Виділене антитіло, яке зв’язує позаклітинний домен prlr
Номер патенту: 97484
Опубліковано: 27.02.2012
Автори: Даміано Джейсон, Мірза Амер, Лукман Мохаммад, Ноне Женевьєв, Бедінджер Деніел, Масат Лінда
Формула / Реферат
1. Виділене антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR з SEQ ID NO: 2 з рівноважною константою дисоціації (KD) 10-6 M або більш низькою і яке містить (a) області, що визначають комплементарність (CDR), які представлені в положеннях від 24 до 38, положеннях від 54 до 60 та положеннях від 93 до 101 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 88, і (b) області CDR, які представлені в положеннях від 31 до 35, положеннях від 50 до 66 та положеннях від 99 до 113 SEQ ID NO: 90.
2. Антитіло за п. 1, яке є химерним антитілом, гуманізованим антитілом, сконструйованим для людини антитілом, антитілом людини, одноланцюжковим антитілом або фрагментом антитіла.
3. Антитіло за п. 1, яке містить константну область послідовності антитіла людини і одну або декілька варіабельних каркасних областей важкого ланцюга і легкого ланцюга послідовності антитіла людини.
4. Антитіло за п. 3, в якому послідовність антитіла людини є індивідуальною послідовністю людини, консенсусною послідовністю людини, індивідуальною послідовністю зародкової лінії людини або консенсусною послідовністю зародкової лінії людини.
5. Антитіло за п. 1, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, їх фрагментом або їх комбінаціями.
6. Антитіло за п. 5, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4.
7. Антитіло за п. 1, що має рівноважну константу дисоціації (KD) 10-7, 10-8 або 10-9 M або більш низьку відносно PRLR.
8. Антитіло за п. 1, в якому константна область легкого ланцюга є модифікованою або немодифікованою константною областю легкого ланцюга лямбда, константною областю легкого ланцюга каппа, їх фрагментом або їх комбінаціями.
9. Антитіло за п. 1, яке інгібує внутрішньоклітинне фосфорилування PRLR.
10. Антитіло за п. 1, яке інгібує індукцію фосфорилування Stat5.
11. Антитіло за п. 1, яке інгібує проліферацію ракової клітини молочної залози.
12. Антитіло за п. 1, яке кон'юговане з іншим діагностичним або терапевтичним агентом.
13. Антитіло за п. 1, яке очищене щонайменше до 95 % гомогенності в розрахунку на масу.
14. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за п. 13 і фармацевтично прийнятний носій.
15. Набір, який містить терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1, упаковану у контейнер, причому зазначений набір містить другий терапевтичний агент, і додатково містить етикетку, прикріплену до контейнера або упаковану з контейнером, де етикетка описує вміст цього контейнера і забезпечує вказівки і/або інструкції, що стосуються застосування вмісту цього контейнера для лікування раку молочної залози.
16. Набір за п. 15, де контейнером є флакон або склянка, або попередньо заповнений шприц.
17. Виділене антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 88 і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 90.
18. Антитіло за п. 1, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR людини з рівноважною константою дисоціації (KD) щонайменше у 10000-15000 разів більш низькою, ніж позаклітинний домен мишачого PRLR.
19. Антитіло за п. 1, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR людини, позаклітинний домен мишачого PRLR і позаклітинний домен PRLR щура.
20. Антитіло за п. 19, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR миші і щура з рівноважною константою дисоціації (KD) 10-6 M або більш низькою.
21. Антитіло за п. 20, що зв'язує той самий епітоп, що і варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіла he.06.642-2.
Текст
1. Виділене антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR з SEQ ID NO: 2 з рівноважною -6 константою дисоціації (KD) 10 M або більш низькою і яке містить (a) області, що визначають комплементарність (CDR), які представлені в положеннях від 24 до 38, положеннях від 54 до 60 та положеннях від 93 до 101 амінокислотної послідовності SEQ ID NO: 88, і (b) області CDR, які представлені в положеннях від 31 до 35, положеннях від 50 до 66 та положеннях від 99 до 113 SEQ ID NO: 90. 2. Антитіло за п. 1, яке є химерним антитілом, гуманізованим антитілом, сконструйованим для людини антитілом, антитілом людини, одноланцюжковим антитілом або фрагментом антитіла. 3. Антитіло за п. 1, яке містить константну область послідовності антитіла людини і одну або декілька варіабельних каркасних областей важкого ланцюга і легкого ланцюга послідовності антитіла людини. 4. Антитіло за п. 3, в якому послідовність антитіла людини є індивідуальною послідовністю людини, консенсусною послідовністю людини, індивідуальною послідовністю зародкової лінії людини або консенсусною послідовністю зародкової лінії людини. 5. Антитіло за п. 1, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, їх фрагментом або їх комбінаціями. 6. Антитіло за п. 5, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. UA (21) a200902394 (22) 17.08.2007 (24) 27.02.2012 (86) PCT/US2007/076160, 17.08.2007 (31) 60/838,648 (32) 18.08.2006 (33) US (31) 60/946,360 (32) 26.06.2007 (33) US (46) 27.02.2012, Бюл.№ 4, 2012 р. (72) БЕДІНДЖЕР ДЕНІЕЛ, US, ДАМІАНО ДЖЕЙСОН, US, ЛУКМАН МОХАММАД, US, МАСАТ ЛІНДА, US, МІРЗА АМЕР, US, НОНЕ ЖЕНЕВЬЄВ, US (73) НОВАРТІС АГ, CH, КСОМА ТЕКНОЛОДЖИ ЛТД., US (56) "Monoclonal Anti-human Prolactin R Antibody" INTERNET CITATION, [Online] 6 June 2005 (200506-06), XP002479170 Retrieved from the Internet: URL:http://www.rndsystems.com/pdf/MAB1167.pdf> [retrieved on 2008-05-05]. HU ZHANG-ZHI ET AL: "Isolation and characterization of two novel forms of the human prolactin receptor generated by alternative splicing of a newly identified exon 11" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 276, no. 44, 2 November 2001 (2001-11-02), pages 41086-41094, XP002479171 ISSN: 0021-9258 -& "Prolactin Receptor" INTERNET CITATION, [Online] XP002479172 Retrieved from the Internet: URL:http://www.bioreagents.com/products/productDet ails/productDetails.cfm?catnbr=MA1-610> [retrieved on 2008-05-05] . SISSOM J F ET AL: "ANTI-GROWTH ACTION ON MOUSE MAMMARY AND PROSTATE GLANDS OF A MONOCLONAL ANTIBODY TO PROLACTIN RECEPTOR" AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, PHILADELPHIA, PA, US, vol. 133, no. 3, 1 December 1988 (1988-12-01), pages 589-595, XP008068076 ISSN: 0002-9440. DAVIES J ET AL: "Affinity improvement of single antibody VH domains: residues in all three hypervariable regions affect antigen binding" IMMUNOTECHNOLOGY, ELSEVIER SCIENCE 2 (19) 1 3 97484 4 7. Антитіло за п. 1, що має рівноважну константу -7 -8 -9 дисоціації (KD) 10 , 10 або 10 M або більш низьку відносно PRLR. 8. Антитіло за п. 1, в якому константна область легкого ланцюга є модифікованою або немодифікованою константною областю легкого ланцюга лямбда, константною областю легкого ланцюга каппа, їх фрагментом або їх комбінаціями. 9. Антитіло за п. 1, яке інгібує внутрішньоклітинне фосфорилування PRLR. 10. Антитіло за п. 1, яке інгібує індукцію фосфорилування Stat5. 11. Антитіло за п. 1, яке інгібує проліферацію ракової клітини молочної залози. 12. Антитіло за п. 1, яке кон'юговане з іншим діагностичним або терапевтичним агентом. 13. Антитіло за п. 1, яке очищене щонайменше до 95 % гомогенності в розрахунку на масу. 14. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло за п. 13 і фармацевтично прийнятний носій. 15. Набір, який містить терапевтично ефективну кількість антитіла за п. 1, упаковану у контейнер, причому зазначений набір містить другий терапевтичний агент, і додатково містить етикетку, прикріплену до контейнера або упаковану з контейне ром, де етикетка описує вміст цього контейнера і забезпечує вказівки і/або інструкції, що стосуються застосування вмісту цього контейнера для лікування раку молочної залози. 16. Набір за п. 15, де контейнером є флакон або склянка, або попередньо заповнений шприц. 17. Виділене антитіло, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 88 і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 90. 18. Антитіло за п. 1, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR людини з рівноважною константою дисоціації (KD) щонайменше у 10000-15000 разів більш низькою, ніж позаклітинний домен мишачого PRLR. 19. Антитіло за п. 1, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR людини, позаклітинний домен мишачого PRLR і позаклітинний домен PRLR щура. 20. Антитіло за п. 19, яке зв'язує позаклітинний домен PRLR миші і щура з рівноважною констан-6 тою дисоціації (KD) 10 M або більш низькою. 21. Антитіло за п. 20, що зв'язує той самий епітоп, що і варіабельні області важкого ланцюга і легкого ланцюга антитіла he.06.642-2. Перехресне посилання на споріднені заявки За даною заявкою заявляється про пріоритет Попередньої заявки на патент США № 60/946360, поданої 26 червня 2007 року, і Попередньої заявки на патент США №60/838648, поданої 18 серпня 2006 року. Галузь техніки, якої стосується винахід Даний винахід стосується способів профілактики і лікування раку введенням PRLRспецифічних антитіл. Рівень техніки Рак є другою основною причиною смерті у Сполучених Штатах. Хоча «раком» називають багато різних типів раку, тобто рак молочної залози, передміхурової залози, легені, ободової кишки, підшлункової залози, кожний тип раку відрізняється як на фенотипічному рівні, так і на генетичному рівні. Нерегульований ріст, характерний для раку, відбувається, коли експресія одного або декількох генів стає експресією з порушеною регуляцією внаслідок мутацій, і ріст клітин не може більше контролюватися. Гени часто класифікують на два класи, онкогени і супресорні гени пухлин. Онкогени є генами, нормальною функцією яких є стимуляція росту клітин, але тільки за конкретних умов. З появою мутації в онкогені і при втраті потім цього контролю, онкоген стимулює ріст за всіх умов. Однак, було виявлено, що, для того щоб рак був дійсно успішним, цей рак повинен мати також мутації у супресорних генах пухлин. Нормальною функцією супресорних генів пухлин є зупинка клітинного росту. Приклади супресорів пухлин включають р53, р16, р21 і АРС, всі з яких, при нормальній дії, зупиняють неконтрольований поділ і ріст клітин. Коли супресор пухлини мутований або втрачений, це гальмування росту клітин також втрачається, дозволяючи клітинам рости тепер без обмежень. Рецептор пролактину (PRLR) є рецептором цитокінів класу 1, що однократно пронизує мембрану, який є гомологічним рецепторам для членів суперсімейства цитокінів, таким як рецептори для IL2, IL3, IL4, IL6, IL7, еритропоетину і GM-CSF. PRLR бере участь у множинних біологічних функціях, що включають ріст клітин, диференціювання, розвиток, лактацію і репродукцію. Він не має внутрішньої тирозинкіназної активності; зв'язування ліганду приводить до димеризації рецептора, перехресного фосфорилування Jak2 і подальшої передачі сигналу. кДНК рецептора пролактину людини була спочатку виділена з бібліотек гепатоми і раку молочної залози. (Boutin, J.-M. et al., Molec. Endocr. 3:1455-1461, 1989). Ця нуклеотидна послідовність передбачила зрілий білок з 598 амінокислот з набагато більш довгим цитоплазматичним доменом, ніж домен рецептора PRL печінки щура. Ген рецептора пролактину знаходиться у тій самій хромосомній області, що і ген рецептора гормону росту, який був картований в 5;13-р12 (Arden, K. С. et al. Cytogenet. Cell Gene 53:161-165, 1990; Arden, K.C. et al., (Abstract) AM. J. Hum. Genet. 45 (suppl.): A129 тільки, 1989). Гормон росту також зв'язується з рецептором пролактину і активує цей рецептор. Була визначена геномна організація гена PRLR людини (Нu, Ζ.-Ζ. et al., J. Clin. Endocr. Metab. 84:1153-1156, 1999). 5'-нетрансльована область гена PRLR містить 2 альтернативних перших екзони: Е13, людська копія щурячого і мишачого Ε13, і новий тип альтернативного першого екзону людини, названий Ε1Ν. 5'-нетрансльована область також містить звичайний некодуючий ек 5 зон 2 і частину екзону 3, що містить кодон ініціації трансляції. Екзони Е13 і Ε1Ν знаходяться на відстані 800 пар основ один від одного. Ці 2 екзони експресуються у тканині молочної залози людини, клітинах раку молочної залози, гонадах і печінці. Загалом і в цілому, транскрипт, що містить Е13, є переважним у більшості тканин. Продукт гена PRLR кодується екзонами 3-10, з яких екзон 10 кодує більшу частину внутрішньоклітинного домену. Екзони Е13 і E1N транскрибуються від альтернативних промоторів РІII і PN, відповідно. Промотор РІII містить елементи Sp1 і С/ЕВР, які ідентичні цим елементам у промоторі гризунів, і є на 81% подібним до області -480/-106 у щура і миші. Промотор PN містить можливі сайти зв'язування для білків сімейства ETS і півсайту для ядерних рецепторів. PRLR існує у ряді різних ізоформ, які відрізняються за довжиною їх цитоплазматичних доменів. Чотири ізоформи мРНК PRLR (L, I, S1a і S1b) були продемонстровані у підшкірній черевній жировій тканині і жировій тканині молочної залози людини (Ling, С. et al., J. Clin. Endocr. Metab. 88:1804-1808, 2003). Крім того, вони детектували експресію білка L-PRLR і I-PRLR у підшкірній черевній жировій тканині і жировій тканині молочної залози людини за допомогою імуноблот-аналізу. PRL зменшував активність ліпопротеїнліпази у жировій тканині людини у порівнянні з контролем. Ling et al. припускають, що ці результати продемонстрували пряму дію PRL, через функціональні PRLR, у зменшенні активності LPL у жировій тканині людини і що ці результати дозволяють припустити, що LPL може також регулюватися подібним чином під час лактації. Була з'ясована функція цих ізоформ PRLR у щура (Perrot-Applanat, Μ. et al., Molec. Endocr. 11:1020-1032, 1997). Подібно до відомої довгої форми (591 амінокислота), форма Nb2, що позбавлена 198 амінокислот цитоплазматичного домену, здатна передавати лактогенний сигнал. На противагу цьому, коротка форма, що позбавлена 291 амінокислоти цитоплазматичного домену, є неактивною. Функцію короткої форми досліджували після котрансфекції як довгої, так і короткої форм. Ці результати показують, що коротка форма діє як домінантно-негативний інгібітор при утворенні неактивних гетеродимерів, приводячи до інгібування активації кінази 2 Януса. PerrotApplanat et al. припускають, що гетеродимеризація PRLR може позитивно або негативно активувати транскрипцію PRL. У нещодавніх повідомленнях припускається, що PRLR надекспресується у тканинах раку молочної залози і раку передміхурової залози людини (Li et al., Cancer Res, 64:4774-4782, 2004; Gill et al., J Clin Pathol, 54:956-960, 2001; Touraine et al., J Clin Endocrinol Metab., 83:667-674, 1998). Li et al. повідомляли, що активація Stat5 і експресія PRLR асоціюється з високим гістологічним ступенем у 54% проб раку передміхурової залози (Li et al., вище). В інших повідомленнях також припускається, що проби первинного раку молочної залози чутливі до PRL в аналізах утворення колоній, і що концентрації PRL у плазмі корелюють з ризиком раку молочної залози (Tworoger et al., Cancer Res, 97484 6 64:6814-6819, 2004; Tworoger et al., Cancer Res, 66:2476-2482, 2006). Інше повідомлення вказувало на те, що PRL-трансгенні миші розвивають злоякісні карциноми молочної залози або гіперплазію передміхурової залози (Wennbo et al., J Clin Invest., 100:2744-2751, 1997; Wennbo et al., Endocrinology, 138:4410-4415, 1997). Моноклональне антитіло PRLR знижувало зустрічаність пухлин молочної залози у мишей (Sissom et al., Am. J. Pathol. 133:589-595, 1988). Крім того, антагоніст PRL (S179 D-мутантий PRL) інгібував проліферацію клітинної лінії карциноми передміхурової залози людини, DU-145 in vitro і DU-145-індуковані пухлини in vivo (Xu et al., Cancer Res., 61:6098-6104, 2001). Таким чином, існує потреба в ідентифікації композицій і способів, які модулюють PRLR, і його роль у таких раках. Даний винахід націлений на ці, а також інші важливі потреби. Суть винаходу Нуклеотидна послідовність PRLR представлена у SEQ ID NO: 1, а амінокислотна послідовність представлена у SEQ ID NO: 2. Позаклітинний домен (ECD), що складається з амінокислот 25-234 SEQ ID NO: 2, може бути розділений на два основних домени, S1 (амінокислоти 25-122) і S2 (амінокислоти 123-234). Був ідентифікований ряд різних ізоформ PRLR: довгі (L) і проміжні (І), S1, неактивна розчинна форма (PRLBP) і неактивні короткі форми S1a і S1b. Екзони і нуклеотидні області, що містяться у кожній ізоформі, зображені на Фігурі 1. В ілюстративних варіантах здійснення даний винахід розглядає антитіла, які зв'язуються з S1доменом і/або з S2-доменом. Ті антитіла, які зв'язуються з S2-доменом, можуть націлюватися на всі активні ізоформи. Даний винахід обговорює також антитіла, які зв'язуються специфічно з однією ізоформою, але не з іншою (наприклад, з проміжною, але не з S1a або S1b), або з активними ізоформами (довгими, проміжними і S1), але не з неактивними ізоформами (S1a і S1b). Матеріали і способи даного винаходу задовольняють згаданим вище та іншим вимогам у даній галузі. В одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR з -6 рівноважною константою дисоціації (KD) 10 M або більш низькою і конкурує з будь-яким з антитіл chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або ХНА.06.907 за зв'язування з PRLR більш ніж на 75%. Під терміном «рі-6 вноважна константа дисоціації (KD) 10 Μ або більш низька» мають на увазі рівноважну констан-6 -7 -8 -9 ту дисоціації, наприклад, 10 Μ, 10 М, 10 М, 10 -10 -11 -12 Μ, 10 Μ, 10 Μ або 10 Μ (тобто величину, -6 більш низьку, ніж 10 Μ). В іншому варіанті здійс 7 нення антитіло зв'язується з тим самим епітопом PRLR, що і будь-яке з антитіл chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.2751, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або ХНА.06.907. В іншому варіанті здійснення згадане вище антитіло містить 1, 2, 3, 4, 5 або 6 областей CDR будь-якого з антитіл chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або ХНА.06.907. В іншому варіанті здійснення згадане вище антитіло є химерним антитілом, гуманізованим антитілом, сконструйованим для людини антитілом, антитілом людини, одноланцюжковим антитілом або фрагментом антитіла. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому щонайменше одна амінокислота у CDR замінена відповідним залишком відповідної CDR іншого анти-PRLR-антитіла. В ілюстративному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому щонайменше одна амінокислота у CDR з антитіла, вибраного з групи, що складається з chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або ХНА.06.907, замінена відповідним залишком відповідної області CDR іншого анти-PRLR-антитіла. В іншому ілюстративному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому щонайменше одна амінокислота у CDR з антитіла, вибраного з групи, що складається з chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або 97484 8 ХНА.06.907, замінена відповідним залишком відповідної CDR іншого антитіла, вибраного з групи, що складається з chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або ХНА.06.907. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому одна або дві амінокислоти у CDR модифіковані. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, яке зберігає щонайменше 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99% ідентичність протягом або варіабельної легкої, або варіабельної важкої області стосовно антитіл chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.13L XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, ХЫА.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або XHA.06.907. В іншому варіанті здійснення згадане вище антитіло містить константну область послідовності антитіла людини і одну або декілька варіабельних каркасних областей важкого і легкого ланцюгів послідовності антитіла людини. Ще в одному варіанті здійснення винаходу забезпечене згадане вище антитіло, в якому послідовність антитіла людини є індивідуальною послідовністю людини, консенсусною послідовністю людини, індивідуальною послідовністю зародкової лінії людини або консенсусною послідовністю зародкової лінії людини. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, їх фрагментом або їх комбінаціями. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому константна область важкого ланцюга є модифікованим або немодифікованим lgG1, IgG2, IgG3 або IgG4. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що має рівно-6 -7 -8 -9 важну константу дисоціації 10 , 10 , 10 або 10 Μ або більш низьку стосовно PRLR. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що містить консервативну заміну в областях CDR. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що містить консервативну або неконсервативну зміну у залишках низького або помірного ризику. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, в якому константна область легкого ланцюга є модифікованою або немодифікованою константною областю легкого ланцюга лямбда, констант 9 ною областю легкого ланцюга каппа, їх фрагментом або їх комбінаціями. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що інгібує димеризацію PRLR, інгібує внутрішньоклітинне фосфорилування PRLR, інгібує індукцію фосфорилування MARK, інгібує індукцію фосфорилування Stat5, інгібує індукцію фосфорилування AKT і/або інгібує зв'язування PRL з PRLR. В інших варіантах здійснення згадане вище антитіло додатково інгібує продукування VEGF і/або ангіогенез. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що інгібує проліферацію ракової клітини. Ще в одному варіанті здійснення це антитіло інгібує проліферацію клітин раку молочної залози, передміхурової залози і легені. Крім раку, інший варіант здійснення винаходу забезпечує згадане вище антитіло для профілактики і/або лікування аутоімунних і запальних захворювань або порушень. Ці антитіла особливо придатні у профілактиці, ослабленні або лікуванні захворювань, що включають аутоімунний і/або запальний компонент. Ці захворювання включають, але не обмежуються ними, аутоімунні і запальні захворювання, такі як системний червоний вовчак (SLE), дискоїдний (хронічний) червоний вовчак, люпус-нефрит (вовчаковий нефрит), саркоїдоз, запальний артрит, у тому числі, але не тільки, ювенільний артрит, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, Синдром Рейтера, анкілозуючий спондиліт і подагричний артрит, відторгнення трансплантата органу або тканини, гіпергостре, гостре або хронічне відторгнення і/або хворобу трансплантат проти хазяїна, розсіяний склероз, гіпер-Ig-синдром, нодозний поліартеріїт, первинний біліарний цироз печінки, запальне захворювання кишечнику, хворобу Крона, глютенову хворобу (глютен-чутливу ентеропатію), аутоімунний гепатит, перніціозну (злоякісну) анемію, аутоімунну гемолітичну анемію, псоріаз, склеродермію, тяжку псевдопаралітичну міастенію, аутоімунну тромбоцитопенічну пурпуру, аутоімунний тиреоїдит, хворобу Грейвса, тиреоїдит Хашимото, хворобу імунних комплексів, синдром хронічної втоми - імунної дисфункції (CFIDS), поліміозит і дерматоміозит, кріоглобулінемію, тромболізис, кардіоміопатію, звичайну пухирчатку, інтерстиціальний легеневий фіброз, цукровий діабет Типу І і Типу II, гіперчутливість уповільненого типу 1, 2, 3 і 4, алергію або алергійні порушення, небажані/ненавмисні імунні реакції на терапевтичні білки, астму, синдром Черджа-Строса (алергійний гранулематоз), атопічний дерматит, алергійний і подразнюючий контактний дерматит, кропивницю, IgE-опосередковану алергію, атеросклероз, васкуліт, ідіопатичні запальні міопатії, гемолітичне захворювання, хворобу Альцгеймера, хронічну запальну демієлінізуючу поліневропатію і т.п. В іншому варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, що кон'юговане з іншим діагностичним або терапевтичним агентом. Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб скринінгу на антитіло проти позаклітинного домену білка PRLR, придатне для лікування раку, 97484 10 що передбачає стадії: контактування поліпептиду, що містить ECD PRLR, з кандидатним антитілом, що містить щонайменше 1, 2, 3, 4, 5 або 6 областей CDR антитіл chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 і ХНА.06.907; детектування афінності зв'язування кандидатного антитіла з даним поліпептидом та ідентифікації зазначеного кандидатного антитіла як антитіла, придатного для лікування раку, якщо детектована -6 рівноважна константа дисоціації 10 М або більш низька. В іншому варіанті здійснення забезпечений спосіб системної зміни антитіл і скринінгу на антитіло проти позаклітинного домену білка PRLR, придатне для лікування раку, що передбачає стадії одержання кандидатного антитіла, що містить модифікації однієї або двох амінокислот в областях CDR антитіл chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 і ХНА.06.907; контактування поліпептиду, що містить ECD PRLR, із зазначеним кандидатним антитілом; детектування афінності зв'язування кандидатного антитіла з цим поліпептидом та ідентифікації зазначеного кандидатного антитіла як антитіла, придатного для лікування раку, якщо детектована рівноважна -6 константа дисоціації 10 Μ або більш низька. Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб скринінгу на антитіло проти позаклітинного домену білка PRLR, придатне для лікування раку, що передбачає стадії контактування клітини молочної залози, легені або передміхурової залози з кандидатним антитілом, що містить щонайменше 1, 2, 3, 4, 5 або 6 областей CDR антитіл chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 і ХНА.06.907, або антитілом, що містить модифікацію однієї або двох амінокислот в одній або декількох областях CDR; детектування проліферації або виживаності зазна 11 ченої клітини та ідентифікації зазначеного кандидатного антитіла як антитіла, придатного для лікування раку, якщо детектовано зменшення клітинної проліферації або виживаності. Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб лікування суб'єкта, який страждає від раку стадій 0, І, II, III, IV або V, що передбачає стадію введення згаданого вище антитіла у терапевтично ефективній кількості. У спорідненому варіанті здійснення цим раком є рак молочної залози, легені або передміхурової залози. В іншому варіанті здійснення вводять другий терапевтичний агент. В ілюстративному варіанті здійснення другим терапевтичним агентом є доксорубіцин, даунорубіцин або інший антрацикліновий або топоізомеразний інгібітор. У наступних варіантах здійснення будьякий з попередніх топоізомеразних інгібіторів вводять з chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4. Ще в одному варіанті здійснення суб'єкта додатково піддають променевій терапії або хірургічному втручанню. В інших варіантах здійснення винаходу цей суб'єкт є позитивним стосовно експресії PRLR і експресії HER2-neu, і зазначеним другим терапевтичним агентом є анти-Неr2-neuантитіло. У спорідненому варіанті здійснення цей суб'єкт є позитивним стосовно експресії PRLR і експресії ER, і зазначеним другим терапевтичним агентом є анти-ER-антитілo. У наступному варіанті здійснення винахід забезпечує антитіло за винаходом для застосування у медицині, у тому числі для застосування у лікуванні раку. В інших варіантах здійснення винахід забезпечує застосування антитіла за винаходом у приготуванні лікарського засобу для лікування раку. Цей лікарський засіб може бути введений пацієнту у комбінації з другим терапевтичним агентом і/або з променевою терапією. В іншому варіанті здійснення винаходу забезпечений спосіб направленого впливу на пухлинну клітину, що експресує PRLR, який передбачає стадію введення згаданого вище антитіла, кон'югованого з радіонуклідом або іншим токсином. В іншому варіанті здійснення цим суб'єктом є ссавець. Ще в одному варіанті здійснення цим суб'єктом є людина. Ще в одному варіанті здійснення забезпечена виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує важкий ланцюг або легкий ланцюг згаданого вище антитіла. Ще в одному варіанті здійснення забезпечений експресуючий вектор, що містить згадану вище молекулу нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язану з регуляторною контрольною послідовністю. Ще в одному варіанті здійснення забезпечена клітина-хазяїн, що містить згаданий вище вектор або згадану вище молекулу нуклеїнової кислоти. Ще в одному варіанті здійснення забезпечений спосіб застосування згаданої вище клітини-хазяїна для одержання антитіла, що передбачає культивування цієї клітини-хазяїна при придатних умовах і витягування зазначеного антитіла. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, одержане згаданим вище способом. 97484 12 Ще в одному варіанті здійснення забезпечене згадане вище антитіло, яке очищене щонайменше до 95% гомогенності розраховуючи на масу. В іншому варіанті здійснення забезпечена фармацевтична композиція, що містить згадане вище антитіло і фармацевтично прийнятний носій. Ще в одному варіанті здійснення забезпечений набір, що містить згадане вище антитіло, що містить терапевтично ефективну кількість антитіла за винаходом, упаковане у контейнер, причому цей набір необов'язково містить другий терапевтичний агент і додатково містить етикетку, приєднану до контейнера або упаковану з контейнером, причому етикетка описує вміст контейнера і забезпечує вказівки і/або інструкції, що стосуються застосування вмісту контейнера для лікування раку. В іншому варіанті здійснення забезпечений набір, в якому контейнером є флакон або склянка, або попередньо заповнений шприц. В іншому варіанті здійснення винаходу забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 82, 84, 86, 88, 91, 95 і 96. В іншому варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 83, 85, 87, 89, 90, 93, 94, 97 і 98. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 88, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 89. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 88, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 90. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 91, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 93. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 91, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 94. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 92, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 93. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 92, і амінокислотну 13 послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 94. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 95, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 97. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 95, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 98. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 96, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 97. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR, що містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга SEQ ID NO: 96, і амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга SEQ ID NO: 98. В іншому варіанті здійснення винаходу забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR людини з KD щонайменше у 10-25000 разів, 100-20000 разів, 1000-18000 разів, 5000-17000 разів, 8000-16000 разів, 10000-15000 разів, 1200015000 разів або 13000-14000 разів більш низькою, ніж позаклітинний домен мишачого PRLR. У спорідненому варіанті здійснення згадане вище антитіло зв'язує той самий епітоп, що і he.06.275-4. Ще в одному варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR людини, позаклітинний домен PRLR миші і позаклітинний домен PRLR щура. В іншому варіанті здійснення забезпечене антитіло, що зв'язує позаклітинний домен PRLR людини, миші і щура з рівноважною -6 константою дисоціації (KD) 10 Μ або менше. У спорідненому варіанті здійснення згадане вище антитіло зв'язує той самий епітоп, що і he.06.642-2. Ще в одному варіанті здійснення зазначені вище способи можуть бути використані для ідентифікації суб'єкта, який потребує лікування антиPRLR-антитілом, за допомогою, наприклад, (а) одержання проби з цього суб'єкта; і (b) аналізу цієї проби на рівень фосфорилування PRLR, Jak2, Марк, Stat5, Erk1/2 і/або Akt; де рівень фосфорилування PRLR, Jak2, Марк, Stat5, Erk1/2 і/або Akt є показником необхідності лікування анти-PRLRантитілом. В іншому варіанті здійснення забезпечений спосіб моніторингу ракової терапії у суб'єкта, який страждає від раку, що передбачає стадії: (а) аналізу першої проби з цього суб'єкта на рівень фосфорилування PRLR перед початком лікування протираковим терапевтичним засобом; і (b) аналізу другої проби після початку лікування протираковим терапевтичним засобом, де зменшення рівня фосфорилування PRLR після початку лікування протираковим терапевтичним засобом свідчить про те, що цей пацієнт одержує терапевтично ефективну дозу протиракового терапевтичного засобу. У спорідненому варіанті здійснення проти 97484 14 раковим терапевтичним засобом є антитіло за будь-яким з описаних вище варіантів здійснення. Короткий опис фігур Фігура 1 показує розташування генів і екзонів у різних ізоформах PRLR. Фігури 2, 3 і 4 показують дію вибраних PRLRспецифічних антитіл на фосфорилування pERK1/2. [mAb1167 є контрольним мишачим моноклональним анти-PRLR-ангитілом; R&D Systems, catalog # МАВ 1167]. Фігура 5 показує дію PRLR-специфічного антитіла на проліферацію PRL-чутливої лінії пухлинних клітин. Фігура 6 показує дію PRLR-специфічного антитіла на внутрішньоклітинне фосфорилування PRLR. Фігура 7А-7С показує амінокислотні послідовності VH і VL, а також місце розташування CDR (підкреслені), антитіл ХРА.06.128, ХРА.06.129, ХРА.06.130, ХРА.06.131, ХРА.06.141, ХРА.06.147, ХРА.06.148, ХРА.06.158, ХРА.06.159, ХРА.06.163, ХРА.06.167, ХРА.06.171, ХРА.06.178, ХРА.06.181, ХРА.06.192, ХРА.06.202, ХРА.06.203, ХРА.06.206, ХРА.06.207, ХРА.06.210, ХРА.06.212, ХРА.06.217, ХРА.06.219, ХРА.06.229, ХРА.06.233, ХРА.06.235, ХРА.06.239, які виявляли більш ніж 80% інгібування в аналізі pERK. Фігура 8 показує амінокислотну послідовність VH і VL антитіла ХРА.06.145. Фігура 9 показує нуклеотидні лідерні послідовності і VH, і VL антитіл ХНА.06.983, ХНА.06.275 і ХНА.06.642. Фігура 10 показує амінокислотні послідовності VH і VL антитіл ХНА.06.983, ХНА.06.275 і ХНА.06.642 (CDR підкреслені). Фігура 11 показує, що химерні анти-PRLR-mAb chXHA.06.642, chXHA.06.275 і chXHA.06.983 сильно інгібують проліферацію і виживаність клітин BaF/PRLR. KLH-G1 є неспецифічним ізотипічно подібним контрольним антитілом. Панель праворуч показує величини ІС50 відповідних мишачих mAb. Фігура 12 показує, що химерні анти-PRLR-mAb інгібують передачу сигналу STAT5 у клітинах T47D. Клітини попередньо обробляли 1 мкг/мл mAb перед 30-хвилинною стимуляцією 50 нг/мл PRL. Лізати аналізували на присутність фосфоPRLR з використанням антитіл, специфічних стосовно залишків фосфотирозину 546 i 611 PRLR. Фігура 13 показує дію сконструйованих антитіл для людини (Human Engineered) на фосфорилування pERK1/2. Фігура 14 показує ADCC, опосередковану химерними анти-PRLR-mAb. Клітини T47D-T2 мітили Саlсеіn-АМ перед нанесенням mAb (1 мкг/мл) і очищених НК-клітин людини при співвідношенні ефектор-мішень 10:1. Після 4-годинної інкубації вимірювали вивільнення Саlсеіn-АМ у супернатант. Анти-KLН-антитіло і герцептин використовували як негативний і позитивний контролі, відповідно. Специфічний лізис у % розраховували як (експериментальне вивільнення -мимовільне вивільнення)/(максимальне вивільнення - мимовільне вивільнення)х100. 15 Фігура 15 показує, що анти-PRLR-mAb діють синергічно з цитотоксичними лікарськими засобами у комбінованих дослідженнях. Доксорубіцин (верхня панель) і цисплатин (нижня панель) вводили разом з контрольним анти-KLH-Ab, антиPRLR-mAb chXHA.06.642 або анти-PRLR-mAb chXHA.06.275 (всі при 1 мкг/мл). Виживаність клітин визначали аналізом CellTiter Glo і виражали у вигляді RLU (у-вісь). Фігура 16 показує, що сконструйовані mAb для людини (Human Engineered) зберігають функціональні характеристики анти-PRLR в аналізах фосфорилування STAT5. Клітини T47D інкубували з 1 або 10 мкг/мл mAb, потім обробляли з PRL (50 нг/мл) або без нього протягом додаткових 30 хвилин. Фігури 17А і В показують, що кандидати гуманізованого анти-PRLR-антитіла сильно інгібують ріст PRL-залежних клітин BaF3/PRLR. Клітини BaF3/PRLR вирощували у присутності PRL (50 нг/мл) протягом 48 годин з контрольним анти-KLHантитілом (верхня лінія), химерним антитілом або з версіями сконструйованого для людини антитіла (Human Engineered). Величини ЕС50 розраховували з використанням нелінійного регресійного аналізу з підгонками кривих. Фігури 18А і В показують інгібування p-STAT5 у пухлинах Nb2-C11 оброблених chXHA.06.642 тварин. Безтимусних мишей з підшкірними пухлинами Nb2-c11 ін'єктували внутрішньочеревинно chXHA.06.642 або контрольними анти-KLH-lgG1mAb. Через два дні вводили болюс 20 мкг внутрішньочеревинною ін'єкцією oPRL. Контрольних тварин ін'єктували сольовим розчином. Через два дні вводили 20 мкг болюсної ін'єкції oPRL, і через 40 хвилин пухлини збирали і оцінювали на pSTAT5 імуноблотингом або ІНС (імуногістохімічним аналізом). Фіг. 18А, Вестерн-Блот 80 мкг Tyr694 p-STAT5; Фіг. 18В, ІНС Tyr694 p-STAT5. Фігури 19А і В показують, що chXHA.06.642 є ефективним у моделі лімфоми щура Nb2-cl 1 у мишах SCID у двох різних дослідженнях. Фігури 20А і В показують, що chXHA.06.642 викликає регресію встановлених пухлин лімфоми щурів Nb2-C11 у мишах SCID. Фіг. 20А зображує об'єм пухлини; Фіг. 20В зображує умовну виживаність. Фігури 21А і В показують, що внутрішньочеревинна болюсна ін'єкція oPRL індукує p-STAT5, і обробка chA64.1 інгібує індукцію p-STAT5 у ксенотрансплантатах T47D молочної залози людини. chXHA.06.642 або контрольний анти-KLH-lgG1 ін'єктували внутрішньочеревинно в імунодефіцитних мишей, які несуть пухлину T47D, імплантованих гранулами естрадіолу 0,18 мг/день (Е2) для підтримки росту. Через два дні внутрішньочеревинно вводили болюсну ін'єкцію oPRL (20 мкг), і через 40 хвилин пухлини T47D збирали і оцінювали на p-STAT5 імуноблотингом або ІНС. Рівні pERK або р-AKT також оцінювали з використанням імуноблоту. Фіг. 21А, Вестерн-Блот 80 мкг Туr694 р-STAT5; Фіг. 21В, ІНС Tyr694 p-STAT5. Докладний опис Даний винахід забезпечує PRLR-специфічні антитіла, фармацевтичні композиції, що містять 97484 16 такі антитіла, способи одержання цих антитіл і фармацевтичних композицій і способи лікування пацієнтів цими фармацевтичними композиціями і сполуками. Антитіла за даним винаходом можуть мати бажану біологічну активність зв'язування з PRLR і/або інгібування димеризації PRLR, і/або внутрішньоклітинного фосфорилування PRLR, і/або інгібування передачі сигналу PRLR далі по ходу процесу, наприклад, за допомогою фосфорилування Jak2, Марк, Stat5, Erk1/2 і/або Akt, та інгібування клітинної проліферації, асоційованої з раком або пухлинами. Таким чином, припускається прямий аналіз активації PRLR детектуванням його фосфорилування або оцінкою статусу фосфорилування інших розташованих далі по ходу процесу партнерів передачі сигналу, таких як Jak2, Stat5, Erk1/2 і/або Akt. Таким чином, аналіз шляхів передачі сигналу далі по ходу процесу може бути використаний для ідентифікації пацієнтів, які потребують анти-PRLR-антитіл, або використаний для моніторингу пацієнтів, яких лікували анти-PRLRантитілами. Антитіла відповідно до даного винаходу можуть альтернативно (або додатково) мати бажану біологічну активність зв'язування з PRLR, що експресується на ракових клітинах, служачи, таким чином, для направленого впливу цитотоксичних терапевтичних засобів на ракові клітини. Далі, даний винахід стосується аналізів скринінгу для ідентифікації антагоністів або агоністів гена або продукту гена PRLR і їх варіантів. Таким чином, даний винахід стосується способів ідентифікації агоністів або антагоністів гена або продукту гена PRLR і їх варіантів і застосування зазначеного агоніста або антагоніста для лікування або профілактики раку, як описано тут. Крім того, даний винахід розглядає застосування молекул нуклеїнових кислот, поліпептидів і/або антагоністів або агоністів продуктів гена, що кодуються геном PRLR, для скринінгу, діагностики, профілактики і/або лікування порушень, які характеризуються аберантною експресією або активністю PRLR, що включають ракові захворювання, такі як, але не тільки, рак легені, рак молочної залози і рак передміхурової залози. Декілька переважних мишачих або химерних антитіл з високою афінністю і ефективністю, виміряними аналізами in vitro, модифіковані для зменшення їх імуногенності у людей на основі способу конструювання для людини Human Engineering Studnicka et al. Коротко, представлені на поверхні амінокислотні залишки варіабельних областей важкого ланцюга і легкого ланцюга модифікують введенням амінокислотних залишків людини у положеннях, які, як було визначено, мають малу ймовірність шкідливої дії на зв'язування антигену або укладання білка, з одночасним зменшенням імуногенності стосовно оточення (середовища) людини. Конструюють синтетичні гени, що містять модифіковані варіабельні області важкого ланцюга і/або легкого ланцюга і зв'язують з константними областями важкого ланцюга і/або легкого ланцюга каппа. Будь-які константні області важкого ланцюга і легкого ланцюга можуть бути використані у комбінації з варіабельними областями сконстру 17 97484 йованого для людини антитіла (Human Engineered). Гени важкого і легкого ланцюгів вводять у клітини ссавців, і утворені рекомбінантні імуноглобулінові продукти одержують і характеризують. Зразкові антитіла відповідно до даного винаходу включають chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 і ХНА.06.907. Наведені нижче гібридоми, що секретують антитіла, були депоновані Американською Колекцією Типових Культур (АТСС) 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 (USA), відповідно до положень Будапештського Договору, 17 серпня 2006 року: Назва гібридоми ХНА.06.567 ХНА.06.642 ХНА.06.983 ХНА.06.275 ХНА.06.189 ХНА.06.907 Номер депозиту АТСС РТА-7794 РТА-7795 РТА-7796 РТА-7797 РТА-7798 РТА-7799 Наведені нижче визначення забезпечені як допомога у більш повному розумінні даного винаходу. Загальні визначення Антиген-мішень людини "PRLR" означає у даному контексті поліпептид людини, що має по суті амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, і його природні алельні і/або сплайсингові варіанти. "ECD PRLR" означає у даному контексті позаклітинну частину PRLR, представлену амінокислотами 25-234 SEQ ID NO: 2. "Пухлиною" називають у даному контексті ріст і проліферацію всіх неопластичних клітин, незалежно від того, є вони злоякісними або доброякісними, і всі передракові і ракові клітини і тканини. Терміни "рак" і "ракове" стосуються фізіологічного стану або описують фізіологічний стан у ссавців, що звичайно характеризується нерегульованим ростом клітин. Приклади раку включають, але не обмежуються ними, рак молочної залози, рак ободової кишки, рак нирки, рак печінки, рак легені, лімфоїдний рак, рак яєчника, рак підшлункової залози, рак передміхурової залози, рак матки, рак шийки матки або рак шкіри. "Лікування" є втручанням, виконуваним з наміром запобігання розвитку або зміни патології порушення. Таким чином, «лікування» стосується як терапевтичного лікування, так і профілактичних або превентивних заходів. Особи, які потребують лікування, включають осіб, які вже мають це порушення, а також осіб, у яких цьому порушенню потрібно запобігти. У лікуванні пухлини (напри 18 клад, раку) терапевтичний агент може безпосередньо зменшувати патологію пухлинних клітин або робити пухлинні клітини більш чутливими до лікування іншими терапевтичними агентами, наприклад, опромінення і/або хіміотерапії. Лікування пацієнтів, які страждають від клінічних, біохімічних, радіологічних або суб'єктивних симптомів може включати ослаблення деяких або всіх симптомів або зменшення схильності до цього захворювання. Термін "патологія" раку включає всі явища, які погіршують хороше самопочуття пацієнта. Він включає, без обмеження, аномальний або неконтрольований ріст клітин, метастазування, перешкоджання нормальному функціонуванню сусідніх клітин, вивільнення цитокінів або інших секреторних продуктів при рівнях, що відхиляються від норми, супресію або загострення запальної або імунологічної реакції і т.д. Таким чином, поліпшення після лікування може проявлятися у вигляді зменшеного розміру пухлини, зниження швидкості росту пухлини, деструкції існуючих пухлинних клітин або метастатичних клітин і/або зменшення розміру або кількості метастазів. "Ссавець" для цілей лікування стосується будь-якої тварини, що класифікується як ссавець, у тому числі людей, домашніх і сільськогосподарських тварин і тварин зоопарків, спортивних тварин і домашніх улюбленців, таких як собаки, коні, коти, корови і т.д. Переважно цим ссавцем є людина. У даному контексті фраза «терапевтично ефективна кількість» означає кількість терапевтичного або профілактичного антитіла, яке було б придатним для варіанту здійснення даного винаходу, що буде індукувати бажані терапевтичні або профілактичні дію або реакцію, у тому числі ослаблення декількох або всіх таких симптомів захворювання або зменшення схильності до цього захворювання при введенні відповідно до бажаної схеми лікування. Антитіла "Афінність" або "афінність зв'язування" часто вимірюють рівноважною константою асоціації (KА) або рівноважною константною дисоціації (KD). Термін "імуноспецифічне" або "специфічно зв'язуюче" означає, що це антитіло зв'язується з PRLR або його ECD з рівноважною константою асоціації 6 -1 (KА), більшою ніж або рівною приблизно 10 М , 7 -1 більшою ніж або рівною приблизно 10 М , біль8 -1 шою ніж або рівною приблизно 10 М , або біль9 -1 10 -1 шою ніж або рівною приблизно 10 М , 10 М , 11 -1 12 -1 10 М або 10 М . Це антитіло може мати істотно більш високу афінність стосовно антигенумішені у порівнянні з іншими неспорідненими молекулами. Це антитіло може мати також істотно більш високу афінність стосовно антигену-мішені у порівнянні з ортологами або гомологами, наприклад, щонайменше 1,5-кратну, 2-кратну, 5-кратну, 3 4 5 10-кратну, 100-кратну, 10 -кратну, 10 -кратну, 10 6 кратну, 10 -кратну або більш високу відносну афінність стосовно антигену-мішені. Альтернативно, воно може бути застосовне як антитіло для перехресної реакції з відомим гомологом або ортологом. 19 Антитіла за винаходом можуть бути також охарактеризовані за рівноважною константою ди-4 -6 -7 -8 -10 соціації (KD) 10 Μ, 10 Μ, 10 Μ або 10 Μ, 10 -11 12 Μ, 10 Μ або 10 Μ, або більш низькою. Такі афінності можуть бути легко визначені з використанням загальноприйнятих способів, наприклад, рівноважним діалізом; з використанням приладу ВІАcore 2000, з використанням загальних процедур, описаних виробником; радіоімуноаналізом з використанням радіоактивно міченого антигенумішені або іншим способом, відомим кваліфікованому у даній галузі фахівцеві. Дані з афінності можуть аналізуватися, наприклад, за способом Scatchard et al., Ann N. Υ. Acad. Sci, 51:660 (1949). Під "нейтралізуючим антитілом" мають на увазі молекулу антитіла, що здатна елімінувати або істотно зменшувати ефекторну функцію антигенумішені, з яким вона зв'язується. Таким чином, «нейтралізуюче» анти-мішень-антитіло здатне елімінувати або істотно зменшувати ефекторну функцію, наприклад, активність ферменту, зв'язування ліганду або внутрішньоклітинну передачу сигналів. Термін "антитіло" використовується в його найширшому змісті і включає повністю зібрані антитіла, моноклональні антитіла, поліклональні антитіл, мультиспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), фрагменти антитіл, які можуть містити антиген (наприклад, Fab', F'(ab)2, Fv, одноланцюжкові антитіла, димерні антитіла), антитіла з частинами антитіл сімейства верблюдячих і рекомбінантні пептиди, що містять всі попередні антитіла, доки вони проявляють бажану біологічну активність. Фрагменти антитіл можуть бути одержані способами рекомбінантних ДНК або ферментативним або хімічним розщепленням інтактних антитіл і описані додатково нижче. Необмежувальні приклади моноклональних антитіл включають мишачі, химерні, гуманізовані антитіла, антитіла людини та імуноглобуліни, сконструйованого для людини антитіла Human Engineered, химерні злиті білки, що мають послідовності, вироблені з імуноглобулінів, або їх мутеїни або похідні, кожні з яких описані додатково нижче. Розглядаються мультимери або агрегати інтактних молекул і/або фрагментів, у тому числі хімічно дериватизовані антитіла. Антитіла будь-якого класу або підкласу ізотипу розглядаються відповідно до даного винаходу. Термін «моноклональне антитіло» стосується у даному контексті антитіла, одержаного з популяції по суті гомогенних антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що містять цю популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть бути присутніми у мінорних кількостях. Моноклональні антитіла є високо специфічними, направленими проти єдиного антигенного сайту. Крім того, на противагу загальноприйнятим (поліклональним) антитілам, які звичайно включають різні антитіла, направлені проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло направлене проти єдиної детермінанти на цьому антигені. Крім їх специфічності, моноклональні антитіла є переважними у тому розумінні, що вони синтезуються гомогенною культурою, не забрудненою 97484 20 іншими імуноглобулінами з відмінними специфічностями і характеристиками. Визначення «моноклональне» вказує на характер цього антитіла, як одержаного по суті з гомогенної популяції антитіл, і не повинне розглядатися як таке, що потребує одержання цього антитіла яким-небудь конкретним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, які повинні використовуватися відповідно до даного винаходу, можуть бути одержані гібридомним способом, вперше описаним Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), або способами рекомбінантних ДHК (див., наприклад, патент США № 4816567). «Моноклональні антитіла» можуть бути рекомбінантними, химерними, гуманізованими, антитілами людини, сконструйованими для людини (Human Engineered) або, наприклад, фрагментами антитіл. "Виділене" антитіло є антитілом, яке було ідентифіковане і відділене, і витягнуте з компонента його природного оточення. Компонентами забруднення його природного оточення є речовини, які могли б заважати діагностичним і терапевтичним застосуванням для цього антитіла, і можуть включати ферменти, гормони та інші, білкові і небілкові розчинені речовини. У переважних варіантах здійснення це антитіло буде очищене (1) до більш ніж 95% розраховуючи на масу антитіла, як визначено за допомогою способу Лоурі, і найбільш переважно більш ніж 99% розраховуючи на масу, (2) до ступеня, достатнього для одержання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності з використанням секвенатора з обертовою чашею, або (3) до гомогенності відповідно до електрофорезу у ДСН-ПААГ при відновлювальних або невідновлювальних умовах з використанням Кумасі синього або барвника, що переважно містить срібло. Виділене антитіло включає антитіло in situ у рекомбінантних клітинах, як тільки не буде присутній щонайменше один компонент природного оточення антитіла. Однак, звичайно, виділене антитіло повинно виділятися з використанням щонайменше однієї стадії очищення. "Імуноглобулін" або "нативне антитіло" є тетрамерним глікопротеїном. У природному імуноглобуліні кожний тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, причому кожна пара має один «легкий» (приблизно 25 кДа) і один «важкий» ланцюг (приблизно 50-70 кДа). Амінокінцева частина кожного ланцюга включає «варіабельну» область приблизно 100-110 або більше амінокислот, первинно відповідальних за пізнавання антигену. Карбоксикінцева частина кожноголанцюга визначає константну область, первинно відповідальну за ефекторну функцію. Імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів в залежності від амінокислотної послідовності константної області їх важких ланцюгів. Важкі ланцюги класифікуються як мю (), дельта (), гамма (), альфа () і епсилон (), і визначають ізотип антитіла, такий як IgM, IgD, IgG, IgA i IgE, відповідно. Декілька з них можуть бути додатково розділені на підкласи або ізотипи, наприклад, lgG1, IgG2, IgG3, IgG4, lgA1 і IgA2. Різні ізотипи мають різні ефекторні функції; наприклад, ізотипи lgG1 і IgG3 мають 21 ADCC-активність. Легкі ланцюги людини класифікуються як легкі ланцюги каппа () і лямбда (). У легкому і важкому ланцюгах варіабельні і константні області з'єднані "J"-областю з приблизно 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг також включає в себе "D''-область з приблизно 10 або більше амінокислот. Див. у загальному вигляді nd Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2 ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Стосовно докладного опису структури і генерування антитіл див. роботу Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, 94:411-414 (1998), включену сюди повністю як посилання. Коротко, спосіб генерування ДНК, що кодує гени важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну, має місце спочатку у В-клітинах, що розвиваються. Перед реаранжуванням і з'єднанням різних генних сегментів імуноглобуліну, сегменти генів V, D, J і константні (С) генні сегменти виявляються у відносно тісній близькості на єдиній хромосомі. Під час диференціювання В-клітин один з кожного з придатних членів сімейства генних сегментів V, D, J (або тільки V і J у випадку генів легкого ланцюга) рекомбінується з утворенням функціонально реаранжованих генів важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну. Цей процес реаранжування генних сегментів є, очевидно, безперервним. Спочатку утворюються зчленування важкий ланцюг D-J, потім зчленування важкий ланцюг V-DJ і зчленування легкий ланцюг V-J. Поряд з реаранжуванням сегментів V, D і J, додаткове різноманіття генерується у первинному репертуарі важкого і легкого ланцюга імуноглобуліну за допомогою варіабельної рекомбінації у місцях розташування, де сегменти V і J з'єднуються у легкому ланцюзі, і де сегменти D і J з'єднуються у важкому ланцюзі. Така варіація у легкому ланцюзі звичайно відбувається в останньому кодоні генного сегмента V і першому кодоні сегмента J. Подібна неточність приєднання відбувається на хромосомі важкого ланцюга між сегментами D і JH і може простягатися на 10 нуклеотидів. Крім того, декілька нуклеотидів можуть бути інсертовані між генними сегментами D і JH і між VH і D, які не кодуються геномною ДНК. Додавання цих нуклеотидів відомо як різноманіття N-області. Сумарним ефектом таких реаранжувань у генних сегментах варіабельної області і варіабельної рекомбінації, що може відбуватися під час такого приєднання, є одержання репертуару первинних антитіл. "Фрагменти антитіл" містять частину інтактного повнорозмірного антитіла (у тому числі антитіл людини), переважно антигензв'язувальної області або варіабельної області інтактного антитіла і включають мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Необмежувальні приклади фрагментів антитіл включають Fab, Fab', F(ab')2, Fv, домен-антитіло (dAb), фрагменти області, що визначає комплементарність (CDR), одноланцюжкові антитіла (scFv), фрагменти одноланцюжкових антитіл, димерні антитіла, тримерні антитіла, тетрамерні антитіла, міні-антитіла, лінійні антитіла (Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995)); хелатоутворюючі рекомбінантні антитіла, тримерні антитіла або бі-антитіла, інтра-антитіла, нано-антитіла, малі модульні імунофармацевтичні 97484 22 речовини (SMIP), злитий білок антигензв'язувальний домен-імуноглобулін, «верблюдизоване» антитіло, VHH-вмісне антитіло, або їх мутеїни або похідні, і поліпептиди, які містять щонайменше частину імуноглобуліну, яка є достатньою для надання зв'язування специфічного антигену до цього поліпептиду, таку як CDR-послідовність, доки це антитіло зберігає бажану біологічну активність. Розщеплення антитіл папаїном дає два ідентичних антигензв'язувальних фрагменти, називаних «Fаb»-фрагментами, кожний з яких має єдиний сайт зв'язування антигену, і залишковий «Рс»фрагмент, назва якого відбиває його здатність легко кристалізуватися (35). Обробка пепсином дає фрагмент F(ab')2, що дає два «Fv»-фрагменти. «Fv»-фрагмент є мінімальним фрагментом антитіла, що містить повний сайт пізнавання і зв'язування антигену. Ця область складається з димеру одного варіабельного домену важкого ланцюга і одного варіабельного домену легкого ланцюга у щільній, нековалентній асоціації. У цій конфігурації три області CDR кожного варіабельного домену взаємодіють для визначення (створення) антигензв'язувального сайту на поверхні димеру VH VL. Разом ці шість областей CDR надають цьому антитілу антигензв'язувальну специфічність. Однак, навіть єдиний варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три області CDR, специфічні стосовно антигену) має здатність пізнаватися і зв'язувати антиген. "Одноланцюжкові Fv" або "sFv", або "scFv" фрагменти антитіл містять домени VH і VL антитіла, де ці домени присутні в єдиному поліпептидному ланцюзі. Переважно цей Fv-поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, що дозволяє цьому Fv утворювати бажану структуру для зв'язування антигену. Стосовно огляду sFv див. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 1 13, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269315(1994). Fab-фрагмент також містить константний домен легкого ланцюга і перший константний домен (СН1) важкого ланцюга. Fab-фрагменти відрізняються від Fab'-фрагментів додаванням декількох залишків на карбокси-кінці СН1-домену важкого ланцюга, у тому числі одного або декількох цистеїнів з шарнірної області антитіла. Fab'-SH є тут позначенням для Fab', в якому залишок (залишки) цистеїну константних доменів несе одну вільну тіолову групу. F(ab')2-фрагменти антитіл спочатку були одержані у вигляді пар Fab'-фрагментів, які мали цистеїни шарніру між ними. Термін «гіперваріабельна» область стосується амінокислотних залишків антитіла, які відповідальні за зв'язування антигену. Гіперваріабельна область містить амінокислотні залишки з «області, що визначає комплементарність», або CDR [тобто залишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) і 89-97 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 31-35 (Н1), 5065 (Н2) і 95-102 (H3) у варіабельному домені важкого ланцюга, як описано Kabat et al., Sequences of th Proteins of Immunological Interest, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] і/або ці залишки з гіперваріа 23 бельної петлі (тобто залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) і 91-96 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга і 26-32 (H1), 53-55 (Н2) і 96-101 (H3) у варіабельному домені важкого ланцюга, як описано [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]. "Каркасні" або FR-залишки є залишками варіабельних доменів, іншими, ніж залишки гіперваріабельної області. Фраза «константна область» стосується частини молекули антитіла, що надає ефекторну функцію. Фраза «химерне антитіло» стосується у даному контексті антитіла, що містить послідовність, вироблену з двох різних антитіл (див., наприклад, патент США № 4816567), що звичайно походить з різних видів. Найбільш часто химерні антитіла містять фрагменти антитіл людини і миші, звичайно константну область людини і варіабельну область миші. Термін «мутеїн» або «варіант» може використовуватися взаємозамінно і стосується поліпептидної послідовності антитіла, яка містить щонайменше одну амінокислотну заміну, делецію або інсерцію у варіабельній області або частині, еквівалентній варіабельній області, за умови, що цей мутеїн або варіант зберігає бажану афінність зв'язування або біологічну активність. Мутеїни можуть бути по суті гомологічні або по суті ідентичні вихідному антитілу. Термін «похідне» стосується, у контексті антитіл даного винаходу, антитіл, ковалентно модифікованих такими способами як убіквітинілювання, кон'югація з терапевтичними або діагностичними агентами, мічення (наприклад, радіонуклідами або різними ферментами), ковалентне приєднання полімеру, таке як пегілюваня (дериватизація поліетиленгліколем), та інсерція або заміна хімічним синтезом неприродних амінокислот. Похідні даного винаходу будуть зберігати зв'язувальні властивості недериватизованих молекул даного винаходу. У даному контексті термін «антитіло» специфічно включає в себе будь-який з наведених нижче компонентів, які зберігають здатність зв'язування позаклітинної частини PRLR: 1) амінокислотний мутеїн вихідного антитіла, що має амінокислотну послідовність, представлену на Фігурі 7А-7С або Фігурі 8, у тому числі мутеїн, що містить амінокислотну послідовність варіабельного важкого ланцюга, що є щонайменше на 60, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99% . гомологічною вихідній амінокислотній послідовності, і/або містить амінокислотну послідовність варіабельного легкого ланцюга, що є щонайменше на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99% гомологічною вихідній амінокислотній послідовності, з врахуванням подібних амінокислот для визначення гомології; 2) PRLR-зв'язувальні поліпептиди, що містять одну або декілька областей, що визначають комплементарність, (CDR) вихідного антитіла, що мають амінокислотну послідовність, представлену на Фігурі 7А-7С або Фігурі 8, що переважно містять щонайменше CDR3 важкого ланцюга і переважно містять дві або більше, або три або більше, або 97484 24 чотири або більше, або п'ять або більше, або всі шість областей CDR; 3) антитіла, сконструйовані для людини (Human Engineered), генеровані зміною вихідної послідовності відповідно до способів, описаних у Studnicka et al., патент США № 5766886 і у прикладі 5 тут, з використанням нумерації Кабата для ідентифікації залишків низького, помірного і високого ризику; такі антитіла містять щонайменше один з наведених нижче важких ланцюгів і щонайменше один з наведених нижче легких ланцюгів: (а) важкий ланцюг, в якому всі з залишків гризуна низького ризику, які відрізняються від відповідних залишків у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, модифікували, щоб вони були тими самими, що і залишки людини у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, або (b) важкий ланцюг, в якому всі з залишків гризуна низького і помірного ризику модифікували, якщо необхідно, щоб вони були тими самими залишками, що і залишки у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, (с) легкий ланцюг, в якому всі з залишків низького ризику модифікували, якщо необхідно, щоб вони були тими самими, що і залишки у посилальній послідовності імуноглобуліну людини, або (d) легкий ланцюг, в якому всі з залишків низького і помірного ризику модифікували, якщо необхідно, щоб вони були тими самими, що і залишки у посилальній послідовності імуноглобуліну людини. 4) мутеїни згаданих вище антитіл попереднього параграфу (3), що містять важкий ланцюг або легкий ланцюг, або варіабельні області важкого або легкого ланцюга, що мають щонайменше 60% ідентичність амінокислотній послідовності з вихідним легким ланцюгом гризуна, більш переважно щонайменше 80%, більш переважно щонайменше 85%, більш переважно щонайменше 90% і найбільш переважно щонайменше 95%, у тому числі, наприклад, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% і 100% ідентичність; 5) PRLR-зв'язувальні поліпептиди, що містять залишки високого ризику однієї або декількох областей CDR антитіла гризуна і переважно містять залишки високого ризику двох або більше, або трьох або більше, або чотирьох або більше, або п'яти або більше, або всіх шести областей CDR і необов'язково містять одну або декілька змін у залишках низького або помірного ризику; наприклад, що містять одну або декілька змін у залишку низького ризику і консервативні заміни у залишку помірного ризику, або наприклад, що зберігають амінокислотні залишки помірного і високого ризику і містять одну або декілька змін у залишку низького ризику, де зміни включають інсерції, делеції або заміни і можуть бути консервативними замінами або можуть змушувати сконструйоване антитіло бути більш близьким у послідовності до послідовності легкого ланцюга або важкого ланцюга людини, послідовності легкого ланцюга або важкого ланцюга зародкової лінії людини, консенсусної послідовності легкого ланцюга або важкого ланцюга людини або консенсусної послідовності легкого 25 ланцюга або важкого ланцюга зародкової лінії людини. Такі розглянуті зміни можуть бути також зображені у форматі послідовності наступним чином. У гіпотетичній послідовності AKKLVHTPYSFKEDF, де відповідний ризик, розподілений відносно кожного залишку відповідно до Studnicka et al., патент США № 5766886, є наступним: HMLHMLHMLHMLHML (Н=високий, М=середній, L=низький), зразкові зміни відносно залишків низького ризику цієї гіпотетичної послідовності можуть бути зображені як: AKXLVXTPXSFXEDX, де X означає будь-яку амінокислоту, або, альтернативно, де X означає консервативну заміну вихідного залишку у цьому положенні, а зразкові зміни відносно залишків низького і помірного ризику можуть бути зображені аналогічним чином, наприклад, AYXLYXTYXSYXEYX, де X означає будь-яку амінокислоту, a Y є консервативною заміною вихідного залишку у цьому положенні. Термін "конкуруюче антитіло" включає 1) не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна, що зв'язується з тим самим епітопом PRLR, що і антитіло chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4. XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або ХНА.06.907, наприклад, як визначено за допомогою рентгенівської кристалографії; або 2) не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна, що конкурує з антитілом chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.6421, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.2753, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або ХНА.06.907 на більш ніж 75%, більш ніж 80% або більш ніж 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% або 95%; альтернативно, не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна, що зменшує зв'язування chXHA.06.642, chXHA.06.275, he.06.642-1, he.06.642-2, he.06.275-1, he.06.275-2, he.06.275-3, he.06.275-4, XPA.06.128, XPA.06.129, XPA.06.130, XPA.06.131, XPA.06.141, XPA.06.147, XPA.06.148, XPA.06.158, XPA.06.159, XPA.06.163, XPA.06.167, XPA.06.171, XPA.06.178, XPA.06.181, XPA.06.192, XPA.06.202, XPA.06.203, XPA.06.206, XPA.06.207, XPA.06.210, XPA.06.212, XPA.06.217, XPA.06.219, XPA.06.229, XPA.06.233, XPA.06.235, XPA.06.239, XPA.06.145, XHA.06.567, XHA.06.642, XHA.06.983, XHA.06.275, XHA.06.189 або 97484 26 ХНА.06.907 щонайменше у 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 разів або більше. В одному варіанті здійснення це не мишаче моноклональне антитіло або моноклональне антитіло не гризуна знаходиться у 50-кратному молярному надлишку. Антитіла за винаходом переважно зв'язуються з ECD PRLR з рівноважною константою дисоціації -6 -7 -8 -9 -10 -11 -12 10 М, 110 М, 10 Μ, 10 Μ, 10 Μ, 10 М, 10 М або більш низькою і переважно інгібують внутрішньоклітинне фосфорилування PRLR і активацію передачі сигналу PRLR далі по ходу процесу, наприклад, за допомогою активації STAT5, МАРK або АKТ. Необов'язково будь-яке химерне антитіло, антитіло людини або гуманізоване антитіло, публічно розкрите до дати подачі цієї заявки або розкрите у заявці, поданій до дати подачі цієї заявки, виключене з обсягу даного винаходу. Моноклональним антитілом "не гризуна" є будь-яке антитіло, визначене у широкому змісті тут, що не є повним інтактним моноклональним антитілом гризуна, генерованим гібридомою гризуна. Таким чином, антитіла не гризуна конкретно включають, але не обмежуються ними, мутеїни антитіл гризуна, фрагменти антитіл гризуна, лінійні антитіла, химерні антитіла, гуманізовані антитіла, сконструйовані для людини антитіла Human Engineered і антитіла людини, у тому числі антитіла людини, одержані з трансгенних тварин або технологією фагового дисплею. Подібним чином, не мишачі антитіла включають, але не обмежуються ними, мутеїни мишачих антитіл, фрагменти мишачих антитіл, лінійні антитіла, химерні, гуманізовані, сконструйовані для людини (Human Engineered) і антитіла людини. Антиген-мішень Антигеном-мішенню для застосування для одержання антитіл може бути, наприклад, позаклітинна частина PRLR або фрагмент, що зберігає бажаний епітоп, необов'язково злиті з іншим поліпептидом, що дозволяє цьому епітопу бути представленим в його нативній конформації. Альтернативно, для генерування антитіл може бути використаний інтактний PRLR, що експресується на поверхні клітин. Такі клітини можуть бути трансформовані для експресії PRLR або можуть бути іншими природними клітинами, які експресують PRLR. Інші форми поліпептидів PRLR, застосовні для генерування антитіл, будуть очевидні кваліфікованим у даній галузі фахівцям. Поліклональні антитіла Поліклональні антитіла переважно індукуються у тварин множинними підшкірними (sc) або внутрішньочеревинними (ір) ін'єкціями відповідного антигену і ад'юванту. Поліпшена реакція у вигляді антитіл може бути одержана кон'югуванням відповідного антигену з білком, що є імуногенним у вигляді, що повинен бути імунізований, наприклад, гемоціаніном морського блюдця, сироватковим альбуміном, бичачим тироглобуліном або інгібітором трипсину сої, з використанням біфункціонального або дериватизуючого агента, наприклад, ефіру малеімідобензоїлсульфосукциніміду (кон'югацією через залишки цистеїну), Nгідроксисукциніміду (через залишки лізину), глута 27 рового альдегіду, бурштинового ангідриду або інших агентів, відомих у даній галузі. Тварин імунізують проти цього антигену, імуногенних кон'югатів або похідних об'єднанням, наприклад, 100 мкг або 5 мкг білка або кон'югату (для кроликів або мишей, відповідно) з 3 об'ємами повного ад'юванту Фрейнда та ін'єкцією цього розчину інтрадермально у множинних сайтах. Через один місяць цих тварин вдруге імунізують 1/5 {часток (1/10)} вихідної кількості пептиду або кон'югату у повному ад'юванті Фрейнда підшкірною ін'єкцією у множинних сайтах. На 7-14 дні після бустер-ін'єкції у тварин беруть кров і одержану сироватку аналізують на титр антитіл. Бустерін'єкції тварин повторюють, доки титр не вийде на плато. Переважно тварину реімунізують тим самим антигеном, але кон'югованим з відмінним білком, і/або з використанням відмінного зшивального реагенту. Кон'югати можуть бути також одержані у культурі рекомбінантних клітин у вигляді злитих білків. Для посилення імунної реакції зручно використовувати також агрегуючі агенти, такі як квасці. Моноклональні антитіла Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням гібридомного способу, вперше описаного Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), або можуть бути одержані способами рекомбінантних ДНК. У гібридомному способі мишу або іншу придатну тварину-хазяїна, таку як хом'ячок або мавпа (макака), імунізують, як описано тут, для індукції лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які будуть специфічно зв'язуватися з білком, використовуваним для імунізації. Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовані in vitro. Потім лімфоцити зливають з мієломними клітинами з використанням придатного агента злиття, такого як поліетиленгліколь, для утворення гібридомної клітини (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)), або вони можуть бути злиті з використанням злиття із застосуванням електроелементу. Гібридомні клітини, одержані таким чином, висівають і вирощують у придатному культуральному середовищі, що переважно містить одну або декілька речовин, які інгібують ріст або виживаність незлитих, вихідних мієломних клітин. Наприклад, якщо вихідні мієломні клітини позбавлені ферменту гіпоксантингуанінфосфорибозилтрансферази (HGPRT або HPRT), це культуральне середовище для гібридом буде звичайно включати гіпоксантин, аміноптерин і тимідин (HATсередовище), які запобігають росту HGPRTнедостатніх клітин. Переважними мієломними клітинами є клітини, які ефективно зливаються, підтримують стабільне продукування високого рівня антитіла відібраними антитіло-продукуючими клітинами і є чутливими до середовища. Лінії клітин мієломи людини і гетеромієломи миша-людина також були описані для одержання моноклональних антитіл людини (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Зразкові лінії мишачої мієломи вклю 97484 28 чають в себе лінії, одержані з пухлин мишей МОР21 і М.С.-11, доступні з Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. USA, і клітини SP-2 або X63-Ag8-653, доступні з Американської Колекції Типових Культур (American Type Culture Collection, Rockville, Md. USA). Культуральне середовище, в якому вирощують гібридомні клітини, аналізують на продукування моноклональних антитіл, направлених проти цього антигену. Переважно, специфічність зв'язування моноклональних антитіл, продукованих гібридомними клітинами, визначають імунопреципітацією або за допомогою аналізу зв'язування in vitro, такого як радіоімуноаналіз (RIA) або твердофазовий імуноферментний аналіз (ELISA). Афінність зв'язування моноклонального антитіла може бути визначена, наприклад, аналізом Скетчарда (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)). Після ідентифікації гібридомних клітин, які продукують антитіла бажаної специфічності, афінності і/або активності, ці клони можуть бути субклоновані процедурами лімітуючого розведення і вирощені стандартними способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Придатні культуральні середовища для цієї мети включають в себе, наприклад, середовище D-MEM або середовище RPMI-1640. Крім того, гібридомні клітини можуть бути вирощені in vivo у вигляді асцитних пухлин у тварині. Моноклональні антитіла, що секретуються цими субклонами, переважно відділяють від культурального середовища, асцитної рідини або сироватки загальноприйнятими процедурами очищення імуноглобулінів, такими як, наприклад, білок А-сефарозна, гідроксіапатитна хроматографія, гель-електрофорез, діаліз або афінна хроматографія. ДНК, що кодує моноклональні антитіла, може бути виділена і секвенована з гібридомних клітин з використанням загальноприйнятих процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні зв'язуватися специфічно з генами, що кодують важкий і легкий ланцюги цих моноклональних антитіл). Визначення послідовності буде звичайно потребувати виділення щонайменше частини гена, що представляє інтерес, або кДНК, що представляє інтерес. Звичайно це потребує клонування ДНК або, переважно, мРНК (тобто кДНК), що кодує ці моноклональні антитіла. Клонування проводять з використанням стандартних способів (див., наприклад, керівництво Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, що включене сюди як посилання). Наприклад, бібліотека кДНК може бути сконструйована зворотною транскрипцією поліА+ мРНК, переважно мембраноасоційованою мРНК, і ця бібліотека може бути піддана скринінгу з використанням зондів, специфічних для послідовностей генів поліпептидів імуноглобуліну людини. Однак, у переважному варіанті здійснення використовують полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) для ампліфікації кДНК (або частин повнорозмірних кДНК), що кодує генний сегмент імуноглобуліну, що представляє інтерес (наприклад, варіабельний сегмент легкого ланцюга). Ці 29 ампліфіковані послідовності можуть бути легко клоновані у придатний вектор, наприклад, в експресуючі вектори, мінігенні вектори або вектори фагового дисплею. Буде зрозуміло, що конкретний спосіб клонування не є вирішальним, доки можна визначати послідовність деякої частини поліпептиду імуноглобуліну, що представляє інтерес. У даному контексті «виділена» молекула нуклеїнової кислоти або «виділена» послідовність нуклеїнової кислоти є молекулою нуклеїнової кислоти, яка або (1) ідентифікована і відділена щонайменше від однієї забруднюючої молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно асоційована у природному джерелі цієї нуклеїнової кислоти, або (2) клонована, ампліфікована, мічена або іншим чином відрізнена від нуклеїнових кислот фону, так що ця послідовність нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, може бути визначена, і вважається виділеною. Виділена молекула нуклеїнової кислоти є іншою, ніж ця молекула у формі або оточенні, в яких вона виявляється у природі. Таким чином, виділені молекули нуклеїнових кислот відрізняються від молекули нуклеїнової кислоти у тому вигляді, в якому вона існує у природних клітинах. Однак, виділена молекула нуклеїнової кислоти включає в себе молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься у клітинах, які звичайно експресують це антитіло, де, наприклад, ця молекула нуклеїнової кислоти знаходиться у місці розташування хромосоми, яке відрізняється від місця розташування природних клітин. Одним джерелом РНК, використовуваним для клонування і секвенування, є гібридома, вироблена одержанням В-клітини з трансгенної миші і злиттям цієї В-клітини з іморталізованою клітиною. Перевага використання гібридом полягає у тому, що вони можуть бути легко піддані скринінгу, і відбирають гібридому, що продукує моноклональне антитіло людини, що представляє інтерес. Альтернативно, РНК може бути виділена з В-клітин (або цілої селезінки) імунізованої тварини. При використанні джерел, інших, ніж гібридоми, може бути бажаним скринінг на послідовності, що кодують імуноглобуліни або поліпептиди імуноглобулінів зі специфічними характеристиками зв'язування. Одним способом для такого скринінгу є застосування технології фагового дисплею. Фаговий дисплей описаний, наприклад, у роботах Dower et al., WO 91/17271, McCafferty et al., WO 92/01047 і Caton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:64506454 (1990), кожна з яких включена сюди як посилання. В одному варіанті здійснення з використанням технології фагового дисплею, кДНК з імунізованої трансгенної миші (наприклад, загальну кДНК селезінки) виділяють, використовують полімеразну ланцюгову реакцію для ампліфікації послідовностей кДНК, які кодують частину поліпептиду імуноглобуліну, наприклад, області CDR, і ампліфіковані послідовності інсертують у фаговий вектор. кДНК, що кодують пептиди, що представляють інтерес, наприклад, пептиди варіабельних областей, з бажаними характеристиками зв'язування, ідентифікують стандартними способами, такими як пенінг. Потім визначають послідовність цієї ампліфікованої або клонованої нуклеїнової кислоти. Зви 97484 30 чайно визначають послідовність, що кодує повну варіабельну область поліпептиду імуноглобуліну, однак, іноді буде достатнім секвенування тільки частини варіабельної області, наприклад, CDRкодуючої частини. Звичайно частина, що секвенується, буде мати довжину 30 основ, більш часто будуть секвенуватися основи, які кодують щонайменше приблизно одну третину або щонайменше приблизно половину довжини варіабельної області. Секвенування може проводитися на клонах, виділених з бібліотеки кДНК або, при використанні ПЛР, після субклонування ампліфікованої послідовності або прямим ПЛР-секвенуванням ампліфікованого сегменту. Секвенування проводять з використанням стандартних способів (див., наприклад, керівництво Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press і Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, які включені сюди як посилання). За допомогою порівняння послідовності клонованої нуклеїнової кислоти з опублікованими послідовностями генів і кДНК імуноглобулінів людини, кваліфікований у даній галузі фахівець буде здатний легко визначити, в залежності від секвенованої області, (і) використання сегмента зародкової лінії гібридомного поліпептиду імуноглобуліну (у тому числі ізотипу важкого ланцюга) і (іі) послідовність варіабельних областей важкого і легкого ланцюга, у тому числі послідовностей, що походять з додавання N-області і процесу соматичної мутації. Одним джерелом інформації послідовностей генів імуноглобулінів є National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. Фрагменти антитіл Як зазначалося вище, фрагменти антитіл містять частину інтактного повнорозмірного антитіла, переважно антигензв'язувальну або варіабельну область інтактного антитіла, і включають лінійні антитіла і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Необмежувальні приклади фрагментів антитіл включають в себе Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, домен-антитіло (dAb), фрагменти області, що визначає комплементарність (CDR), одноланцюжкові антитіла (scFv), фрагменти одноланцюжкових антитіл, димерні антитіла, тримерні антитіла, тетрамерні антитіла, міні-антитіла, лінійні антитіла, хелатоутворюючі рекомбінантні антитіла, тримерні антитіла або бі-антитіла, інтра-антитіла, нано-антитіла, малі модульні імунофармацевтичні речовини (SMIP), злитий білок антигензв'язувальний домен-імуноглобулін, верблюдизоване антитіло, VHH-вмісне антитіло, або їх мутеїни або похідні, і поліпептиди, які містять щонайменше частину імуноглобуліну, яка є достатньою для надання зв'язування специфічного антигену цьому поліпептиду, таку як CDR-послідовність, доки це антитіло зберігає бажану біологічну активність. Такі фрагменти антитіл можуть бути одержані модифікацією цілих антитіл або синтезовані de novo з використанням технологій рекомбінантних ДНК або пептидного синтезу. Термін "димерні антитіла" стосується малих фрагментів антитіл з сайтами, що зв'язують два 31 антигени, причому ці фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному і тому ж поліпептидному ланцюгу (VH VL). За допомогою застосування лінкера, що є занадто коротким, щоб дозволити спарювання між цими двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, домени змушують спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і створювати сайти, що зв'язують два антигени. Димерні антитіла описані більш повно, наприклад, в ЕР 404097; WO 93/11161 і 30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). "Одноланцюжкові Fv" або "scFv" фрагменти антитіл містять домени VH і VL антитіла, де ці домени присутні в єдиному поліпептидному ланцюгу і необов'язково містять поліпептидний лінкер між доменами VH і VL, що дозволяє Fv утворювати бажану структуру для зв'язування антигену (Bird et al., Science 242:423-426, 1988, і Huston et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883, 1988). Fdфрагмент складається з доменів VH і СH1. Додатковий фрагмент антитіла включає фрагмент домену антитіла (dAb) (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), що складається з домену VH. "Лінійні антитіла" містять пару тандемних Fdсегментів (VH-CH1-VH-CH1), які утворюють пару антигензв'язувальних областей. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними (Zapata et al. Protein Eng. 8:1057-62 (1995)). "Міні-антитіло", що складається з scFv, злитого з СH3 через пептидний лінкер (без шарніра) або через шарнір IgG, було описане в Olafsen, et al., Protein Eng Des Sel. 2004 Apr; 17(4):315-23. Функціональні антитіла важкого ланцюга, позбавлені легких ланцюгів, зустрічаються у природі у вусатих акулах-няньках (Greenberg et al., Nature 374:168-73, 1995), килимових акулах (воббегонгах) (Nuttal et al., Mol Immunol. 38:313-26, 2001), Camelidae (Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8, 1993; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998), таких як верблюди, дромедари, альпаки і лами. Антигензв'язувальний сайт у цих тваринах зменшений до єдиного домену, домену VHH. Ці антитіла утворюють антигензв'язувальні області з використанням тільки варіабельної області важкого ланцюга, тобто ці функціональні антитіла є гомодимерами тільки важких ланцюгів, що мають структуру H2L2 (називаними "антитілами важких ланцюгів" або "НСАb"). Повідомлялося, що верблюдизований VHH рекомбінується з константними областями IgG2 і IgG3, які містять шарнірну область, домени СН2 і СH3 і позбавлені домену СН1 (Hamers-Casterman et al., вище). Наприклад, lgG1 лами є загальноприйнятим ізотипом антитіла (H2L2), в якому VH рекомбінується з константною областю, що містить шарнірну область, домени СH1, СН2 і СH3, тоді як IgG2 і IgG3 лами є ізотипами тільки важкого ланцюга, які позбавлені доменів СH1 і які не містять легких ланцюгів. Класичні тільки-VH-фрагменти важко одержати у розчинній формі, але поліпшення розчинності і специфічного зв'язування можуть бути одержані при зміні залишків каркасу таким чином, що вони є більш VНН-подібними. (Див., наприклад, Reichman, 97484 32 et al., J Immunol Methods 1999, 231:25-38). Було виявлено, що верблюдизовані домени VHH зв'язуються з антигеном з високою афінністю (Desmyter et al., J. Biol. Chem. 276:26285-90, 2001) і мають високу стабільність у розчині (Ewert et al., Biochemistry 41:3628-36, 2002). Способи генерування антитіл, що мають верблюдизовані важкі ланцюги, описані, наприклад, у Публікаціях патентів США з номерами 20050136049 і 20050037421. Оскільки варіабельний домен антитіл важких ланцюгів є найменшим повністю функціональним антигензв'язувальним фрагментом з молекулярною масою тільки 15 кДа, цю молекулу називають нано-антитілом (Cortez-Retamozo et al., Cancer Research 64:2853-57, 2004). Бібліотека наноантитіл може бути генерована з імунізованого дромедара, як описано у Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother 45:2807-12, 2001, або з використанням рекомбінантних способів. Інтра-антитіла є одноланцюжковими антитілами, які демонструють внутрішньоклітинну експресію і можуть впливати на внутрішньоклітинну функцію білків (Віосса, et al., EMBO J. 9:101-108, 1990; Colby et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101:17616-21, 2004). Інтра-антитіла, які містять сигнальні послідовності клітини, що зберігають конструкцію антитіла у внутрішньоклітинних областях, можуть бути одержані, як описано у Mhashilkar et al., (EMBO J. 14:1542-51, 1995) і Wheeler et al., (FASEB J. 17:1733-5, 2003). Транс-антитіла є антитілами, що проникають у клітину, в яких домени трансдукції білка (PTD) злиті з одноланцюжковим варіабельним фрагментом (scFv) (Heng et al., Med Hypotheses, 64:1105-8, 2005). Далі розглядаються антитіла, які є SMIP або злитими білками домену зв'язування імуноглобуліну, специфічними стосовно білка-мішені. Ці конструкції є одноланцюжковими поліпептидами, що містять антигензв'язувальні домени, злиті з доменами імуноглобуліну, необхідними для здійснення ефекторних функцій антитіл. Див., наприклад, WO 03/041600, публікації патентів США 20030133939 і 20030118592. Мультивалентні антитіла У деяких варіантах здійснення може бути бажаним генерування мультивалентного або навіть мультиспецифічного (наприклад, біспецифічного, триспецифічного і т.д.) моноклонального антитіла. Таке антитіло може мати специфічності зв'язування стосовно щонайменше двох різних епітопів антигену-мішені, або воно може зв'язуватися з двома різними молекулами, наприклад, з антигеноммішенню і з білком або рецептором поверхні клітини. Наприклад, біспецифічне антитіло може включати в себе плече, що зв'язується з мішенню, та інше плече, що зв'язується з молекулою, що запускає, на лейкоциті, наприклад, молекулою Тклітинного рецептора (наприклад, CD2 або CD3), або Fc-рецепторами для IgG (FcR), наприклад, FcRI (CD64), FcRII (CD32) і FcRIII (CD 16), таким чином, щоб сфокусувати механізми клітинного захисту на клітині, що експресу є мішень. Як інший приклад, біспецифічні антитіла можуть бути використані для локалізації цитотоксичних агентів у клітини, які експресують антиген-мішень. Ці анти 33 тіла мають плече зв'язування мішені і плече, що зв'язує цитотоксичний агент (наприклад, сапорин, анти-інтерферон-60, алкалоїд Vinca, ланцюг А рицину, метотрексат або гаптен з радіоактивним ізотопом). Мультиспецифічні антитіла можуть бути одержані у вигляді повнорозмірних антитіл або фрагментів антитіл. Біспецифічні антитіла включають зшиті або "гетерокон'югатні" антитіла. Наприклад, одне з антитіл у цьому гетер окон'югаті може бути зв'язане з авідином, а інше - з біотином. Гетер окон'югатні антитіла можуть бути одержані з використанням будь-яких способів зшивання. Придатні зшивальні агенти добре відомі у даній галузі і описані у патенті США № 4676980, разом з рядом способів зшивання. Відповідно до іншого підходу для одержання біспецифічних антитіл, межа поділу між парою молекул антитіл може бути сконструйована для максимізації відсотка гетеродимерів, які витягуються з культури рекомбінантних клітин. Переважна межа поділу містить щонайменше частину домену СН3 константного домену антитіла. У цьому способі малі бічні ланцюги однієї або декількох амінокислот з межі поділу молекули першого антитіла замінені більшими бічними ланцюгами (наприклад, тирозину або триптофану). Компенсуючі «западини» ідентичного або подібного розміру стосовно більшого бічного ланцюга (більших бічних ланцюгів) створюються на поверхні поділу молекули другого антитіла заміною більших бічних ланцюгів амінокислот меншими бічними ланцюгами (наприклад, аланіну або треоніну). Це забезпечує механізм для збільшення виходу цього гетеродимеру у порівнянні з іншими небажаними кінцевими продуктами, такими як гомодимери. Див. WO 96/27011, опублікований 6 вересня 1996 року. Способи генерування біспецифічних антитіл з фрагментів антитіл також були описані у літературі. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути одержані з використанням хімічного зв'язку. Brennan et al., Science 229:81 (1985) описують процедуру, в якій інтактні антитіла протеолітично розщеплюють для генерування фрагментів F(ab')2. Ці фрагменти відновлюють у присутності дитіолкомплексуючого агента арсеніту натрію для стабілізації віцинальних дитіолів і запобігання утворенню міжмолекулярних дисульфідних зв'язків. Потім генеровані фрагменти Fab' перетворюють у похідні тіонітробензоату (TNB). Потім одне з похідних Fab'-TNB перетворюють назад у Fab'-тіол відновленням меркаптоетиламіном і змішують з еквімолярною кількістю іншого похідного Fab'-TNB з утворенням біспецифічного антитіла. Одержані біспецифічні антитіла можуть бути використані як агенти для селективної іммобілізації ферментів. Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) описують секрецію функціональних фрагментів антитіл з бактерій (див., наприклад, Better et al., Skerra et al. Science 240:1038-1041 (1988)). Наприклад, Fab'SH-фрагменти можуть бути безпосередньо одержані з Е. coli і хімічно зв'язані з утворенням біспецифічних антитіл (Carter et al., Bio/Technology 97484 34 10:163-167 (1992); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)). Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) описують одержання молекули повністю гуманізованого біспецифічного антитіла F(ab')2. Кожний фрагмент Fab' секретувався окремо з Е. coli і піддавався направленому хімічному зв'язуванню in vitro для утворення біспецифічного антитіла. Утворене таким чином біспецифічне антитіло було здатне зв'язуватися з клітинами, які надекспресують рецептор HER2, і нормальними Т-клітинами людини, а також запускати літичну активність цитотоксичних лімфоцитів людини проти пухлин-мішеней молочної залози людини. Були також описані різні способи одержання і виділення фрагментів біспецифічних антитіл безпосередньо з культури рекомбінантних клітин. Наприклад, біспецифічні антитіла одержували з використанням лейцинових блискавок, наприклад, GCN4. (Див. у цілому Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547-1553 (1992)). Пептиди лейцинової блискавки з білків Fos і Jim зв'язували з Fab'частинами двох різних антитіл злиттям генів. Ці гомодимери антитіл відновлювали у шарнірній області для утворення мономерів і потім повторно окиснювали для утворення гетеродимерів антитіл. Цей спосіб може бути також використаний для одержання гомодимерів антитіл. Термін "димерні антитіла" стосується малих фрагментів антитіл з двома антигензв'язувальними сайтами, причому ці фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) в одному і тому ж поліпептидному ланцюгу (VH VL). З використанням лінкера, що є занадто коротким, щоб було можливим спарювання між цими двома доменами на одному і тому ж ланцюгу, змушують ці домени спарюватися з комплементарними доменами іншого ланцюга і утворювати два антигензв'язувальних сайти. Див. наприклад, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, (1993). Повідомлялася також інша стратегія одержання фрагментів біспецифічних антитіл з використанням одноланцюжкових димерів Fv (sFv). Див. Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994). Альтернативно, біспецифічне антитіло може бути «лінійним антитілом», одержуваним, як описано у Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995). Коротко, ці антитіла містять пари тандемних сегментів Fd (VH-CH1-VH-CH1), які утворюють пари антигензв'язувальних областей. Лінійні антитіла можуть бути біспецифічними або моноспецифічними. Антитіла з більш ніж двома валентностями також обговорюються. Наприклад, можуть бути одержані триспецифічні антитіла (Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)). «Хелатоутворююче рекомбінантне антитіло» є біспецифічним антитілом, що пізнає сусідні і такі, що не перекриваються, епітопи антигену-мішені і є досить гнучким для зв'язування обох епітопів одночасно (Neri et al., J Mol Biol. 246:367-73, 1995). Одержання біспецифічного Fab-scFv ("біантитіла") і триспецифічного Fab-(scFv)(2) ("триантитіла") описане у Schoonjans et al. (J Immunol. 35 165:7050-57, 2000) і Willems et al. (J. Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Для бі-антитіл або три-антитіл молекулу scFv зливають з одним або обома ланцюгами VL-CL (L) і VH-CH1 (Fd); наприклад, для одержання триантитіла два scFv зливають з С-кінцем Fab, тоді як у бі-антитілі один scFv зливають з С-кінцем Fab. Рекомбінантне одержання антитіл Антитіла можуть бути одержані методологією рекомбінантних ДНК з використанням однієї з систем експресії антитіл, добре відомих у даній галузі (див., наприклад, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). ДНК, що кодує антитіла за винаходом, може бути вміщена в експресуючі вектори, які потім трансфікують у клітини-хазяїни, такі як клітини Е. coli, клітини COS мавпи, клітини 293 ембріональної нирки людини (наприклад, клітини 293Е), клітини Китайського хом'ячка (СНО) або мієломні клітини, які в іншому випадку не продукують білок імуноглобуліну, для одержання синтезу моноклональних антитіл у рекомбінантних клітинах-хазяїнах. Рекомбінантне одержання антитіл добре відоме у даній галузі. Фрагменти антитіл виробляють протеолітичним розщепленням інтактних антитіл (див., наприклад, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) і Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Однак, ці фрагменти можуть тепер продукуватися безпосередньо рекомбінантними клітинами-хазяїнами. Інші способи одержання фрагментів антитіл, у тому числі пептидний синтез і ковалентне зв'язування, будуть очевидними кваліфікованому практику. Регуляторними послідовностями експресії називають послідовності ДНК, необхідні для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності у конкретному організмі-хазяїні. Наприклад, регуляторні послідовності, які є придатними для прокаріотів, включають в себе промотор, необов'язково операторну послідовність і сайт зв'язування рибосом. Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, сигнали поліаденілювання і енхансери. Нуклеїнова кислота є функціонально зв'язаною, коли вона вміщена у функціональний взаємозв'язок з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК для передпослідовності або секреторного лідера функціонально зв'язана з ДНК для поліпептиду, якщо він експресується у вигляді пребілка, що бере участь у секреції цього поліпептиду; промотор або енхансер є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він впливає на транскрипцію цієї послідовності; або сайт зв'язування рибосом є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він розташований таким чином, що транскрипція посилюється. Звичайно термін «функціонально зв'язані» означає, що ДНК-послідовності, являючись зв'язаними, є суміжними і, у випадку секреторного лідера, суміжними і такими, що знаходяться у рамці зчитування. Однак, енхансери не повинні бути обов'язково суміжними. Зв'язування виконується лігуванням у зручних сайтах рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, використовують синтетичні 97484 36 олігонуклеотидні адаптори або лінкери відповідно до загальноприйнятої практики. Терміни клітина, клітинна лінія і культура клітин часто використовуються взаємозамінно, і всі такі назви тут включають в себе і потомство. Трансформанти і трансформовані клітини включають в себе первинну розглянуту клітину і культури, вироблені з неї, без врахування кількості переносів. Повинно бути також зрозуміло, що все потомство може не бути точно ідентичним за змістом ДНК внаслідок навмисних або ненавмисних мутацій. У винахід включене мутантне потомство, що має ту ж саму функцію або біологічну активність, на яку проводиться скринінг у спочатку трансформованій клітині. Якщо маються на увазі особливі значення, це буде зрозуміло з контексту. В альтернативному варіанті здійснення амінокислотна послідовність імуноглобуліну, що представляє інтерес, може бути визначена прямим секвенуванням білка. Придатні нуклеотидні послідовності можуть бути сконструйовані відповідно до таблиці універсальних кодонів. Мутеїни амінокислотної послідовності бажаного антитіла можуть бути одержані введенням придатних нуклеотидних змін у кодуючу ДНК або пептидним синтезом. Такі мутеїни включають в себе, наприклад, делеції і/або інсерції, і/або заміни залишків в амінокислотних послідовностях цих антитіл. Будь-яка комбінація делеції, інсерції або заміни здійснюється для одержання кінцевої конструкції, за умови, що ця кінцева конструкція має бажані характеристики. Амінокислотні зміни можуть також змінювати посттрансляційні процеси моноклонального антитіла, антитіла людини, гуманізованого антитіла, сконструйованого для людини антитіла Human Engineered або антитіламутеїну, наприклад, зміною кількості або положення сайтів глікозилювання. Молекули нуклеїнових кислот, що кодують мутеїни амінокислотної послідовності антитіла, одержують різними способами, відомими у даній галузі. Ці способи включають, але не обмежуються ними, виділення з природного джерела (у випадку природних мутеїнів амінокислотної послідовності) або одержання олігонуклеотид-опосередкованим (або сайт-направленим) мутагенезом, ПЛРмутагенезом і касетним мутагенезом одержаного раніше мутеїну або версії цього антитіла, що не є мутеїном. Даний винахід забезпечує також виділену нуклеїнову кислоту, що кодує антитіла за винаходом, необов'язково функціонально зв'язану з регуляторними послідовностями, пізнаваними клітиноюхазяїном, вектори і клітини-хазяїни, що містять ці нуклеїнові кислоти, і рекомбінантні способи для одержання цих антитіл, які можуть передбачати культивування клітини-хазяїна таким чином, що ця нуклеїнова кислота експресується і, необов'язково, витягування цього антитіла з культури клітинихазяїна або культурального середовища. Для рекомбінантного одержання антитіла нуклеїнову кислоту, що кодує його, виділяють та інсертують у вектор, що реплікується, для додаткового клонування (ампліфікації цієї ДНК) або для експресії. ДНК, що кодує моноклональне антитіло, 37 легко виділяють і секвенують з використанням загальноприйнятих процедур (наприклад, з використанням олігонуклеотидних зондів, які здатні зв'язуватися специфічно з генами, що кодують важкий і легкий ланцюги цього антитіла). Доступно багато векторів. Компоненти векторів звичайно включають в себе, але не обмежуються ними, один або декілька з наступних компонентів: сигнальну послідовність, сайт ініціації реплікації, один або декілька маркерних генів, енхансерний елемент, промотор і послідовність термінації транскрипції. (1) Компонент сигнальної послідовності Антитіло за винаходом може бути одержане рекомбінантно не тільки безпосередньо, але також у вигляді злитого поліпептиду з гетерологічним поліпептидом, який переважно є сигнальною послідовністю або іншим поліпептидом, що має сайт специфічного розщеплення, на N-кінці зрілого білка або поліпептиду. Вибрана сигнальна послідовність переважно є послідовністю, що упізнається і процесується (тобто відщеплюється сигнальною пептидазою) клітиною-хазяїном. Якщо прокаріотична клітина-хазяїн не упізнає і не процесує сигнальну послідовність нативного антитіла, ця сигнальна послідовність може бути замінена сигнальною послідовністю, вибраною, наприклад, з групи, що складається з лідерів пектатліази (наприклад, реlВ), лужної фосфатази, пеніцилінази, Ірр, або лідерами термостабільного ентеротоксину II. Для секреції дріжджів нативна сигнальна послідовність може бути замінена, наприклад, лідером дріжджової інвертази, лідером -фактора (у тому числі лідерами -фактора Saccharomyces і Kluyveromyces) або лідером кислої фосфатази, лідером глюкоамілази С. albicans або сигналом, описаним у WO90/13646. В експресії клітин ссавців доступними є сигнальні послідовності ссавців, а також лідери вірусної секреції, наприклад, сигнал gD вірусу простого герпесу. ДНК для такої області-попередника лігують у рамці зчитування з ДНК, що кодує це антитіло. (2) Компонент сайту ініціації реплікації Як експресуючі, так і клонуючі вектори містять послідовність нуклеїнової кислоти, яка дозволяє вектору реплікуватися в одній або декількох клітинах-хазяїнах. Звичайно у клонуючих векторах цією послідовністю є послідовність, що дозволяє вектору реплікуватися незалежно від хромосомної ДНК хазяїна і включає в себе сайти ініціації реплікації або послідовності, що автономно реплікуються. Такі послідовності добре відомі для різних бактерій, дріжджів і вірусів. Сайт ініціації реплікації з плазміди pBR322 є придатним для більшості грамнегативних бактерій, сайт ініціації реплікації плазміди 2 є придатним для дріжджів, і різні вірусні сайти ініціації реплікації застосовні для клонуючих векторів у клітинах ссавців. Звичайно компонент сайту ініціації реплікації не потрібен для експресуючих векторів ссавців (звичайно може використовуватися сайт ініціації реплікації SV40, тільки тому, що він містить ранній промотор). (3) Компонент селективного маркера Експресуючі і клонуючі вектори можуть містити селективний ген, також називаний маркером, що 97484 38 селектується. Типові селективні гени кодують білки, які (а) надають стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, неоміцину, метотрексату, тетрацикліну, G418, генетицину, гістидинолу або мікофенолової кислоти, (b) заповнюють ауксотрофні недостатності або (с) доставляють критичні нутриєнти, недоступні з комплексного середовища, наприклад, ген, що кодує Dаланінрацемазу, для бацил. Один приклад схеми відбору використовує лікарський засіб для зупинки росту клітини-хазяїна. Клітини, які успішно трансформуються гетерологічним геном, продукують білок, що надає стійкість до лікарського засобу, і, отже, виживають у схемі відбору. Приклади такого домінантного відбору використовують лікарські засоби метотрексат, неоміцин, гістидинол, пуроміцин, мікофенолову кислоту і гігроміцин. Іншим прикладом придатних маркерів, що селектуються, для клітин ссавців є маркери, які роблять можливою ідентифікацію клітин, компетентних стосовно поглинання нуклеїнової кислоти, що кодує антитіло, такі як DHFR, тимідинкіназа, металотіонеїн-І і -II, переважно гени металотіонеїну приматів, аденозиндеамінази, орнітиндекарбоксилази і т.д. Наприклад, клітини, трансформовані геном відбору DHFR, спочатку ідентифікують культивуванням всіх цих трансформантів у культуральному середовищі, що містить метотрексат (Mtx), конкурентний антагоніст DHFR. Придатною клітиноюхазяїном, при використанні DHFR дикого типу, є лінія клітин яєчника Китайського хом'ячка (СНО), дефектна за активністю DHFR. Альтернативно, клітини-хазяїни (зокрема, хазяїни дикого типу, які містять ендогенну DHFR), трансформовані або котрансформовані ДНКпослідовностями, що кодують антитіло за винаходом, білок DHFR дикого типу та інший маркер, що селектується, такий як аміноглікозид-3'фосфотрансфераза (ΑΡΗ), можуть бути відібрані за ростом клітин у середовищі, що містить агент селекції для відбору, що селектується, такий як аміноглікозидний антибіотик, наприклад, канаміцин, неоміцин або G418. Див. патент США № 4965199. Придатним селективним геном для застосування у дріжджах є ген trp1, присутній у дріжджовій плазміді YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Ген trp1 забезпечує маркер, що селектується, для мутантного штаму дріжджів, позбавленого здатності рости у триптофані, наприклад, АТСС No. 44076 або РЕР4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Присутність ушкодження trp1 у геномі дріжджової клітини-хазяїна забезпечує потім ефективне середовище для детектування трансформації за ростом за відсутності триптофану. Подібним чином Leu2-дефіцитні штами дріжджів (АТСС 20622 або 38626) доповнюють відомими плазмідами, що несуть ген Leu2. Ura3-недостатні штами дріжджів доповнюють плазмідами, що несуть ген Ura3. Крім того, вектори, вироблені з кільцевої плазміди 1,6 мкм pKD1, можуть бути використані для трансформації дріжджів Kluyveromyces. Альтерна 39 тивно, для K. lactis повідомлялася експресійна система для великомасштабного одержання рекомбінантного хімозину теляти. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Описані також стабільні мультикопійні експресуючі вектори для секреції зрілого рекомбінантного сироваткового альбуміну людини промисловими штамами Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968975 (1991). (4) Компонент промотору Експресуючі і клонуючі вектори звичайно містять промотор, що упізнається організмомхазяїном і функціонально зв'язаний з нуклеїновою кислотою, що кодує антитіло. Промотори, придатні для використання з прокаріотичними хазяїнами, включають промотор арабінози (наприклад, аrаВ), промотор phoA, промоторні системи -лактамази і лактози, лужної фосфатази, промоторну систему триптофану (tip) і гібридні промотори, такі як промотор tac. Однак, придатними є й інші відомі бактеріальні промотори. Промотори для використання у бактеріальних системах будуть також містити послідовність Шайна-Далгарно (S.D.), функціонально зв'язану з ДНК, що кодує антитіло за даним винаходом. Промоторні послідовності відомі і для еукаріот. Фактично всі еукаріотичні гени мають АТ-багату область, розташовану на 25-30 основ ліворуч від сайту, в якому ініціюється транскрипція. Іншою послідовністю, виявленою на 70-80 основ ліворуч від початку транскрипції, є область CNCAAT, де N може бути будь-яким нуклеотидом. На 3'-кінці більшості еукаріотичних генів знаходиться послідовність ААТААА, яка може бути сигналом для додавання полі-А хвоста до 3'-кінця кодуючої послідовності. Всі ці послідовності придатним чином інсертують в еукаріотичні експресуючі вектори. Приклади придатних промотуючих послідовностей для використання з хазяїнами-дріжджами включають в себе промотори для 3фосфогліцераткінази або інших гліколітичних ферментів, таких як енолаза, гліцеральдегід-3фосфатдегідрогеназа, гексокіназа, піруватдекарбоксилаза, фосфофруктокіназа, глюкозо-6фосфатізомераза, 3-фосфогліцератмутаза, піруваткіназа, триозофосфатізомераза, фосфоглюкозоізомераза і глюкокіназа. Іншими дріжджовими промоторами, які є промоторами, що індукуються, що мають додаткову перевагу транскрипції, регульованої умовами вирощування, є промоторні області для алкогольдегідрогенази 2, ізоцитохрому С, кислої фосфатази, деградуючих ферментів, асоційованих з метаболізмом азоту, металотіонеїну, гліцеральдегід-3фосфатдегідрогенази і ферментів, відповідальних за утилізацію мальтози і галактози. Придатні вектори і промотори для використання в експресії дріжджів описані додатково в ЕР 73657. Енхансери дріжджів також переважно використовуються з промоторами дріжджів. Транскрипція антитіл з векторів у клітинаххазяїнах ссавців регулюється, наприклад, промоторами, одержаними з геномів вірусів, таких як вірус лейкозу Абельсона, поліомавірус, вірус віспи 97484 40 (дифтериту) птахів, аденовірус (такий як аденовірус 2), бичачий папіломавірус, вірус пташиної саркоми, найбільш переважно цитомегаловірус, ретровірус, вірус гепатиту В, вірус мавп 40 (SV40), з гетерологічних промоторів ссавців, наприклад, промотор актину або промотор імуноглобуліну, з промоторів теплового шоку, за умови, що такі промотори сумісні з системами клітин-хазяїнів. Ранній і пізній промотори вірусу SV40 придатним чином одержують у вигляді рестрикційного фрагмента SV40, що містить також вірусний сайт ініціації реплікації. Негайно ранній промотор цитомегаловірусу людини придатним чином одержують у вигляді рестрикційного фрагмента Hindlll. Система для експресії ДНК у хазяїнах-ссавцях з використанням бичачого папіломавірусу як вектора описана у патенті США № 4419446. Одна модифікація цієї системи описана у патенті США № 4601978. Див. також Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) стосовно експресії кДНК -інтерферону людини у мишачих клітинах під контролем промотору тимідинкінази з вірусу простого герпесу. Альтернативно, як промотор може бути використаний довгий кінцевий повтор вірусу саркоми Рауса. (5) Компонент енхансерного елемента Транскрипція ДНК, що кодує антитіло за винаходом, вищими еукаріотами часто збільшується інсертуванням енхансерної послідовності у вектор. Багато енхансерних послідовностей у наш час відомі з генів ссавців (глобіну, еластази, альбуміну, альфа-фетопротеїну та інсуліну). Однак, звичайно використовують енхансер з вірусу еукаріотичної клітини. Приклади включають в себе енхансер SV40 на пізній стороні сайту ініціації реплікації (пари нуклеотидів 100-270), енхансер раннього промотору цитомегаловірусу на пізній стороні сайту ініціації реплікації, енхансер поліомавірусу на пізній стороні сайту ініціації реплікації і енхансери аденовірусу. Див. також Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) стосовно енхансерних елементів для активації еукаріотичних промоторів. Енхансер може бути сплайсований у вектор у положенні 5' або 3' стосовно послідовності, що кодує антитіло, але переважно він знаходиться у сайті 5' (ліворуч) від промотору. (6) Компонент термінації транскрипції Експресуючі вектори, використовувані в еукаріотичних клітинах-хазяїнах (дріжджах, грибах, комахах, рослині, тварині або клітинах, що містять ядро, з інших багатоклітинних організмів), будуть також містити послідовності, необхідні для термінації транскрипції і для стабілізації мРНК. Такі послідовності звичайно доступні з 5'- та іноді 3'нетрансльованих областей еукаріотичних або вірусних ДНК або кДНК. Ці області містять нуклеотидні сегменти, що транскрибуються у вигляді поліаденільованих фрагментів у нетрансльованій частині мРНК, що кодує антитіло. Одним застосовним компонентом термінації транскрипції є область поліаденілювання бичачого гормону росту. Див. WO94/11026 і описаний у ньому експресуючий вектор. Іншим є термінатор транскрипції легкого ланцюга імуноглобуліну миші. (7) Відбір і трансформація клітин-хазяїнів 41 Придатними клітинами-хазяїнами для клонування або експресії ДНК в описаних тут векторах є клітини прокаріотів, дріжджів або вищих еукаріотів. Придатні прокаріоти для цієї мети включають в себе еубактерії, такі як грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Enterobacteriaceae, такі як Escherichia, наприклад, Е. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, наприклад, Salmonella typhimurium, Serratia, наприклад, Serratia marcescans, і Shigella, а також бацили, такі як В. subtilis і В. licheniformis (наприклад, В. licheniformis 41 Ρ, описана у DD 266710, опублікованому 12 квітня 1989 року), Pseudomonas, такий як P. aeruginosa, і Streptomyces. Одним переважним клонуючим хазяїном Е. coli є Е. coli 294 (АТСС 31446), хоча придатними є й інші штами, такі якЕ. coli В, Е. coli X1776 (АТСС 31537) і Е. coli W3110 (АТСС 27325). Ці приклади є ілюстративними, а не обмежувальними. Крім прокаріотів, еукаріотичні мікроби, такі як нитчасті гриби або дріжджі, є придатними клонуючими або експресуючими хазяїнами для векторів, що кодують антитіло. Saccharomyces cerevisiae, або звичайні пекарні дріжджі, є найбільш часто використовуваним серед нижчих еукаріотичних мікроорганізмів-хазяїнів. Однак, ряди інших родів, видів і штамів звичайно є доступними і застосовними тут, такі як Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces-хазяїни, такі як, наприклад, K. lactis, K. fragilis (АТСС 12424), K. bulgaricus (АТСС 16045), K. wickeramii (АТСС 24178), K. waltii (АТСС 56500), K. drosophilarum (АТСС 36906), K. thermotolerans і K. marxianus; Yarrowia (ЕР 402226); Pichia pastoris (ЕР 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, наприклад, Schwanniomyces occidentalis; і нитчасті гриби, такі як, наприклад, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium і Aspergillusхазяїни, такі як A. nidulans і A. niger. Придатні клітини-хазяїни для експресії глікозилованого антитіла одержують з багатоклітинних організмів. Приклади клітин безхребетних включають в себе клітини рослин і комах. Були ідентифіковані численні бакуловірусні штами і варіанти і відповідні пермісивні клітини-хазяїни комах з таких хазяїнів, як Spodoptera frugiperda (гусениця), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодова мушка, дрозофіла) і Bombyx mori. Різні вірусні штами для трансфекції є публічно доступними, наприклад, варіант L-1 NPV Autographa californica і штам Bm-5 NPV Bombyx mori, і такі віруси можуть бути використані як віруси тут відповідно до даного винаходу, зокрема, для трансфекції клітин Spodoptera frugiperda. Культури клітин рослин бавовнику, кукурудзи, картоплі, сої, петунії, томату, тютюну, ряски і клітин інших рослин можуть також використовуватися як хазяїни. Однак, найбільший інтерес представляли клітини хребетних, і розмноження клітин хребетних у культурі (культурі тканини) стало рутинною процедурою. Прикладами застосовних ліній клітинхазяїнів ссавців є клітини яєчника Китайського хом'ячка, у тому числі клітини СНОК1 (АТСС CCL61), 97484 42 DXB-11, DG-44 і клітини/-DHFR яєчника Китайського хом'ячка (СНО, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); лінія клітин CV1 мавпи, трансформована SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); лінія клітин ембріональної нирки людини (клітини 293 або клітини 293, субклоновані для росту у суспензійній культурі [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]; клітини нирки дитинчати хом'яка (ВHK, АТСС CCL 10); клітини Сертолі миші (ТМ4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клітини нирки мавпи (CV1 АТСС CCL 70); клітини нирки Африканської зеленої мавпи (VERO-76, АТСС CRL-1587); клітини раку шийки матки людини (HELA, АТСС CCL 2); клітини нирки собачих (MDCK, АТСС CCL 34); клітини печінки буйволового щура (BRL 3А, АТСС CRL 1442); клітини легені людини (W138, АТСС CCL 75); клітини печінки людини (Hep G2, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562, АТСС CCL51); TRIклітини (Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383:4468 (1982)); клітини MRC 5; клітини FS4 і клітини гепатомної лінії людини (Hep G2). Клітини-хазяїни трансформували або трансфікували описаними вище експресуючими або клонуючими векторами для одержання антитіл і культивували у придатних поживних середовищах, модифікованих відповідним чином для індукції промоторів, відбору трансформантів або ампліфікації генів, що кодують бажані послідовності. Крім того, нові вектори і трансфіковані клітинні лінії з множинними копіями транскрипційних одиниць, відділені з використанням селективного маркера, є особливо застосовними і переважними для експресії антитіл. (8) Культивування клітин-хазяїнів Клітини-хазяїни, використовувані для одержання антитіла за даним винаходом, можуть культивуватися у різних середовищах. Для культивування клітин-хазяїнів придатні комерційно доступні середовища, такі як Ham F10 (Sigma), мінімальне есенціальне середовище ((MEM), (Sigma)), RPMI1640 (Sigma) і модифіковане за способом Дульбеко середовище Ігла ((DMEM), Sigma). Крім того, будь-які з середовищ, описаних у Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патентах США з номерами 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 або 5122469; WO90103430; WO 87/00195 або патенті США Re. № 30985, можуть бути використані як культуральні середовища для цих клітин-хазяїнів. Будь-які з цих середовищ можуть бути доповнені, якщо необхідно, гормонами і/або іншими факторами росту (такими як інсулін, трансферин або епідермальний фактор росту), солями (такими як хлорид натрію, кальцію, магнію і фосфат), буферами (такими як HEPES), нуклеотидами (такими як аденозин і тимідин), антибіотиками (такими як Гентаміцин), мікроелементами (що визначаються як неорганічні сполуки, звичайно присутні у кінцевій концентрації у діапазоні мікромолярних концентрацій) і глюкозою або еквівалентним джерелом енергії. Будь-які інші необхідні домішки, які відомі кваліфікованим у даній галузі фахівцям, можуть бути також включені у придатних концентраціях. Умови культивування, такі як температура, рН і т.п., є умовами, викорис 43 товуваними раніше з клітиною-хазяїном, вибраною для експресії, і будуть очевидними для фахівця зі звичайною кваліфікацією у даній галузі. (9) Очищення антитіла При використанні рекомбінантних технологій антитіло може бути одержане внутрішньоклітинно, у периплазматичному просторі і безпосередньо секретоване у середовище, у тому числі з мікробних культур. Якщо це антитіло продукується внутрішньоклітинно, як перша стадія, залишки у вигляді частинок або фрагменти клітин-хазяїнів, або лізовані фрагменти видаляють, наприклад, центрифугуванням або ультрафільтрацією. Better et al. Science 240:1041-1043 (1988); ICSU Short Reports 10:105 (1990); і Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:457-461 (1993) описують процедуру виділення антитіл, які секретуються у периплазматичний простір Е. coli. (див. також Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Композиція антитіл, приготована з мікробних клітин і клітин ссавців, може бути очищена з використанням, наприклад, гідроксіапатитної хроматографії, катіоно- або аніонообмінної хроматографії і афінної хроматографії, причому переважним способом очищення є афінна хроматографія. Придатність білка А як афінного ліганду залежить від виду та ізотипу будь-якого Fc-домену імуноглобуліну, що є присутнім у цьому антитілі. Білок А може бути використаний для очищення антитіл, які базуються на важких ланцюгах 1, 2 або 4 людини (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Білок G рекомендується для всіх ізотипів миші і для 3 людини (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). Матриксом, до якого приєднують цей афінний ліганд, є найчастіше агароза, але доступні й інші матрикси. Механічно стабільні матрикси, такі як скло з контрольованими порами або полі(стирендивініл)бензол, роблять можливими більш швидкі швидкості потоку і більш короткі періоди часу обробки, ніж швидкості і періоди, одержувані з агарозою. Коли антитіло містить домен СН3, для очищення застосовна смола Bakerbond АВХ (J. Т. Baker, Phillipsburg, NJ). Доступні також інші способи очищення білка, такі як фракціонування на іонообмінній колонці, осадження етанолом, оберненофазова ВЕРХ, хроматографія на силікагелі, хроматографія на гепарині, хроматографія на Сефарозі, хроматографія на аніоноабо катіонообмінній смолі (такій як колонка з поліаспарагіновою кислотою), хроматофокусування, електрофорез у ДСН-ПААГ і осадження сульфатом амонію. Химерні антитіла Антитіло гризуна після повторюваного введення in vivo людині, або окремо, або у вигляді кон'югату, буде викликати імунну реакцію у реципієнті проти антитіла гризуна; так звану реакцію НАМА (людське анти-мишаче антитіло). Реакція НАМА може обмежувати ефективність фармацевтичного засобу при повторюваному введенні доз. Імуногенність антитіла може бути зменшена хімічною модифікацією цього антитіла гідрофільним полімером, таким як поліетиленгліколь, або з використанням способів генної інженерії, щоб зробити структуру антитіла більш подібною до структури 97484 44 антитіла людини, наприклад, у вигляді химерного, гуманізованого антитіла, антитіла людини або сконструйованих для людини антитіл Human Engineered. Оскільки такі сконструйовані антитіла є менш імуногенними у людях, ніж вихідні мишачі моноклональні антитіла, вони можуть бути використані для лікування людей з набагато меншим ризиком анафілаксії. Таким чином, ці антитіла можуть бути переважними у терапевтичних застосуваннях, які включають в себе введення in vivo людині. Химерні моноклональні антитіла, в яких варіабельні домени Ig мишачого моноклонального антитіла злиті з константними доменами Ig людини, можуть бути генеровані з використанням стандартних процедур, відомих у даній галузі (див. Morrison, S. L., et al. (1984) Chimeric Human Antibody Molecules; Mouse Antigen Binding Domains with Human Constant Region Domains, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6841-6855; і Boulianne, G.L., et al., Nature 312, 643-646. (1984)). Наприклад, послідовності генів для варіабельних областей антитіла гризуна, які зв'язують СЕА, можуть бути введені для заміни варіабельних доменів білка мієломи людини з одержанням, таким чином, рекомбінантного химерного антитіла. Ці процедури докладно описані в ЕР 194276, ЕР 0120694, ЕР 0125023, ЕР 0171496, ЕР 0173494 і WO 86/01533. Хоча деякі химерні моноклональні антитіла виявилися менш імуногенними у людях, варіабельні домени Ig миші можуть усе ще приводити до значної реакції людини проти мишачих антитіл. Гуманізовані антитіла Гуманізовані антитіла можуть бути одержані різними способами, що включають, наприклад, (1) трансплантацію областей, що визначають комплементарність, (CDR) не людини на каркасну і константну область людини (спосіб, називаний у даній галузі гуманізацією через «трансплантацію CDR»), або альтернативно (2) трансплантацію повних варіабельних доменів не людини, але «покриванням» їх людиноподібною поверхнею заміною поверхневих залишків (спосіб, називаний у даній галузі «облицюванням»). У даному винаході гуманізовані антитіла будуть включати в себе як «гуманізовані», так і «облицьовані» антитіла. Ці способи описані, наприклад, у статтях Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169-217 (1994); і Kettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7):773-83 (1991), кожна з яких включена сюди як посилання. Наприклад, послідовності генів областей CDR антитіла гризуна можуть бути виділені або синтезовані і введені для заміни відповідних областей послідовності гомологічного гена антитіла людини, з одержанням антитіла людини зі специфічністю вихідного антитіла гризуна. Ці процедури описані в ЕР 023940, WO 90/07861 і WO 91/09967. Трансплантація області CDR включає введення однієї або декількох з шести областей CDR з варіабельних доменів Ig важкого і легкого ланцюга 45 миші у відповідні чотири каркасних області варіабельних доменів Ig людини, також називане трансплантацією CDR. Цей спосіб (Riechmann, L., et al., Nature 332, 323 (1988)) використовує консервативні каркасні області (FR1-FR4) як каркас для підтримки петель CDR, які є первинними контактами з антигеном. Однак, недоліком трансплантації CDR є те, що вона може приводити до гуманізованого антитіла, що має істотно більш низьку афінність зв'язування, ніж вихідне антитіло миші, оскільки амінокислоти каркасних областей можуть сприяти зв'язуванню антигену, і оскільки амінокислоти петель CDR можуть впливати на асоціацію двох варіабельних доменів Ig. Для збереження афінності гуманізованого моноклонального антитіла цей спосіб трансплантації CDR може бути поліпшений вибором каркасних областей людини, які найбільш близько подібні до каркасних областей вихідного антитіла миші, і сайт-направленим мутагенезом окремих амінокислот у каркасі або CDR за допомогою комп'ютерного моделювання сайту зв'язування антигену (наприклад, Со, Μ. S., et al. (1994), J. Immunol. 152, 2968-2976). Один спосіб гуманізації антитіл передбачає порівняння послідовностей важкого і легкого ланцюгів не людини з послідовностями важкого і легкого ланцюгів людини, відбір і заміну каркаса не людини каркасом людини на основі такого порівняння, молекулярне моделювання для передбачення конформації цієї гуманізованої послідовності і порівняння з конформацією вихідного антитіла. За цим процесом йшла зворотна мутація залишків в області CDR, що порушує структуру областей CDR, доки передбачена конформація моделі гуманізованої послідовності не наблизиться близько до конформації областей CDR не людини вихідного антитіла не людини. Такі гуманізовані антитіла можуть бути додатково дериватизовані для полегшення поглинання і кліренсу, наприклад, за допомогою Ashwell-рецепторів (див., наприклад, патенти США з номерами 5530101 і 5585089, які включені сюди як посилання). Повідомлявся ряд гуманізацій мишачих моноклональних антитіл за допомогою раціонального конструювання (див., наприклад, 20020091240, опублікований 11 липня 2002 року, WO 92/11018 і патент США № 5693762, патент США №5766866). Сконструйовані для людини (Human Engineered) антитіла Фраза "сконструйоване для людини (Human Engineered) антитіло" стосується антитіла, виробленого з антитіла не людини, звичайно з мишачого моноклонального антитіла. Альтернативно, сконструйоване для людини антитіло Human Engineered може бути вироблене з химерного антитіла, що зберігає або по суті зберігає властивості зв'язування антитіла вихідного антитіла не людини, але яке проявляє зменшену імуногенність у порівнянні з вихідним антитілом при введенні людям. Конструювання для людини (Human Engineering) варіабельних доменів антитіла було описане Studnicka [Див., наприклад, Studnicka et al., патент США №5766886; Studnicka et al. Protein Engineering 7:805-814 (1994)] як спосіб для змен 97484 46 шення імуногенності при збереженні активності зв'язування молекул антитіла. Відповідно до цього способу, кожній амінокислоті варіабельної області приписували ризик заміни. Амінокислотні заміни відрізняються однією з трьох категорій ризику: (1) змінами низького ризику є зміни, які мають найвищий потенціал для зменшення імуногенності з найменшим шансом порушення зв'язування антигену; (2) змінами помірного (середнього) ризику є зміни, які можуть додатково зменшувати імуногенність, але мають більший шанс впливу на зв'язування антигену або укладання (фолдинг) білка; (3) змінами високого ризику є зміни, які є важливими для зв'язування або для збереження структури антитіла і несуть найвищий ризик того, що вони будуть впливати на зв'язування антигену або укладання білка. Внаслідок тривимірної структурної ролі пролінів, модифікації у пролінах звичайно вважаються щонайменше змінами помірного (середнього) ризику, навіть якщо дане положення звичайно є положенням низького ризику. Варіабельні області легкого і важкого ланцюгів антитіла гризуна конструюються для людини (Human Engineered) наступним чином для заміни амінокислот людини у положеннях, визначених як такі, що не мають ймовірності шкідливої дії ні на зв'язування антигену, ні на укладання білка, але мають ймовірність зменшення імуногенності при введенні людині. Амінокислотні залишки, які знаходяться у положеннях «низького ризику» і які є кандидатами для модифікації відповідно до даного способу, ідентифікують порівнянням амінокислотних послідовностей варіабельних областей гризуна з послідовністю варіабельної області людини. Може бути використана будь-яка варіабельна область людини, у тому числі окрема послідовність VH або VL, або консенсусна послідовність VH або VL людини, або окрема або консенсусна послідовність зародкової лінії людини. Амінокислотні залишки у будь-якій кількості положень низького ризику або у всіх положеннях низького ризику можуть бути змінені. Наприклад, у кожному положенні низького ризику, де порівняні амінокислотні залишки миші і людини відрізняються, вводять модифікацію амінокислоти, що заміняє амінокислотний залишок гризуна амінокислотним залишком людини. Альтернативно, можуть бути змінені амінокислотні залишки у всіх положеннях низького ризику і у будь-якому положенні помірного ризику. В ідеалі, для досягнення найменшої імуногенності всі з положень низького і помірного ризику змінюють у послідовності гризуна з одержанням послідовності людини. Синтетичні гени, що містять модифіковані варіабельні області важкого і/або легкого ланцюга, конструюють і зв'язують з константними областями важкого ланцюга і/або легкого ланцюга каппа людини. Будь-які константні області важкого ланцюга і легкого ланцюга людини можуть бути використані у комбінації з варіабельними областями сконструйованого для людини (Human Engineered) антитіла, у тому числі IgA (будьякого підкласу, такого як lgA1 або IgA2), IgD, IgE, IgG (будь-якого підкласу, наприклад, lgG1, IgG2, IgG3 або IgG4) або IgM. Гени важкого і легкого 47 ланцюга вводять у клітини-хазяїни, такі як клітини ссавців, і утворені рекомбінантні імуноглобулінові продукти одержують і характеризують. Антитіла людини з трансгенних тварин Антитіла людини для націлювання на антиген можуть бути також одержані з використанням трансгенних тварин, які не мають ендогенного продукування імуноглобуліну, і сконструйовані для вміщення локусів імуноглобуліну людини. Наприклад, WO 98/24893 описує трансгенних тварин, які мають локус Ig людини, причому ці тварини не продукують функціональні ендогенні імуноглобуліни внаслідок інактивації ендогенних локусів важкого і легкого ланцюга. WO 91/10741 також описує трансгенних хазяїнів-ссавців не приматів, здатних утворювати імунну реакцію на імуноген, причому ці антитіла мають константні і варіабельні області приматів, а ендогенні локуси, що кодують імуноглобулін, замінені або інактивовані. WO 96/30498 описує застосування системи Cre/Lox для модифікації локусу імуноглобуліну у ссавці, наприклад, заміни всіх або частини константної або варіабельної області, для утворення модифікованої молекули антитіла. WO 94/02602 описує ссавцівхазяїнів не людини, що мають інактивовані ендогенні локуси Ig і функціональні локуси Ig людини. Патент США № 5939598 описує способи одержання трансгенних мишей, в яких ці миші позбавлені ендогенних важких ланцюгів і експресують екзогенний локус імуноглобуліну, що містить одну або декілька ксеногенних константних областей. З використанням описаної вище трансгенної тварини може бути одержана імунна реакція на вибрану антигенну молекулу, і клітини, що продукують антитіло, можуть бути видалені з тварини і використані для одержання гібридом, які секретують моноклональні антитіла людини. Протоколи імунізації, ад'юванти і т.п. відомі у даній галузі і використовувалися в імунізації, наприклад, трансгенної миші, як описано у WO 96/33735. Ця публікація описує моноклональні антитіла проти різних антигенних молекул, у тому числі IL-6, IL-8, TNFa, CD4 людини, L-селектину, gp39 і правцевого токсину. Ці моноклональні антитіла можуть бути випробувані на здатність інгібувати або нейтралізувати біологічну активність або фізіологічну дію відповідного білка. WO 96/33735 описує, що моноклональні антитіпя проти IL-8, одержані з імунних клітин трансгенних мишей, імунізованих IL-8, блокували функції нейтрофілів, що індукуються IL-8. Моноклональні антитіла людини зі специфічністю стосовно антигену, використаного для імунізації трансгенних тварин, також описані у WO 96/34096 і заявці на патент США № 20030194404; і заявці на патент США № 20030031667. Див. також Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993); і патент США № 5591669, патент США № 5589369, патент США № 5545807 і заявку на патент США № 20020199213, WO 96/34096 і заявку на патент США № 20030194404 і заявку на патент США № 20030031667. Додаткові трансгенні тварини, застосовні для одержання моноклональних антитіл, включають в 97484 48 себе Medarex HuMAb-MOUSE, описану у патенті США №5770429 і Fishwild, et al. (Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996), що містить генні послідовності з неаранжованих генів антитіла людини, які кодуютьважкий і легкий ланцюги антитіл людини. Імунізація з використанням HuMAb-MOUSE робить можливим продукування моноклональних антитіл до білка-мішені. Ishida et al. (Cloning Stem Cells. 4:91-102, 2002) описують також мишу TransChromo Mouse (TCMOUSE), яка містить сегменти з розмірами 6 порядку мега (10 ) нуклеотидів ДНК людини і яка включає локуси повного імуноглобуліну людини (hlg). TCMOUSE має повний різноманітний репертуар blg, що включає в себе всі підкласи IgG (lgG1G4). Імунізація ТС-миші різними антигенами продукує реакції у вигляді антитіл, що містять антитіла людини. Заявка на патент США № 20030092125 описує способи зсуву імунної реакції тварини на бажаний епітоп. Антитіла людини можуть бути також генеровані активованими in vitro В-клітинами (див. патенти США з номерами 5567610 і 5229275). Антитіла з технології фагового дисплею Розвиток технологій для одержання репертуарів рекомбінантних генів антитіл людини і дисплею фрагментів антитіл, що кодуються, на поверхні нитчастого бактеріофагу забезпечило рекомбінантні способи для прямого одержання і відбору антитіл людини, які можуть бути також застосовані до гуманізованих, химерних, мишачих або мутеїнових антитіл. Антитіла, одержувані фаговою технологією, продукуються у вигляді антигензв'язувальних фрагментів, звичайно Fv- або Fab-фрагментів, у бактеріях і, отже, позбавлені ефекторних функцій. Ефекторні функції можуть бути введені однією з двох стратегій: ці фрагменти можуть бути сконструйовані або у повні антитіла для експресії у клітинах ссавців, або у фрагменти біспецифічного антитіла з другим сайтом зв'язування, здатним запускати ефекторну функцію. Звичайно Fd-фрагмент (VH-CH1) і легкий ланцюг (VL-CL) антитіл клонують окремо за допомогою ПЛР і рекомбінують випадковим чином у комбінаторних бібліотеках фагового дисплею, які можуть бути потім відібрані на зв'язування з конкретним антигеном. Fab-фрагменти експресуються на поверхні фагу, тобто фізично зв'язані з генами, які їх кодують. Таким чином, відбір Fab за зв'язуванням антигену одночасно відбирає послідовності, що кодують Fab, які можуть бути потім ампліфіковані. За допомогою декількох циклів зв'язування антигену і повторюваної ампліфікації, процедури, називаної пенінгом, Fab, специфічний для цього антигену, збагачують і, нарешті, виділяють. У 1994 році був описаний підхід для гуманізації антитіл, називаний «відбором, що направляється». Відбір, що направляється, використовує ефективність способу фагового дисплею стосовно гуманізації моноклонального антитіла миші (див. Jespers, L. S., et al., Bio/Technology 12, 899-903 (1994)). Для цього Fd-фрагмент моноклонального антитіла миші може бути виставлений у дисплеї у комбінації з бібліотекою легких ланцюгів людини, і потім одержаний гібрид може бути відібраний з антигеном. За 49 допомогою цього мишачий Fd-фрагмент забезпечує матрицю для направлення відбору. Потім відібрані легкі ланцюги людини об'єднують з бібліотекою Fd-фрагментів людини. Відбір з одержаних виходів бібліотеки дає повністю «людський» Fab. Були описані різні процедури для створення антитіл людини з бібліотек фагового дисплею (див., наприклад, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581597 (1991); патенти США з номерами 5565332 і 5573905; Clackson, Т., і Wells, J. Α., TIBTECH 12, 173-184 (1994)). Зокрема, відбір in vitro і еволюція антитіл, вироблених з бібліотек фагового дисплею, стали потужним інструментом (див. Burton, D. R., and Barbas III, C. F, Adv. Immunol. 57, 191-280 (1994); Winter, G, et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455 (1994); заявку на патент США № 20020004215 і WO92/01047; заявку на патент № 20030190317, опубліковану 9 жовтня 2003 року, і патент США № 6054287; патент США № 5877293). Watkins, Screening of Phage-Expressed Antibody Libraries by Capture Lift, Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display: Methods and Protocols 178:187-193, і заявка на патент США № 200120030044772, опублікована 6 березня 2003 року, описують способи скринінгу бібліотек антитіл, що експресуються фагом, або інших зв'язувальних молекул за допомогою захоплюючого підйому (ліфтингу), причому один спосіб включає в себе іммобілізацію кандидатних зв'язувальних молекул на твердому носії. Продукти антитіл можуть бути піддані скринінгу на активність і на застосовність у способах даного винаходу з використанням аналізів, описаних у розділі із заголовком «Способи скринінгу» тут, або з використанням будь-яких інших придатних аналізів, відомих у даній галузі. Мутеїни амінокислотних послідовностей Антитіла за винаходом включають мутеїни або варіанти вихідного антитіла, в яких поліпептидна послідовність вихідного антитіла була змінена щонайменше однією амінокислотною заміною, делецією або інсерцією у варіабельній області або частині, еквівалентній варіабельній області, у тому числі в області CDR, за умови, що цей мутеїн або варіант зберігає бажану афінність зв'язування або біологічну активність. Мутеїни можуть бути по суті гомологічними або по суті ідентичними вихідному антитілу, наприклад, щонайменше на 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98%, 99% або 100% ідентичними або гомологічними. Ідентичність або гомологія стосовно цієї послідовності визначається тут як відсоток амінокислотних залишків у кандидатній послідовності, які є ідентичними з вихідною послідовністю, після порівняння цих послідовностей і введення гепів, якщо необхідно, для одержання максимальної процентної ідентичності послідовності і без врахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовності. Жодна з Nкінцевих, С-кінцевих або внутрішніх подовжень, делецій або інсерцій у це антитіло не повинна розглядатися як така, що впливає на ідентичність або гомологію послідовностей. Таким чином, ідентич 97484 50 ності послідовності можуть бути визначені стандартними способами, які звичайно використовують для порівняння подібності у положенні амінокислот двох поліпептидів. З використанням комп'ютерної програми, такої як BLAST або FASTA, два поліпептиди порівнюють для оптимальної відповідності їх відповідних амінокислот (або по всій довжині однієї або обох послідовностей, або по заданій частині однієї або обох послідовностей). Ці програми забезпечують штраф за відкриття гепу за умовчанням і штраф за подовження гепу за умовчанням, і може бути забезпечена матриця оцінок, така як РАМ 250 [стандартна матриця оцінок; див. Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)], разом з цією комп'ютерною програмою. Наприклад, процентна ідентичність може бути потім розрахована як загальна кількість ідентичних збігів, помножена на 100 і потім поділена на суму довжини більш довгої послідовності у співпадаючій відстані і кількості гепів, введених у більш довгі послідовності для порівняння цих двох послідовностей. Антитіла за винаходом можуть також включати зміни у поліпептидній послідовності константної області, які не будуть впливати на афінність зв'язування, але будуть змінювати ефекторну функцію, таку як антитілозалежна клітинна токсичність (ADCC), комплементзалежна цитотоксичність (CDC) або кліренс і поглинання (і одержана дія на напівперіод існування в організмі). Інсерції Інсерції амінокислотної послідовності включають аміно- і/або карбоксикінцеві злиття з довжиною у діапазоні від одного залишку до поліпептидів, що містять сто або більше залишків, а також інсерції всередині послідовності єдиних або множинних амінокислотних залишків, наприклад, 2, 3 або більше. Приклади кінцевих інсерцій включають в себе антитіло з N-кінцевим метіонільним залишком або антитіло (у тому числі фрагмент антитіла), злите з епітопною міткою або епітопом рецептора реутилізації. Інші інсерційні мутеїни молекули антитіла включають в себе додавання сайтів глікозилювання, додавання цистеїнів для внутрішньомолекулярного або міжмолекулярного зв'язування, або злиття з поліпептидом, що збільшує напівперіод існування у сироватці цього антитіла, наприклад, на N-кінці або С-кінці. Наприклад, цистеїновий зв'язок (цистеїнові зв'язки) може бути доданий до антитіла для поліпшення його стабільності (особливо, коли це антитіло є фрагментом антитіла, таким як Fv-фрагмент). Глікозилювання антитіл звичайно є Nзв'язаним або О-зв'язаним. N-зв'язаним називають приєднання вуглеводної частини молекули до бічного ланцюга залишку аспарагіну. Трипептидні послідовності аспарагін-Х-серин і аспарагін-Хтреонін, де X означає будь-яку амінокислоту, крім проліну, є послідовностями пізнавання для ферментативного приєднання вуглеводної частини молекули до бічного ланцюга аспарагіну. Присутність будь-якої з цих трипептидних послідовностей у поліпептиді створює потенційний сайт глікозилювання. Таким чином, N-зв'язані сайти глікозилювання можуть бути додані до антитіла зміною амі 51 нокислотної послідовності таким чином, що вона містить одну або декілька цих трипептидних послідовностей. О-зв'язаними сайтами глікозилювання називають приєднання одного з цукрів Nацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксиламінокислоти, найбільш часто серину або треоніну, хоча може бути також використаний 5гідроксипролін або 5-гідроксилізин. О-зв'язані сайти глікозилювання можуть бути додані до антитіла інсертуванням або заміною одного або декількох залишків серину або треоніну стосовно послідовності вихідного антитіла. Термін "мічений епітопом" стосується антитіла, злитого з епітопною міткою. Поліпептид епітопної мітки має досить залишків для забезпечення епітопу, проти якого може бути вироблене антитіло, але все ще досить коротким, так що воно не перешкоджає активності цього антитіла. Епітопна мітка переважно є досить унікальною, так що це антитіло по суті не реагує перехресно з іншими епітопами. Придатні поліпептиди-мітки звичайно мають щонайменше 6 амінокислотних залишків і звичайно мають приблизно 8-50 амінокислотних залишків (переважно між приблизно 9-30 залишками). Приклади включають в себе поліпептидмітку flu НА і його антитіло 12СА5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165 (1988)]; мітку с-myc і антитіла 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 і 9Е10 до неї [Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616 (1985)]; і глікопротеїн D (gD)-мітку вірусу простого герпесу і його антитіло [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6):547553 (1990)]. Іншою зразковою міткою є полігістидинова послідовність, звичайно близько шести залишків гістидину, що робить можливим виділення міченої таким чином сполуки з використанням утворення хелату нікелю. Інші мітки і «ярлики», такі як мітка FLAG® (Eastman Kodak, Rochester, NY), добре відомі і рутинно використовувані у даній галузі, включені у даний винахід. У даному контексті термін «епітоп зв'язування рецептора порятунку» стосується епітопу Fcобласті молекули IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4), що є відповідальним за збільшення напівперіоду існування у сироватці in vivo молекули IgG. Делеції Делеції амінокислотної послідовності включають аміно- і/або карбоксил-кінцеві делеції з довжиною у діапазоні від одного до ста або більше залишків, що приводять до фрагментів, які зберігають афінність зв'язування стосовно антигенумішені, а також делеції всередині послідовності єдиного або множинних амінокислотних залишків, наприклад, 2, З або більше. Наприклад, сайти глікозилювання можуть бути делетовані або переміщені в інше положення делецією частини або всіх трипептидів, або інших послідовностей пізнавання для глікозилювання. Заміни Іншим типом мутеїну є мутеїн з амінокислотними замінами. Ці мутеїни мають щонайменше один видалений амінокислотний залишок у молекулі антитіла і вставлений на його місце інший залишок. Обговорюється замінний мутагенез у будьякій з гіперваріабельних або CDR-областей, або 97484 52 каркасних областей. Консервативні заміни показані у таблиці 1. Найбільш консервативна заміна показана під заголовком «переважні заміни». Якщо такі заміни не приводять до зміни біологічної активності, то можуть бути введені більш істотні зміни, названі «зразковими замінами» у таблиці 1, або описані нижче у посиланні на класи амінокислот, і продукти можуть бути піддані скринінгу. Таблиця 1 Вихідна Зразкові Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) IIe (I) val; leu; ile lys; gln; asn gln; his; asp, lvs; gln glu; asn ser; ala asn; glu asp; gln ala asn; gln; lys; arg leu; val; met; ala; phe; норлейцин; ile; val; met; ala; phe arg; gln; asn leu; phe; ile leu; val; ile; ala; tyr ala thr ser tyr; phe trp; phe; thr; ser ile; leu; met; phe; ala; норлейцин Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Переважні заміни залишків val lys arg glu ser asn asp leu норлейцин ile arg leu ser tyr phe leu Істотні модифікації у біологічних властивостях антитіла виконують відбором замін, які істотно відрізняються в їх дії на збереження (а) структури скелету поліпептиду у зоні заміни, наприклад, у вигляді складчастої або спіральної конформації, (b) заряду або гідрофобності молекули у сайтімішені або (с) об'єму бічного ланцюга. Природні залишки розділені на групи на основі загальних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: норлейцин, met, ala, val, leu, ile; (2) нейтральні гідрофільні: cys, ser, thr; (3) кислі: asp, glu; (4) основні: asn, gln, his, lys, arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга: gly, pro; і (6) ароматичні: trp, tyr, phe. Консервативні заміни включають заміну амінокислоти іншою амінокислотою її класу. Неконсервативні заміни включають заміну члена одного з цих класів членом іншого класу. Будь-який залишок цистеїну, не включений у збереження правильної конформації антитіла, також може бути замінений, звичайно серином, для поліпшення окисної стабільності молекули і запобігання аберантному зшиванню. Дозрівання афінності звичайно включає одержання і скринінт варіантів антитіл, які мають заміни в областях CDR вихідного антитіла, і відбору 53 варіантів, які мають поліпшені біологічні властивості, такі як афінність зв'язування, стосовно вихідного антитіла. Зручним шляхом для генерування таких варіантів з замінами є дозрівання афінності з використанням фагового дисплею. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельних областей (наприклад, 6-7 сайтів) мутують для генерування всіх можливих амінокислотних замін у кожному сайті. Генеровані таким чином варіанти антитіл представляють у вигляді дисплею одновалентним чином з частинок нитчастого фагу у вигляді злиттів з продуктом гена III М13, упакованим у кожній частинці. Потім ці представлені фагом варіанти піддають скринінгу на їх біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування). Див., наприклад, WO 92/01047, WO 93/112366, WO 95/15388 і WO 93/19172. Існуючі способи дозрівання афінності антитіл стосуються двох категорій мутагенезу: стохастичної (випадкової) і нестохастичної. Схильна до помилок ПЛР, мутаторні бактеріальні штами (Low et al., J. Mol. Biol. 260, 359-68, 1996) і мутагенез, що насичує, (Nishimiya et al., J. Biol. Chem. 275:1281320, 2000; Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. 178, 269-85, 2002) є типовими прикладами способів стохастичного мутагенезу (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102:8466-71, 2005). Нестохастичні способи часто використовують аланін-сканування або сайт-направлений мутагенез для генерування обмежених колекцій специфічних варіантів. Деякі способи описані більш докладно нижче. Дозрівання афінності через способи пенінгу Дозрівання афінності рекомбінантних антитіл звичайно виконують за допомогою декількох циклів пенінгу кандидатних антитіл у присутності зменшуваних кількостей антигену. Зменшення кількості антигену на цикл відбирає антитіла з найвищою афінністю до антигену, видаючи тим самим антитіла високої афінності з великого пулу вихідного матеріалу. Дозрівання афінності за допомогою пенінгу добре відоме у даній галузі і описане, наприклад, у Huls et al. (Cancer Immunol Immunother. 50:163-71, 2001). Способи дозрівання афінності з використанням технологій фагового дисплею описані тут в іншому місці і відомі у даній галузі (див., наприклад, Daugherty et al., Proc Natl Acad Sci USA. 97:2029-34, 2000). Переглядовий (Look-through) мутагенез - Переглядовий мутагенез (LTM) (Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102:8466-71, 2005) забезпечує спосіб швидкого картування антигензв'язувально сайту. Для LTM відбирають дев'ять амінокислот, реперезентативних для хімії основних бічних ланцюгів, забезпечуваних 20 природними амінокислотами, для аналізу функціональних внесків бічних ланцюгів у зв'язування у кожному положенні у всіх шести областях CDR антитіла. LTM генерує позиційний ряд моносайтових мутацій в області CDR, де кожний залишок «дикого типу» систематично заміняють однією з дев'яти вибраних амінокислот. Мутування області CDR об'єднують для генерування комбінаторних бібліотек одноланцюжкових варіабельних фрагментів (scFv) складності, що збільшується, і розміру, що збільшується, які не стають забороняючими стосовно кількісного 97484 54 дисплею всіх варіантів. Після позитивного відбору клони з поліпшеним зв'язуванням секвенують і сприятливі мутації картують. Схильна до помилок ПЛР - Схильна до помилок ПЛР включає рандомізацію нуклеїнових кислот між різними циклами відбору. Ця рандомізація відбувається при низькій швидкості за допомогою швидкості помилок, властивої використовуваній полімеразі, але може бути посилена схильною до помилок ПЛР (Zaccolo et al., J. Mol. Biol. 285:775783, 1999) з використанням полімерази, що має високу внутрішню швидкість помилок під час транскрипції (Hawkins et al., J Mol. Biol. 226:889-96, 1992). Після циклів мутації клони з поліпшеною афінністю стосовно антигену відбирають за допомогою рутинних способів у даній галузі. Перетасування ДНК - Перетасування нуклеїнової кислоти є способом гомологічної рекомбінації in vitro або in vivo пулів коротших або менших полінуклеотидів для одержання варіантних полінуклеотидів. Перетасування ДНК було описане у патенті США № 6605449, патенті США № 6489145, WO 02/092780 і Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 91:10747-51 (1994). Звичайно перетасування ДНК містить 3 стадії: фрагментацію генів, що підлягають перетасуванню, ДНКазою І, випадкову гібридизацію фрагментів і повторне складання або наповнення у цей фрагментований ген за допомогою ПЛР у присутності ДНК-полімерази (статева ПЛР) і ампліфікацію знову зібраного продукту з використанням звичайної ПЛР. Перетасування ДНК відрізняється від схильної до помилок ПЛР тим, що воно є інвертованою ланцюговою реакцією. У схильній до помилок ПЛР кількість сайтів старту полімерази і кількість молекул росте експоненціально. На противагу цьому, у повторному складанні нуклеїнових кислот або перетасуванні випадкових полінуклеотидів кількість сайтів старту і кількість (але не розмір) випадкових полінуклеотидів зменшується протягом часу. У випадку антитіла перетасування ДНК робить можливою асоціацію, наприклад, усіх з CDR1 з усіма з CDR2, з усіма з CDR3. Припускається, що численні сімейства послідовностей можуть бути перетасовані в одній і тій же реакції. Крім того, перетасування звичайно зберігає відносний порядок, так що, наприклад, CDR1 не будевиявлений у положенні CDR2. Рідкі перетасовані продукти будуть містити велику кількість найкращих (наприклад, найвищої афінності) областей CDR, і ці рідкі перетасовані продукти можуть бути відібрані на основі їх переважаючої афінності. Матричним полінуклеотидом, що може бути використаний у перетасуванні ДНК, може бути ДНК або РНК. Вона може бути різної довжини в залежності від розміру гена або більш короткого або меншого полінуклеотиду, що підлягає рекомбінації або повторному складанню. Переважно цей матричний полінуклеотид має розмір 50 п.н. - 50 т.п.н. Матричний полінуклеотид часто повинен бути двохланцюжковим. Припускається, що полінуклеотиди одноланцюжкових або двохланцюжкових нуклеїнових кислот, що мають області ідентичності з матричним полінуклеотидом і області гетерології з матричним 55 полінуклеотидом, можуть бути додані до цього матричного полінуклеотиду під час початкової стадії відбору генів. Припускається також, що під час цієї початкової стадії можуть бути змішані дві різні, але споріднені полінуклеотидні матриці. Аланін-сканування - Аланін-скануючий мутагенез може виконуватися для ідентифікації залишків гіперваріабельних областей, які істотно сприяють зв'язуванню антигену. Cunningham and Wells (Science 244:1081-1085, 1989). Ідентифікують залишок або групу залишків (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, his, lys i glu) і заміняють їх нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (найбільш переважно аланіном або поліаланіном) для впливу на взаємодію цих амінокислот з антигеном. Потім місця розташування амінокислот, що демонструють функціональну чутливість до цих замін, поліпшують введенням додаткових або інших варіантів у сайтах замість сайтів заміни. Таким чином, хоча сайт для введення варіації амінокислотної послідовності є попередньо визначеним, характер самої мутації (per se) не повинен бути попередньо визначеним. Наприклад, для аналізу виконання мутації у конкретному сайті проводять аlа-скануючий або випадковий мутагенез у кодоні-мішені, і експресовані мутеїни антитіл піддають скринінгу на бажану активність. Конструювання за допомогою комп'ютера Альтернативно або на додаток може бути корисним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту між антитілом і антигеном або для використання комп'ютерного програмного забезпечення для моделювання точок контакту. Залишки контакту і сусідні залишки є кандидатами на заміну відповідно до розроблених тут способів. Після генерування таких варіантів панель варіантів піддають скринінгу, як описано тут, і антитіла з переважаючими властивостями в одному або декількох релевантних аналізах можуть бути відібрані для додаткового розвитку. Дозрівання афінності включає одержання і скринінг мутеїнів антитіл, які мають заміни в областях CDR вихідного антитіла, і відбір мутеїнів, які мають поліпшені біологічні властивості, такі як афінність зв'язування, стосовно вихідного антитіла. Зручним способом генерування таких мутеїнів із замінами є дозрівання афінності з використанням фагового дисплею. Коротко, декілька сайтів гіперваріабельних областей (наприклад, 6-7 сайтів) мутують для генерування всіх можливих амінокислотних замін у кожному сайті. Генеровані таким чином мутеїни антитіл представляють у вигляді дисплею одновалентним чином з часток нитчастого фагу у вигляді злиттів з продуктом гена III Μ13, упакованим у кожній частинці. Потім ці представлені фагом мутеїни піддають скринінгу на їх біологічну активність (наприклад, афінність зв'язування). Аланін-скануючий мутагенез може виконуватися для ідентифікації залишків гіперваріабельних областей, які істотно сприяють зв'язуванню антигену. Альтернативно або на додаток може бути корисним аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації точок контакту 97484 56 між антитілом і антигеном. Залишки такого контакту і сусідні залишки є кандидатами на заміну відповідно до розроблених тут способів. Після генерування таких мутеїнів панель мутеїнів піддають скринінгу, як описано тут, і антитіла з переважаючими властивостями в одному або декількох релевантных аналізах можуть бути відібрані для додаткового розвитку. Змінена ефекторна функція Розглядаються й інші модифікації антитіла. Наприклад, може бути бажаною модифікація антитіла за даним винаходом стосовно ефекторної функції, наприклад, для посилення ефективності антитіла у лікуванні раку. Наприклад, в Fc-область можуть бути введені залишок(ки) цистеїну, що дозволяють утворення міжланцюжкових дисульфідних зв'язків у цій області. Генероване таким чином гомодимерне антитіло може мати поліпшену здатність інтерналізації і/або збільшені комплементопосередковане убивання клітин і антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC). Див. Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) і Shopes, В. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерні антитіла з підвищеною активністю можуть бути також одержані з використанням гетеробіфункціональних зшивальних агентів, як описано у Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Альтернативно, може бути сконструйоване антитіло, що має подвійні Fc-області і може за допомогою цього мати посилені здатності лізису комплементу і ADCC. Див. Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Крім того, було показано, що послідовності в області CDR можуть змусити антитіло зв'язуватися з МНС Класу II і запускати небажану хелперну Т-клітинну реакцію. Консервативна заміна може дозволити антитілу зберігати активність зв'язування, але все ще втрачати його здатність запуску небажаної Т-клітинної реакції. Див. також статтю Steplewski et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85(13):4852-6, включену сюди як посилання в її повному вигляді, що описує химерні антитіла, в яких варіабельна область імуноглобуліну миші з'єднана з константними областями гамма 1, гамма 2, гамма 3 і гамма 4 імуноглобуліну людини. У деяких варіантах здійснення винаходу може бути бажаним застосування фрагмента антитіла, а не інтактного антитіла, наприклад, для збільшення проникнення у пухлину. У цьому випадку може бути бажана модифікація фрагмента антитіла, наприклад, для збільшення його напівперіоду існування у сироватці, додавання молекул, таких як ПЕГ або інші водорозчинні полімери, у тому числі полісахаридні полімери, до фрагментів антитіл для збільшення напівперіоду існування. Це може бути також досягнуто, наприклад, включенням епітопу зв'язування рецептора порятунку у фрагмент антитіла (наприклад, мутацією придатної області у фрагменті антитіла або включенням цього епітопу у пептидну мітку, яку потім зливають з фрагментом антитіла на іншому кінці або у середині, наприклад, за допомогою ДНК або пептидного синтезу) (див., наприклад, WO 96/32478). Цей епітоп зв'язування рецептора порятунку переважно утворює область, в якій один або декі 57 лька залишків амінокислоти з однієї або декількох петель домену Fc перенесені у відповідне положення фрагменту антитіла. Ще більш переважно переносять три або більше залишків епітопу з однієї або двох петель Fc-домену. Ще більш переважно епітоп береться з СН2-домену Fc-області (наприклад, IgG) і переноситься в область СH1, СH3 або VH, або більш ніж в одну таку область, антитіла. Альтернативно, цей епітоп береться з СН2домену Fc-області і переноситься в С. sub. Lобласть або V. sub. L-область, або в обидві, цього фрагменту антитіла. Див. також міжнародні заявки WO 97/34631 і WO 96/32478, які описують Fcваріанти і їх взаємодії з рецептором порятунку. Таким чином, антитіла за винаходом можуть містити Fc-область людини, консенсусну частину Fc або його мутеїн, що зберігає здатність взаємодіяти з рецептором реутилізації Fc, у тому числі мутеїни, в яких цистеїни, що беруть участь в утворенні дисульфідних зв'язків, модифіковані або видалені, і/або в які доданий met на N-кінці і/або видалені одна або декілька з N-кінцевих 20 амінокислот, і/або видалені області, які взаємодіють з комплементом, такі як сайт зв'язування C1q, і/або видалений сайт ADCC [див., наприклад, Molec. Immunol. 29 (5):633-9 (1992)]. Антитіла класу IgG можуть також включати в себе відмінну константну область, наприклад, антитіло IgG2 може бути модифіковане для надання константної області lgG1 або IgG4. У випадку lgG1 модифікації константної області, зокрема, шарнірної області або СН2-області, можуть збільшувати або зменшувати ефекторну функцію, у тому числі активність ADCC і/або CDC. В інших варіантах здійснення константну область IgG2 модифікують для зменшення утворення агрегатів антитіло-антиген. У випадку IgG4 модифікації константної області, зокрема шарнірної області, можуть зменшувати утворення напів-антитіл. У конкретних зразкових варіантах здійснення забезпечене мутування шарнірної послідовності IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys у шарнірну послідовність lgG1 Cys-Pro-Pro-Cys. Попередні дослідження картували сайт зв'язування на IgG людини і миші для FcR первинно у нижній шарнірній області, що складається з залишків IgG 233-239. Інші дослідження припускали додаткові широкі сегменти, наприклад, Gly316Lys338 для Fc-рецептора І людини, Lys274-Arg301 і Tyr407-Arg416 для Fc-рецептора III людини, або виявляли декілька специфічних залишків поза нижнім шарніром, наприклад, Asn297 і Glu318 для мишачого IgG2b, що взаємодіє з мишачим Fcрецептором II. Повідомлялася 3,2-Å кристалічна структура Fc-фрагменту lgG1 людини зі зміненими у напрямку диференціювання залишками lgG1 Leu234-Ser239, Asp265-Glu269, Asn297-Thr299 і Аlа327-Іlе332 Fc-рецептора IIΘΑ людини як така, що бере участь у зв'язуванні з Fc-рецептором IIΘΑ. На підставі кристалічної структури було зроблене припущення, що поряд із залишками нижнього шарніру (Leu234-Gly237) залишки у петлях FG СН2-домену IgG (залишки 326-330) і ВС (залишки 265-271) можуть відігравати роль у зв'язуванні з Fc-рецептором IIА. Див. роботу Shields et al., J. 97484 58 Biol. Chem., 276(9):6591-6604 (2001), включену сюди як посилання у повному вигляді. Мутація залишків у сайтах зв'язування Fc-рецептора може приводити до зміненої ефекторної функції, наприклад, до зміненої активності ADCC або CDC, або до зміненого напівперіоду життя. Як описано вище, потенційні мутації включають інсерцію, делецію або заміну в одному або декількох залишках, у тому числі заміну аланіном, консервативну заміну, неконсервативну заміну або заміну відповідного амінокислотного залишку у тому самому положенні залишком відмінного підкласу IgG (наприклад, заміну залишку lgG1 відповідним залишком IgG2 у цьому положенні). Shields et al. повідомляли, що залишки lgG1, що беруть участь у зв'язуванні всіх Fc-рецепторів людини, розташовані у домені СН2, проксимальному стосовно шарніра, і попадають у дві категорії наступним чином: 1) положення, які можуть взаємодіяти з усіма FcR, включають в себе Leu234Pro238, Ala327 і Pro329 (і, можливо, Asp265); 2) положення, які впливають на характер або положення вуглеводу, включають Asp265 і Asn297. Додаткові залишки lgG1, які впливають на зв'язування з Fc-Рецептором II, є наступними: (найбільша дія) Arg255, Thr256, Glu258, Ser267, Asp270, Glu272, Asp280, Arg292, Ser298 і (менша дія) His268, Asn276, His285, Asn286, Lys290, Gln295, Arg301, Thr307, Leu309, Asn315, Lys322, Lys326, Pro331, Ser337, Ala339, Ala378 і Lys414. A327Q, A327S, P329A, D265A і D270A зменшували зв'язування. Крім залишків, ідентифікованих вище для всіх FcR, додатковими залишками lgG1, які зменшували зв'язування з Fc-рецептором IIΘΑ на 40% або більше, є наступні: Ser239, Ser267 (тільки Gly), His268, Glu293, Gln295, Tyr296, Arg301, Val303, Lys338 і Asp376. Мутеїни, які поліпшували зв'язування з FcRIIIA, включають в себе Т256А, K290А, S298A, Е333А, K334А і А339Т. Lys414 показував 40% зменшення зв'язування для FcRIIA і FcRIIB, Arg416 - 30% зменшення для FcRIIA і FcRIIIA, Gln419 - 30% зменшення стосовно FcRIIA і 40% зменшення стосовно FcRIIB, і Lys360 - 23% поліпшення стосовно FcRIIIA. Див. також Presta et al., Biochem. Soc. Trans. (2001) 30, 487-490. Наприклад, патент США № 6194551, включений сюди як посилання у повному вигляді, описує мутеїни зі зміненою ефекторною функцією, що містять мутації в Fc-області IgG людини, у положенні амінокислот 329, 331 або 322 (з використанням нумерації Кабата), деякі з яких проявляли зменшене зв'язування C1q або зменшену активність CDC. Як інший приклад, патент США № 6737056, включений сюди як посилання в його повному вигляді, описує мутеїни з ефекторною функцією або зв'язуванням Fc-гамма-рецептора, що містять мутації в Fc-області IgG людини, у положенні амінокислот 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 або 439 (з використанням нумерації Кабата), деякі з яких 59 проявляють профілі зв'язування рецептора, асоційовані зі зменшеною активністю ADCC або CDC. Стверджується, що з них мутація у положенні амінокислоти 238, 265, 269, 270, 327 або 329 зменшує зв'язування з FcRI, мутація у положенні амінокислоти 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 або 439 зменшує зв'язування з FcRII, а мутація у положенні амінокислоти 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 або 437 зменшує зв'язування з FcRIII. Патент Сполучених Штатів № 5624821, включений сюди як посилання в його повному вигляді, повідомляє, що активність зв'язування C1q мишачого антитіла може бути змінена мутацією амінокислотного залишку 318, 320 або 322 важкого ланцюга і заміна залишку 297 (Asn) приводить до видалення літичної активності. Публікація заявки на патент Сполучених Штатів № 20040132101, включена сюди як посилання в її повному вигляді, описує мутеїни з мутаціями в амінокислотних положеннях 240, 244, 245, 247, 262, 263, 266, 299, 313, 325, 328 або 332 (з використанням нумерації Кабата) або положеннях 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 або 332 (з використанням нумерації Кабата), з яких мутації у положеннях 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 269, 296, 297, 298, 299, 313, 325, 327, 328, 329, 330 або 332 можуть зменшувати активність ADCC або зменшувати зв'язування з Fc-гамма-рецептором. Стаття Chappel et al., Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88(20):9036-40, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що цитофільна активність lgG1 є властивістю, властивою домену СН2 його важкого ланцюга. Єдина точкова мутація у будь-якому з амінокислотних залишків 234-237 lgG1 значимо знижувала або виключала його активність. Була потрібна заміна всіх із залишків 234-237 lgG1 (LLGG) в IgG2 і IgG4 для відновлення повної активності зв'язування. Спостерігали, що антитіло IgG2, що містить повну послідовність ELLGGP (залишки 233-238), є більш активним, ніж lgG1 дикого типу. Стаття Isaacs et al., J Immunol. 1998; 161(8):3862-9, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутації у мотиві, критичному для зв'язування Fc-гамма-R (глутамат 233 у пролін, лейцин/фенілаланін 234 у валін і лейцин 235 в аланін), повністю запобігали виснаженню клітин-мішеней. Мутація глутамату 318 в аланін елімінувала ефекторну функцію мишачого IgG2b і також зменшувала активність IgG4 людини. Стаття Armour et al., Mol Immunol. 2003; 40(9):585-93, включена сюди як посилання в її повному вигляді, ідентифікувала мутеїни lgG1, які взаємодіють з активуючим рецептором, Fc-гаммаRIIa, щонайменше у 10 разів менш ефективно, ніж lgG1 дикого типу, але їх зв'язування з інгібуючим рецептором, Fc-гамма-RIIb, зменшується тільки у 4 рази. Мутації були одержані в області амінокислот 233-236 і/або у положеннях амінокислот 327, 330 і 97484 60 331. Див. також WO 99/58572, включений сюди як посилання в його повному вигляді. Стаття Xu et al., J Biol Chem. 1994; 269(5):3469-74, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутування Pro331 lgG1 у Ser помітно зменшувало зв'язування C1q і фактично елімінувало літичну активність. На відміну від цього, заміна Pro замість Ser331 в IgG4 надавала часткову літичну активність (40%) мутеїну IgG4 Pro331. Стаття Schuurman et al., Mol Immunol. 2001; 38(1):1-8, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутування одного з цистеїнів шарнірної області, що бере участь в утворенні зв'язку між важкими ланцюгами, Cys226, у серин приводило до більш стабільного зв'язку між важкими ланцюгами. Мутування шарнірної послідовності IgG4 Cys-Pro-Ser-Cys у шарнірну послідовність lgG1 Cys-Pro-Pro-Cys також помітно стабілізує ковалентну взаємодію між важкими ланцюгами. Стаття Angal et al., Mol Immunol. 1993; 30(1): 105-8, включена сюди як посилання в її повному вигляді, повідомляє, що мутування серину у положенні амінокислоти 241 в IgG4 у пролін (що виявляється у цьому положенні в lgG1 і IgG2) приводило до одержання гомогенного антитіла, а також подовженого напівперіоду існування у сироватці і поліпшення розподілу у тканині у порівнянні з вихідним химерним IgG4. Даний винахід розглядає також одержання молекул антитіл зі зміненою вуглеводною структурою, що приводить до зміненої ефекторної активності, у тому числі молекул антитіл з відсутнім або зменшеним фукозилюванням, які проявляють поліпшену активність ADCC. У даній галузі відомі різні шляхи для виконання цього. Наприклад, ефекторна активність ADCC опосередковується зв'язуванням молекули антитіла з рецептором FcRIII, яке, як було показано, залежить від вуглеводної структури N-зв'язаного глікозилювання при Asn297 СН2-домену. Нефукозильоване антитіло зв'язує цей рецептор зі збільшеною афінністю і запускає FсRIII-опосередковані ефекторні функції більш ефективно, ніж нативні, фукозильовані антитіла. Наприклад, рекомбінантне одержання нефукозильованого антитіла у клітинах СНО, в яких фермент альфа-1,6-фукозилтрансфераза був зруйнований нокаутом, приводить до антитіла зі збільшеною у 100 разів активністю ADCC [YamaneOhnuki et al., Biotechnol Bioeng. 2004 Sep 5; 87(5):614-22]. Подібні ефекти можуть бути одержані зменшенням активності цього або інших ферментів у шляху фукозилювання, наприклад, за допомогою siRNA або обробки антисмисловою РНК, конструюванням клітинних ліній з нокаутом ферменту (ферментів) або культивуванням з селективними інгібіторами глікозилювання [Rothman et al., Mol Immunol. 1989 Dec; 26(12):1113-23]. Деякі штами клітин-хазяїнів, наприклад, Lee13 або щуряча гібридомна клітинна лінія YB2/0, продукують антитіла з більш низькими рівнями фукозилювання. Shields et al., J Biol Chem. 2002 Jul 26; 277(30):26733-40; Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003 Jan 31; 278(5):3466-73. Було також визначе
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюIsolated antibody that binds the extracellular domain of prlr
Автори англійськоюBedinger, Daniel, Damiano, Jason, Luqman, Mohammad, Masat, Linda, Mirza, Amer, Nonet, Genevieve
Назва патенту російськоюВыделенное антитело, которое связывает внеклеточный домен prlr
Автори російськоюБединджер Дениэл, Дамиано Джейсон, Лукман Мохаммад, Масат Линда, Мирза Амер, Ноне Женевьев
МПК / Мітки
МПК: C12N 15/13, A61P 35/00, C07K 16/18, A61K 39/395
Мітки: зв'язує, яке, антитіло, виділене, позаклітинний, домен
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/123-97484-vidilene-antitilo-yake-zvyazueh-pozaklitinnijj-domen-prlr.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Виділене антитіло, яке зв’язує позаклітинний домен prlr</a>
Моноклональне антитіло, яке спричиняє апоптоз кров’яних клітин, що містять ядро та інтегрин-пов’язаний протеїн людини (іпп), фрагмент моноклонального антитіла, гібридома, яка продукує моноклональне антитіло (ва
Номер патенту: 72192
Опубліковано: 15.02.2005
Автори: Фукушіма Наоші, Уно Шінсуке
МПК: C12P 21/08, C12N 5/20, C07K 16/28
Мітки: протеїн, містять, спричиняє, антитіло, іпп, моноклональне, гібридома, продукує, яка, яке, антитіла, ядро, кров'яних, ва, клітин, фрагмент, апоптоз, людини, інтегрин-пов'язаний, моноклонального
Формула / Реферат:
1. Моноклональне антитіло, яке зв’язується із інтегрин-пов’язаним протеїном людини (ІПП) і спричиняє апоптоз кров'яних клітин, що містять ядро та ІПП.2. Моноклональне антитіло за п.1, яке відрізняється тим, що антитіло отримують способом, що включає:а) імунізацію тварин з використанням ІПП людини як сенсибілізуючого антигена,б) одержання гібридом;в) відбір антитіл, що розпізнають ІПП людини та спричиняють апоптоз...
Химерне антитіло проти cd40 людини, молекула нуклеїнової кислоти, вектор експресії, фармацевтична композиція для лікування захворювань, опосередкованих т-клітинами, яка містить химерне антитіло
Номер патенту: 71909
Опубліковано: 17.01.2005
Автори: Херріс Лінда Дж., Ву Херрен, Холленбау Даєн, Беррі Карен К., Бейорет Юрген, Аруффо Аледжандро А., Торн Барбара А., Уоткінс Джеффрі Д., Сайдек Ентоні В., Хьюз Уільям Д.
МПК: C07K 14/725, A61K 39/395, C07K 16/28, C07K 14/46, A61P 29/00, A61P 43/00, C12N 15/09, C12N 15/13, A61P 19/02, A61P 37/06, C12N 1/21, A61P 37/02
Мітки: т-клітинами, кислоти, молекула, лікування, фармацевтична, антитіло, химерне, композиція, вектор, опосередкованих, людини, нуклеїнової, містить, яка, захворювань, експресії
Формула / Реферат:
1. Варіабельна ділянка легкого ланцюга химерного антитіла, що зв’язується з CD40 людини, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NО:1 (Фіг. 4а).2. Варіабельна ділянка важкого ланцюга химерного антитіла, що зв’язується з CD40 людини, яка містить амінокислотну послідовність SEQ ID NО:2 (Фіг. 4b).3. Химерне антитіло, що зв'язується з CD40 людини, яке містить легкий і важкий ланцюг, причому зазначений легкий ланцюг містить ...
Виділене антитіло або фрагмент антитіла, що специфічно зв’язуються з фрагментом поліпептиду rg1, імунокон’югат, який включає виділене антитіло або фрагмент антитіла, способи вибіркового руйнування клітини, ліку
Номер патенту: 85527
Опубліковано: 10.02.2009
Автори: Паркес Дебора, Харкінс Річард, Перрі Гордон, Шнайдер Дуглас В., Штейнбрехер Ренате
МПК: C12N 1/19, C12N 15/09, A61P 35/04, C12N 5/10, A61P 13/08, C07K 16/18, C07K 14/47, G01N 33/53, A61K 39/395
Мітки: клітині, антитіло, включає, фрагмент, поліпептиду, імунокон'югат, антитіла, виділене, зв'язуються, специфічно, вибіркового, способи, руйнування, фрагментом, ліку
Формула / Реферат:
1. Виділене антитіло або фрагмент антитіла, що специфічно зв'язуються з фрагментом поліпептиду RG1, вибраним із групи, яка складається з:(а) біологічно або імунологічно активного фрагменту поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, яка відповідає частині, але не всій амінокислотній послідовності, представленій на фіг. 2 (SEQ ID NO: 2);(б) фрагменту поліпептиду, який складається з амінокислот 28-46 послідовності,...
Виділене антитіло, яке специфічно зв’язує gdf-8, та його застосування
Номер патенту: 91815
Опубліковано: 10.09.2010
Автори: Расселл Керолайн, Девіс Монік В., Сонг Кенінг, Фельдман Гейтруіда М., Вальге-Архер Фія, Вольфман Нейл М., Гроув-Бріджес Крісті, Філд Енн
МПК: A61K 39/395, A61P 21/00, A61P 3/00, C07K 16/22
Мітки: gdf-8, специфічно, зв'язує, яке, виділене, антитіло, застосування
Формула / Реферат:
1. Виділене антитіло, яке специфічно зв'язує GDF-8, що містить щонайменше одну амінокислотну послідовність, вибрану із групи, що складається з:a) SEQ ID NO:14;b) SEQ ID NO:26;c) амінокислотної послідовності, що містить SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 і SEQ ID NO:36, де одна або декілька амінокислот у SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 або SEQ ID NO:36...
Виділене антитіло, яке специфічно зв’язує рецептор-2 тrail (tr-2)
Номер патенту: 97096
Опубліковано: 10.01.2012
Автори: Фолтц Ян, Янг Ксяо-донг, Фостер Стівен, Фенг Ксяо, Гліняк Брайан, Кетчем Рендалл Р., Фіч Елісон, Вонг-Медден Шерон
МПК: A61P 35/00, C07K 16/28, C12N 5/10, C12P 21/08, C12N 15/13, A61K 39/395
Мітки: антитіло, рецептор-2, tr-2, тrail, специфічно, зв'язує, яке, виділене
Формула / Реферат:
1. Виділене антитіло, що включає важкий ланцюг та легкий ланцюг, де важкий ланцюг містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 30, а легкий ланцюг містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 64, і антитіло специфічно зв'язує рецептор-2 TRAIL (TR-2).2. Виділене антитіло за пунктом 1, яке відрізняється тим, що антитіло є повністю людським антитілом.3. Фармацевтична композиція, що містить антитіло за будь-яким з пунктів 1 або...
Попередній патент: Похідне піримідину як інгібітор pi3k і його застосування
Наступний патент: Одержання даних в системах множинного доступу з частотним розділенням
Випадковий патент: Спосіб конверсії вуглеводнів паровим риформінгом та установка для його здійснення