Спосіб одержання лейкоцитарних інтерферонів людини

Изобретение относится к технологии рекомбинантныхДНК, т.е. к способам, использующимся в рекомбинантной ДНК-технологии, и к продуктам, полученным этими способами. Штамм бактерий Escherichia coli трансформируют рек омбинан тами из группы pIJeIFiA25, pLelF В trp 7, pLelF С trp 35, pLelF D trp 11, pLelF FF trp 1, pLelF I trp 1 и pLelF j trp 1, дялее культивируют трансформанты, выделяют и очищают лейкоцитарный интерферон. С 1 H14319 Изобретение относится к области технологии рекомбинантных ДНК, т,е. к способам, использующимся в рекомбинантной ДНК-технологии, и к продуктам, полученным этими способами. П р и м е р . Используют два мккроорганияма: E.coli х1776 и E.roli К.-12 штамм 294 (конец A.thi"", hsr , bsm R ) . tO мРНК лейкоцитарного интерферона человека (LeIF) получают из пейкодитов человека» взятых у больных хронической миелогенной лейкемией. Таковыми являются линия клеток у обозна- 15 ченная KG-1, полученных от пациентов с острой миелогенной лейкемией. У KG-1 клеток индуцируют продукцию лейкоцитарного интерферона мРНК с помощью вирусов Сендай или Ньюкаст- 20 ла. Клетки собирают 5 ч спустя после индуцирования и РНК приготовляют по методике с применением гуанидинтиоцианат-гуанидчигидрохлоридао Для получения 12 S фракций поли (А) 25 ( мРНК используют олигодеокситимидин d Т--целлюлозную хроматографию и сахарозное градиентное ультрацентрифугиоование, 5 мкг мРНК используют для полу30 чения двойной цепочки кДНК по цепочечной методике. Указанный кДНК фракционируют по размерам с помощью электрофореза на 6 Z - H O M полиакриламидном геле и 230 нг материала с рззме- 35 рами в интервале от 500 до 1500 в.п. выделяют электроэлюированием. 100 нг этой кДНК присоединяют к деоксицитидиновым остаткам (dc) и реденатурируют с 470 нг плазмид рН R322, кото- 40 рые были соединены с деоксигуанозино*выми (dG) остатками по (Pst I) сайту и используют для трансформации E.coli х1776. Получают устойчивые к тетрациклину, чувствительные к ампициллину 45 трансформанты. Синтезируют четыре набора дезоксиолигонуклеотидных зондов для каждой последовательности, содержащие три (Т-ЇА, В ; С, D) или один (Т-1ЗА, В, С7 D) олигонуклеотид 50 каждая. мРНК получают из 12 S РНК, KG-I индуцированных вирусом Сендай либо целиком поли (А) М Р Н К ИЗ неиндуцированных лейкоцитов, Р-меченные 55 кДНК готовят известным способом. Немеченный продукт выделяют с помощью гельфильтрацин на колонке, заполненной 10 мл Сефадекс С-50, обработан ной 0 s 3N NaOH в течение 30 мин при 70 С для pa-^pvraeHHH РНК, нейтрализуют НС1 и осуществляют гибридияапию. Для идентификации клонов pL1-pL30 используют быстрый процесс изолирования плазмиды по Бирнбойму. При этом получают 1 мкг плазмиды ДНК из каждых 500 индивидуальных трансформантов E.coli К—12 штамма 294. Каждый образец ДНК денатурируют и наносят на нитроцеллюлозные фильтры в трех экземплярах, следуя методике Кафатоса с сотр. (см, выше) „ Три группы нитроцеллюлозных фильтров, содержащих 500 образцов плазмид, гибридизируют со стимулированной кДНК, заложенной с Т-1 группой носителей информации (праймеров) - Т-1 3s заложенной стимулиро, ванной кДНК, нестимулированной кДНК„ приготовленной с использованием обеих групп носителей информации» Клоны считают положительными, если они гибридизируют сильнее один или оба зонда стимулированной кДНК, чем полностью нестимулированный зондо Было отобрано 30 положительных клонов CpL1-pL30) из 500 для дальнейшего анализа. Трансформанты E.coli x1776 скринируют по методике гибридизации колоний „ используя в качестве зонда Р-меченную стимулированную мРНК. Немеченную мРНК из нестимулированиых клеток смешивают с зондом при соотношении 200:1 для конкуренции с нестимулированной мРНК, имеющейся в Р-меченном препарате. Гибридизация меченой мРНК будет происходить предпочтительно в колониях, содержащих < • *• стимулированные последовательности. Получают три класса трансформантов: 2-3% колоний^ гибридизованных ? мРНК очень сильно, 10% гибридизованных значительно меньше, чем 1-й класс; остальное, не дающее определимый сигнал гибридизации. Исследуют положительные колонии (классы 1 и 2) иа наличие интерферон-специфических последовательностей с помощью анализа, который зависит от гибридизации интерфероновой мРНК конкретно в плазмиду ДНК. Первоначально выращивают индивидуально 60 сильно положительных колоний (класс 1) в 100 мл среды М9, дополненной тетрациклином (200 мкг/мл), 14U31U 4 диаминопимелиновой кислотой мент, обозначенный LeIF HI, очень (100 мкг/мл), тимидичом (20 мкг/мл), похожий на LeIF H. Полученные гибриди d-биотином (Ї мкг/мл). ные плазмиды обозначают pLEIF H и т.п. Среда М9 содержит 6 г/л Ма г НР0 4 9 3 г/л КН г Р0 4 0,5 г NaCl и 1 г/л МН4С1, Готовят плаэмиду ДНК из всех 39 После автоклавирования прибавляют потенциальных LeIF кДНК клонов и про1 мл стерильного Ш MgS0 4 и 10 мл водят повторный скрининг с тем же стерильного 0 8 0ї М СаС!^, Собирают 260 в.р. ДНК зондом, используя проЇ0 культур и изолируют ллазкиду ДНК 10 цедуру гибридизации Кафатоса с сотр. из шести пулов, как описано Клевеллом (см. выше). Три плазмиды (pL 4, pt. 31, с сотр. Biochemistry 9, 4428-А40 pL 34) дают очень сильные признаки (1970). W мкг каждого пула плазмидьг (сигналы) гибридизации, четыре ДНК расщепляют Hind III денатурируют (pL 13, pL 30 9 pL 32, pL 36) гибрии ковалентно связывают с ДБМ (дназо- tS дизованы умеренно и три (pL 6, pL 8, бензилоксиметиловой) бумагой. На каж$Ь 14) слабо гибридизованы зондом. дом фильтре гибридизуют 1 мкг очиТакже скринируют 39 потенциальщенной мРНК из стимулированных кленых LeIF кДНК рекомбинантных плазмид .ток, Негибридизованную мРНК удаляют с использованием Р-меченных синтепромывкой. Специфически гибридизован» 30 тических ундекамеров (индивидуальные ную мРНК элюиругот и транслируют в соТ-1 первичные пулы праймеров информациты личинок Xenopus. По этой пробе ции или индивидуальные Т—13 праймеры все 6 пулов были отрицательными. информации) непосредственно в качест5 пулов из 10 колоний каждый и 1 пул ве гнбрнднзукяцих зондов. Условия из 9 колоний делают из 59 слабо положительных колоний (класс 2 ) , Готовят 25 гибридизации выбирают таким образом, что для определимых сигналов гибриплаэмнды из пулов и исследуют» как дизации должны требоваться точно спаописано выше. Среды 6 тестированных ренные основания. Следовательно, пулов был тестирован один (к10), гибплазмида ДНК из 3 клонов была пригоридизованный в интерферонную мРНК • 30 товлена по стандартной процедуре при условии значительно выше исходочищения лизата (Клевелл с сотр., ных уровней каждого времени. Для тосм, выше) и очищена колонной хромаго, чтобы определить специфический тографией на Биорад Агарозе А-50. интерферонный кДНК-клон готовят плазОбразцы по 3 мкг каждого препарамиды ДНК из 9 колоний пула К10 и ис^» та делают линейными обработкой Есо следуют индивидуально. Две из девяти RI, денатурируют в щелочи и наносят плазмид (№101 и № 104) связывают инна 2 отдельных нитроцеллюлозных фильтерферонную мРНК существенно лучше,, тра по 1,5 мкг на пятно (Кафатос с '' •• чем при указанных исходных уровнях. сотр 0 , см. выше). Фосфоршшруют инди*" Из плазмиды № 104 выделяют один Bgl II рестрикционный фрагмент, со4о видуальные синтетические деоксиолидержащий 260 в.р,„ меченный Р с гонуклеотидные праймеры информации и использованием процедуры, описанной пулы праймеров информации с помощью Тейлором с сотр.,и используют в каче( $ 3 р) АТР следующим образом: стве зонда для независимого скриннн50 пкмоль олигонуклеоткда и 100 пкмоль; га 400 E.coli 294 трансформантов с еді