або ідентичні нуклеотидній послідовності РНК, вироблюваній геном AGL20, що дозволяє їм запускати мовчання РНК. Термін "по суті комплементарний" означає, що послідовність першої або другої нитки міРНК здатна в достатній мірі гібридизуватися або відпалюватися з РНК, вироблюваної цільовим геном (мРНК) в умовах цитоплазми, запускаючи ІРНК, що веде до пригнічення експресії цільового гена. Ця супресія гена AGL20 викликає у цукрового буряка розвиток фенотипу, що не стрілкується, а це означає, що рослина цукрового буряка перестає реагувати на типовий 18-тижневий період яровизації викиданням стрілки і наступним цвітінням, продовжуючи вегетативний ріст (без викидання стрілки) і розвиваючи нормальний стрижневий корінь. Рослини, експресуючі зазначений фенотип, що не стрілкується, можна досить просто ідентифікувати і відбирати, застосовуючи експерименти з фенотипічним аналізом при стандартизованих умовах вирощування піддослідних рослин. В одному з варіантів реалізації винаходу пропонована цим винаходом молекула міРНК включає нитку нуклеїнової кислоти, яка по суті комплементарна або ідентична щонайменше частині гена AGL20. Відомо, що, якщо нитка міРНК ідентична, то цільова мРНК розрізається на марні фрагменти РНК. Однак, якщо спарювання (основ) не зовсім ідентичне, то комплекс RISC зв'язується з мРНК і здатний блокувати рух рибосом уздовж нативної мРНК, але не здатний розрізати мРНК на дрібні фрагменти. Проте, у будь-якому випадку експресія гена, з якого транскрибується мРНК, замовкає, тобто білок, кодований геном AGL20, не утворюється. Таким чином, даний винахід додатково включає одну нитку міРНК, яка по суті комплементарна або ідентична відповідній послідовності мРНК, транскрибованій тим геном, експресія якого цілеспрямовано змінюється. Наприклад, нитка міРНК, що зв'язується з мРНК, ідентична відповідній послідовності мРНК щонайменше на 50 %, переважніше щонайменше на 70 %, ще переважніше щонайменше на 90 % і ще переважніше щонайменше на 95 %. Необхідно розуміти, що процентний показник ідентичності між однією ниткою міРНК, яка по суті комплементарна або ідентична відповідній послідовності мРНК, транскрибованій тим геном, експресію якого треба змінити, і мРНК, вироблюваній цільовим геном, що знаходиться в діапазоні між ідентичністю щонайменше 70 % і ідентичністю щонайменше 95 %, може являти собою будь-яку числову величину в цьому діапазоні. Відомо, що для пригнічення експресії цільового гена також ефективні послідовності РНК із інсерціями, делеціями і одиничними точковими мутаціями (відносно цільової послідовності). Ідентичність послідовності між молекулою міРНК і продуктом транскрипції цільового гена (наприклад, мРНК цільового гена) можна оптимізувати, використовуючи алгоритми вивірення, відомі в даній галузі знань, і обчислюючи процентну подібність між нуклеотидними послідовностями. В альтернативному варіанті молекулу міРНК, яка відповідає даному винаходу, можна ідентифікувати не по подібності її послідовності з цільовою молекулою, а по її здатності гібридизуватися з цільовою послідовністю і заглушувати експресію цільової послідовності. 19 UA 98766 C2 Згідно з ще одним варіантом реалізації даного винаходу нові композиції міРНК можна використовувати з РНК-залежною РНК-полімеразою (RdRp) для одержання нової длРНК, з якої в результаті наступного процесингу можна одержати більше міРНК. Ще один варіант реалізації винаходу полягає в тому, що композиції однониткової міРНК, яка відповідає винаходу, не асоційовані з комплексом RISC при зв'язуванні з відповідною мРНК, наприклад, із мРНК, транскрибованою геном AGL20, причому РНК-залежна РНК-полімераза служить праймером для вироблення длРНК. Ще в одному варіанті реалізації винаходу спосіб індукції мовчання гена включає роздільне введення в рослинну клітину смислового фрагмента РНК, транскрибованої цільовим геном, наприклад, AGL20, і антисмислового фрагмента РНК того ж гена, причому смисловий і антисмисловий фрагменти РНК здатні утворювати молекулу двониткової РНК, яка бере участь у зміні експресії цільового гена в клітині. У переважному варіанті реалізації винаходу фрагменти РНК включені в дві різні молекули РНК. Ще в одному переважному варіанті реалізації винаходу фрагменти РНК перед введенням у клітину змішують у таких умовах, які дозволяють їм утворювати молекулу двониткової РНК. Ще в одному переважному варіанті реалізації винаходу фрагменти РНК вводять у зазначену клітину один за одним. Ще в одному варіанті реалізації винаходу фрагменти РНК включені в одну молекулу РНК. У такому випадку молекула РНК, переважно, здатна скручуватися таким чином, що зазначені фрагменти РНК, які включені в неї, утворюють молекулу двониткової РНК. Різні способи індукції мовчання цільового гена за рахунок використання смислових і антисмислових фрагментів РНК описані в документі WO 99/61631. Даний винахід додатково пропонує спосіб введення в рослинну клітину молекули длРНК, яка включає смисловий і антисмисловий фрагменти мРНК, транскрибованої цільовим геном. Однак треба визнати, що механізми індукції мовчання гена за рахунок iРНК, які лежать в основі цього підходу, можуть бути не повністю зрозумілі, і внаслідок цього даний винахід не можна зв'язувати з будь-якою конкретною теорією мовчання генів на основі ІРНК. Таким чином, у контексті даного винаходу термін "мовчання, опосередковане ІРНК" не обмежується якимнебудь конкретним клітинним механізмом РНК-інтерференції. ПРИКЛАДИ ПРИКЛАД 1: Складання бінарного вектора трансформації для конститутивної експресії гена FLC у трансгенному цукровому буряку. Генна касета FLC знаходиться під контролем конститутивного промотору CaMV35S. Кодуюча область гена FLC складається з кДНК FLC рослини Arabidopsis thaliana (інвентарний номер AF537203, SEQ ID NO: 3) і завершується термінатором манопін-синтетази (mas) з Agrobacterium tumefaciens. Генна касета (кластер) була введена як фрагмент Asc І - Рас І розміром 2,4 кб у Т-ДНК власного бінарного вектора трансформації pVictorHiNK, який несе селектований маркерний ген SuperMAS::PMI::NOS для відбору манози в цукровому буряку (Joersbo et al., 1998), що виробляє бінарний вектор pHiNK260 (фігура 1). Повна нуклеотидна послідовність pHiNK260 розкрита в SEQ 1. По завершенні всіх дій бінарний вектор pHiNK260 був перетворений у штам ЕНА101 Agrobacterium tumefaciens (Hood et al., 1986) за допомогою температурного шоку, як це описано в посиланні Holsters et al., 1978. ПРИКЛАД 2: Ампліфікація і клонування гомологів цукрового буряка біологічного виду Beta vulgaris. 2.1 Ампліфікація і клонування передбачуваного гомолога гена FLC з цукрового буряка. Для того, щоб ампліфікувати і клонувати гомолог гена FLC з цукрового буряка, були сконструйовані вироджені праймери до консервативного MADS_MEF2-подібного домену, що є присутнім на NH2-кінці всіх членів типу 2 сімейства факторів транскрипції MADS box, до якого належить ген FLC (Parenicova et al, 2003). Вироджений праймер HiNK5277 націлений на мотив консервативної амінокислотної послідовності "RRNGLLKKA", а праймер НiNK5279 гібридизується безпосередньо нижче HiNK5277 і націлений на мотив амінокислотної послідовності "AYELSVLCDAE". Тотальну РНК екстрагували з листів і верхівок цукрового буряка з використанням набору RNeasy Plant Mini виробництва компанії Qiagen і конвертували в кДНК за допомогою набору FirstChoice RLM-RACE виробництва компанії Ambion, Inc. Умови експерименту практично відповідали описам протоколу 3' RLM-RACE, прикладеного до набору, крім того, як праймер в реакції зі зворотною транскриптазою використовували адаптер 3' RACE. Передбачуваний гомолог гена FLC потім був ампліфікований, починаючи з реакції кДНК, як початкового шаблона, у двох послідовних прогонах ПЛР із використанням зовнішнього праймера 3' RACE у комбінації з виродженим праймером HiNK5277 при наступному комбінуванні внутрішнього праймера 3' 20 UA 98766 C2 RACE з виродженим праймером HiNK5279 у типових ПЛР. Одержаний у такий спосіб ампліфікований фрагмент мав довжину приблизно 0,6 кб, як можна було очікувати, виходячи з послідовності гомологів гена FLC з рослин біологічного виду Brassica. Однак очікується, що одержана зв'язка ДНК може містити множину послідовностей внаслідок виродженої сутності праймерів HiNK5277 і HiNK5279, що принципово дозволить ампліфікувати багатьох членів сімейства факторів транскрипції MADS box. Продукти ПЛР були вирізані, очищені, клоновані і потім представлені для секвенування. Серед всіх одержаних послідовностей, які, відповідно до очікувань, суміщали частину мотиву MADS box, три високогомологічні послідовності були ідентифіковані як передбачувані гомологи гена FLC і одержали назви contig_71, _78 і _79. Ці три фрагменти кДНК відрізняються один від одного маленькими делеціями усередині рамки, а це дозволяє припустити, що вони представляють альтернативні варіанти сплайсингу одного й того ж гена. На 5'-кінці всі три фрагменти кДНК демонструють велику гомологію послідовності з загальнодоступною послідовністю EST цукрового буряка, зареєстрованою під інвентарним номером BQ595637. Комбінування послідовності EST із трьома фрагментами кДНК проводилося з урахуванням відновлення повнорозмірних кДНК, транскрибованих передбачуваним гомологом гена FLC (SEQ ID NO:21, 23 і 25) і відповідних продуктів трансляції (SEQ ID NO:22, 24 і 26). Вивірення трьох передбачуваних білків FLC показане на фігурі 9. 2.2 Ампліфікація і клонування гомолога гена AGL20 з цукрового буряка. Для того, щоб ампліфікувати і клонувати гомолог гена AGL20 з цукрового буряка, були сконструйовані вироджені праймери до консервативних нуклеотидних послідовностей з вивіренням кДНК AGL20 з Arabidopsis по гомологах гена AGL20 з гірчиці і тютюну (фігура 2). Оскільки ген AGL20 належить до великого сімейства факторів транскрипції MADS box, праймери були сконструйовані до регіонів, які консервативні у різних гомологів AGL20 але відрізняються у більшості інших членів сімейства MADS box. Праймер HiNK624 суміщає гомологію послідовності з крайньою кінцевою ділянкою NH2, починаючи від кодону ATG з охопленням кодонів 1-9, а праймер HiNK619 , комплементарний СООН-кінцю, гібридизуючись безпосередньо вище стоп-кодону в екзоні 8, охоплюючи кодони 198-206 відповідно до послідовності AGL20 з Arabidopsis. Тотальну РНК екстрагували з листя цукрового буряка з використанням набору RNeasy Plant Mini виробництва компанії Qiagen і конвертували в кДНК із використанням зворотної транскриптази Superscript™ II RNase H виробництва компанії Life Technologies. Умови експерименту практично відповідали описам постачальників, але як праймер для реакції зі зворотною транскриптазою був використаний HiNK619. Передбачуваний гомолог гена AGL20 був ампліфікований, починаючи з реакції кДНК як шаблона і з використанням праймерів HiNK619 і HiNK624 у типовій ПЛР. Одержаний у такий спосіб ампліфікований фрагмент мав довжину приблизно 0,6 кб, як можна було очікувати, виходячи з послідовності гомологів гена AGL20 з рослин гетерологічних біологічних видів. За даними, одержаними при клонуванні і секвенуванні, було показано, що нуклеотидна послідовність гомолога цукрового буряка (див. фігуру 3) має значну гомологію з геном AGL20 з Arabidopsis (фігура 4) і далі буде згадуватися тут під назвою BvAGL20 (SEQ ID NO:6). Хоча фрагмент BvAGL20 не має настільки сильної гомології, як це спостерігається для гомологів гена AGL20 від інших біологічних видів, включаючи сосну і горох, гомологія з AGL20 була сильнішою, ніж у будь-яких інших членів сімейства факторів транскрипції MADS box з Arabidopsis. Часткова геномна послідовність, включаючи інтрони з 2 по 6, була одержана за допомогою конструювання праймерів до екзонів 2 і 7 HiNK.725 і HiNK729 , відповідно, які були використані для ампліфікації і секвенування геномного фрагмента, одержаного при використанні ДНК цукрового буряка як шаблона в типовій ПЛР. Часткова геномна послідовність гомолога цукрового буряка (SEQ ID NO:4) показала сильний консерватизм відносно положення інвертованих послідовностей у порівнянні з послідовністю Arabidopsis, незалежно від того факту, що інтрони у цукрового буряка значно довші, ніж у арабідопсиса. ПРИКЛАД 3: Складання бінарного вектора трансформації для супресії гена AGL20, індукованої iРНК, у трансгенного цукрового буряка. За допомогою стратегії, відомої як "рекомбінантна ПЛР" (Higuchi, 1990), фрагмент кДНК довжиною 0,28 кб, що складається з екзонів з 3 по 7 гомолога AGL20 з цукрового буряка (SEQ ID NO:5), був злитий із другим інтроном з гена ST-LS 1 картоплі (Eckes et al., 1986; Vancanneyt et al., 1990). При цьому приділяли увагу тому, щоб не включати домен MADS для попередження супресії інших факторів транскрипції MADS box у зв'язку з вираженим консерватизмом послідовності домену MADS у всьому сімействі факторів транскрипції MADS box. Фрагмент 21 UA 98766 C2 BvAGL20 був ампліфікований з праймерами HiNK792 і 793 , причому перший з них несе короткий лінкер для приєднання сайта рестрикції ВаmН І, а другий несе хвіст із 17 нуклеотидів, комплементарний 5'-кінцю інтрона ST-LS1 (лінкери і хвости далі в цьому тексті будуть виділені підкресленням). Фрагмент довжиною 0,19 кб, що включає інтрон ST-LS1 і фланкуючі сайти сплайсингу, був ампліфікований із праймерами HiNK529 і 796 , причому HiNK529 несе лінкер, який включає розпізнавальну послідовність Sac II, a HiNK796 несе хвіст із 22 нуклеотидів, ідентичний 5'-кінцевій ділянці фрагмента BvAGL20 довжиною 0,28 кб. Як наслідок додавання хвостів, праймери HiNK793 і 796, а також родинні продукти їх ампліфікації комплементарні один одному по відрізку довжиною 39 нуклеотидів. На основі цього перекривання обидва продукти ампліфікації були злиті один з одним за допомогою повторної ПЛР із застосуванням праймерів HiNK792 і 529 і з використанням обох продуктів ампліфікації як шаблона, одержуючи на виході гібридний продукт довжиною 0,47 кб. Фрагмент BvAGL20 довжиною 0,28 кб був ампліфікований вдруге із застосуванням праймерів HiNK794 і 795 , які відрізняються від HiNK793 і HiNK792, відповідно, тільки по їх лінкерах; HiNK794 і 795 несуть 5'-лінкери для приєднання розпізнавальних послідовностей Sac II і Sac І, відповідно. Обидва фрагменти були злиті в сайтах рестрикції Sac II для створення інвертованого повтору послідовності BvAGL20, відділеного інтроном від гена картоплі ST-LS1. Інтрон був включений як спейсерний фрагмент для стабілізації інвертованого повтору, а також для підвищення ефективності феномена іРНК при майбутніх трансгенних явищах (Wang and Waterhouse, 2001; Smith et al., 2000). Одержаний у такий спосіб інвертований повтор довжиною приблизно 0,75 кб потім був введений між промотором Ubi3 з Arabidopsis (Norris et al., 1993) і термінатором nos з Agrobacterium tumefaciens як фрагмент BamH I - Sal I. Пізніше генний кластер був переміщений як фрагмент Asc І - Рас І довжиною 2,5 кб на Т-ДНК власного бінарного вектора трансформації pVictorHiNK, що давав на виході pHiNK382, селективний маркерний ген для відбору по манозі, що йде за геном SuperMAS:PMI:NOS (фігура 4). Повна нуклеотидна послідовність pHiNK382 розкрита в SEQ ID NO:2. Ще один варіант реалізації винаходу включає два додаткових бінарних вектори: pHiNK440 і pHiNK441, які були зібрані для трансгенної експресії фрагмента кДНК BvAGL20 у цукровому буряку. На відміну від pHiNK382, який несе інвертований повтор для фрагмента кДНК BvAGL20, що приводить до миттєвого утворення длРНК або "шпильки" при експресії генного кластера, pHiNK440 і 441 експресують, відповідно, тільки смислову або антисмислову орієнтацію фрагмента кДНК BvAGL20. Отже, длРНК для BvAGL20 одержують після подій схрещування кожного з двох векторів з іншим, в результаті чого відбувається одночасне накопичення смислової й антисмислової орієнтації фрагмента кДНК із наступним утворенням длРНК. Генні кластери для смислової (pHiNK440) і антисмислової (pHiNK441) експресії були одержані при ампліфікації того ж фрагмента BvAGL20 довжиною 0,28 кб (SEQ ID NO:5) із праймерами HiNK2617 , і HiNK795, відповідно, праймерів HiNK2618 і HiNK792, з наступним клонуванням продуктів ампліфікації, як фрагмента ВаmН І - Sal І між промотором Ubi3 і термінатором nos. Як і у випадку з pHiNK382, генні кластери були потім перенесені як фрагменти Asc І - Рас І на Т-ДНК власного бінарного вектора трансформації pVictorHiNK, що вже ніс селективний маркер SuperMAS::PMI::NOS для відбору по манозі з одержанням на виході pHiNK440 і 441 (фігури 7 і 8). Повна нуклеотидна послідовність бінарних векторів pHiNK440 і 441 розкрита в SEQ 19 і SEQ 20, відповідно. По закінченні всі бінарні вектори були трансформовані в штам ЕНА101 Agrobacterium tumefaciens за допомогою теплового шоку за протоколом, описаним в посиланні Holsters et al., 1978. Отже, даний винахід додатково пропонує експресуючу касету, що включає фрагмент кДНК BvAGL20, орієнтований у смисловому напрямку, і другу експресуючу касету, яка включає фрагмент кДНК BvAGL20, орієнтований в антисмисловому напрямку. В одному з варіантів реалізації винаходу експресуюча касета, яка включає фрагмент кДНК BvAGL20, орієнтований у 22 UA 98766 C2 смисловому напрямку, це pHiNK440, тоді як експресуюча касета, яка включає фрагмент кДНК BvAGL20, орієнтований в антисмисловому напрямку, це pHiNK441. Даний винахід додатково належить до способу умовного іРНК пригнічення ендогенної експресії гена AGL20 у цукрового буряка, причому зазначений спосіб включає: (а) трансформацію чоловічої або жіночої інбредної батьківської лінії цукрового буряка фрагментом кДНК BvAGL20, орієнтованим у смисловому напрямку, і трансформацію жіночої або чоловічої інбредної батьківської лінії фрагментом кДНК BvAGL20, орієнтованим в антисмисловому напрямку; (b) схрещування жіночої і чоловічої батьківських ліній за пунктом (а) для одержання гібридної рослини цукрового буряка, причому смисловий і антисмисловий фрагменти кДНК утворюють длРНК у гібридній рослині цукрового буряка, що приводить до стримування стрілкування у зазначеної гібридної рослини. Даний винахід включає визнання того факту, що батьківські лінії, які включають тільки смисловий або антисмисловий фрагмент кДНК BvAGL20, не виявлять ефект іРНК експресії гена AGL20, отже, будуть розвиватися в напрямку цвітіння і вироблення насіння для відтворення потомства. Тільки в тому випадку, коли смисловий і антисмисловий фрагменти будуть скомбіновані в гібридній рослині, механізми iРНК, дійсно, викличуть пригнічення стрілкування, у зв'язку з чим цукровий буряк можна буде сіяти в північних широтах восени без ризику стрілкування і цвітіння на наступний рік (весняний сезон). Ці зрушення для цукрового буряка з традиційної весняної сівби на підзимову сівбу дозволяють буряківникам проводити сівбу восени і збирати врожай на наступне літо. Було показано, що зимові сорти типово дають більш високий врожай у порівнянні з весняними сортами. ПРИКЛАД 4: Трансформація Інтактне насіння цукрового буряка було стерилізоване на поверхні, пророщене і піддане попередній обробці in vitro. Потім експлантати були трансформовані через генне перенесення, опосередковане Agrobacterium tumefaciens за протоколом множинного приросту, розкритим в документі WO 02/14523 А2. 4.1 Стерилізація і пророщування насіння Насіння цукрового буряка (Beta vulgaris L.) стерилізували на поверхні і висівали на живильне середовище для пророщення (GM) в асептичній культурі. Живильне середовище GM містило солі Murashige and Skoog (MS) і сахарозу (приблизно 30 г/л), міоінозитол (100 мг/л), пантотенову кислоту (1 мг/л), крім того, у середовище GM були також введені придатний желатинізуючий засіб і регулятори росту рослин з функціями на зразок цитокініну. Рівень цитокініну, як правило, знаходиться в типовому діапазоні від 0,5 мг/л до 5 мг/л, звичайно від 1,0 до 2,0 мг/л. Був також доданий інгібітор ауксину ТІВА. 4.2 Ексцизія й ініціація коротких меристематичних культур Верхівки паростків 10-20-денних сіянців відрізали і висівали на живильне середовище для розмноження паростків (SMM). У даному випадку середовище SMM включало солі Murashige and Skoog із сахарозою (30 г/л) і придатний желатинізуючий засіб. На додаток до цього, середовище SMM містило щонайменше один цитокініновий регулятор росту, наприклад, ВА, кінетин, 2-ір або зеатин, як правило, у діапазоні концентрацій приблизно від 1 до 10 мг/л, а частіше в діапазоні концентрацій 1-5 мг/л. Верхівки паростків складалися як з апікальних, так і з пазушних коротких меристематичних регіонів, примордію листів, 5 мм гіпокотиля і котиледонних листів, які обрізали для того, щоб обмежити їх подальше подовження. Кожні 7-10 днів після сівби цільові експлантати субкультивували у свіжому середовищі SMM після видалення будьякого нового наростаючого листового матеріалу. Цільові експлантати множинних паростків типово культивують при малій інтенсивності освітлення (10-30 мікроейнштейнів) при 16-годинній тривалості світлового дня і температурі близько 21-22 °C. Через 4-7 тижнів культури множинних паростків схожі на компактні розетки, що свідчить про їх готовність до трансформації. 4.3 Інокуляція й інкубація культури множинних паростків Для трансформації культури множинних паростків використовували трансформацію, опосередковану Agrobacterium tumefaciens. Штам A. tumefaciens ЕНА101, який відповідно до винаходу містить бінарні вектори (наприклад, pHiNK260, pHiNK382, pHiNK440 і 441), вирощували на твердому живильному середовищі, яке складається з 1 г/л екстракту дріжджів, 5 г/л пептону і придатного желатинізуючого засобу, протягом 2-3 днів при 28 °C. За день до трансформації культуру множинних паростків готували для щеплення, видаляючи будь-які залишки наростаючого листового матеріалу. Для того, щоб почати щеплення, одиночні колонії A. tumefaciens збирали разом на оригінальному культуральному планшеті YEB за допомогою стерильної петлі. Для фактичного щеплення кожного цільового експлантата стерильне лезо скальпеля занурювали в зібраний матеріал колоній A. tumefaciens, після чого робили ним надрізи в апікальних і пазушних регіонах 23 UA 98766 C2 меристеми кожного цільового об'єкта. Негайно за цим етапом щеплення в деяких експериментах до ранової поверхні кожного цільового об'єкта прикладали приблизно 7 мкл індукційного середовища MSMG (солі MS, 2 г/л глюкози, MES і 200 мкМ ацетосирингону). Надріз по можливості намагалися робити з максимальним центруванням по меристематичних зонах, щоб здійснити пряму доставку гена з влученням у клітини, які продукують меристему. У типовому робочому сеансі одну за одною обробляли від десяти до двадцяти цільових культур, після чого висушували їх повітрям у стерильних умовах у ламінарній шафі протягом 10 хвилин. Після повітряного висушування оброблені цільові експлантати поміщали в живильне середовище MSCC для спільного культивування (солі MS, вітамін В5, 2 мг/л ВА, 30 г/л сахарози, 200 мкМ ацетосирингону з придатним желатинізуючим засобом). Після цього оброблені експлантати інкубували в живильному середовищі MSCC протягом 2-4 днів при 21-22 °C і при постійній темряві. 4.4 Цільова культура і відбір Після щеплення і спільного культивування експлантати множинних паростків переносили у свіже живильне середовище SMM з 2 мг/л ВА, придатними антибіотиками і желатинізуючим засобом не менше ніж на чотири дні, після чого здійснювали тиск відбору по манозі. Трансформовані тканини відбирали, поступово підвищуючи кількість манози (2,5 г/л - 15 г/л) і знижуючи кількість сахарози (20 г/л - 3 г/л) після трансформації. Селективний рівень манози збільшували покроковим чином від 2,5 г/л манози + 20 г/л сахарози до 4 г/л манози + 20 г/л сахарози, далі 5 г/л манози + 20 г/л сахарози, далі 6 г/л манози + 18 г/л сахарози і 8 г/л манози + 15 г/л сахарози. Культури множинних паростків продовжували рости, збільшуючись у розмірах, після чого їх обережно поділяли при кожному субкультивуванні, щоб стимулювати адекватний тиск відбору. У цей період рівень ВА знижували до 0,25 мг/л, а потім повністю елімінували цей інгредієнт, щоб стимулювати подовження паростків. Ділянки трансформованої тканини, що виживає, постійно відокремлювали від умираючих ділянок первісних цільових експлантатів, а ділянки, що вижили, знову обережно поділяли для того, щоб стимулювати строгий відбір. Відбір і регенерація паростків у типовому випадку прогресують протягом проміжку часу приблизно від 10 до 30 тижнів. У міру появи молодих паростків їх сепарували і виділяли під тиском відбору для найбільш ефективного відбору трансформованих паростків. 4.5 Подовження трансформованих паростків Коли молоді паростки досягали приблизно 0,5-1,5 см, їх переносили в контейнери з живильним середовищем для подовження паростків (подовження паростків, що розвиваються, підсилюється при обмеженні рівня цитокініну) і з відбором по манозі, як це описано вище. Середовище для подовження паростків, яке містить солі MS, придатний желатинізуючий засіб і низький рівень цитокініну, включають у стандартне середовище для подовження в типовому діапазоні від 0,1 до 1,0 мг/л. Оптимальне внесення цитокініну в живильне середовище для цукрового буряка складає 0,2 мг/л кінетину. 4.6 Регенерація трансформованих рослин Відбір трансгенних паростків цукрового буряка проводили на стандартному середовищі для регенерації з добавкою манозо-6-фосфату як селективного агента (WO 94/20627). Трансформовані паростки клонували в середовищі для клонування на основі MS з добавкою манози в кількості 5-15 г/л. Іноді є бажаними множинні паростки з одного первісного трансгенного паростка і з цього міркування для індукції клонування була використана комбінація цитокініну й ауксину в основному середовищі MS. Низький рівень обох регуляторів росту типово варіювався в діапазоні від 0,1 мг/л до 0,5 мг/л. Для цукрового буряка використовували солі MS, 30 г/л сахарози, придатний желатинізуючий засіб, 2 мг/л кінетину і 0,1 мг/л NAA. Через кілька місяців після щеплення трансгенність паростків підтверджували аналізом РМІ або аналізом ПЛР. Клональне розмноження й укорінення трансгенних паростків проводили на стандартному середовищі для розмноження й укорінення, підтримуючи відбір по манозі для елімінації химерних рослин, які уникнули процедури відбору. Нарешті, рослини посилали в теплицю для фенотипічного тестування. Одиночні паростки або клони успішно укоріняли при перенесенні в живильне середовище для укорінення, яке містить основне середовище MS з добавкою ауксину, наприклад, ІВА у кількості від 0,5 мг/л до 5 мг/л. В одному прикладі середовище для укорінення містить 5 мг/л ІВА і приблизно 12-15 г/л манози. Відомо, що трансформація біологічних видів рослин зараз являє собою рутинну процедуру для разюче великого числа рослин, включаючи як дводольні, так і однодольні рослини. У принципі, можна використовувати будь-який спосіб трансформації для введення химерної ДНК (відповідно до винаходу) у придатну клітину-предка доти, поки клітини здатні регенерувати в цілу рослину. Способи можна придатним чином вибирати з наступного набору: спосіб 24 UA 98766 C2 кальцію/поліетиленгліколю для протопластів (Krens, F. A. et al., 1982; Negrutiu І. et al., 1987), електропорація протопластів (Shillito R. D. et al., 1985), мікроін'єкція в рослинний матеріал (Crossway A. et al., 1988), бомбардування різного рослинного матеріалу частинками, покритими ДНК або РНК (Klein Т. М, et al., 1987), інфікування вірусами (неінтегративними) і т. п. Один зі способів відповідно до винаходу включає перенесення ДНК, опосередковане Agrobacterium. Ще один спосіб, що відповідає винаходу, полягає в застосуванні так званої технологи бінарних векторів, розкритої в документі ЕР А 120516 і в патенті США № 4940838. ПРИКЛАД 5: Умови вирощування для рослин покоління Т0 Плазміда pHiNK260 була трансформована як в однорічних, так і в дворічних генотипахакцепторах цукрового буряка, тоді як трансформацію pHiNK382 проводили тільки в дворічному матеріалі. Перше покоління трансформованих рослин називається Т0. Наступні покоління називаються Т1, Т2 і т. д. Насіння в експериментах використовували, починаючи з поколінь Т1, Т2 і т. д. Для того, щоб створити нетрансгенні (NT) контрольні рослини, були відтворені паростки цукрового буряка in vitro. За винятком процедур фактичної трансформації і відбору ці паростки NT піддавали такій же обробці й укоріненню, як і трансформовані паростки. Кожна доставка трансгенних рослин у теплицю супроводжувалася щонайменше однією контрольною NT рослиною з таким же генотипом. Після перенесення в теплицю трансформовані паростки покоління Т0 і контрольні NT паростки переводили у фазу укорінення. Дрібні рослини висаджували в маленькі горщики з ґрунтом і вирощували два тижні при насиченні атмосфери CO 2. Після закінчення цих двох тижнів укорінені рослини переносили в горщики розміром 12 см (0,7 літра). Після фази укорінення однорічні рослини цукрового буряка переносили в біокамеру КК3 (17годинне штучне освітлення, денна і нічна температура 18 °C). День прибуття рослини в камеру КК3 був позначений як '0-й день' і вважався початком експерименту по фенотипічному аналізу. Після фази укорінення дворічні рослини цукрового буряка переносили в теплицю VH113 (17годинне освітлення, денна температура 25 °C і нічна температура 15 °C) на два тижні перед яровизацією. Яровизація відбувалася в холодній кімнаті КК6 при постійній температурі 6° С і 12годинному малому штучному освітленні протягом декількох тижнів. Звичайно рослини цукрового буряка з генетичним фоном G018 яровизувалися протягом 14 тижнів, тоді як генетичний матеріал G024 яровизувався протягом 16 тижнів. День винесення рослин з кімнати для яровизації був позначений як '0-й день' і вважався початком експерименту по фенотипічному аналізу. Спочатку рослини повільно акліматизували два тижні в біокамері КК5, поетапно підвищуючи температуру від 10 до 18 °C, після чого їх пересаджували в більш великі горщики (16 см, 2 літри) і переносили в біокамеру КК3. Фенотипічний аналіз явищ у поколінні Т0 починали на безперервній основі і звичайно продовжували 3 місяці (90 днів) або до того моменту, коли всі рослини починали стрілкуватися. Рослини, що усе ще не починали стрілкуватися після закінчення 3 місяців, називали такими, що не стрілкуються (NB), і піддавали повторній яровизації, намагаючись індукувати стрілкування і цвітіння для одержання наступного покоління. ПРИКЛАД 6: Умови вирощування для поколінь Т1, Т2, Т3 Зведені дані по умовах вирощування: Експерименти по фенотипічному аналізу починалися з насіння. Насіння пророщували на піддонах з 96 ямками, що закриваються (горщичками). Для того, щоб вирівняти характер проростання і коренеутворення, підтримували 17-годинне освітлення піддонів і температуру 18-25 °C у світлий час і 16 °C у темний час. Через два тижні брали зразки рослин для проведення аналізу методом ПЛР. Аналіз методом ПЛР проводили для того, щоб ідентифікувати в популяціях потомства NT і трансгенні рослини. Це досягалося за допомогою ПЛР або на трансгенну касету, або на селективний маркер РМІ. Популяції, що сегрегують в однорічному або дворічному циклі розвитку рослин, також тестували з маркерами гена В, що контролює річний характер циклу розвитку. Відбір трансгенних і NT рослин проводили за результатами ПЛР. Рослини типу NT служили внутрішнім контролем рослин і супроводжували трансгенні рослини протягом всього експерименту. Для фенотипічного аналізу однорічних рослин вибирали і висаджували в горщики тільки сильні рослини (0-й день). Дворічні рослини тримали в горщиках, що закриваються, і штучно яровизували перед початком експерименту. В другому описаному напівпольовому випробуванні дворічні рослини висаджували в ґрунт перед яровизацією. Після відбору рослин проводили експерименти по фенотипічному аналізу, створюючи рослинам різні умови вирощування, як це більш докладно буде описано нижче. 25 UA 98766 C2 Експеримент 02-703 був виконаний у теплиці VH113 у 2002 році. Фенотипічний аналіз однорічних рослин починали безпосередньо з ПЛР, тоді як дворічні рослини спочатку яровизували в камері КК6 протягом 14 тижнів. Процедура яровизації й акліматизації в КК5 була ідентична такій для покоління Т0. Експерименти 02-741 і 735 об'єднували і виконували в теплиці VH113. Відбирали тільки однорічні рослини, які яровизували в КК6 протягом 17 і 19 тижнів. Після двотижневої акліматизації в КК5, сильні рослини пересадили в горщики і перенесли в теплицю VH113 на першому тижні травня 2003 року. Експеримент 03-753 був проведений у теплиці VH114. Яровизацію проводили штучно в КК6 протягом 17 і 19 тижнів, а акліматизацію - у КК5 протягом двох тижнів. Наприкінці квітня і початку травня 2004 р. провели пересадження рослин у VH114. У цій теплиці вирощування дворічних рослин проводили не в горщиках, а в ґрунті. Тому експеримент одержав назву напівпольового випробування. Експерименти 04-754 і 755 об'єднали і виконали по типу напівпольового випробування в теплиці VH114 з вересня 2004 по травень 2005 року. Яровизація носила природний характер і проводилася в теплиці VH114 без підігріву, але і без заморозків. Рослини піддавали м'якій яровизації протягом 13 тижнів (7-12 °C) і твердій яровизації протягом 15 тижнів (3-7 °C). Енергійні рослини, що вижили, яровизували штучно протягом 18 тижнів при 6 °C у камері КК6 і після двох тижнів акліматизації в камері КК5 перенесли в теплицю VH113 у середині березня 2005 року. Експерименти 04-766 і 767 об'єднали і виконали в кліматичній камері КК11 (16-годинне освітлення, температура 18 °C вдень і 12 °C уночі). Енергійні дворічні рослини яровизували в камері КК6 протягом 15 тижнів при 6 °C і акліматизували в камері КК5 протягом двох тижнів, після чого пересадили в горщики і перенесли в камеру КК11 (16-годинне освітлення, температура 18 °C вдень і 12 °C уночі). В експериментах по фенотипічному аналізу стрілкування рослин оцінювали в балах до трьох разів на тиждень. День викидання стрілки визначали як день, коли вперше можна було візуально помітити витягування міжвузль меристеми. Тепер зазначені вище експерименти будуть описані більш докладно. Напівпольове випробування VH114 (вересень 2004 року - травень 2005 року) Експерименти 04-754 і 755 Насіння пророщували в теплиці, як при природному, так і при штучному освітленні і підігріві для вирівнювання умов пророщування. Через два тижні рослини в лотках з 96 ямками, що закриваються, переносили в більш природні осінні умови навколишнього середовища. Через шість тижнів, 20 і 21 жовтня 2004 року, відібрані рослини висаджували в теплицю VH114 (у ґрунт зі звичайним розташуванням для польових випробувань). Вимірювання температури проводили на висоті пологу теплиці (повітря) і на глибині 10 см (ґрунт). Температура: Освітлення: Полив: СО2: Розмір горщика: Посів Теплиця VH113, тижні 37-39 (середина вересня 2004 року) 18-25 °C вдень і 16 °C уночі 17-годинне штучне + 12-годинне природне освітлення; металогалогенова лампа ОSRAM зі світловою потужністю HQI-BT 2 400W/D; >150-200 мкмоль/м На щоденній основі Навколишнє повітря Піддони з ямками, що закриваються (96 ямок на піддоні, ямки 4×4 см) 2 У денний час інтенсивність освітлення могла перевищувати 800 мкмоль/м внаслідок природного сонячного освітлення. Штучне освітлення вимикали, якщо інтенсивність освітлення 2 перевищувала 35 кілолюкс (600 мкмоль/м ) Попередня яровизація Теплиця VH111, тижні 40-43 (кінець вересня - середина жовтня 2004 року) Температура: 10-15 °C Освітлення: 12-годинне - 10-годинне природне освітлення Полив: На щоденній основі СО2: Навколишнє повітря Розмір горщика: Піддони з ямками, що закриваються (96 ямок на піддоні, ямки 4×4 см) Нічна яровизація. Перед яровизацією рослини пересаджували 26 UA 98766 C2 Яровизація 'Природна', 22 тижні Теплиця VH114, тижні 43-12 (середина жовтня 2004 року - кінець березня 2005 року) Температура 0