Способи та композиції для доставки до цнс арилсульфатази а

Реферат: Винахід стосується складу для інтратекального введення при лікуванні хвороби метахроматичної лейкодистрофії (МЛД), який містить білок арилсульфатазу А (ASA) у концентрації 5-50 мг/мл та фармацевтично прийнятну допоміжну речовину, де зазначений склад не містить фосфату або містить не більше ніж 5 мМ фосфату, NaCl та полісорбатну поверхнево-активну речовину і при цьому рН складу знаходиться у межах 5,5-6,0. UA 115650 C2 (12) UA 115650 C2 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ПЕРЕХРЕСНІ ПОСИЛАННЯ НА РОДИННІ ЗАЯВКИ [0001] Дана заявка претендує на пріоритет за попередніми заявками на патент США під номерами 61/358,857 з датою подачі 25 червня 2010 р.; 61/360,786 з датою подачі 1 липня 2010 р.; 61/387,862 з датою подачі 29 вересня 2010 р.; 61/435,710 з датою подачі 24 січня 2011 р.; 61/442,115 з датою подачі 11 лютого 2011 р.; 61/476,210 з датою подачі 15 квітня 2011р.; і 61/495,268 з датою подачі 9 червня 2011 р.; кожна з яких включена до даної заявки за допомогою посилання. [0002] Родинними для даної заявки є заявки на патент США під заголовком "Способи та композиції для доставки до ЦНС гепаран-N-сульфатази" з такою ж датою подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС ідуронат-2-сульфатази", та ж дата подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС β-галактоцереброзидази", та ж дата подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС арилсульфатази A", та ж дата подачі; кожна з яких включена до даної заявки за допомогою посилання. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ [0003] Замісна ферментна терапія (ЗФТ) включає системне введення суб'єктам природних або рекомбінантних білків і/або ферментів. Схвалені терапевтичні засоби зазвичай вводять суб'єктам внутрішньовенно і зазвичай вони є ефективними при лікуванні соматичних симптомів первинної ферментної недостатності. У результаті обмеженого розподілу введеного внутрішньовенно білка і/або ферменту по клітинах і тканинах центральної нервової системи (ЦНС) лікування захворювань, що мають етіологію, пов'язану з ЦНС, є особливо складним завданням, оскільки введені внутрішньовенно білки і/або ферменти не проникають у достатній мірі через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ). [0004] Гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) − це структурна система, яка складається з ендотеліальних клітин, функцією яких є захист центральної нервової системи (ЦНС) від шкідливих речовин у крові, таких як бактерії, макромолекули (наприклад, білки) та інші гідрофільні молекули, шляхом обмеження проникнення подібних речовин через ГЕБ до спинномозкової рідини (СМР) і ЦНС. [0005] Існує декілька способів обійти ГЕБ для покращення доставки терапевтичного агента до мозку, в тому числі пряма внутрішньочерепна ін'єкція, короткочасна пермеабілізація ГЕБ і модифікація активного агента, яка змінює розподіл у тканинах. Пряма ін'єкція терапевтичного агента до тканин мозку повністю обходить судинну систему, але пов'язана в першу чергу з ризиком ускладнень (інфекція, ушкодження тканин, імунна відповідь), які виникають у результаті внутрішньочерепних ін'єкцій і слабкої дифузії активного агента з місця введення. На даний момент пряме введення білків до мозкової речовини не забезпечило значного терапевтичного ефекту внаслідок існування бар'єра для дифузії та обмеженого об'єму складу, який може бути введений. Була вивчена дифузія з конвекцією через катетери, розміщені в паренхімі мозку, з використанням повільної довгострокової інфузії (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), однак у жодному зі схвалених способів терапії цей підхід не використовується для тривалого лікування. Крім того, розміщення внутрішньомозкових катетерів є вкрай інвазивним і є менш бажаною клінічною альтернативою. [0006] Також були розпочаті спроби здійснити інтратекальну (ІТ) ін'єкцію або введення білків до спинномозкової рідини (СМР), але вони також не призвели до терапевтичного успіху. Однією з основних проблем при такому лікуванні є схильність активної речовини до дуже щільного зв'язування з епендимною вистилкою шлуночка, яке заважає наступній дифузії. У даний час є відсутніми дозволені продукти для лікування генетичного захворювання мозку шляхом прямої доставки агентів до СМР. [0007] Насправді, багато хто вважає, що бар'єр для дифузії на поверхні мозку, а також відсутність ефективних і зручних способів доставки, є занадто суттєвою перешкодою для досягнення відповідного терапевтичного ефекту в головному мозку при лікуванні будь-якого захворювання. [0008] Багато які з лізосомних хвороб накопичення зачіпають нервову систему, що особливо ускладнює лікування цих хвороб за допомогою традиційних методів терапії. Часто зустрічаються значні накопичення глюкозоаміногліканів (ГАГ) у нейронах і в мозкових оболонках хворих індивідів, що призводить до різних форм симптомів з боку ЦНС. На сьогоднішній день не відомі випадки успішного лікування симптомів з боку ЦНС, викликаних лізосомними хворобами, з використанням доступних засобів. [0009] Таким чином, залишається велика потреба в ефективній доставці терапевтичних речовин до мозку. Зокрема, існує велика потреба в більш ефективній доставці активних речовин до центральної нервової системи для лікування лізосомних хвороб накопичення. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ 1 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0010] Даний винахід забезпечує ефективний і менш інвазивний підхід для прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Зокрема, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, який полягає в тому, що заміщуючий фермент (наприклад, арилсульфатаза А (ASA)) лізосомних хвороб накопичення (наприклад, МЛД) може бути прямо введений до спинномозкової рідини (СМР) суб'єкта, що потребує лікування, у високій концентрації (наприклад, більше 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл або більше), завдяки чому фермент ефективно й активно проникає через різні поверхні та поширюється в різних областях мозку, включаючи глибокі області мозку. Зовсім несподівано автори даного винаходу продемонстрували, що доставка такої високої концентрації білка може бути досягнута з використанням простих фізіологічних або буферних розчинів, не викликаючи суттєвих побічних ефектів, таких як різко виражена імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, даний винахід забезпечує високоефективний, клінічно бажаний і зручний для пацієнта підхід для прямої доставки до ЦНС для лікування різних захворювань і розладів, пов'язаних із компонентами ЦНС, зокрема лізосомних хвороб накопичення. Даний винахід являє собою значне досягнення в області спрямованої доставки речовин до ЦНС і замісної ферментної терапії. [0011] Як докладно описано нижче, автори даного винаходу розробили стабільні склади для ефективного інтратекального (ІТ) введення білка арилсульфатази А (ASA). Припускається, однак, що різні стабільні склади, описані в даній заявці, є в цілому підходящими для доставки до ЦНС терапевтичних агентів, включаючи різні інші лізосомальні ферменти. Дійсно, стабільні склади згідно з даним винаходом можуть бути використані для доставки до ЦНС за допомогою різних способів і шляхів, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: інтрапаренхімальне, інтрацеребральне, інтраветрикулярне церебральне (ІЦВ), інтратекальне (тобто ІТ-поперекове, ІТ-мостомозочкове) введення або будь-який інший метод і шлях прямого або непрямого введення до ЦНС і/або до СМР. [0002] Припускається також, що різні стабільні склади, представлені в даній заявці, є в цілому підходящими для доставки до ЦНС терапевтичних агентів, таких як терапевтичні білки, включаючи різні заміщуючі ферменти для лікування хвороб лізосомного накопичення. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент може бути синтетичним, рекомбінантним, генактивованим або природним ферментом. [0003] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад для прямого інтратекального введення до ЦНС, який містить білок арилсульфатазу А (ASA), сіль і поверхнево-активну речовину полісорбат. У деяких варіантах реалізації, білок ASA є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 1-300 мг/мл (тобто 1-250 мг/мл, 1-200 мг/мл, 1-150 мг/мл, 1100 мг/мл, 1-50 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, білок ASA є присутнім у концентрації, обраній із: 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл чи вище. [0004] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад для будь-якого застосування, наведеного в даній заявці, у яких білок ASA включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO:1. У деяких варіантах реалізації, білок ASA включає амінокислотну послідовність, щонайменше на 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % або 98 % ідентичну послідовності SEQ ID NO:1. У деяких варіантах реалізації, стабільний склад для будь-якого застосування, описаного в даній заявці, включає сіль. У деяких варіантах реалізації, сіллю є NaСl. У деяких варіантах реалізації, NaСl є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 0-300 мМ (тобто 0-250 мМ, 0-200 мМ, 0-150 мМ, 0-100 мМ, 0-75 мМ, 0-50 мМ або 0-30 мМ). У деяких варіантах реалізації, NaСl є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 137-154 мМ. У деяких варіантах реалізації, NaСl є присутнім у концентрації приблизно 154 мМ. [0005] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будьяким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, у якому поверхнево-активна речовина полісорбат обрана з групи, яка включає полісорбат 20, полісорбат 40, полісорбат 60, полісорбат 80 і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, поверхнево-активна речовина полісорбат є полісорбатом 20. У деяких варіантах реалізації, полісорбат 20 є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 0-0,02 %. У деяких варіантах реалізації, полісорбат 20 є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 0-0,005 %. [0006] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будьяким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, причому зазначений склад додатково включає буферний агент. У деяких варіантах реалізації, буферний агент обраний із групи, яка складається з фосфату, гістидину і сукцинату, трис(гідроксиметил)амінометану ("Трис") і їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації, агентом для буферизації є фосфат. У деяких 2 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіантах реалізації, фосфат є присутнім у концентрації не вище 50 мМ (тобто не вище, ніж 45 мМ, 40 мМ, 35 мМ, 30 мМ, 25 мМ, 20 мМ, 15 мМ, 10 мМ або 5 мМ). У деяких варіантах реалізації, фосфат є присутнім у концентрації не вище 20 мМ. У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, у яких склад має рН приблизно 3,0-8,0 (тобто приблизно 4-7,5; 58; 5-7,5; 5-6,5; 5-7,0; 5,5-8,0; 5,5-7,7; 5,5-6,5; 6-7,5 або 6-7,0). У деяких варіантах реалізації, склад має pН приблизно 5,5-6,5 (тобто 5,5; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4 або 6,5). У деяких варіантах реалізації, склад має pН приблизно 6,0. [0007] У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будьяким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, у яких склад є рідким складом. У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, у яких склад має лікарську форму ліофілізованого сухого порошку. [0008] У деяких варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад для інтратекального введення, який містить білок арилсульфатазу А в концентрації приблизно 1-300 мг/мл, NaСl у концентрації приблизно 154 мМ, полісорбат 20 у концентрації приблизно 0,005 % і pН приблизно 6,0. У деяких варіантах реалізації, білок ASA є присутнім у концентрації приблизно 10 мг/мл. У деяких варіантах реалізації, білок ASA є присутнім у концентрації приблизно 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл. [0009] У різних аспектах даний винахід включає контейнер, що містить дозовану лікарську форму стабільного складу в різних варіантах реалізації, представлених у даній заявці. У деяких варіантах реалізації, контейнер може бути обраним із групи, що включає ампули, віали, пляшки, картриджі, резервуари, шприци «lyo-ject» або попередньо заповнені шприци. У деяких варіантах реалізації, контейнер є попередньо заповненим шприцом. У деяких варіантах реалізації, попередньо заповнений шприц обраний із групи, що включає шприци з боросилікатного скла з термічно обробленим силіконовим покриттям, шприци з боросилікатного скла з нанесеним шаром силікону й пластикові шприци без силікону. У деяких варіантах реалізації, стабільний склад є присутнім у об'ємі, меншому за 50 мл (тобто меншому за 45 мл, 40 мл, 35 мл, 30 мл, 25 мл, 20 мл, 15 мл, 10 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2,5 мл, 2,0 мл, 1,5 мл, 1,0 мл або 0,5 мл). У деяких варіантах реалізації, стабільний склад є присутнім у об'ємі, меншому за 3,0 мл. [0010] У різних аспектах реалізації, даний винахід включає способи лікування метахроматичної лейкодистрофії, які включають інтратекальне введення суб'єкту, що цього потребує, складу згідно з будь-яким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці. [0011] У деяких варіантах реалізації, даний винахід включає спосіб лікування метахроматичної лейкодистрофії, який включає інтратекальне введення суб'єкту, що цього потребує, складу, який включає білок арилсульфатазу А (ASA) в концентрації приблизно 1-300 мг/мл, NaСl у концентрації приблизно 154 мМ, полісорбат 20 у концентрації приблизно 0,005 % і pН приблизно 6,0. [0012] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення не викликає у суб'єкта суттєвих побічних ефектів, таких як тяжка імунна реакція. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення не викликає у суб'єкта суттєвої адаптивної Т-клітинної імунної відповіді. [0013] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу забезпечує доставку білка арилсульфатази А до різних тканин-мішеней у головному мозку, спинному мозку і/або периферичних органах. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу забезпечує доставку білка арилсульфатази А до тканин-мішеней головного мозку. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені головного мозку включають білу речовину і/або нейрони в сірій речовині. У деяких аспектах білок арилсульфатаза А доставляється до нейронів, клітин глії, периваскулярних клітин і/або менінгеальних клітин. У деяких варіантах реалізації, білок арилсульфатаза А доставляється до нейронів у спинному мозку. [0014] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу додатково забезпечує системну доставку білка ASA до периферичних клітин-мішеней. У деяких варіантах реалізації, периферичні клітини-мішені обрані з групи, яка включає печінку, нирки, селезінку і/або серце. [0015] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до його лізосомальної локалізації в тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниження накопичення сульфатидів у тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, накопичення сульфатидів знижується щонайменше на 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, у 1 раз, у 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем (тобто накопиченням у 3 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 суб'єкта ГАГ до терапії). У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниження вакуолізації в нейронах (щонайменше на 20 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 90 %, у 1 раз, у 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем). У деяких варіантах реалізації, нейрони містять клітини Пуркіньє. [0016] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до підвищення ферментативної активності ASA в тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність ASA підвищується щонайменше в 1 раз, у 2 рази, в 3 рази, в 4 рази, в 5 разів, у 6 разів, у 7 разів, у 8 разів, у 9 разів або в 10 разів у порівнянні з контролем (тобто ендогенною ферментативною активністю у суб'єкта до лікування). У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність ASA становить щонайменше приблизно 10 нмоль/год/мг, 20 нмоль/год/мг, 40 нмоль/год/мг, 50 нмоль/год/мг, 60 нмоль/год/мг, 70 нмоль/год/мг, 80 нмоль/год/мг, 90 нмоль/год/мг, 100 нмоль/год/мг, 150 нмоль/год/мг, 200 нмоль/год/мг, 250 нмоль/год/мг, 300 нмоль/год/мг, 350 нмоль/год/мг, 400 нмоль/год/мг, 450 нмоль/год/мг, 500 нмоль/год/мг, 550 нмоль/год/мг або 600 нмоль/год/мг. [0017] У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність ASA підвищується в поперековому відділі. У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність ASA в поперековому відділі становить щонайменше приблизно 500 нмоль/год/мг, 600 нмоль/год/мг, 700 нмоль/год/мг, 800 нмоль/год/мг, 900 нмоль/год/мг, 1000 нмоль/год/мг, 1500 нмоль/год/мг, 2000 нмоль/год/мг, 3000 нмоль/год/мг, 4000 нмоль/год/мг, 5000 нмоль/год/мг, 6000 нмоль/год/мг, 7000 нмоль/год/мг, 8000 нмоль/год/мг, 9000 нмоль/год/мг або 10000 нмоль/год/мг. [0018] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниження інтенсивності, тяжкості або частоти, або вповільнення прояву щонайменше одного симптому чи ознаки хвороби МЛД. У деяких варіантах реалізації, щонайменше один симптом чи ознака хвороби МЛД являє собою підвищений внутрішньочерепний тиск, замісну гідроцефалію, накопичення сульфатованих гліколіпідів у мієлінових оболонках у центральній і периферичній нервовій системі та у внутрішніх органах, прогресуючу демієлінізацію та втрату аксонів у ЦНС і ПНС і/або рухову й когнітивну дисфункцію. [0019] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на 2 тижні. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на 2 місяці. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення застосовують у комбінації з внутрішньовенним введенням. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на тиждень. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на два тижні. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на два місяці. У певних варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють частіше, ніж один раз на місяць, наприклад, введення двічі на тиждень, один раз на тиждень, один раз через тиждень або два рази на місяць. [0020] У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють у той самий день. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення не здійснюють протягом деякого періоду часу між введеннями, наприклад, у межах щонайменше 2 днів, у межах щонайменше 3 днів, у межах щонайменше 4 днів, у межах щонайменше 5 днів, у межах щонайменше 6 днів, у межах щонайменше 7 днів або в межах щонайменше одного тижня. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють за перемінним графіком, наприклад, перемінне введення щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення заміняють інтратекальним введенням у графіку введень, наприклад, при графіку внутрішньовенного введення один раз на тиждень, один раз на два тижні, два рази на місяць або один раз на місяць, кожне третє або четверте, або п'яте внутрішньовенне введення в цьому графіку може бути замінене на інтратекальне введення замість внутрішньовенного введення. [0021] У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють послідовно, наприклад, спочатку здійснюють внутрішньовенне введення (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісячне дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року і більше) з наступним ІТ введенням (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більш ніж двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше). У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють першим (наприклад, щотижня, 4 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 один раз на два тижні, два рази на місяць, щомісяця, один раз на два місяці, один раз на три місяці, дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше) з наступним внутрішньовенним введенням (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більш ніж двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше). [0022] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення застосовують при відсутності внутрішньовенного введення. [0023] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення застосовують при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії. КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ [0024] Фігура 1 ілюструє показові дані з концентрації арилcульфатази А (rhASA) у сироватці після ВВ введення. [0025] Фігура 2 ілюструє показові дані з концентрації rhASA у сироватці після ІТ поперекового введення. [0026] Фігура 3 ілюструє показові дані з концентрації rhASA у СМР після ВВ введення. [0027] Фігура 4 ілюструє показові дані з концентрації rhASA у СМР після ІТ поперекового введення. [0028] Фігура 5 ілюструє показове дослідження впливу буфера і рН на температурну стабільність rhASA. [0029] Фігура 6 ілюструє показовий аналіз rhASA методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) з додецилсульфатом натрію (ДСН) (офарблення Кумассі) після зберігання протягом 2 тижнів при температурі 40±2 ºC. [0030] Фігура 7 ілюструє показовий аналіз rhASA у складі для ІТ введення методом електрофорезу в ПААГ з ДСН (офарблення Кумассі) після зберігання протягом 3 місяців при температурі 5 ºC і 25 ºC. [0031] На Фігурі 8 показаний показовий зовнішній вигляд лікарської субстанції й лікарського препарату rhASA після 48 годин перемішування (А) і струшування (В). [0032] На Фігурі 9 показаний показовий зовнішній вигляд лікарського препарату rhASA (без Р20) з (n = 2) і без вільного простору (n = 1) над продуктом після перемішування протягом 48 годин. [0033] Фігура 10 ілюструє показові дані з буферної ємності лікарської субстанції rhASA у порівнянні з контрольним буфером при титруванні хлористоводневою кислотою. [0034] На Фігурі 11 наведені показові дані з буферної ємності лікарської субстанції rhASA у порівнянні з контрольним буфером при титруванні 1 М гідроксидом натрію. [0035] На Фігурі 12 зображені показові зразки rhASA у сольовому розчині, рН 6,0, з різною концентрацією. [0036] Фігура 13 ілюструє показовий аналіз rhASA методом ексклюзійної ВЕРХ (рН рухомої фази 5,5) в 154 мМ NaСl, pН 5,9. [0037] Фігура 14 ілюструє показовий аналіз rhASA в 154 мМ NaСl, pН 5,9 методом ексклюзійної ВЕРХ (рН рухомої фази 7,0). [0038] Фігура 15 ілюструє показові профілі ексклюзійної хроматографії зразків rhASA у початковій точці відліку часу та зразків, що зберігалися протягом 11 місяців вивчення стабільності в 154 мМ NaСl, pН 5. [0039] На Фігурі 16 наведена типова мікрофотографія тканин мозку, мозкових оболонок, інфільтратів (групи з середніми та високими дозами, обидві статі) після лікування. [0040] На Фігурі 17 наведена інша показова мікрофотографія тканин мозку, мозкових оболонок, інфільтратів (групи з середніми та високими дозами, обидві статі) після лікування. [0041] На Фігурі 18 наведена показова мікрофотографія тканин мозку, периваскулярних, інфільтратів (групи з середніми дозами – чоловіки; групи з високими дозами – жінки) після лікування. [0042] На Фігурі 19 наведене показове офарблення, з використанням альціанового синього, спинного мозку імунотолерантних мишей МЛД, які одержували rhASA, і результати, що демонструють зменшення сульфатидів, яке було визначене шляхом офарблення, з використанням альціанового синього, шийного відділу спинного мозку у тварин, які одержували інтратекальні ін'єкції рекомбінантного rhASA у 1, 8, 15 і 22 день у дозі 520 мг/кг маси мозку, або контрольних мишей, яким вводили наповнювач. Як показано, обробка шляхом інтратекального введення рекомбінантної rhASA призводила до зниження накопичення сульфатидів у спинному мозку, в тому числі у шийному відділі спинного мозку. 5 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0043] Фігура 20 ілюструє показовий морфометричний аналіз офарблення, з використанням альціанового синього, відділів хребта у імунотолерантних мишей МЛД, що одержували rhASA, включаючи типові результати, які ілюструють оптичну щільність альціанового синього всього спинного мозку (З-СМ), усієї сірої речовини (З-СР), сірої речовини поперекового відділу (П-СР), сірої речовини шийного відділу (Ш-СР), усієї білої речовини (З-БР), білої речовини поперекового відділу (П-БР) і білої речовини шийного відділу (Ш-БР), як визначено з використанням морфометричного аналізу. Статистично значуще зменшення офарблення, показане офарбленням альціановим синім, було виявлене у тварин, що одержували rhASA, у порівнянні з контрольними мишами, яким вводили наповнювач. [0044] На Фігурі 21 показане показове зменшення офарблення на LAMP у білій речовині (фімбрія) імунотолерантних мишей із МЛД, що одержували rhASA, наведені показові результати, що ілюструють рівень LAMP-1 у бахромці, визначений із використанням імуногістохімії. Збільшення 20х. Показано, що обробка шляхом інтратекального введення rhASA призводила до зменшення LAMP-1 у білій речовині головного мозку. [0045] На Фігурі 22 наведені результати показового морфометричного аналізу офарблення на LAMP тканин мозку імунотолерантних мишей МЛД, що одержували rhASA, і зображені показові результати, які ілюструють інтенсивність офарблення на LAMP-1 у мозолистому тілі (МТ), бахромці (Б), білій речовині мозочка (Моз-БР) і стовбурі мозку (СтМ) тварин, що одержували 20 мг/кг внутрішньовенно rhASA, 300 мг/кг маси мозку інтратекально rhASA, 520 мг/кг маси мозку внутрішньовенно rhASA, або контрольних мишей, яким вводили наповнювач. [0046] Фігура 23 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення наповнювача один раз на два тижні протягом 6 місяців – загальна некропсія. [0047] Фігура 24 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення rhASA у дозі 1,8 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців – загальна некропсія. [0048] Фігура 25 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення rhASA у дозі 6,0 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців – загальна некропсія. [0049] Фігура 26 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення rhASA у дозі 18,6 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців – загальна некропсія. [0050] Фігура 27 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення один раз на два тижні (ФСБ як контроль) протягом 6 місяців – прижиттєвий розтин. [0051] Фігура 28 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення один раз на два тижні (РДН) наповнювача протягом 6 місяців – прижиттєвий розтин. [0052] Фігура 29 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення rhASA у дозі 1,8 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців – прижиттєвий розтин. [0053] Фігура 30 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення rhASA у дозі 6,0 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців – прижиттєвий розтин. [0054] Фігура 31 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення rhASA у дозі 18,6 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців – прижиттєвий розтин. [0055] Фігура 32 ілюструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканини головного мозку, взятих із поверхні мозку тварин із контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній некропсії). [0056] Фігура 33 ілюструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканини з глибокої білої речовини головного мозку тварин з контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній некропсії). [0057] Фігура 34 ілюструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканини з глибокої сірої речовини головного мозку тварин з контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для 6 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній некропсії). [0058] Фігура 35 ілюструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканини з різних областей головного мозку тварин із контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній некропсії). [0059] Фігура 36 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у відділах хребта молодих довгохвостих макак після ІТ введення один раз на два тижні протягом 6 місяців – прижиттєвий розтин. [0060] Фігура 37 ілюструє як приклад концентрацію rhASA у відділах хребта молодих довгохвостих макак після ІТ введення один раз на два тижні протягом 6 місяців – прижиттєвий розтин. [0061] Фігура 38 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку. [0062] Фігура 39 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку. [0063] Фігура 40 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку. [0064] Фігура 41 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку. [0065] Фігура 42 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку. [0066] Фігура 43 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку. [0067] Фігура 44A–G ілюструє концентрацію рекомбінантної людської арилсульфатази (rhASA) у виділених фрагментах тканин головного мозку дорослих і молодих довгохвостих макак, яким ін’єктували або наповнювач, або 1,8 мг rhASA, або 18,6 мг rhASA. Кожна з Фігур 44А-G відповідає області тканини головного мозку, показаної на Фігурі 39. [0068] Фігура 45A і B ілюструє показове порівняння концентрації рекомбінантної людської арилсульфатази А (rhASA), визначеної в глибокій білій речовині (Фігура 45A) або в глибокій сірій речовині (Фігура 45B) тканин мозку дорослих або молодих довгохвостих макак, які одержували інтратекальні або інтрацеребровентрикулярні ін'єкції rhASA. [0069] Фігура 46А ілюструє як приклад концентрації rhASA, визначені в декількох фрагментах тканин, отриманих у молодих (12 місяців від народження) довгохвостих макак, які одержували інтратекальні ін'єкції 18,6 мг рекомбінантної людської арилсульфатази А (rhASA). Як показано на обох Фігурах 46А і В, концентрація rhASA, доставленої до тканин, була в межах або перевищувала необхідну терапевтичну концентрацію 2,5 нг/мг білка. Анатомічними областями тканин мозку, які відповідають зразкам тканини, показаним на Фігурі 46А і Фігурі 46В, є: підкіркова біла речовина (1); перивентрикулярна біла речовина і глибока біла речовина (2); підкіркова біла речовина (3); підкіркова біла речовина (4); внутрішня капсула (5); хвостате ядро внутрішньої капсули (6); глибока біла речовина (7); підкіркова біла речовина й кора (8); шкарлупа (9); підкіркова біла речовина й кора скроневої долі (10); глибока сіра речовина (11); глибока сіра речовина (12); перивентрикулярна й підкіркова лобові долі (13); підкіркова біла речовина, кіркова поверхнева речовина (14); мозолисте тіло й навколомозолиста підкіркова біла речовина (15); глибока підкіркова біла речовина (16); глибока сіра речовина (17); глибока сіра речовина (18); перивентрикулярна біла речовина (19); глибока підкіркова біла речовина (20); гіпокамп (21); мозолисте тіло (22); глибока біла речовина (23); підкіркова біла речовина, потилична доля (24); і біла речовина мозочка (25). [0070] На Фігурі 47А показані ділянки тканин глибокої білої речовини, отриманої від довгохвостих макак, які одержували інтратекальні ін'єкції 1,8 мг rhASA. Фігура 47В ілюструє імуноофарблення тканин глибокої білої речовини й виявлений розподіл rhASA у відповідних клітинах. Фігура 47С ілюструє, що ІТ введена rhASA демонструє органельну колокалізацію в тканинах глибокої білої речовини у довгохвостих макак і, зокрема, у лізосомах. На Фігурі 47С у верхньому лівому вікні показане імуноофарблення на ASA. 124 [0071] На Фігурі 48 наведене порівняння розподілу I-міченої арилсульфатази (ASA) з використанням ПЕТ-сканування через 24 години після ІТ або ІЦВ введення довгохвостим мавпам ASA, міченої зазначеним способом. 124 [0072] Фігура 49 ілюструє розподіл I-міченої ASA відразу після ІЦВ введення довгохвостим 124 мавпам і порівняння розподілу ІТ введеної I-міченої ASA протягом 2-5 годин. Як показано, ІТ 7 UA 115650 C2 124 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 введення доставляє I-мічену ASA до тих самих початкових відділів (цистерна і проксимальний відділ хребта), як це показано для ІЦВ введення. [0073] На Фігурі 50 наведені результати показового ІЦВ і ІТ введення на моделі миші. [0074] На Фігурі 51 показаний приклад пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ). [0075] На Фігурі 52 показаний приклад низькопрофільної системи доступу PORT-A-CATH®, що інтратекально імплантується. [0076] На Фігурі 53 показаний приклад пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ). [0077] На Фігурі 54 показаний приклад пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ), який дозволяє вводити в домашніх умовах ферменти до ЦНС при замісній ферментній терапії (ЗФТ). [0078] Фігура 55 ілюструє типову схему пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ) із захисним механізмом. [0079] На Фігурі 56А показаний приклад розташування ПІДЛЗ на тілі пацієнта. На Фігурі 56B показані різні компоненти пристрою інтратекальної доставки лікарських препаратів (ПІДЛЗ); на Фігурі 56C показаний приклад розташування впровадженого до тіла пацієнта пристрою для ІТ поперекової ін'єкції. ВИЗНАЧЕННЯ [0090] Для полегшення розуміння даного винаходу нижче надані визначення деяких термінів. Додаткові визначення наступних термінів та інші терміни наведені в тексті опису. [0091] Приблизно або близько: У даній заявці термін "приблизно" або "близько" стосовно одного або більше розглянутих значень відноситься до значення, яке є близьким до зазначеного еталонного значення. У деяких варіантах реалізації термін "приблизно" або "близько" відноситься до діапазону значень, які входять до діапазону 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % або менше в будь-якому напрямку (більше або менше) від установленого еталонного значення, якщо не зазначено інше або інше не є очевидним із контексту (окрім випадків, коли таке значення перевищує 100 % від можливого значення). [0092] Покращення: У даній заявці "покращення" означає попередження, скорочення або тимчасове полегшення стану, або покращення стану суб'єкта. Покращення включає, але не обов'язково, повне видужання або повне попередження хворобливого стану. У деяких варіантах реалізації, покращення включає підвищення рівнів відповідного білка або його активності, які є недостатніми у відповідних хворих тканинах. [0093] Біологічна активність: У даній заявці вираз "біологічна активність" відноситься до характеристики будь-якого агента, який має активність у біологічній системі й, зокрема, в організмі. Наприклад, агент, який при введенні до організму демонструє біологічний вплив на організм, вважається біологічно активним. У конкретних варіантах реалізації, у випадках, коли білок або поліпептид є біологічно активним, ту частину білка або поліпептиду, яка має щонайменше один вид біологічної активності білка або поліпептиду, як правило, називають "біологічно активною" частиною. [0094] Наповнювач: У даній заявці термін "наповнювач" відноситься до сполуки, яка додає маси ліофілізованій суміші та вносить вклад у фізичну структуру ліофілізованої таблетки (наприклад, полегшує виробництво по суті однорідної ліофілізованої таблетки, яка підтримує структуру з відкритими порами). Приклади таких наповнювачів включають манітол, гліцин, хлорид натрію, гідроксиетилкрохмаль, лактозу, сахарозу, трегалозу, поліетиленгліколь і декстран. [0095] Катіон-незалежний маноза-6-фосфатний рецептор (CI-MRP): У даній заявці термін "катіон-незалежний маноза-6-фосфатний рецептор (CI-MRP)" відноситься до клітинних рецепторів, які зв'язують фрагменти маноза-6-фосфату на попередниках кислих гідролаз у апараті Гольджи, призначених для транспорту до лізосом. На додаток до маноза-6-фосфатів, CI-MRP також зв'язує інші білки, у тому числі IGF-II. CI-MRP також відомий як рецептор "M6P/IGF-II", рецептор "CI-MRP/IGF-II", "рецептор IGF-II" або "рецептор IGF2". Ці терміни і їхні скорочення використовуються в даній заявці взаємозамінно. [0096] Супутня імунопригнічуюча терапія: У даній заявці термін "супутня імунопригнічуюча терапія" включає будь-які способи імунопригнічуючої терапії, які використовуються як попереднє лікування, прекондиціювання або паралельно зі способом лікування. [0097] Розчинник: У даній заявці термін "розчинник" відноситься до фармацевтично прийнятної (наприклад, безпечної та нетоксичної для ін'єкції людині) розчиняючої речовини, застосовної для приготування відновлюваного складу. Приклади розчинників включають 8 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стерильну воду, бактеріостатичну воду для ін'єкцій (БВІ), буферний розчин (наприклад, фосфатно-сольовий буфер), стерильний фізіологічний розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози. [0098] Лікарська форма: У даній заявці термін "лікарська форма" і "дозована лікарська форма" відноситься до фізично дискретної одиниці терапевтичного білка для лікування пацієнта. Кожна одиниця містить деяку кількість активної речовини, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту. Слід розуміти, однак, що загальна доза в композиції буде визначена лікарем у рамках обґрунтованого медичного висновку. [0099] Замісна ферментна терапія (ЗФТ): У даній заявці термін "замісна ферментна терапія (ЗФТ)" відноситься до будь-якої терапевтичної стратегії, яка коректує дефіцит ферменту з використанням доставки відсутнього ферменту. У деяких варіантах реалізації, відсутній фермент доставляють шляхом інтратекального введення. У деяких варіантах реалізації, відсутній фермент доставляють шляхом інфузії до кров'яного потоку. Після введення фермент поглинається клітинами і транспортується до лізосом, де фермент діє, видаляючи речовини, які накопичуються в лізосомах у результаті ферментної недостатності. Як правило, замісна ферментна терапія лізосомальними ферментами є ефективною, терапевтичні ферменти доставляються до лізосом у клітинах відповідних тканин-мішеней, де проявляється дефект накопичення. [0100] Покращення, збільшення або зменшення: У даній заявці терміни "покращення", "збільшення" або "зменшення" чи граматичні еквіваленти вказують на значення, які співвідносяться зі значеннями базових вимірювань, наприклад, у того ж самого індивіда, до початку обробки/лікування, описаного в даній заявці, або значеннями, виміряними у контрольних індивідів (або декількох контрольних індивідів) при відсутності обробки/лікування, описаного в даній заявці. "Контрольні індивіди" являють собою індивідів, які страждають на ті ж самі форми лізосомної хвороби накопичення, що й індивіди, які проходять лікування, і вони приблизно того ж віку, що й індивіди, які проходять лікування (для того, щоб стадії захворювання індивіда, який проходить лікування, і контрольного індивіда (індивідів) були порівнянними). [0101] Індивід, суб'єкт, пацієнт: У даній заявці терміни "індивід", "суб'єкт" або "пацієнт" відносяться до людини або тварини, відмінної від людини. Індивід (який також згадується як "пацієнт" або "суб'єкт"), що проходить лікування, являє собою індивіда (плід, немовля, дитину, підлітка або дорослу людину), що страждає на розглянуте захворювання. [0102] Інтратекальне введення: У даній заявці термін "інтратекальне введення" або "інтратекальна ін'єкція" відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можуть бути використані різні методики, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через трепанаційний отвір або цистернову чи поперекову пунктуру або т.п. У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до ІТ введення або доставки через поперекову область або відділ, наприклад, поперекове ІТ введення або доставка. У даній заявці термін "поперековий відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, відділу хребта L2-S1. [0103] Лінкер: У даній заявці термін "лінкер" відноситься до амінокислотної послідовності в гібридному білку, крім тієї, яка зустрічається в конкретному положенні в природних білках і, як правило, лінкер сконструйований таким чином, що він є гнучким або являє собою проміжну структуру, таку як а-спіраль, між двома частинами білка. Лінкер також відноситься до спейсера. [0104] Ліопротектор: У даній заявці термін “ліопротектор” відноситься до молекули, яка попереджає або зменшує хімічну і/або фізичну нестабільність білка або іншої речовини при ліофілізації та наступному зберіганні. Приклади ліопротекторів включають цукри, такі як сахароза або трегалоза; амінокислоти, такі як глутамат натрію або гістидин; метиламіни, такі як бетаїн; ліотропні солі, такі як сульфат магнію; багатоатомні спирти, такі як трьохатомні або вищі спирти, наприклад, гліцерин, еритрит, гліцерол, арабітол, ксиліт, сорбіт і манітол, пропіленгліколь, поліетиленгліколь; плюроніки; і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, ліопротектор являє собою невідновлений цукор, такий як трегалоза або сахароза. [0105] Лізосомальний фермент: У даній заявці термін "лізосомальний фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який є здатним зменшити накопичені в лізосомах тварин сполуки або який може попередити чи покращити один або більше симптомів лізосомної хвороби накопичення. Лізосомальні ферменти, придатні для даного винаходу, включають як фермент дикого типу, так і модифікований лізосомальний фермент, і вони можуть бути отримані з 9 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням рекомбінантних і синтетичних методик або можуть бути виділені з природних джерел. Приклади лізосомальних ферментів перераховані в Таблиці 1. [0106] Лізосомна ферментна недостатність: У даній заявці термін "лізосомна ферментна недостатність" відноситься до групи генетичних захворювань, які є результатом недостатності щонайменше одного ферменту, який є необхідним для руйнування макромолекул (наприклад, ферментних субстратів) до пептидів, амінокислот, моноцукрів, нуклеїнових кислот і жирних кислот у лізосомах. У результаті у індивідів, що страждають на лізосомну ферментну недостатність, накопичуються сполуки в різних тканинах (наприклад, ЦНС, печінці, селезінці, кишечнику, стінках кровоносних судин та в інших органах). [0107] Лізосомна хвороба накопичення: У даній заявці термін "лізосомна хвороба накопичення" відноситься до будь-якої хвороби в результаті недостатності одного або декількох лізосомальних ферментів, необхідних для метаболізму природних макромолекул. Ці захворювання, як правило, призводять до накопичення незруйнованих молекул у лізосомах, що призводить до збільшення числа запасних гранул (також називаних запасними пухирцями). Ці захворювання й різні приклади описані більш докладно нижче. [0108] Поліпептид: У даній заявці “поліпептид”, у цілому, являє собою ланцюжок із щонайменше 2 амінокислот, з'єднаних одна з одною за допомогою пептидного зв'язку. У деяких варіантах реалізації, поліпептид може включати щонайменше 3-5 амінокислот, кожна з яких з'єднана з іншими з використанням щонайменше одного пептидного зв'язку. Фахівцям у даній області відомо, що поліпептиди можуть включати "неприродні" амінокислоти або інші молекули, які, проте, здатні до інтеграції в поліпептидний ланцюг. [0109] Заміщуючий фермент: У даній заявці термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який може діяти як заміщуючий, щонайменше частково, при недостатності або відсутності ферменту при лікуванні хвороби. У деяких варіантах реалізації, термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь-якого ферменту, дія якого може заміщувати, щонайменше частково, недостатність або відсутність лізосомальних ферментів при лізосомних хворобах накопичення, що підлягають лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент дозволяє знизити накопичення речовин у лізосомах ссавців або може попередити чи покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення. Заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, включають обидва з ферменту дикого типу і модифікованого лізосомального ферменту та можуть бути отримані з використанням рекомбінантних і синтетичних способів або виділені з природних джерел. Заміщуючий фермент може бути рекомбінантним, синтетичним, ген-активованим або природним ферментом. [0110] Розчинний: У даній заявці термін “розчинний” відноситься до здатності терапевтичного агента утворювати гомогенний розчин. У деяких варіантах реалізації, розчинність терапевтичного агента в розчині, до якого він введений і з використанням якого він транспортується до ділянки-мішені (наприклад, до клітин і тканин головного мозку), є достатньою для доставки терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента до сайтумішені. Декілька факторів можуть впливати на розчинність терапевтичних агентів. Наприклад, фактори, які можуть впливати на розчинність білка, включають йонну силу, амінокислотну послідовність і наявність інших супутніх косолюбілізуючих агентів або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції складені так, що солі кальцію виключаються з таких композицій. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти відповідно до даного винаходу є розчинними у відповідній фармацевтичній композиції. Слід мати на увазі, що хоча ізотонічні розчини, як правило, є переважними для парентерального введення складів, застосування ізотонічних розчинів може обмежувати адекватну розчинність для деяких терапевтичних агентів і, зокрема, деяких білків і/або ферментів. Було продемонстровано, що злегка гіпертонічні розчини (наприклад, до 175 мМ хлориду натрію в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) і цукровмісні розчини (наприклад, до 2 % сахарози в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) добре переносяться мавпами. Наприклад, найпоширенішою прийнятою композицією болюсного складу для ЦНС є фізіологічний розчин (150 мМ NaCl у воді). [0111] Стабільність: У даній заявці термін “стабільність” відноситься до здатності терапевтичного агента (наприклад, рекомбінантного ферменту) підтримувати його терапевтичну ефективність (наприклад, усю або переважно всю його передбачувану біологічну активність і/або фізико-хімічну цілісність) при тривалому періоді часу. Стабільність терапевтичного агента і здатність фармацевтичної композиції підтримувати стабільність такого терапевтичного агента можуть бути оцінені протягом тривалого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців і більше). Загалом, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом були створені таким чином, щоб вони були здатні стабілізувати або ж сповільнювати чи запобігати деградації одного або більше терапевтичних агентів, поєднаних із ними 10 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (наприклад, рекомбінантних білків). У контексті даного винаходу стабільним складом є той, у якому терапевтичний агент по суті зберігає свої фізичну і/або хімічну цілісність і біологічну активність при зберіганні й під час обробки (наприклад, заморожування/відтавання, механічного перемішування й ліофілізації). Стабільність білка може бути оцінена за утворенням високомолекулярних агрегатів, втратою ферментативної активності, формуванням пептидних фрагментів і зміщенням профілів заряду. [0112] Суб'єкт: У даній заявці термін "суб'єкт" означає будь-якого ссавця, включаючи людину. У деяких варіантах реалізації даного винаходу суб'єкт являє собою дорослого, підлітка і немовля. Крім того, даний винахід передбачає введення фармацевтичної композиції і/або здійснення способів лікування внутрішньоутробно. [0113] Суттєва гомологія: У даній заявці словосполучення "суттєва гомологія" відноситься до порівняння між послідовностями амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло фахівцям у даній області, дві послідовності зазвичай вважаються "по суті гомологічними", якщо вони містять гомологічні залишки у відповідних положеннях. Гомологічні залишки можуть бути однаковими залишками. Крім того, гомологічні залишки можуть бути неідентичними залишками, які мають адекватно близькі структурні і/або функціональні характеристики. Наприклад, як добре відомо фахівцям у даній області, деякі амінокислоти зазвичай класифікують як "гідрофобні" або "гідрофільні" амінокислоти і/або такі, що мають “полярні” або “неполярні” бічні ланцюги. Заміна однієї амінокислоти на іншу того ж типу часто може вважатися "гомологічною" заміною. [0114] Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як BLASTN для нуклеотидних послідовностей і BLASTP, gapped BLAST і PSI-BLAST для амінокислотних послідовностей. Приклади таких програм описані в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. На додаток до ідентифікації гомологічних послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня гомології. У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно гомологічними, якщо щонайменше 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше їхніх відповідних залишків є гомологічними до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка залишків є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків. [0115] Суттєва ідентичність: У даній заявці словосполучення "суттєва ідентичність" відноситься до порівняння послідовностей амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло фахівцям у даній області, дві послідовності, як правило, вважаються "по суті ідентичними", якщо вони містять однакові залишки у відповідних позиціях. Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як BLASTN для нуклеотидних послідовностей і BLASTP, gapped BLAST і PSI-BLAST для амінокислотних послідовностей. Приклади таких програм описані в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. На додаток до визначення однакових послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня ідентичності. У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно ідентичними, якщо не менше 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше їхніх відповідних залишків ідентичні до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків. 11 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0116] Синтетична СМР: У даній заявці термін "синтетична СМР" відноситься до розчину, який має рН, електролітний склад, вміст глюкози і осмос, що відповідають таким характеристикам у спинномозковій рідині. Синтетичну СМР також називають штучною СМР. У деяких варіантах реалізації, синтетична СМР являє собою розчин Елліотта B. [0117] Підходящий для доставки до ЦНС: У даній заявці фраза "підходящий для доставки до ЦНС" або "підходящий для інтратекальної доставки" стосовно фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом, як правило, відноситься до стабільності, переносимості та властивостей розчинності таких композицій, а також до здатності таких композицій доставляти ефективну кількість терапевтичного агента, що міститься в ньому, до цільових місць доставки (наприклад, до СМР або мозку). [0118] Тканини-мішені: У даній заявці термін «тканини-мішені» відноситься до будь-якої тканини, на яку впливає лізосомна хвороба накопичення, яка розглядається для лікування, або будь-якої тканини, в якій недостатньо лізосомальних ферментів, виражених у нормі. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, в яких існує помітна або аномально висока кількість ферменту, субстрату, наприклад, накопичених у клітинних лізосомах тканини, у пацієнтів, що страждають на або мають сприйнятливість до лізосомної хвороби накопичення. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, які відображають патології, супутні хвороби, симптоми або функції. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких недостатньо лізосомальних ферментів, як правило, в нормі експресованих на високому рівні. У даній заявці "тканини-мішені" можуть являти собою тканинимішені головного мозку, тканини-мішені спинного мозку і/або периферичні тканини-мішені. Приклади тканин-мішеней докладно описані нижче. [0119] Терапевтична група/фрагмент: У даній заявці термін "терапевтична група/фрагмент" відноситься до групи/фрагменту молекули, яка обумовлює терапевтичний ефект молекули. У деяких варіантах реалізації, терапевтична група/фрагмент являє собою поліпептид, що має терапевтичну активність. [0120] Терапевтично ефективна кількість: У даній заявці термін "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка (наприклад, заміщуючого ферменту), який дає терапевтичний ефект у суб'єкта, що пройшов лікування, відповідно до розумного співвідношення користь/ризик, застосовного для будь-якого медичного лікування. Терапевтичний ефект може бути об'єктивним (тобто вимірюваним із використанням деяких випробувань чи маркерів) або суб'єктивним (тобто суб'єкт проявляє ознаки або відчуває ефект). Зокрема, "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка або композиції, яка забезпечує лікування, покращення або попередження бажаного захворювання чи стану або демонструє помітний терапевтичний чи профілактичний ефект, такий як покращення симптомів, пов'язаних із хворобою, попередження або затримка прояву захворювання і/або зменшення тяжкості або частоти симптомів захворювання. Терапевтично ефективну кількість зазвичай вводять у режимі введення, який може включати багаторазове введення доз. Для будь-якого конкретного терапевтичного білка, терапевтично ефективна кількість (і/або відповідна доза з ефективним режимом введення) може варіювати, наприклад, у залежності від способу введення, в комбінації з іншими фармацевтичними засобами. Крім того, конкретна терапевтично ефективна кількість (і/або доза) для кожного конкретного пацієнта може залежати від різних факторів, включаючи захворювання, яке лікують, тяжкість захворювання; активність застосовуваного конкретного фармацевтичного агента, конкретного застосовуваного складу; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і дієту пацієнта, час введення, шлях введення і/або швидкість виведення або метаболізму застосовуваного конкретного гібридного білка, тривалість лікування і подібні фактори, які добре відомі в медицині. [0121] Допустимий/переносимий: У даній заявці терміни "допустимий/переносимий" і "переносимість" відносяться до здатності фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом не викликати побічних реакцій у суб'єкта, якому вводять таку композицію, або, як варіант, не викликати серйозної побічної реакції у суб'єкта, якому вводять таку композицію. У деяких варіантах реалізації, фармацевтична композиція згідно з даним винаходом добре переноситься суб'єктом, якому вводять таку композицію. [0122] Лікування: У даній заявці термін "лікування" (а також "лікувати/обробляти") відноситься до будь-якого введення терапевтичного білка (наприклад, лізосомального ферменту), яке повністю або частково пом'якшує, покращує стан, знімає, гальмує, затримує настання, зменшує тяжкість і/або зменшує частоту одного чи декількох симптомів або особливостей конкретного захворювання, розладу і/або умови (наприклад, синдрому Хантера, синдрому Санфіліппо типу B). Таке лікування/обробка може проводитися для суб'єкта, який не проявляє ознак відповідного захворювання, розладу і/або стану, і/або суб'єкта, який демонструє 12 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 тільки перші ознаки захворювання, розладу і/або патологічного стану. Як альтернатива або доповнення таке лікування може проводитися для суб'єкта, який має одну або більше виражених ознак відповідного захворювання, розладу і/або патологічного стану. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ [0123] Даний винахід передбачає, серед іншого, покращені способи для ефективної прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Як уже обговорювалося вище, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, що заміщуючий фермент (наприклад, білок ASA) для лізосомної хвороби накопичення (наприклад, метахроматичної лейкодистрофії) може бути безпосередньо введений до спинномозкової рідини (ліквору) суб'єкта, що потребує лікування, у високих концентраціях, не викликаючи суттєвих несприятливих ефектів у суб'єкта. Найбільш дивно, автори даного винаходу виявили, що заміщуючий фермент може бути доставлений у простому фізіологічному розчині або буферній композиції без застосування синтетичної СМР. Ще більш несподіваним є те, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу не призводить до суттєвих побічних ефектів, таких як тяжка імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, у деяких варіантах реалізації інтратекальну доставку відповідно до даного винаходу можна застосовувати при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії (наприклад, без індукції імунної толерантності з використанням попередньої обробки або попередньої підготовки). [0124] У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує ефективну дифузію до різних тканин головного мозку, що призводить до ефективного заміщення ферменту в різних тканинах-мішенях на поверхні головного мозку, до неглибоких і/або глибоких областей головного мозку. У деяких варіантах реалізації інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує достатню кількість заміщуючого ферменту, який циркулює в периферичній системі кровообігу. У результаті в деяких випадках інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу призводить до доставки заміщуючого ферменту до периферичних тканин, таких як печінка, серце й нирки. Цей результат є несподіваним і може бути особливо корисним для лікування лізосомних хвороб накопичення, що зачіпають як ЦНС, так і периферичні компоненти, які, як правило, потребують як регулярного інтратекального введення, так і внутрішньовенного введення. Припускається, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу може дозволити зменшити дози і/або частоту внутрішньовенної ін'єкції без шкоди для терапевтичного ефекту при лікуванні периферичних симптомів. [0125] Даний винахід забезпечує різні несподівані й корисні ознаки, які забезпечують ефективну та зручну доставку заміщуючого ферменту до різних тканин мозку, що призводить до ефективного лікування лізосомних хвороб накопичення, прояв яких пов'язаний із ЦНС. [0126] Різні аспекти даного винаходу докладно описані в наступних розділах. Використання розділів не призначене для обмеження даного винаходу. Кожний розділ можна застосувати до будь-якого аспекту даного винаходу. У даній заявці використання "або" означає "і/або", якщо не зазначено інше. Терапевтичні білки [0080] У деяких варіантах реалізації, способи згідно з винаходом і композиції, представлені в даному винаході, застосовують для доставки білка арилсульфатази А (ASA) до ЦНС для лікування метахроматичної лейкодистрофії. Підходящим білком ASA може бути будь-яка молекула або сукупність молекул, які здатні замінити активність білка арилсульфатази А (ASA) природного походження або позбавити від одного або більше фенотипів чи симптомів, асоційованих із дефіцитом ASA. У деяких варіантах реалізації, заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є поліпептид, що має N- і С-кінці й амінокислотну послідовність, суттєво подібну або ідентичну зрілому білку ASA людини. [0081] Зазвичай ASA людини синтезується у вигляді молекули-попередника, яка потім процесується в зрілу форму. Цей процес зазвичай відбувається шляхом видалення сигнального пептиду, який складається з 18 амінокислот. Зазвичай форму попередника також називають повнорозмірним попередником або повнорозмірним білком ASA, який містить 507 амінокислот. 18 N-кінцевих амінокислот відрізаються, у результаті чого утворюється зріла форма довжиною 489 амінокислот. Таким чином припускають, що 18 N-кінцевих амінокислот зазвичай не є необхідними для активності білка ASA. Амінокислотні послідовності зрілої форми (SEQ ID NO:1) і повнорозмірного попередника (SEQ ID NO:2) показового білка ASA людини дикого типу, тобто природного походження, представлені в Таблиці 1. 13 UA 115650 C2 Таблиця 1 Арилсульфатаза А людини Зріла форма Повнорозмірний попередник 5 10 15 20 25 RPPNIVLIFADDLGYGDLGCYGHPSSTTPNLDQLAAGGL RFTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRLPVRМГMYPGVLVPSS RGGLPLEEVTVAEVLAARGYLTGMAGKWHLGVGPEGA FLPPHQGFHRFLGIPYSHDQGPCQNLTCFPPATPCDGG CDQGLVPIPLLANLSVEAQPPWLPGLEARYMAFAHDLM ADAQRQDRPFFLYYASHHTHYPQFSGQSFAERSGRGP FGDSLMELDAAVGTLMTAIGDLGLLEET LVIFTADNGPETMRMSRGGCSGLLRCGKGTTYEGGVR EPALAFWPGHIAPGVTHELASSLDLLPTLAALAGAPLPN VTLDGFDLSPLLLGTGKSPRQSLFFYPSYPDEVRGVFA VRTGKYKAHFFTQGSAHSDTTADPACHASSSLTAHEPP LLYDLSKDPGENYNLLGGVAGATPEVLQALKQLQLLKAQ LDAAVTFGPSQVARGEDPALQICCHPGCTPRPACCHCP DPHA (SEQ ID NO:1) МГAPRSLLLALAAGLAVARPPNIVLIFADDLGYGDLGCYGH PSSTTPNLDQLAAGGLRFTDFYVPVSLCTPSRAALLTGRL PVRМГMYPGVLVPSSRGGLPLEEVTVAEVLAARGYLTGM AGKWHLGVGPEGAFLPPHQGFHRFLGIPYSHDQGPCQNL TCFPPATPCDGGCDQGLVPIPLLANLSVEAQPPWLPGLEA RYMAFAHDLMADAQRQDRPFFLYYASHHTHYPQFSGQSF AERSGRGPFGDSLMELDAAVGTLMTAIGDLGLLEETLVIFT ADNGPETMRMSRGGCSGLLRCGKGTTYEGGVREPALAF WPGHIAPGVTHELASSLDLLPTLAALAGAPLPNVTLDGFDL SPLLLGTGKSPRQSLFFYPSYPDEVRGVFAVRTGKYKAHF FTQGSAHSDTTADPACHASSSLTAHEPPLLYDLSKDPGEN YNLLGGVAGATPEVLQALKQLQLLKAQLDAAVTFGPSQVA RGEDPALQICCHPGCTPRPACCHCPDPHA (SEQ ID NO:2) [0082] Таким чином, у деяких варіантах реалізації терапевтичним фрагментом, підходящим для даного винаходу, є білок ASA людини (SEQ ID NO:1). У деяких варіантах реалізації, підходящим терапевтичним фрагментом може виступати гомолог або аналог зрілого білка ASA людини. Наприклад, гомологом або аналогом зрілого білка ASA людини може виступати модифікована зріла форма білка ASA людини, яка містить одну або більше амінокислотну заміну, делецію і/або інсерцію в порівнянні з білком ASA дикого типу або природного походження (наприклад, SEQ ID NO:1) та зберігає суттєву активність білка ASA. Таким чином, у деяких варіантах реалізації терапевтичним фрагментом, підходящим для даного винаходу, є білок, суттєво гомологічний до зрілої форми білка ASA людини (SEQ ID NO:1). У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше гомологічну SEQ ID NO:1. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, суттєво ідентичний зрілій формі білка ASA людини (SEQ ID NO:1). У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше ідентичну SEQ ID NO:1. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, містить фрагмент або частину зрілої форми білка ASA людини. [0083] Крім того, заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є повнорозмірний білок ASA. У деяких варіантах реалізації, підходящий заміщуючий фермент може бути гомологом або аналогом повнорозмірного білка ASA людини. Наприклад, гомолог або аналог повнорозмірного білка ASA людини може бути модифікованим повнорозмірним білком ASA людини, який містить одну або більше амінокислотну заміну, делецію і/або вставку в порівнянні з повнорозмірним білком ASA дикого типу або природного походження (наприклад, 14 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 SEQ ID NO:2) та по суті зберігає активність білка ASA. Таким чином, у деяких варіантах реалізації заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є білок, суттєво гомологічний до повнорозмірного білка ASA людини (SEQ ID NO:2). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше гомологічну SEQ ID NO:2. У деяких варіантах реалізації, заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є білок, по суті ідентичний повнорозмірному білку ASA людини (SEQ ID NO:2). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше ідентичну SEQ ID NO:2. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, містить фрагмент або частину повнорозмірного білка ASA людини. У контексті даної заявки повнорозмірний білок ASA зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність. [0084] У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок включає терапевтичний фрагмент (наприклад, націлюючу на лізосоми послідовність) і/або пептид, який проникає через мембрани. У деяких варіантах реалізації, націлююча на лізосоми послідовність, і пептид, що проникає через мембрани, є внутрішньою частиною терапевтичного фрагмента (наприклад, зв'язаною за допомогою хімічного зв'язку або такою, що утворює з терапевтичним фрагментом химерний білок). У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент манозо-6фосфату. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент IGF-I. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент IGF-II. Інші лізосомні хвороби накопичення та заміщуючі ферменти [0132] Припускається, що способи та композиції згідно з даним винаходом можна застосовувати для лікування інших лізосомних хвороб накопичення, зокрема, лізосомних хвороб накопичення, що мають етіологію і/або симптоми ЦНС, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: аспартилглюкозамінурію, хворобу накопичення холестеринових ефірів, хворобу Вольмана, цистиноз, хворобу Данона, хворобу Фабрі, ліпогрунуломатоз Фарбера, хворобу Фарбера, фукозидоз, галактазидоз I/II типів, хворобу Гоше I/II/III типу, лейкодистрофію глобоїдних клітин, хворобу Краббе, хворобу накопичення глікогену II, хворобу Помпі, GM1гангліозидоз I/II/III типу, GM2-гангліозидоз I типу, хворобу Тея-Сакса, GM2-гангліозидоз II типу, хворобу Сандхофа, GM2-гангліозидоз, α-манозидоз I/II типу, β-манозидоз, метахроматичну лейкодистрофію, муколіпідоз типу I, сіалідоз типу I/II, муколіпідоз II/III типу,хворобу клітинних включень, муколіпідоз типу IIIC, муколіпідоз III типу, мукополісахаридоз I типу, мукополісахаридоз II типу, мукополісахаридоз IIIA типу, синдром Санфіліппо, мукополісахаридоз IIIB типу, мукополісахаридоз IIIC типу, мукополісахаридоз IIID типу, мукополісахаридоз IVA типу, синдром Моркіо, мукополісахаридоз IVB типу, мукополісахаридоз VI типу, мукополісахаридоз VII типу, синдром Слая, мукополісахаридоз IX типу, множинний дефіцит сульфатази, нейронний цероїдний ліпофусциноз, хворобу Баттена CLN1, хворобу Баттена CLN2, хворобу Німана-Піка типу A/B, хворобу Німана-Піка типу C1, хворобу НіманаПіка типу C2, пікнодизостоз, хворобу Шиндлера I/II типу, хворобу Гоше і хворобу накопичення сіалових кислот. [0133] Докладний огляд генетичної етіології, клінічних проявів і молекулярно-біологічних механізмів лізосомних хвороб накопичення докладно викладений у роботі Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol. II, Mcgraw Hill, (1995). Таким чином, ферментна недостатність при вищезгаданих захворюваннях відома фахівцям у даній області, деякі з таких захворювань наведені як приклади в Таблиці 2 нижче: 15 UA 115650 C2 Таблиця 2 Назва хвороби Недостатність ферменту Речовини, що накопичуються Хвороба Помпа Кисла α1,4-глюкорозилаза GM1 гангліозид Хвороба Тея-Сакса GM2 гангліозидоз: AB варіант Хвороба Сандхоффа Хвороба Фабрі Хвороба Гоше Метахроматична лейкодистрофія Хвороба Краббе Хвороба Німана-Піка, типи A іB β-галактозидаза β-гексозамінідаза A Глікоген α1-4-зв'язані олігосахариди GM1 гангліозиди GM2 гангліозид GM2 активаторний білок GM2 гангліозид β-гексозамінідаза A і B α-галактозидаза A Глюкоцереброзидаза GM2 гангліозид Глобозиди Глюкозилцерамід Арилсульфатаза A Сульфатиди Галактозилцерамідаза Галактоцереброзид Кисла сфінгомієліназа Сфінгомієлін Хвороба Німана-Піка, тип D Хвороба Фарбера Хвороба Вольмана Пошкодження естерифікації холестерину Невідомо Кисла керамідаза Кисла ліпаза Синдром Хурлера (MPS IH) α-L-ідуронідаза Синдром Шая (MPS IS) α-L-ідуронідаза Хурлер-Шай (MPS IH/S) α-L-ідуронідаза Синдром Хантера (MPS II) Ідуронат сульфатаза Санфіліппо A (MPS IIIA) Гепаран-N-сульфатаза Сфінгомієлін Церамід Холестеринові ефіри Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран сульфатаза Санфіліппо B (MPS IIIB) α-N-ацетилглюкозамінідаза Гепаран сульфатаза Хвороба Німана-Піка, тип C Моркіо B (MPS IVB) Марото-Ламі (MPS VI) Ацетил-CoA-глюкозамінід ацетилтрансфераза Ацетилглюкозамін-6сульфатаза β-галактозидаза Арилсульфатаза B Синдром Слая (MPS VII) β-глюкоронідаза α-манозидоз β-манозидоз Фукозидоз α-манозидаза β-манозидаза α-L-фукозидаза N-аспартил-βглюкозоамінідаза α-нейромінідаза Недостатність лізосомного захисного білка α-N-ацетилгалактозамінідаза N-ацетилглюкозоамін-1фосфотрансфераза Сфінгомієлін Санфіліппо C (MPS IIIC) Санфіліппо D (MPS IIID) Аспартилглюкозамінурія Сіалідоз (муколіпідоз I) Галактосіалідоз (синдром Голдберга) Хвороби Шиндлера Муколіпідоз II (I-клітинна хвороба) Муколіпідоз III (ПсевдоХантер полідистрофія) Цистиноз Хвороба Салла Гепаран сульфатаза Гепаран сульфатаза Кератан сульфат Дерматан сульфат Маноза/олігосахариди Маноза/олігосахариди Фукозил олігосахариди Аспартилглюкозамін аспарагіни Сіалілолігосахариди Сіалілолігосахариди Гепаран сульфат Те ж саме, що і при МЛ II Цистин транспортний білок Сіаловий кислий транспортний білок 16 Вільний цистин Вільна сіалова кислота глюкуронова кислота і UA 115650 C2 Інфантильна хвороба накопичення сіалових кислот Інфантильний нейроцероїдний ліпофусциноз Муколіпідоз IV 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Невідомо Просапозин 5 Сіаловий транспортний білок Пальмітоїл-білкова тіоестераза кислий Вільна сіалова кислота глюкуронова кислота й Сапозини A, B, C і D Ліпофусцини Гангліозиди гіалуронові кислоти & [0134] Способи згідно з даним винаходом можна застосовувати для доставки інших різних заміщуючих ферментів. У даній заявці заміщуючі ферменти, придатні для застосування для даного винаходу, можуть включати будь-який фермент, який може діяти як такий, що заміщує, щонайменше частково, активність недостатнього або відсутнього лізосомального ферменту при лізосомній хворобі накопичення, що підлягає лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент здатний знизити накопичені речовини в лізосомах або здатний полегшити чи покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення. [0135] У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти можуть являти собою будь-які лізосомальні ферменти, про які відомо, що вони пов’язані з лізосомною хворобою накопичення, лікування якої проводиться. У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти обрані з ферментів, перерахованих вище в Таблиці 2. [0136] У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати послідовність дикого типу або природну послідовність. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати змінену послідовність, по суті ідентичну або гомологічну послідовності дикого типу або природній послідовності (наприклад, таку, що має щонайменше 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ідентичності послідовності з послідовністю дикого типу або природною послідовністю). [0137] Заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може бути отриманий будьяким доступним способом. Наприклад, заміщуючі ферменти можуть бути отримані рекомбінантним шляхом з використанням системи клітини-хазяїна, в якій експресуються нуклеїнові кислоти, які кодують заміщуючий фермент. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути отримані шляхом активації ендогенних генів. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути частково або повністю отримані шляхом хімічного синтезу. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти також можуть бути виділені з природних джерел. [0138] При отриманні ферментів рекомбінантним шляхом можна застосовувати будь-яку систему експресії. Наприклад, відомі системи експресії включають, наприклад, яйцеклітини, бакуловіруси, рослини, дріжджі або клітини ссавців. [0139] У деяких варіантах реалізації, ферменти, підходящі для даного винаходу, отримують у клітинах ссавців. Необмежуючі приклади клітин ссавців, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, включають лінію мишачої мієломи BALB/с (NSO/I, ECACC No: 85110503); ретинобласти людини (PER.C6, Crucell, Лейден, Нідерланди); лінію CV1 нирок мавпи, трансформовану SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); лінію клітин нирки ембріона людини (293 або 293 клітини, субклоновані для росту в суспензійній культурі, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59,1977.); клітинну лінію фібросаркоми людини (наприклад, HT1080); клітини нирок дитинчат хом'яка (BHK, ATCC CCL 10); клітини яєчника китайського хом'ячка +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); клітини Сертолі миші (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); клітини нирки мавпи (CV1 ATCC CCL 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клітини цервікальної карциноми людини (Hela, ATCC CCL 2); клітини нирки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клітини печінки пацюків buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клітини легені людини (W138, ATCC CCL 75); клітини печінки людини (Hep G2, HB 8065); клітини пухлини молочної залози миші (MMT 060562, ATCC CCL51); клітини TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 клітини; клітини FS4 і лінія гепатоми людини (Hep G2). [0140] У деяких варіантах реалізації, запропоновані способи відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючи ферментів, які виробляються клітинами людини. У деяких варіантах реалізації, способи, які пропонуються, відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючих ферментів, які виробляються клітинами СНО. [0141] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, які доставляються з використанням способу згідно з даним винаходом, містять молекулу, яка зв'язується з рецепторами на поверхні клітин головного мозку, що сприяє поглинанню клітинами і/або націлюванню на лізосоми. Наприклад, такий рецептор може являти собою катіон-незалежний 17 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 маноза-6-фосфат рецептор (CI-MPR), який зв'язується з залишком маноза-6-фосфату (M6P). Крім того, CI-MPR також зв'язується з іншими білками, у тому числі IGF-II. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, містить залишки M6P на поверхні білка. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може містити біс-фосфорильовані олігосахариди, які мають більш високу афінність зв'язування з CI-MPR. У деяких варіантах реалізації, підходящий фермент містить щонайменше приблизно 20 %-біс-фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. У інших варіантах реалізації, підходящі ферменти можуть містити приблизно 10 %, 15 %, 18 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % біс-фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. Хоча такі бісфосфорильовані олігосахариди можуть природно бути присутніми в ферменті, слід зазначити, що ферменти можуть бути модифіковані з отриманням ферментів, які містять такі олігосахариди. Наприклад, підходящі заміщуючі ферменти можуть бути модифіковані з використанням деяких ферментів, які здатні каталізувати перенос N-ацетилглюкозаміна-Lфосфату з UDP-GlcNAc в положенні 6'α-1,2-зв'язаних маноз на лізосомальні ферменти. Способи і композиції для отримання і застосування таких ферментів описані, наприклад, Canfield et al. у патенті США № 6537785 і патенті США № 6534300, кожний із яких включений до даної заявки за допомогою посилання. [0142] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти для застосування в даному винаході можуть бути кон’юговані або гібридизовані з молекулами, що обумовлюють спрямовану доставку (таргетинг) до лізосом, які здатні зв'язуватися з рецептором на поверхні клітин головного мозку. Підходящими молекулами для лізосомного таргетингу є IGF-I, IGF-II, RAP, p97 і їх варіанти, гомологи або фрагменти (наприклад, включаючи їх пептиди, що мають послідовність, щонайменше на 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 % ідентичну послідовності зрілого пептиду людини IGF-I, IGF-II, RAP, p97 дикого типу). [0143] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, не модифіковані для покращення доставки або транспорту таких агентів через ГЕБ і до ЦНС. [0085] У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок включає націлюючий фрагмент (наприклад, націлюючу на лізосоми послідовність) і/або пептид, який проникає через мембрани. У деяких варіантах реалізації, націлююча на лізосоми послідовність і пептид, що проникає через мембрани, є внутрішньою частиною терапевтичного фрагмента (наприклад, зв'язаною за допомогою хімічного зв'язку або такою, що утворює з терапевтичним фрагментом химерний білок). У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить манозо-6-фосфат фрагмент. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент IGF-I. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент IGF-II. Склади [0145] Водні фармацевтичні розчини та композиції (тобто склади), які зазвичай використовуються для доставки до ЦНС суб'єкта, зазвичай включають традиційний небуферний ізотонічний сольовий розчин і розчин Елліотта В, який являє собою штучну СМР. Порівняння складу СМР і розчину Елліотта В наведене в Таблиці 3. Як показано в Таблиці 3, концентрації речовин у розчині Елліотта В близькі таким концентраціям у СМР. Розчин Елліотта В, однак, містить дуже низькі концентрації буфера і, відповідно, не може забезпечити адекватну буферну ємність, необхідну для стабілізації терапевтичних агентів (наприклад, білків), особливо протягом тривалого періоду часу (наприклад, у ході зберігання). Крім того, розчин Елліотта В містить деякі солі, які можуть бути несумісними зі складами, призначеними для доставки деяких терапевтичних агентів і, зокрема, білків або ферментів. Наприклад, солі кальцію, присутні в розчині Елліотта В, сприяють осадженню білків і тим самим знижують стабільність складу. Таблиця 1 + Розчин Na мЕкв/л СМР 117-137 Розчин 149 Еліотта В 50 K мЕкв/л Ca мЕкв/л Mg мЕкв/л HCO3мЕкв/л Cl мЕкв/л pH Фосфор мг/л 2,3 2,2 2,2 22,9 113-127 7,31 1,2-2,1 Глюкоза мг/л 45-80 2,6 2,7 2,4 22,6 132 6,0-7,5 2,3 80 + ++ ++ [0086] Даний винахід забезпечує склади, які перебувають або в рідкій, або в преліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, для терапевтичних агентів, які були складені таким чином, що вони є стабільними або ж сповільнюють чи запобігають деградації одного або більше терапевтичного агента, що входить до їхнього складу (наприклад, 18 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рекомбінантних білків). У деяких варіантах реалізації, дані склади забезпечують ліофілізований склад для терапевтичних агентів. У деяких варіантах реалізації, дані склади забезпечують рідкий склад для терапевтичних агентів. У деяких варіантах реалізації, склади є стабільними складами. [0087] У даній заявці термін "стабільний" відноситься до можливості терапевтичного агента (наприклад, рекомбінантного ферменту) підтримувати його терапевтичну ефективність (наприклад, усі або більшість видів передбачуваної біологічної активності і/або фізико-хімічну цілісність) протягом тривалого періоду часу. Стабільність терапевтичного агента і здатність фармацевтичної композиції підтримувати стабільність такого терапевтичного агента може бути оцінена протягом тривалого періоду часу (наприклад, більш переважно протягом щонайменше 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців і більше). У даному контексті стабільний склад є таким складом, у якому терапевтичний агент по суті зберігає свою фізичну і/або хімічну цілісність і біологічну активність при зберіганні й при проведенні з ним різних операцій (наприклад, у ході заморожування/відтавання, механічного перемішування й ліофілізації). Стабільність білка може бути оцінена на основі утворення високомолекулярних агрегатів, на основі втрати ферментативної активності, формування пептидних фрагментів і за зміщенням профілів заряду. [0148] Стабільність терапевтичного агента має особливо важливе значення для підтримки певного рівня концентрації терапевтичного агента, необхідного для можливості здійснення агентом його бажаної терапевтичної функції. Стабільність терапевтичного агента може бути також оцінена за біологічною активністю і фізико-хімічною цілісністю терапевтичного агента протягом тривалого періоду часу. Наприклад, стабільність у цей момент часу може бути зіставлена зі стабільністю в більш ранній момент часу (наприклад, при створенні складу в день 0) або може бути зіставлена зі стабільністю терапевтичного агента без допоміжних речовин, і результати цього порівняння виражені у відсотках. Переважно фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом зберігають щонайменше 100 %, щонайменше 99 %, щонайменше 98 %, щонайменше 97 %, щонайменше 95 %, щонайменше 90 %, щонайменше 85 %, щонайменше 80 %, щонайменше 75 %, щонайменше 70 %, щонайменше 65 %, щонайменше 60 %, щонайменше 55 % або щонайменше 50 % біологічної активності терапевтичного агента або фізико-хімічної цілісності протягом тривалого періоду часу (наприклад, при вимірюванні протягом щонайменше 6-12 місяців, при кімнатній температурі або при спеціальних умовах зберігання). [0149] Терапевтичні агенти є переважно розчинними в фармацевтичних композиціях згідно з даним винаходом. Термін "розчинний" стосовно терапевтичних агентів згідно з даним винаходом відноситься до здатності таких терапевтичних агентів утворювати гомогенний розчин. У переважному варіанті розчинність терапевтичного агента в розчині, в якому його вводять і з яким він транспортується до сайту-мішені дії (наприклад, клітин і тканин головного мозку), є достатньою для доставки терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента до цільових ділянок-мішеней. Декілька факторів можуть вплинути на розчинність терапевтичних агентів. Наприклад, відповідні фактори, які можуть вплинути на розчинність білка, включають йонну силу, амінокислотну послідовність і наявність інших супутніх солюбілізуючих агентів або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції створені таким чином, що з їхнього складу виключені солі кальцію. [0088] Підходящі склади, що перебувають або в рідкій, або в пре-ліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, можуть містити цільовий терапевтичний агент у різних концентраціях. У деяких варіантах реалізації, підходящі склади можуть містити білок або терапевтичний агент у концентрації в межах від приблизно 0,1 мг/мл до 100 мг/мл (тобто від приблизно 0,1 мг/мл до 80 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 60 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 40 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 30 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 25 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 60 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 40 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 30 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 25 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 15 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 10 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 5 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до 10 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до 20 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до 40 мг/мл, від приблизно 5 мг/мл до 100 мг/мл, від приблизно 5 мг/мл до 50 мг/мл або від приблизно 5 мг/мл до 25 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, склади відповідно до винаходу можуть містити терапевтичний агент у концентрації приблизно 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл або 100 мг/мл. [0089] Склади згідно з даним винаходом характеризуються переносимістю або в формі водних розчинів, або у вигляді відновлених розчинів ліофілізату. У даній заявці термін «переносимий» і «переносимість» відноситься до здатності фармацевтичної композиції згідно з 19 UA 115650 C2 5 даним винаходом не викликати побічної реакції у суб'єкта, якому вводиться дана композиція, або не викликати серйозної побічної реакції у суб'єкта, якому вводиться дана композиція. У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом добре переносяться суб'єктом, якому вводяться дані композиції. [0152] Багато терапевтичних агентів, зокрема білки і ферменти згідно з даним винаходом, потребують контрольованого рН і специфічних допоміжних речовин для підтримки їхньої розчинності та стабільності в фармацевтичній композиції згідно з даним винаходом. У Таблиці 4 наведені деякі аспекти прикладів білкових складів, які є важливими для підтримки розчинності й стабільності білкових терапевтичних агентів згідно з даним винаходом. 10 Таблиця 4 Параметр pH Тип буфера Концентрація буфера Регулятор тонічності Поверхневоактивна речовина Інше 15 20 25 30 35 40 Показовий діапазон/Тип 5 до 7,5 ацетат, сукцинат, цитрат, гістидин, фосфат або Трис 5-50 мМ NaCl, цукри, манітол Полісорбіт 20, полісорбіт 80 Амінокислоти (наприклад, аргінін) приблизно сотні мМ Призначення Для стабілізації Іноді також для розчинності Для підтримки оптимального pH Може також впливати на стабілізацію Для підтримки pH Може також стабілізувати й додавати йонної сили Для створення ізоосматичного або ізотонічного розчинів Для надання стійкості до поверхні розділу і при зміщенні Для збільшення розчинності та стабільності Буфери[0090] pН складу є додатковим фактором, який здатний змінити розчинність терапевтичного агента (наприклад, ферменту або білка) у водному складі або преліофілізованому складі. Відповідно, склади згідно з даним винаходом переважно містять один або декілька буферів. У деяких варіантах реалізації, водні склади містять кількість буферів, достатню для підтримки оптимального рН зазначеної композиції приблизно між 4,0 і 8,0 (тобто приблизно 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,2; 6,4; 6,5; 6,6; 6,8; 7,0; 7,5 або 8,0). У деяких варіантах реалізації, pН складу становить приблизно між 5,0 і 7,5, приблизно між 5,5 і 7,0, приблизно між 6,0 і 7,0, приблизно між 5,5 і 6,0, приблизно між 5,5 і 6,5, приблизно між 5,0 і 6,0, приблизно між 5,0 і 6,5 і приблизно між 6,0 і 7,5. Підходящі концентрації буфера включають, наприклад, ацетат, цитрат, гістидин, фосфат, сукцинат, трис(гідроксиметил)амінометан (“Трис”) та інші органічні кислоти. Концентрації буфера та діапазон рН фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом є факторами, що контролюють і регулюють переносимість складу. У деяких варіантах реалізації, буферний агент присутній у концентрації, що перебуває в діапазоні від приблизно 1 мМ до приблизно 150 мМ або від приблизно 10 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 15 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 20 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 25 мМ до приблизно 50 мМ. У деяких варіантах реалізації, підходящий буферний агент присутній у концентрації приблизно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 75 мМ, 100 мМ, 125 мМ або 150 мМ. Тонічність[0091] У деяких варіантах реалізації, склади, що перебувають або в рідкій, або в пре-ліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, містять ізотонічний агент для підтримки ізотонічності складу. Зазвичай термін "ізотонічний" означає, що склад, який розглядається, по суті має такий же осмотичний тиск, що й кров людини. Ізотонічні склади зазвичай мають осмотичний тиск від 240 мОсм/кг до 350 мОсм /кг. Ізотонічність можна виміряти з використанням, наприклад, тиску парів або осмотичної точки заморожування. Приклади ізотонічних агентів включають, але не обмежуються перерахованими: гліцин, сорбіт, маніт, хлорид натрію та аргінін. У деяких варіантах реалізації, підходящі ізотонічні агенти можуть бути присутніми у водних і/або пре-ліофілізованих складах у концентрації 0,01-5 % (наприклад, 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 або 5,0 %) за вагою. У деяких варіантах реалізації, склади для ліофілізації містять ізотонічний агент, що підтримує преліофілізаційні склади або відновлені склади ізотонічними. [0092] Хоча ізотонічні розчини зазвичай є переважними для парентерального введення лікарських препаратів, застосування ізотонічних розчинів може змінити розчинність деяких терапевтичних агентів і, зокрема, деяких білків і/або ферментів. Було показано, що слабко 20 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гіпертонічні розчини (тобто такі, що містять більше 175 мМ хлориду натрію в 5 мМ фосфаті натрію, рН 7,0) і цукор-вмісні розчини (тобто більше 2 % сахарози в 5 мМ фосфаті натрію, рН 7,0) добре переносяться. Найбільш часто застосовуваним складом для болюсного введення до ЦНС є композиція в сольовому розчині (близько 150 мМ NaСl у воді). Стабілізуючі агенти [0156] У деяких варіантах реалізації, склади можуть містити стабілізуючий агент, або ліопротектор, для захисту білка. Зазвичай підходящим агентом є цукор, невідновлюючий цукор або амінокислота. Приклади цукрів можуть включати, але не обмежуватися наступними: декстран, лактозу, манітол, манозу, сорбітол, рафінозу, сахарозу і трегалозу. Приклади амінокислот можуть включати, але не обмежуються перерахованими: аргінін, гліцин і метіонін. Додаткові стабілізуючі агенти можуть включати хлорид натрію, гідроксиетиловий крохмаль і полівінілпіролідон. Кількість стабілізуючого агента в ліофілізованому складі підбирається, головним чином, так, щоб склад був ізотонічним. Проте, гіпертонічні відновлені склади можуть також підходити. Крім того, кількість стабілізуючого агента не повинна бути занадто низькою, такою, при якій має місце неприйнятна деградація/агрегація терапевтичного агента. Приблизні концентрації стабілізуючого агента в композиції можуть варіювати від 1 мМ до 400 мМ (наприклад, від 30 мМ до 300 мМ, від 50 мМ до 100 мМ) або, навпаки, від 0,1 % до 15 % (наприклад, від 1 % до 10 %, від 5 % до 15 %, від 5 % до 10 %) за вагою. У деяких варіантах реалізації, відношення масової кількості стабілізуючого агента і терапевтичного агента становить приблизно 1:1. У інших варіантах реалізації, співвідношення маси стабілізуючого агента і терапевтичного агента може становити приблизно 0,1:1; 0,2:1; 0,25:1; 0,4:1; 0,5:1; 1:1; 2:1; 2,6:1; 3:1; 4:1; 5:1; 10:1 або 20:1. У деяких варіантах реалізації, підходящий для ліофілізації стабілізуючий агент є ліопротектором. [0093] У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, придатні для застосування згідно з даним винаходом, містять аморфні матеріали. У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, придатні для застосування згідно з даним винаходом, містять суттєву кількість аморфних матеріалів (наприклад, склади на основі сахарози). У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, придатні для застосування згідно з даним винаходом, містять частково кристалічні / частково аморфні матеріали. Наповнювачі [0094] У деяких варіантах реалізації, підходящі склади для ліофілізації можуть також включати один наповнювач або більше. «Наповнювач» – це компонент, який додає маси ліофілізованій суміші та вносить вклад у фізичну структуру ліофілізату. Наприклад, наповнювач може покращити зовнішній вигляд ліофілізованої таблетки (тобто, наприклад, забезпечити по суті однорідний ліофілізат). Підходящі наповнювачі включають, але не обмежуються перерахованими: хлорид натрію, лактозу, манітол, гліцин, сахарозу, трегалозу, гідроксиетиловий крохмаль. Зразкові концентрації наповнювачів становлять від приблизно 1 % до приблизно 10 % (тобто 1,0 %, 1,5 %, 2,0 %, 2,5 %, 3,0 %, 3,5 %, 4,0 %, 4,5 %, 5,0 %, 5,5 %, 6,0 %, 6,5 %, 7,0 %, 7,5 %, 8,0 %, 8,5 %, 9,0 %, 9,5 % і 10,0 %). Поверхнево-активні речовини [0159] У деяких варіантах реалізації, є бажаним додавання до складу поверхнево-активної речовини. Приклади поверхнево-активних речовин включають нейонні поверхнево-активні речовини, такі як полісорбати (наприклад, полісорбат 20 або 80); полоксамери (наприклад, полоксамер 188); тритон; додецилсульфат натрію (ДСН); лаурил сульфати натрію; октил глікозиди натрію; лаурилсульфат; мірістил-, лінолеїл-, або стеариловий-сульфобетаїн; лаурил-, мірістил-, лінолеїл- або стеариновий саркозин; лінолеїл-, мірістил- або цетил-бетаїн; лауроамідопропіл; кокамідопропіл; лінолеамідопропіл; мірістамідопропіл; пальмідопропіл або ізостеарамідопропіл-бетаїни (наприклад, лауроамідопропіл); мірістарнідопропіл-, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропіл-диметиламіни; метил натрію, кокоїл- або динатрію метил-офеїл таурати та серії MONAQUATTM (Mona Industries, Inc, Патерсон, штат Нью-Джерсі), поліетилен гліколь, поліпропіл гліколь і співполімери етилену та пропілен гліколю (наприклад, Pluronics, PF68 і т.д.). Звичайна кількість поверхнево-активної речовини є такою, що вона зменшує агрегацію білка і зводить до мінімуму утворення часток або спінювання. Наприклад, поверхнево-активна речовина може бути присутньою в складі в концентрації приблизно 0,0010,5 % (наприклад, приблизно 0005-0,05 % або приблизно 0,005-0,01 %). Зокрема, поверхневоактивна речовина може бути присутньою в складі в концентрації приблизно 0,005 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, або приблизно 0,5 % і т.д. Додатково поверхнево-активна речовина може додаватися до ліофілізованого складу, пре-ліофілізованого складу і/або до відновленого складу. 21 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [0095] Інші фармацевтично прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори, такі як ті, що описані в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), можуть бути включені до складу (і/або до ліофілізованого складу, і/або до відновленого складу) за умови, що вони не виявляють побічної дії на бажані характеристики складу. Прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори є нетоксичними для реципієнта в застосовуваних дозах та концентраціях і включають, але не обмежуються перерахованими: додаткові буферні агенти, консерванти; допоміжні розчинники; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонін; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; комплекси металів (наприклад, комплекси Zn-білок); біодеградовані полімери, такі як поліефіри; і/або протийони, що утворюють солі, такі як натрій. [0161] Склади, що перебувають або в рідкій, або в пре-ліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, відповідно до даного винаходу можуть бути оцінені на основі аналізу якості продукції, часу відновлення (якщо склад ліофілізований), якості відновлення (якщо склад ліофілізований), великої молекулярної маси, вологості й температури склування. Зазвичай аналіз якості білка й продуктів включає аналіз швидкості руйнування продукту з використанням методів, які включають, але не обмежуються перерахованими: ексклюзійну ВЕРХ (SE-HPLC), катіонообмінну ВЕРХ (CEX-HPLC), рентгенівську дифракцію (РД), модульовану диференціальну скануючу калориметрію (МДСК), ВЕРХ зі зворотною фазою (RP-HPLC), багатокутове світлорозсіювання (MALS), флуоресценцію, поглинання в ультрафіолеті, нефелометрію, капілярний електрофорез (КЕ), електрофорез у ПААГ з ДСН і їхні комбінації. У деяких варіантах реалізації, оцінка продукту відповідно до даного винаходу може включати етап оцінки зовнішнього вигляду (зовнішній вигляд рідини або таблетки). [0162] Зазвичай склади (ліофілізовані або водні) можуть зберігатися протягом тривалого часу при кімнатній температурі. Температура зберігання може коливатися від 0 °С до 45 °C (наприклад, 4 °C, 20 °C, 25 °C, 45 °C і т.д.). Склади можуть зберігатися протягом періоду від декількох місяців до декількох років. Строк зберігання, як правило, становить 24 місяці, 12 місяців, 6 місяців, 4,5 місяці, 3 місяці, 2 тижні або 1 місяць. Склади можуть зберігатися безпосередньо в контейнері, застосовуваному для введення, що дозволяє виключити етап переносу. [0163] Сполуки можуть зберігатися безпосередньо в ліофілізаційному контейнері (якщо вони ліофілізовані), який може функціонувати як посудина для відновлення, щоб виключити етап переносу. Крім того, ліофілізований лікарський склад може бути дозований із невеликим інкрементом для зберігання. У процесі зберігання в цілому необхідно уникати впливів, які призводять до руйнування білків, у тому числі, без обмежень, впливів сонячних променів, ультрафіолетового випромінювання та інших форм електромагнітного випромінювання, надмірного тепла або холоду, швидкого теплового шоку й механічного шоку. Ліофілізація [0096] Способи згідно з винаходом згідно з даним винаходом можуть застосовуватися для ліофілізації будь-яких матеріалів, зокрема терапевтичних агентів. Зазвичай пре-ліофілізований склад додатково містить обрані відповідним чином допоміжні речовини або інші компоненти, такі як стабілізатори, буферні агенти, наповнювачі й поверхнево-активні речовини для запобігання деградації цільового компонента (наприклад, агрегації білка, деамідування і/або окиснення) під час заморожування-сушіння та зберігання. Склади для ліофілізації можуть включати один або більше додаткових компонентів, включаючи ліопротектори або стабілізуючі агенти, буфери, наповнювачі, ізотонічні агенти й поверхнево-активні речовини. [0097] Після того, як цільова субстанція й будь-який додатковий компонент змішані разом, склад ліофілізують. Ліофілізація зазвичай включає три основні стадії: заморожування, первинне сушіння та вторинне сушіння. Заморожування необхідне для перетворення води в лід або певного аморфного компонента в кристалічну форму. Первинне сушіння – етап процесу, під час якого лід видаляється із замороженого продукту шляхом прямої сублімації при низькому тиску й температурі. Вторинне сушіння – етап процесу, під час якого зв'язана вода видаляється з матриці продукту із застосуванням дифузії залишкової води до випаровуючої поверхні. Температура продукту протягом вторинного сушіння зазвичай вища, ніж протягом первинного сушіння. Див. Tang X. et al. (2004) "Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals: Practical advice," Pharm. Res., 21:191-200; Nail S.L. et al. (2002) "Fundamentals of freeze-drying," in Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Nail S.L. editor New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, pp 281-353; Wang et al. (2000) “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals," Int. J. Pharm., 203:1-60; Williams N.A. et al. (1984) "The lyophilization of pharmaceuticals; A literature review." J. Parenteral Sci. Technol., 38:48-59. Загалом, будь-який процес ліофілізації може бути використаний разом із даним винаходом. 22 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0098] У деяких варіантах реалізації, етап відпалювання може бути включений протягом початкового заморожування продукту. Етап відпалювання може скоротити загальний час циклу. Не будемо вдаватися в теорію, але логічно припустити, що етап відпалювання може допомогти стимулювати кристалізацію допоміжної речовини й формування більших кристалів льоду завдяки рекристалізації малих кристалів, сформованих під час охолодження, що, у свою чергу, покращує відновлення. Зазвичай етап відпалювання включає інтервал або коливання температури під час заморожування. Наприклад, температура заморожування може бути 40 °C, і температура на етапі відпалювання буде підвищена до, наприклад, -10 °C, і дана температура буде підтримуватися протягом певного періоду часу. Час етапу відпалювання може перебувати в діапазоні від 0,5 годин до 8 годин (тобто 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3; 4; 6 і 8 годин). Температура відпалювання може перебувати між температурою заморожування та 0 °C. [0099] Ліофілізація може здійснюватися в ємності, такій як туба, контейнер, бутель, ванна, віала (наприклад, скляна віала), шприц або інша підходяща ємність. Ємності можуть бути одноразового використання. Ліофілізацію також можна здійснювати у великому масштабі або в малому масштабі. У деяких випадках може бути бажаним ліофілізувати білок у тій же ємності, в якій буде здійснюватися відновлення білка з метою уникнути етапу переносу. Ємністю в такому 3 випадку може бути, наприклад, віала об'ємом 3, 4, 5, 10, 20, 50 або 100 см . [0100] Безліч різноманітних ліофілізаторів є доступними для даних цілей, таких як лабораторні ліофілізатори Hull pilot scale dryer (SP Industries, США), Genesis (SP Industries) або будь-які ліофілізатори, здатні контролювати задані параметри процесу ліофілізації. Ліофілізація супроводжується заморожуванням складу та наступною сублімацією льоду з замороженого вмісту при температурі, підходящій для первинного сушіння. Початкове заморожування забезпечує температуру складу нижче приблизно -20 C (тобто -50 C, -45 C, -40 C, -35 C, -30 C, -25 C і т.д.) зазвичай не більше, ніж на приблизно 4 години (тобто не більше, ніж на приблизно 3 години, не більше, ніж на приблизно 2,5 години, не більше, ніж на приблизно 2 години). У даних умовах температура продукту зазвичай є нижчою від евтектичної точки або температури руйнування складу. Зазвичай температура для первинного сушіння перебуває в діапазоні від приблизно -30 C до 25 C (забезпечуючи знаходження продукту нижче від точки плавлення протягом вторинного сушіння) при підходящому тиску, який зазвичай перебуває в діапазоні від приблизно 20 до 250 мТорр. Склад, розмір і тип ємності, який містить зразок (тобто скляної віали), і об'єм рідини будуть обумовлювати час, необхідний для сушіння, який може перебувати в діапазоні від декількох годин до декількох днів. Етап вторинного сушіння проходить при температурі приблизно 0-60 °C у залежності, переважно, від типу й розміру ємності та типу використовуваного терапевтичного білка. Аналогічно, об'єм рідини буде головним чином залежати від часу, необхідного для сушіння, який може перебувати в діапазоні від декількох годин до декількох днів. [0101] У остаточному підсумку, в результаті ліофілізації одержують ліофілізований склад, у якому вміст вологи становить менше, ніж приблизно 5 %, менше, ніж приблизно 4 %, менше, ніж приблизно 3 %, менше, ніж приблизно 2 %, менше, ніж приблизно 1 %, і менше, ніж приблизно 0,5 %. Відновлення [0102] Хоча фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом зазвичай перебувають у рідкій формі під час введення суб'єктові, у певних варіантах реалізації фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом є ліофілізованими. Такі композиції повинні бути відновлені шляхом додавання до них одного або більше відновників перед введенням суб'єктові. На бажаному етапі, зазвичай у відповідний час перед введенням пацієнтові, ліофілізований склад може бути відновлений за допомогою відновника з одержанням бажаної концентрації білка у відновленому розчині. [0103] Різні відновники можуть використовуватися відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах реалізації, підходящим відновником для відновлення є вода. Вода, яка використовується як відновник, може бути оброблена з використанням безлічі способів, включаючи зворотний осмос, дистиляцію, дейонізацію, фільтрацію (наприклад, фільтрацію з використанням активованого вугілля, мікрофільтрацію, нанофільтрацію) і комбінацію цих способів обробки. Зазвичай вода є підходящою для ін'єкцій, включаючи стерильну воду або бактеріостатичну воду для ін'єкцій, але не обмежуючись ними. [0104] Додаткові приклади відновників включають буферні розчини з постійним рН (наприклад, фосфатно-буферний сольовий розчин), стерильні сольові розчини, розчин Елліотта, розчин Рінгера або розчин декстрози. Підходящі відновники можуть додатково містити консервант. Консерванти, що наводяться для прикладу, включають ароматичні спирти, такі як бензиловийспирт або фенол. Кількість консерванту, яку необхідно застосувати, визначається 23 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шляхом оцінки сумісності різних концентрацій консервантів із білком і дослідженням ефективності консервантів. Наприклад, якщо консервантом виступає ароматичний спирт (такий як бензиловий спирт), він може бути присутнім у кількості приблизно 0,1-2,0 %, приблизно 0,51,5 % або приблизно 1,0-1,2 %. [0105] Відновники, придатні для застосування для даного винаходу, можуть включати різноманітні добавки, включаючи, але не обмежуючись ними: буферні агенти, що забезпечують постійне значення рН (наприклад, Трис, гістидин), солі (наприклад, хлорид натрію) та інші добавки (наприклад, сахароза), включаючи описані вище (наприклад, стабілізуючі агенти, ізотонічні агенти). [0106] Згідно з даним винаходом, ліофілізована субстанція (наприклад, білок) може бути відновлена до концентрації щонайменше 25 мг/мл (наприклад, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 75 мг/мл, щонайменше 100 мг/мл) і до будь-якого діапазону концентрацій між ними. У деяких варіантах реалізації, ліофілізована субстанція (наприклад, білок) може бути відновлена до концентрації, що перебуває в діапазоні від приблизно 1 мг/мл до 100 мг/мл (наприклад, від приблизно 1 мг/мл до 50 мг/мл, від 1 мг/мл до 100 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 5 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 10 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 25 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 30 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 50 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 50 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, від приблизно 50 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 50 мг/мл до приблизно 100 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, концентрація білка у відновленому складі може бути вищою, ніж концентрація в пре-ліофілізованому складі. Припускається, що висока концентрація білка у відновленому складі є особливо корисною, коли бажаною є підшкірна або внутрішньом'язова доставка відновленого складу. У деяких варіантах реалізації, концентрація білка у відновленому складі може бути в приблизно 2-50 разів більшою, ніж у преліофілізованому складі (наприклад, у приблизно 2-20 разів, у приблизно 2-10 разів або в приблизно 2-5 разів). У деяких варіантах реалізації, концентрація білка у відновленому складі може бути щонайменше в приблизно 2 рази більшою, ніж у пре-ліофілізованому складі (наприклад, щонайменше в приблизно 3, 4, 5, 10, 20, 40 разів). [0107] Відновлення згідно з даним винаходом може здійснюватися в будь-якій ємності. Ємності, придатні для застосування для даного винаходу, наприклад, включають, але не обмежуються перерахованими: туби, віали, шприци (наприклад, однокамерні або двокамерні), контейнери, пляшки й ванни. Підходящі ємності можуть бути зроблені з будь-яких матеріалів, таких як скло, пластик, метал. Ємності можуть бути одноразового або багаторазового використання. Відновлення також може здійснюватися у великому масштабі або в малому масштабі. [0108] У деяких випадках може бути бажаним ліофілізувати білкову композицію в тій же ємності, в якій буде проводитися відновлення білка з метою виключення етапу переносу. Ємністю в такому випадку може бути, наприклад, віала об'ємом 3, 4, 5, 10, 20, 50 або 100 см³. У деяких варіантах реалізації, підходящою ємністю для ліофілізації й відновлення є двокамерний шприц (наприклад, шприци Lyo-Ject® (Vetter)). Наприклад, двокамерний шприц може містити як ліофілізовану субстанцію, так і відновник, кожний в окремій камері, розділеній перегородкою (див. Приклад 5). Для відновлення плунжер може бути приєднаним до перегородки з боку відновника й надавлений для переміщення відновника до камери з продуктом таким чином, щоб відновник міг контактувати з ліофілізованою субстанцією і відновлення могло пройти, як описано в даній заявці (див. Приклад 5). [0109] Фармацевтичні композиції, склади й пов'язані способи даного винаходу придатні для доставки безлічі терапевтичних агентів до ЦНС суб'єкта (наприклад, інтратекально, інтравентрикулярно або інтрацистернально) і для лікування супутніх захворювань. Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом є особливо корисними для доставки білків і ферментів (наприклад, у замісній ферментній терапії) суб'єктові, що страждає на лізосомні хвороби накопичення. Лізосомні хвороби накопичення представляють групу відносно рідкісних спадкових метаболічних захворювань, які викликають розлади лізосомної функції. Лізосомні захворювання характеризуються накопиченням нерозщеплених макромолекул у лізосомах, що викликає збільшення розміру та кількості лізосом і, в остаточному підсумку, клітинну дисфункцію та клінічні відхилення. Доставка до ЦНС [0110] Припускається, що різні стабільні склади, описані в даній заявці, є в цілому підходящими для доставки до ЦНС терапевтичних агентів. Стабільні склади згідно з даним 24 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом можуть бути використані для доставки до ЦНС за допомогою різних способів і шляхів, які включають, але не обмежуються перерахованими: інтрапаренхімальне, інтрацеребральне, інтраветрикулярне церебральне (ІЦВ), інтратекальне (наприклад, ІТпоперекове, ІТ-мостомозочкове) введення і будь-який інший спосіб і шлях для введення прямо або непрямо до ЦНС і/або СМР. Інтратекальна доставка [0111] У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до ЦНС у складі, описаному в даній заявці. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до ЦНС шляхом введення до спинномозкової рідини (СМР) суб'єкта, що потребує лікування. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення використовують для доставки бажаного заміщуючого ферменту (наприклад, білка ASA) до СМР. У контексті даної заявки, інтратекальне введення (також називане інтратекальною ін'єкцією) відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір навколо спинного мозку). Можуть бути використані різні способи, включаючи, без обмежень, латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через трепанаційний отвір або цистернову чи поперекову пунктуру і т.п. Типові методи описані в Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 і Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179, зміст яких включений до даної заявки за допомогою посилання. [0112] Відповідно до даного винаходу фермент може бути ін’єктований до будь-якої області навколо спинномозкового каналу. У деяких варіантах реалізації, фермент ін’єктують до поперекової області або цистерни, або інтравентрикулярно до простору мозкового шлуночка. У даній заявці термін "поперековий (люмбальний) відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, до відділу хребта L2-S1. Зазвичай інтратекальні ін'єкції через поперековий відділ або поперекову область також називають “поперековою ІТ доставкою" або "поперековим ІТ введенням”. Термін "цистерна" відноситься до простору навколо й нижче мозочка через отвір між черепом і у верхній частині хребта. Зазвичай інтратекальне введення через цистерну також згадується як "доставка до великої цистерни". Термін "шлуночок мозку" відноситься до порожнини мозку, яка продовжується в центральному каналі спинного мозку. Зазвичай ін'єкції через мозкову порожнину шлуночка називають інтравентрикулярною церебральною (ІЦВ) доставкою. [0113] У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до поперекового ІТ введення або доставки, наприклад, доставки між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш конкретно, L2-S1 відділу хребта. Припускається, що поперекове ІТ введення або доставка відрізняється від доставки до великої цистерни тим, що поперекове ІТ введення або доставка відповідно до даного винаходу забезпечує кращу й більш ефективну доставку до дистального каналу хребта, хоча цистернова доставка, крім усього іншого, як правило, не забезпечує доставку складу до дистального каналу хребта. Пристрій для інтратекального введення [0182] Різні пристрої можна застосовувати для інтратекальної доставки відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах реалізації, пристрій для інтратекального введення містить порт введення рідини (наприклад, ін'єкційний порт): порожній резервуар (наприклад, катетер), який включає перший отвір для рідини, сполучений із вхідним портом для рідини, і другий отвір для рідини, виконаний із можливістю введення до спинного мозку, і блокуюче пристосування для блокування введення порожнистої основної частини до спинного мозку. Як приклад, але не обмеження, на Фігурі 42 показано, що підходяще блокуюче пристосування включає одну або більше опуклостей, виконаних на поверхні порожнистої основної частини, і блокуюче кільце виконане з можливістю установки над однією або більшим числом опуклостей для запобігання вислизанню порожнистої основної частини (наприклад, катетера) зі спинного мозку. У різних варіантах реалізації, порт введення рідини включає резервуар. У деяких варіантах реалізації, порт введення рідини включає механічний насос (наприклад, інфузійний насос). У деяких варіантах реалізації, імплантований катетер з'єднують із резервуаром (наприклад, для болюсної доставки) або з інфузійним насосом. Порт введення рідини може бути таким, що імплантується, або бути зовнішнім. [0183] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення може бути виконане або з використанням спинномозкової пункції (тобто повільний болюс) або через систему доставки порт-катетер (наприклад, інфузія або болюс). У деяких варіантах реалізації, катетер вводять між пластинками поперекових хребців, і наконечник вставлений до міжоболонкового простору до бажаного рівня (як правило, L3-L4) (На Фігурі 63). 25 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0184] Однократна доза, підходяща для інтратекального введення зазвичай є невеликою в порівнянні з внутрішньовенним введенням. Зазвичай інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу підтримує баланс складу СМР, а також внутрішньочерепний тиск суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка здійснюється при відсутності відповідного вилучення СМР у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, об'єм, підходящий для однократної дози, може бути, наприклад, меншим за 10 мл, 8 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1,5 мл, 1 мл, 0,5 мл, або в деяких варіантах реалізації, об'єм, підходящий для однократної дози, може становити приблизно 0,5-5 мл, 0,5-4 мл, 0,5-3 мл, 0,5-2 мл, 0,5-1 мл, 1-3 мл, 1-5 мл, 1,5-3 мл, 1-4 мл або 0,5-1,5 мл. У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу включає стадію попереднього вилучення необхідної кількості спинномозкової рідини. У деяких варіантах реалізації, перед ІТ введенням видаляють менше, ніж 10 мл (наприклад, менше, ніж 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1 мл) СМР. У тих випадках підходящий об'єм однократної дози може становити, наприклад, більше 3 мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл або 20 мл. [0185] Різні інші пристрої можуть бути використані для здійснення інтратекального введення терапевтичної композиції. Наприклад, склади, що містять бажані ферменти, можуть бути надані для використання з резервуаром Омайя, який зазвичай застосовують для інтратекального введення лікарських засобів при менінгеальному карциноматозі (Lancet 2: 983-84, 1963). Зокрема в цьому способі вентрикулярну трубку вводять через отвір, сформований у передньому розі спинного мозку, і підключають до резервуара Омайя, встановленого під шкірою голови, і резервуар проколюють підшкірно для інтратекальної доставки заміщуючого ферменту, який вводять до резервуару. Інші пристрої для інтратекального введення терапевтичних композицій або складів описані в патентах США № 6217552, включених до даної заявки за допомогою посилання. Крім того, склад може бути введений інтратекально, наприклад, шляхом однократної ін'єкції або інфузії. Слід розуміти, що лікувальна доза може являти собою або одноразову дозу, або багаторазову дозу. [0186] Для ін'єкції склади даного винаходу можуть бути приготовані у вигляді рідких розчинів. Крім того, фермент може входити до складу в твердому вигляді і може бути повторно розчиненим або суспендованим безпосередньо перед застосуванням. Ліофілізовані форми також передбачені. Ін'єкція може бути, наприклад, у вигляді болюсної ін'єкції або безперервної інфузії ферменту (наприклад, із використанням інфузійних насосів). [0187] У одному варіанті реалізації даного винаходу, фермент вводять шляхом латеральної церебровентрикулярної ін'єкції в головний мозок суб'єкта. Ін'єкцію можна здійснити, наприклад, через трепанаційний отвір у черепі суб'єкта. У іншому варіанті реалізації, фермент і/або інший фармацевтичний склад вводять до шлуночка мозку суб'єкта через хірургічно введений шунт. Наприклад, ін'єкція може бути здійснена в бічні шлуночки, які мають більший розмір. У деяких варіантах реалізації, може бути також здійснена ін'єкція в третій і четвертий шлуночки, розмір яких менший. [0188] У ще одному варіанті реалізації, фармацевтичні композиції, які застосовуються в даному винаході, вводять у вигляді ін'єкцій до великої цистерни або поперекової області суб'єкта. [0189] У іншому варіанті реалізації способу згідно з даним винаходом, фармацевтично прийнятний склад забезпечує безперервну доставку суб'єктові, наприклад, "повільне вивільнення" ферменту або іншої фармацевтичної композиції, яка застосовується в даному винаході, протягом щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох тижнів або більш тривалого періоду часу, після того як фармацевтично прийнятні склади вводять суб'єктові. [0190] У даній заявці термін "безперервна доставка" відноситься до безперервної доставки фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом in vivo протягом тривалого періоду часу після введення, переважно щонайменше декількох днів, тижня або декількох тижнів. Безперервна доставка композиції може проявлятися, наприклад, у тривалому терапевтичному ефекті ферменту, що вводиться, протягом тривалого періоду часу (наприклад, стійка доставка ферменту може проявлятися в триваючому зменшенні об'єму запасних гранул у суб'єкта). Крім того, безперервна доставка ферменту може проявлятися у виявленні присутності ферменту in vivo протягом тривалого періоду часу. Доставка до тканин-мішеней [0191] Як уже обговорювалося вище, одна з несподіваних і важливих ознак даного винаходу полягає в тому, що терапевтичні агенти, зокрема заміщуючі ферменти, вводяться з використанням способів згідно з даним винаходом, і композиції згідно з даним винаходом здатні ефективно й широко дифундувати через поверхню мозку й проникати до різних шарів або областей мозку, у тому числі до глибоких областей мозку. Крім того, способи згідно з даним 26 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом і композиції згідно з даним винаходом відносяться до ефективної доставки терапевтичних агентів (наприклад, ферменту ASA) до різних тканин або нейронів спинного мозку, у тому числі до поперекової області, до якої важко здійснювати спрямовану доставку з використанням існуючих способів доставки до ЦНС, таких як ІЦВ ін'єкція. Крім того, способи згідно з даним винаходом і композиції згідно з даним винаходом забезпечують доставку достатньої кількості терапевтичних агентів (наприклад, ферменту ASA) у кров і до різних периферичних органів і тканин. [0192] Таким чином, у деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки (наприклад, фермент ASA) надходять до центральної нервової системи суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки (наприклад, фермент ASA) надходять до однієї або більше тканин-мішеней головного мозку, спинного мозку і/або периферичного органа. У даній заявці термін "тканинамішень/цільова тканина" відноситься до будь-якої тканини, ураженої лізосомною хворобою накопичення, яку лікують, або будь-якої тканини, в якій лізосомний фермент, рівень якого знижений, експресується в нормі. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких виявлена аномально висока кількість субстрату ферменту, наприклад, накопиченого в лізосомах клітин тканини, у пацієнтів, що страждають на або мають схильність до лізосомної хвороби накопичення. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, які демонструють патології, симптоми або ознаки, асоційовані з такою хворобою. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких недостатній лізосомальний фермент у нормі експресується на високому рівні. У даній заявці тканина-мішень може являти собою тканину-мішень головного мозку, тканину-мішень спинного мозку і/або периферичну тканину-мішень. Приклади тканин-мішеней докладно описані нижче. Тканини-мішені головного мозку [0193] У цілому, головний мозок може бути розділений на різні відділи, шари і тканини. Наприклад, менінгеальні тканини являють собою систему мембран, яка включає центральну нервову систему, у тому числі головний мозок. Мозкові оболонки містять три шари, в тому числі тверду мозкову оболонку, павутинну тканину і м'яку мозкову оболонку. Зазвичай основною функцією мозкових оболонок і спинномозкової рідини є захист центральної нервової системи. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок відповідно до даного винаходу доставляють до одного або декількох шарів мозкових оболонок. [0194] Головний мозок складається з трьох основних відділів, у тому числі півкуль головного мозку, мозочка і стовбура мозку. Півкулі головного мозку розташовані вище від більшості інших структур головного мозку й покриті корковим шаром. Під півкулями головного мозку лежить стовбур мозку, який нагадує стебло, до якого прикріплені півкулі головного мозку. У задній частині мозку під півкулями головного мозку і за стовбуром мозку перебуває мозочок. [0195] Проміжний мозок, який знаходиться недалеко від середньої лінії головного мозку і вище від середнього мозку, включає таламус, метаталамус, гіпоталамус, епіталамус, преталамус і претектум. Середній мозок, який також називають мезенцефалоном, містить дах, тегумент, вентрикулярний мезоцелій і церебральні ніжки, червоне ядро і черепні нерви III ядра. Середній мозок пов'язаний із зором, слухом, керуванням рухом, сном/неспанням, уважністю та регуляцією температури. [0196] Області тканин центральної нервової системи, включаючи головний мозок, можуть бути охарактеризовані на основі глибини тканин. Наприклад, тканини ЦНС (наприклад, головний мозок) можуть бути охарактеризовані як поверхневі тканини або неглибокі, тканини середньої глибини і/або глибокі тканини. [0197] Відповідно до даного винаходу терапевтичний білок (наприклад, заміщуючий фермент) може бути доставлений до будь-якої підходящої тканини-мішені мозку, пов'язаної з хворобою суб'єкта, яку лікують. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки (наприклад, заміщуючий фермент) відповідно до даного винаходу доставляють до поверхневих або неглибоких тканин-мішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляються до тканин-мішеней мозку на середній глибині. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до глибоких тканин-мішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до комбінації поверхневих або неглибоких тканин-мішеней головного мозку, тканин-мішеней головного мозку середньої глибини і/або глибоких тканинмішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до глибоких тканин мозку, що лежать щонайменше на 4 мм, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм, 10 мм і глибше (або внутрішні) від зовнішньої поверхні мозку. [0198] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше поверхневих або неглибоких тканин головного мозку. У 27 UA 115650 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку знаходяться в межах 4 мм від поверхні головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку обрані з тканин м'якої мозкової оболонки, кори головного мозку, гіпокампу, простору Вірхова-Робіна, кровоносних судин у просторі ВР, гіпокампу, частин гіпоталамуса на нижній поверхні мозку, зорових нервів і шляхів, нюхової цибулини і проекцій, і їх комбінацій. [0199] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше глибоких тканин головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку розташовані на 4 мм (наприклад, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм або 10 мм) глибше від (або всередину відносно) поверхні головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові глибокі тканини головного мозку включають кору головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові глибокі тканини головного мозку включають одну або більше тканин проміжного мозку (наприклад, гіпоталамус, таламус, вентральний таламус, субталамус і т.д.), заднього мозку, сочевицеподібні ядра, базальні ганглії, хвостате ядро, шкарлупу, мигдалеподібне тіло, бліду кулю і їх комбінації. [0200] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше тканин мозочка. У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин-мішеней мозочка обрані з групи, яка включає тканини молекулярного шару, тканини шару клітин Пуркіньє, тканини зернистого шару, ніжки мозочка і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше глибоких тканин мозочка, включаючи, без обмежень, тканини шару клітин Пуркіньє, тканини зернистого шару клітин, глибокої білої речовини мозочка (наприклад, глибокі відносно зернистого шару клітин) і глибокі тканини ядер мозочка. [0201] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше тканини мозку. У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин-мішеней мозку включають тканини білої речовини стовбура головного мозку і/або тканини ядер стовбура мозку. [0202] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до різних тканин мозку, включаючи, без обмежень, сіру речовину, білу речовину, перивентрикулярні області, м'яку-павутинну оболонку, до мозкової оболонки, кори головного мозку, мозочка, до глибоких тканин кори головного мозку, молекулярного шару, дорсального стріатуму, середнього мозку, глибинних областей моста і довгастого мозку, а також їх комбінацій. [0203] У деяких варіантах, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) надходять до різних клітин у мозку, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: нейрони, гліальні клітини, периваскулярні клітини і/або менінгеальні клітини. У деяких варіантах, терапевтичний білок доставляють до олігодендроцитів глибокої білої речовини. Спинний мозок [0204] У цілому, області або тканини спинного мозку можна охарактеризувати в залежності від глибини тканин. Наприклад, тканини спинного мозку можуть бути охарактеризовані як поверхневі або неглибокі тканини, тканини середньої глибини і/або глибокі тканини. [0205] У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше поверхневих або неглибоких тканин спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини спинного мозку знаходяться в межах 4 мм від поверхні спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини спинного мозку включають м'яку оболонку і/або ділянки білої речовини. [0206] У деяких варіантах, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше глибоких тканин спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові глибокі тканини спинного мозку розташовані всередині на глибині 4 мм від поверхні спинного мозку. У деяких варіантах, цільові глибокі тканини спинного мозку включають сіру речовину спинного мозку і/або епендимні клітини. [0207] У деяких варіантах, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до нейронів спинного мозку. Периферичні тканини-мішені [0208] У даній заявці периферичні органи або тканини відносяться до будь-якого органа або тканини, які не є частиною центральної нервової системи (ЦНС). Периферичні тканини-мішені можуть включати, без обмежень, кровоносну систему, печінку, нирки, серце, ендотелій, кістковий мозок і клітини-похідні кісткового мозку, селезінку, легені, лімфатичні вузли, кістки, хрящі, яєчники і сім’яники. У деяких варіантах, терапевтичні білки (наприклад, заміщуючий 28