Речовина, що має пригнічуючу дію на міокард

Вещество, обладающее угнетающим действием на миокард, выделенное из крови, миокарда, печени, тимуса, селезенки, лимфатических узлов животных, представляющее трипептид, с молекулярной массой 300 дальтон с максимумами поглощения при 236 и 292 нм, содержащее гистидин, тирозин, триптофан. С> Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и может быть использовано для получения низкомолекулярного вещества, обладающего угнетающим действием на миокард. Известен низкомолекулярный фактор, выделенный из плазмы крови интактных кошек и кошек, перенесших геморрагический шок, угнетающий миокард при введении его другим животным. Доказано, что специфическое угнетающее миокард действие данного фактора связано с пептидом молекулярной массой 800 - 1000 дальтон [1]. Изобретение решает задачу создания нового вещества из арсенала низкомолекулярных веществ эндогенного происхождения, оказывающих угнетающее действие на миокард. Поставленная задача решается так, что в качестве вещества, оказывающего угнетающее действие на миокард, используют фракцию эндогенных низкомолекулярных веществ, выделенную гель-хроматографией из диализатов сыворотки крови и водно-солевых экстрактов внутренних органов живо тных, представляющую собой трипептид молекулярной массой 300 дальтон, характеризующийся максимумами поглощения при 236 нм и 292 нм, содержащий гистидин, тирозин, триптофан. 1. Метод и источники выделения предлагаемого вещества, обладающего угнетающим действием на миокард. Пример 1. Тотальным кровопусканием из бедренной артерии под местной анестезией 0,25% раствором новокаина забивают интактную собаку. Для исследования берут: .кровь, миокард, печень, тимус, селезенку, брыжеечные лимфатические узлы. Навески органов гомогенизируют в гомогенизаторе типа РТ-2 при добавлении 5-кратного объема (вес. об.) охлажденного 0,14 М раствора хлорида натрия рН 7,2-7,4 и экстрагируют в течение 8-12 ч при 2 - 4°С. Экстракты гомогенатов отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Сыворотку крови получают одним из известных способов. Все дальнейшие операции проводят на холоду при 2 - 4°С. Сыворотку крови и экстракты гомогенатов внутренних органов подвергают диализу че со со о о о 13300 рез полу проницаемую мембрану д ля отд еления кру пномолеку лярных примесей против 510-крзтного объема (объем/ объем) 0,14 М рас твора х лорид а натрия рН 7, 2 - 7,4. Диализаты собирают, концентрируют, например, 5 выветриванием в целлофановых кульках или упариванием в вакууме, до исходного объема сыворотки крови или гомогената органа и под вергают гель-х роматографическому раз делению на колонках, заполненных се фа- 10 д екс ом G-15 и с табилизированных 0, 14 М расі вором х лорида натрия рН 7,2 - 7, 4. Элю-цьио проводят 0, 14 М рас твором хлорида натрия рН 7, 2 - 7,4. Элюэ нт с обирают порционно, например при помощи автоматиче- 15 ского коллектора с бора фракций ХКОВ-1. В ыход материала контролируют по оптической плотнос ти при д лине волны 280 нм в каждой отдельной пробе э люэнта на спектро-фотоиетре, например СФ-16, и с троят гра- 20 фкк кривой элюции (гель-хроматограмму ). Пробы э люзнта, входящие в пики, объединяют и регис трируют на спек трофо тометре, например " Спекорд М40", спектры поглощения каждого пика (фракции) в ультрафиолето- 25 вом излучении (220-330 нм) с интервалом измерений 2 нм. Опред еляют макс имумы пог лощения, характерные для каждой из выделяемых фракций. Р ас твор сравнения -д еминерализованная вод а. В ых од отдельных 30 фракций опред еляют, с оотнос я их объем элюции к свобод ному объему колонк и (Vo ). Фракцию, э люиру ющуюся с колонок в объеме 5, 0 -6,0 V o и х арактеризующуюся макс имумами поглощения при 236 нм и 292 нм, 35 использу ют в качес тве вещес тва, облад ающего угнетающим дейс твием на миокард . Количес твенное с одержание д анной фракции в под вергну тых исс лед ованиях биосу бс тратах интактн ых с обак предс тавлен в 40 таблице. П р и м е р 2. Тотальным кровопус канием из бедренной артерии под мес тной анес те з и ей 0, 2 5% рас тв о р ом н о во к а и н а забивают собаку через 1 час после примене- 45 ния ос трого с тресс орного возд ейс твия, мод ел и ру ем ого в ну тр ив ен н ым вв ед е ни ем анти ци тох ромок с ид азной с ыворотки против фермента цитох ромоксид азы, выделенного из миокард а с обак (авт. св. СССР № 50 972556, 07. 07.1982). Для исс лед ования беру т: кровь, миокард, печ ень, тимус, селезенку, брыжеечные лимфатические узлы. Указанные биосу бс т-рзты под вергают обработке, аналогичной, 55 привед енной в примере 1. Количес твенное содерж ание фрак ции, э люирующейся в объеме элюции 5.0 - 6, 0 Vo и х арактеризующейся макс имумами поглощения при 236 нм и 292 нм, в под вергну тых исс ледованию био- . субстратах собак, перенесших ос трое с трессорное возд ейс твие, предс тавлено в таблице. П р и м е р 3. Дек апитацией забивают 3-5 крыс -с амов, подвергну тых фикс ации в положении на спине в течение 6 ч (э моционально-болевое с трессорное воздейс твие). Для исследования беру т кровь, миокард, печень, тимус, селезенку и брыжеечные лимфатические узлы, которые подвегают обработке, аналогичной, привед енной в примерах 1 и 2. Количес твенное содержание фракции, содержащей вещес тво, облад ающее угнетающим дейс твием на миокард, в подвергну тых исслед ованию биосу бс тратах крыс, перенес ш их ос тро е с тр ес с ор но е возд ейс тв ие, предс тавлено в таблице. П р и м е р 4. Декапитацией забивают 3-5 интактных крыс-с амцов. Для исследования беру т кровь, миок ард, печень, тимус, селезенку и брыжеечные лим фатические узлы, которые подвергают обработке, аналогичной, привед енной в примерах 1, 2, 3. Количес твенное с одержание фракции, содержащей вещес тво, облад ающее у гнета ю -' щим дейс твием на миокард, в подвергну тых ис с лед ованию биос у бс тратах ин так тных крыс предс тавлено в таблице. Из д анных, прес тавленных в таблице, следу ет, что наибольшее количес тво фрак ции низкомолеку лярных вещес тв, обладающей угнетающ им д ейс твием на миокард, содержится в селезенке, лимфатических узлах и с ыворотке крови интактных с обак и крыс. Пос ле перенесенного ос трого с трес сорнго воздейс твия отмечаетс я отчетливое перерас пред еление с од ержания д анной фракции во вну тренних органах - резкое снижение до следовых количес тв в селезенке и лимфоу злах и у величение в миокарде, тимусе и печени при практичес ки неизменном ее уровне в с ыворотке крови. При э том увеличние сод ерж ания фрак ции, обладаю щей угнетающим дейс твием на миокард, в серд ечной мыш це при ос тром сгресс орном воздействии наблюдалось значительно раньше (по времени) и сохранялось дольше, чем в тимусе и печени, что позволило рассматривать данный феномен, как избирательное накопл ен ие фр ак ц ии низк омо лек у ляр ных вещес тв в серд ечной мыш це при ос тром стрессорном возд ейс твии. 2. Физико-химические свойс тва и харак терис тики пред лагаемого вещества, обладающего угнетающим дейс твием на миокард. Гель- фильтрация на с ефад екс е G-15. При гель-хроматографическом разд елении диализатов с ыворотки крови и вод но-солевых экс трактов гомогенатов вну тренних органов животных на колонках заполненных 13300 сефадексом G-15 в описанных выше условиях фракция низкомолекулярных веществ, обладающая угнетающим действием на миокард, элюируется в объеме элюции 5,0-6,0 Vo. Определение молекулярной массы. На 5 стандартизованных калиброванных колонках, заполненных сефадексом G-15 и стабилизированных 0,14 М раствором хлорида натрия рН 7,2 - 7,4 установлена молекулярная масса веществ входящих в фракцию, 10 обладающую угнетающим действием на миокард. Поскольку объем ее элюции больше, чем объем злюции тиамина (ММ - 435,20), меньше, чем объем элюции валина (ММ =117,50), и близкий таковому у морфина (ММ 15 = 285,33), молекулярная масса фракции соответствует 300 Д. Инфракрасная спектроскопия. Лиофильно высушенная фракция низкомолекулярных веществ, обладающая угнетающим 20 действием на миокард, запрессованная в таблетки с KBr характеризуется полосами поглощения в области 924 - 928 см" ; 989 -997 см \ 1000 - 1200 см"1; 1400 см"1; 1480 -1550 1600 - 1660 см*1; 1740 - 1750 см'1; 25 3280 3350 см"1; 3380 см"1. Это свидетельствует о наличии в молекуле составляющего ее вещества: 1. Пептидной связи - полосы поглощения в интервале 1200 1600 см"1, характерные для кольце- 30 вых структур коротких пептидов (амид 1, 2) Кроме того, подтверждением наличия пептидной связи в молекуле являются частотные колебания в интервале 3280 - 3350 см*1: характерные для NH-группы пептидной свя- 35 зи. 2. Ионизированных концевых групп (МНз+ (валентные колебания с широкими по лосами поглощения в области 1480 - 1550 см \ 1600- 1660 см"1), NH2r (широкая поло- 40 са поглощения при 3380 см"1) и СООН ~ (две полосы поглощения - около 1400 см и в области 1550 - 1610 см"1). 3. Неионизированных концевых групп СООН (сильная полоса поглощения около 45 1740 - 1750 см"1, обусловленная колебания ми с участием растяжения одинарных свя зей "С - О"), ЫНг (деформационные колебания в интервале 1500 - 1650 см*1 и полоса поглощения при 3380 см"1). 50 4. Известно, что в области ниже 1400 см многие полосы поглощения связаны с колебаниями, в которых принимает участие весь скелет молекулы. В препарате низко молекулярной фракции эти колебания пред- 55 ставлены сопряженными двойными связями (989 - 997 см"1), растяжением связи "С - О" (1000 - 1200 см"1), крутильными веерообразными колебаниями групп - СН2(около 1400 см"1). 6 Следует подчеркнуть, что в ИК-спектре полосы поглощения, характерные для пептидной связи, в молекуле вещества низко молекулярной фракции представлены не очень выражено. С другой стороны, в спектре значительное представительство имеют полосы поглощения, характеризующие концевые группы молекулы. Это позволяетi,\e» лать заключение, что вещество, входящее в низкомолекулярную фракцию, является коротким пептидом, поскольку известно, что ИК-спектры коротких пептидов значительно отличаются по внешнему виду от спектров полипептидов и белков, чго обусловлено проявлением колебаний концевых групп коротких пептидов. Эта особенность связана с тем, что молекулы коротких пептидов, как и аминокислот, обычно имеют диполярное строение. Кислотным концом служит ионизированный карбоксил (СОО*. СООН"). а основным - группа Г\ІНз+ или NH2+. При этом по мере удлинение пептидной цепи (увеличение аминокислотных остатков в пептиде) относительный вес колебаний концевых групп в ИК-спектре уменьшается и уже в спектре тетрапептидов обнаружить соответствующие полосы становится трудно, хотя в ряде случаев в спектре могут проявляться ионизированные іруппьі боковых цепей аминокислотных остатков. На основании регистрации и расшифровки ИК-спектров низкомолекулярной фракции представляется возможным заключить, что ее угнетающее действие на миокард обусловлено коротким пептидом, содержащим значительные количества ионизированных концевых групп СООН", NH2f и NH3+ и сопряженные двойные связи. Учитывая установленную молекулярную массу (300 Д) и химическую природу (пептид), о ее состав может входить не более трех аминокислотных остатков, а значительное преобладание в ИК-спектре полос поглощения, указывающих на наличие в молекуле сильно ионизированных концевых групп NH2+ и ІМНз+ свидетельствует об ее основных свойствах (Ленинджер А. Молекулярные основы структуры и функции клетки. М , Мир, 1976, с. 956: Чиргадзе Ю Н Инфракрасные спектры и структура полипептичов и белков М., Наука, 1965, с. 135; Наканиси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений. М., Мир 1965, с. 190), Спектроскопия в ультрафиолетовом излучении. Идентификация аминокислотных остатков, входящих в состав трипептида, обладающего угнетающим действием нп миокард приведена с помощью регистрации характерных спектров его поглощения о ультрафиолетовом излучении. Доказатель 13300 8 стном наличия в трипептиде триптофана, зируемых полосках миокарда лягушки и патирозина, гистидина являются следующие пиллярных мышцах желудочка белых крыс. данные (фиг. 1): П р и м е р 1. Нативную фракцию низ- для триптофана: наличие в спектре комолекулярных веществ в объеме 10 мл поглощения трипептида в нейтральном вод- 5 медленно вводили через катетер в восходяносолевом растворе (рН 7.2 - 7,4) характер щую часть аорты интактных собак, наркотино для триптофана максимума поглощения зированных внутривенно смесью хлоралозы при 290 нм, а также сдвиг максимума погло (50 мг/кг) и уретана (500 мг/кг массы). В качещения в более коротковолновую область стве контрольного раствора в том же обьеме УФ-спектра (с 292 нм к 284 нм) при закисле- 10 вводили 0,14 М раствор хлорида натрия рН иии раствора трипептида, который одно 7,2-7,4. Оценку сократительной способности значно определяется наличием в пептидах миокарда и нарушений сердечной деятельнои белках, наряду с тирозином, триптофана; сти проводили методом фазового анализа - для тирозина: наличие сдвига макси сердечного цикла (Кубышкин В.Ф. Кардиоломума поглощения в более длинноволновую 15 гические фазовые синдромы. К., Здоровья, область спектра (с 292 нм к 294 нм) при 1982, с. 192). защелачивании раствора трипептида, кото На фиг. 2 представлены данные фазоворый обус/ювлент в белках и пептидах исклюго анализа сердечной деятельности интактчительно ионизацией гидрокисльной ных собак после внутриаортального группы тирозина, а также сдвига максимума 20 введения изучаемой нативной фракции низпоглощения в более коротковолновую об комолекулярных веществ. На фиг. 5- 10 мин ласть спектра (с 292 к 284 нм) при закислепосле ее введения выявлены нарушения нии растйора трипептида, который обеспе сердечной деятельности, характеризующичивается наличием в белках и пептидах на еся развитием синдрома нагрузки объемом, ряду с триптофаном, тирозина; 25 а на 15 - 20 мин - синдрома высокого ди- для гистидина: наличие в спектре по 'астолическогго давления, возникающие при глощения трипептида в закисленном рас изменении гидродинамического режима ратворемаксимума поглощения при 230 нм, боты сердца и его компенсаторной гиперхарактерного для кислотной денатурации функции. белков и пептидов и обусловленного дена- ЗО Пример 2. Собакам, наркотизировантурацией гистидина (Бренд Дж. К.Д., Скотт ным нембуталом, со вскрытой грудной клетА.И. Применение ультрафиолетовой спект- кой и управляемым дыханием пункцией роскопии / / В кн.: Установление структуры непосредственно в огибающую ветвь левой органических соединений физическими и коронарной артерии вводили 1 мл нативной химическими методами. М., Химия, 1967, с. 35 изучаемой фракции низкомолекулярных ве81 -157; Уильяме В., Уильяме X. Физическая ществ. В качестве контролируемого раствохимия для биологов. М., Мир, 1976, с. 600; ра в таком же количестве вводили 0,14 М Жоли М. Физическая химия денатурации раствор хлорида натрия рН 7,2 - 7,4. белков. М., Мир, 1968, с. 364). На фиг. 3 представлены данные по изуУсловия хранения. Фракция низкомоле- 40 чению изменений кардио- и гемодинамики кулярных веществ, обладающая угнетающим у собак после внутрикоронарного введения действием на миокард, сохраняет свое изучаемой фракции низкомолекулярных вебиологическое действие при хранении в усществ. Выявленные изменения регистрируловиях холодильника (2 - 4°С) в течение 3 -7 емых показателей указывают на развитие сут, а при хранении в замороженном со- 45 .сердечной недостаточности, связанной с стоянии при (-20) - (-40)°С в течение 2-3 мес нарушением сократительной функции мио(срок наблюдения). карда: снижение системного артериального 3. Биологическое действие предлагае давления на 15%, давления в полости левомого вещества, обладающего угнетающим го желудочка на 19,5%, индексов сократидействием на миокард. 50 мости миокарда (скорости нарастания Биологическое действие фракции низ- давления в полости левого желудочка и инкомолекулярных веществ, используемой в декса его расслабления), увеличение дликачестве вещества, обладающего угнетающим тельности систолы на 14,2% и укорочение действием на миокард, полученной из длительности диастолы на 8,4%. Выявлено перечисленных выше биологических суб- 55 перераспределение общего коронарного стратов интактных и подвергнутых острому кровотока: увеличение его диастолической стрессорному воздействию животных, изучали фракции на 20,9% и снижение систоличев опытах на интактных собаках при ской на 23,3%. внутриаортальном и внутрикоронарном ее На фиг. 4, 5 представлены данные по введении, а также на изолированных перфу- . изучению влияния фракции низкомолеку 13300 лярных веществ на механическую активность изолированных полосок миокарда лягушки в феномене лестницы Боудича и папиллярных мышц желудочка крыс при парной стимуляции, перфузируемых соот5 ветственно ргствором Рингера или Тироде рН 7,2 - 7,4 после насыщения газовой смесью карбоген (96,0% 02 и 4,0% СОг). Механическую активность изолированных полосок миокарда лягушки и папиллярных 10 мышц желудочка крыс определяли с помощью механического преобразователя 6МХС в условиях, приближенных к изометрическим. Скорость перфузии 1 мл/мин. Нативную фракцию низкомолекулярных '15 веществ использовали в разведении 1:25 в соответствующем растворе для перфузии. Как следует из данных, приведенных на фиг. 4, замена раствора Рингера тестирующим раствором, содержащим изучаемую 20 фракцию, приводит к прогрессирующему во времени снижению прироста амплитуды сокращений полосок миокарда лягушки. Последующая замена тестирующего раствора, содержащего изучаемую низкомолекуляр- 25 ную фракцию, на нормальный раствор Рингера не приводила к восстановлению относительного прироста амплитуды сокращений полосок миокарда к исходным величинам в течение первых 20-30 мин 30 перфузии. Наоборот, в первые 9 - 1 5 мин перфузии нормальным раствором Рингера наблюдалось дальнейшее снижение ее прироста. Восстановление прироста амплитуды сокращений полосок миокарда лягушки 35 в среднем до 70% по отношению к исходной величины наблюдалось лишь к 45 - 60 мин перфузии нормальным раствором Рингера. При изучении влияния низкомолекуляр-нои фракции на сократительную функцию 40 папиллярных мышц желудочка крыс с использованием парной стимуляции (фиг. 5) установлено резкое снижение амплитуды как первого, так и второго сокращений, достигающее минимальных значений на 4 мин 45 перфузии тестирующим раствором, свидетельствующее о существенном уменьшении силы сокращения папиллярных мышц. При этом выявлялись идентичные по времени развития, степени выраженности и направ- 50 ленносги изменения со стороны скорости нарастания сокращения и скорости нарастания расслабления папиллярных мышц. Начиная с 5 мин опыта отмечалась тенденция к восстановлению как амплитуды сокра- 55 щения, так и скорости нарастания сокращения и последующего расслабления папиллярных мышц, однако указанные показатели не достигали исходных величин и оставались сниженными на 15 - 25% до 10 конца опыта. Максимальное нарушение сократительной функции папиллярных мыш ц сочеталось с повышением их тонуса, а последующая тенденция к ухудшению их функции сопровождалась снижением их тонической активности. Замена тестирующего раствора, содержащего изучаемую фракцию, нормальным раствором Тироде не приводила к восстановлению относительного прироста амплитуды первого и второго сокращений, а также скорости нарастания сокращения и скорости расслабления папиллярных мышц в течение последующих 10 мин перфузии. Более того, с удлинением времени отмывки нормальным раствором Тироде выявлялась тенденция к углублению вызванных нарушений сократительной функции папиллярных мышц. Увеличение их тонического напряжения приобретало стойкий характер, свойственный для развития контактуры. При сопоставлении с известными факторами, используемыми в качестве средств, оказывающих угнетающее действие на миокард, предлагаемое вещество обладает следующими преимуществами: - использование предлагаемой фрак ции низкомолекулярных веществ позволяет расширить арсенал веществ эндогенного происхождения, оказывающих угнетающее действие на миокард, а также источников их выделения (миокард, печень, лимфоидные органы). - фракция низкомолекулярных веществ, охарактеризованная в материалах заявки, обладает четко выраженным прямым угне тающим действием на миокард интактных животных, что доказано в опытах in vivo и in vitro: - биологическое действие данной фрак ции низкомолекулярных веществ на сердеч ную мышцу реализуется через универсаль ный биофизический механизм, поскольку со храняется у теплокровных и холоднокров ных животных; - установленные физико-химические свойства и характеристики фракции низко молекулярных веществ, обладающей угне тающим действием на миокард, позволяют утверждать, что данное вещество не описа но в научной и патентной литературе: ука занные свойства позволяют проводить достоверную идентификацию фракции в пределах каждой гель-хроматограммы, - распределение количественного со держания фракции низкомолекулярных ве ществ обладающей угнетающим действием на миокард, между изученными источника ми ее выделения у интактных животных и животных подвергнутых острому стрессор 11 13300 ному воздействию, установление ее избирательного накопления при остром стрессор мп м в озд ейс тв и и в м и ок ард е , а так же данные по биологическому действию, направленному на угнетение сердечной деяЖивотные 12 тельности, значительно дополняют и расти ряют представление о молекулярных механ и з м ах фо р м и р о в а н и я с е рд е ч н о й недостаточности при острых стрессорных 5 повреждениях миокарда. Содержание фракции, обладающей Сыворотка Миокард угнетающим действием на миокард, M+ (%) w Печень Тимус Селезенка крови Лимфатические узлы Интактные 27,4+1,8 1,6+0,7 После острого стрессор, воздействия р 22,1+1,8 >0,05 20,9+0,9 0,05 24,1+2,8