Спосіб стимулювання мієлінізації та диференціювання олігодендроцитів шляхом застосування семафорину 6a
Формула / Реферат
1. Спосіб in vitro стимулювання проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів, що включає приведення в контакт зазначених олігодендроцитів з ефективною кількістю композиції, що включає ізольований поліпептид семафорин 6А ("Sema6A"), причому поліпептид Sema6A має амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну амінокислотній послідовності порівняння, вибраній з групи, що включає:
i) від 56 до 417 в SEQ ID NO: 2;
ii) від a до 417 в SEQ ID NO:2;
iii) від b до 417 в SEQ ID NO:2;
iv) від 1 до 417 в SEQ ID NO:2;
v) від 56 до c в SEQ ID NO: 2;
vi) від a до c в SEQ ID NO: 2;
vii) від b до c в SEQ ID NO: 2;
viii) від 1 до c в SEQ ID NO: 2;
ix) від 56 до c' в SEQ ID NO: 6;
x) від a до c' в SEQ ID NO: 6;
xi) від b до c' в SEQ ID NO: 6;
xii) від 1 до c' в SEQ ID NO: 6;
xiii) від 56 до d в SEQ ID NO: 2;
xiv) від a до d в SEQ ID NO: 2;
xv) від b до d в SEQ ID NO: 2;
xvi) від 1 до d в SEQ ID NO: 2;
xvii) від 56 до d' в SEQ ID NO: 6;
xviii) від a до d' в SEQ ID NO: 6;
xix) від b до d' в SEQ ID NO: 6;
xx) від 1 до d' в SEQ ID NO: 6;
xxi) від 56 до e в SEQ ID NO: 2;
xxii) від a до e в SEQ ID NO: 2;
xxiii) від b до e в SEQ ID NO: 2;
xxiv) від 1 до e в SEQ ID NO: 2;
xxv) від 56 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvi) від a до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvii) від b до e' в SEQ ID NO: 6;
xxviii) від 1 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxix) від 56 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxx) від a до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxi) від b до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxii) від 1 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxiii) від 56 до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxiv) від a до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxv) від b до e''' в SEQ ID NO: 6;
xxxvi) від 1 до e''' в SEQ ID NO: 8;
xxxvii) від 56 до f в SEQ ID NO: 2;
xxxviii) від a до f в SEQ ID NO: 2;
xxxix) від b до f в SEQ ID NO: 2;
xl) від 1 до f в SEQ ID NO: 2;
xli) від 56 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlii) від a до f' в SEQ ID NO: 6;
xliii) від b до f' в SEQ ID NO: 6;
xliv) від 1 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlv) від 56 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvi) від a до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvii) від b до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlviii) від 1 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlix) від 56 до f''' в SEQ ID NO: 4;
l) від a до f''' в SEQ ID NO: 4;
li) від b до f''' в SEQ ID NO: 4;
lii) від 1 до f''' в SEQ ID NO: 4;
liii) від 56 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
liv) від a до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lv) від b до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvi) від 1 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvii) від 56 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lviii) від a до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lix) від b до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lx) від 1 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lxi) від 56 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxii) від a до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiii) від b до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiv) від 1 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxv) від 56 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvi) від a до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvii) від b до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxviii) від 1 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxix) від 19 до 417 в SEQ ID NO: 2;
lxx) від 19 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxi) від 19 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxii) від 19 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxiii) від 19 до 647 в SEQ ID NO:2;
lxxiv) від 19 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxv) від 19 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxvi) від 19 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxvii) від 56 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxviii) від 56 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxix) від 56 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxx) від 56 до 647 в SEQ ID NO:2;
lxxxi) від 56 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxxii) від 56 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxxiii) від 56 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxxiv) від 1 до 649 в SEQ ID NO: 2;
lxxxv) від 1 до 590 в SEQ ID NO: 6;
lxxxvi) від 1 до 594 в SEQ ID NO: 8;
lxxxvii) від 1 до 666 в SEQ ID NO: 4;
lxxxviii) від 18 до 703 в SEQ ID NO: 2;
lxxxix) від 18 до 644 в SEQ ID NO: 6;
xc) від 18 до 648 в SEQ ID NO: 8;
xci) від 18 до 720 в SEQ ID NO: 4;
xcii) від 1 до 648 в SEQ ID NO: 2;
xciii) від 1 до 589 в SEQ ID NO: 6;
xciv) від 1 до 593 в SEQ ID NO: 8;
xcv) від 1 до 665 в SEQ ID NO: 4; та
xcvi) комбінації двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей;
причому a являє собою будь-яке ціле число між 24 і 56, b являє собою будь-яке ціле число між 19 і 21, c являє собою будь-яке ціле число між 472 і 512, c' являє собою будь-яке ціле число між 418 і 453, d являє собою будь-яке ціле число між 514 і 569, d' являє собою будь-яке ціле число між 455 і 510, e являє собою будь-яке ціле число між 570 і 650, e' являє собою будь-яке ціле число між 511 і 591, e'' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 595, e''' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 667; f являє собою будь-яке ціле число між 647 і 671, f' являє собою будь-яке ціле число між 588 і 612, f'' являє собою будь-яке ціле число між 592 і 616, f''' являє собою будь-яке ціле число між 664 і 688.
2. Спосіб in vitro стимулювання олігодендроцит-опосередкованої мієлінізації нейронів, що включає здійснення контакту суміші нейронів і олігодендроцитів з ефективною кількістю композиції, що включає ізольований поліпептид Sema6A, причому поліпептид Sema6A має амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну амінокислотній послідовності порівняння, вибраній з групи, що включає:
i) від 56 до 417 в SEQ ID NO: 2;
ii) від a до 417 в SEQ ID NO: 2;
iii) від b до 417 в SEQ ID NO: 2;
iv) від 1 до 417 в SEQ ID NO: 2;
v) від 56 до c в SEQ ID NO: 2;
vi) від a до c в SEQ ID NO: 2;
vii) від b до c в SEQ ID NO: 2;
viii) від 1 до c в SEQ ID NO: 2;
ix) від 56 до c' в SEQ ID NO: 6;
x) від a до c' в SEQ ID NO: 6;
xi) від b до c' в SEQ ID NO: 6;
xii) від 1 до c' в SEQ ID NO: 6;
xiii) від 56 до d в SEQ ID NO: 2;
xiv) від a до d в SEQ ID NO: 2;
xv) від b до d в SEQ ID NO: 2;
xvi) від 1 до d в SEQ ID NO: 2;
xvii) від 56 до d' в SEQ ID NO: 6;
xviii) від a до d' в SEQ ID NO: 6;
xix) від b до d' в SEQ ID NO: 6;
xx) від 1 до d' в SEQ ID NO: 6;
xxi) від 56 до e в SEQ ID NO: 2;
xxii) від a до e в SEQ ID NO: 2;
xxiii) від b до e в SEQ ID NO: 2;
xxiv) від 1 до e в SEQ ID NO: 2;
xxv) від 56 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvi) від a до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvii) від b до e' в SEQ ID NO: 6;
xxviii) від 1 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxix) від 56 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxx) від a до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxi) від b до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxii) від 1 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxiii) від 56 до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxiv) від a до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxv) від b до e''' в SEQ ID NO: 6;
xxxvi) від 1 до e''' в SEQ ID NO: 8;
xxxvii) від 56 до f в SEQ ID NO: 2;
xxxviii) від a до f в SEQ ID NO: 2;
xxxix) від b до f в SEQ ID NO: 2;
xl) від 1 до f в SEQ ID NO: 2;
xli) від 56 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlii) від a до f' в SEQ ID NO: 6;
xliii) від b до f' в SEQ ID NO: 6;
xliv) від 1 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlv) від 56 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvi) від a до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvii) від b до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlviii) від 1 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlix) від 56 до f''' в SEQ ID NO: 4;
l) від a до f''' в SEQ ID NO: 4;
li) від b до f''' в SEQ ID NO: 4;
lii) від 1 до f''' в SEQ ID NO: 4;
liii) від 56 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
liv) від a до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lv) від b до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvi) від 1 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvii) від 56 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lviii) від a до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lix) від b до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lx) від 1 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lxi) від 56 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxii) від a до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiii) від b до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiv) від 1 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxv) від 56 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvi) від a до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvii) від b до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxviii) від 1 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxix) від 19 до 417 в SEQ ID NO: 2;
lxx) від 19 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxi) від 19 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxii) від 19 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxiii) від 19 до 647 в SEQ ID NO:2;
lxxiv) від 19 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxv) від 19 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxvi) від 19 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxvii) від 56 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxviii) від 56 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxix) від 56 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxx) від 56 до 647 в SEQ ID NO: 2;
lxxxi) від 56 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxxii) від 56 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxxiii) від 56 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxxiv) від 1 до 649 в SEQ ID NO: 2;
lxxxv) від 1 до 590 в SEQ ID NO: 6;
lxxxvi) від 1 до 594 в SEQ ID NO: 8;
lxxxvii) від 1 до 666 в SEQ ID NO: 4;
lxxxviii) від 18 до 703 в SEQ ID NO: 2;
lxxxix) від 18 до 644 в SEQ ID NO: 6;
xc) від 18 до 648 в SEQ ID NO: 8;
xci) від 18 до 720 в SEQ ID NO: 4;
xcii) від 1 до 648 в SEQ ID NO: 2;
xciii) від 1 до 589 в SEQ ID NO: 6;
xciv) від 1 до 593 в SEQ ID NO: 8;
xcv) від 1 до 665 в SEQ ID NO: 4; та
xcvi) комбінації двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей;
причому a являє собою будь-яке ціле число між 24 і 56, b являє собою будь-яке ціле число між 19 і 21, c являє собою будь-яке ціле число між 472 і 512, c' являє собою будь-яке ціле число між 418 і 453, d являє собою будь-яке ціле число між 514 і 569, d' являє собою будь-яке ціле число між 455 і 510, e являє собою будь-яке ціле число між 570 і 650, e' являє собою будь-яке ціле число між 511 і 591, e'' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 595, e''' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 667; f являє собою будь-яке ціле число між 647 і 671, f' являє собою будь-яке ціле число між 588 і 612, f'' являє собою будь-яке ціле число між 592 і 616, f''' являє собою будь-яке ціле число між 664 і 688.
3. Спосіб in vivo стимулювання проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів або мієлінізації нейронів у ссавця, що включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості композиції, що включає ізольований поліпептид Sema6A, або композиції, що включає виділений полінуклеотид, який кодує поліпептид Sema6A, причому поліпептид Sema6A має амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну амінокислотній послідовності порівняння, вибраній з групи, що включає:
i) від 56 до 417 в SEQ ID NO: 2;
ii) від a до 417 в SEQ ID NO: 2;
iii) від b до 417 в SEQ ID NO: 2;
iv) від 1 до 417 в SEQ ID NO: 2;
v) від 56 до c в SEQ ID NO: 2;
vi) від a до c в SEQ ID NO: 2;
vii) від b до c в SEQ ID NO: 2;
viii) від 1 до c в SEQ ID NO: 2;
ix) від 56 до c' в SEQ ID NO: 6;
x) від a до c' в SEQ ID NO: 6;
xi) від b до c' в SEQ ID NO: 6;
xii) від 1 до c' в SEQ ID NO: 6;
xiii) від 56 до d в SEQ ID NO: 2;
xiv) від a до d в SEQ ID NO: 2;
xv) від b до d в SEQ ID NO: 2;
xvi) від 1 до d в SEQ ID NO: 2;
xvii) від 56 до d' в SEQ ID NO: 6;
xviii) від a до d' в SEQ ID NO: 6;
xix) від b до d' в SEQ ID NO: 6;
xx) від 1 до d' в SEQ ID NO: 6;
xxi) від 56 до e в SEQ ID NO: 2;
xxii) від a до e в SEQ ID NO: 2;
xxiii) від b до e в SEQ ID NO: 2;
xxiv) від 1 до e в SEQ ID NO: 2;
xxv) від 56 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvi) від a до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvii) від b до e' в SEQ ID NO: 6;
xxviii) від 1 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxix) від 56 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxx) від a до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxi) від b до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxii) від 1 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxiii) від 56 до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxiv) від a до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxv) від b до e''' в SEQ ID NO: 6;
xxxvi) від 1 до e''' в SEQ ID NO: 8;
xxxvii) від 56 до f в SEQ ID NO: 2;
xxxviii) від a до f в SEQ ID NO: 2;
xxxix) від b до f в SEQ ID NO: 2;
xl) від 1 до f в SEQ ID NO: 2;
xli) від 56 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlii) від a до f' в SEQ ID NO: 6;
xliii) від b до f' в SEQ ID NO: 6;
xliv) від 1 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlv) від 56 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvi) від a до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvii) від b до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlviii) від 1 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlix) від 56 до f''' в SEQ ID NO: 4;
l) від a до f''' в SEQ ID NO: 4;
li) від b до f''' в SEQ ID NO: 4;
lii) від 1 до f''' в SEQ ID NO: 4;
liii) від 56 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
liv) від a до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lv) від b до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvi) від 1 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvii) від 56 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lviii) від a до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lix) від b до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lx) від 1 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lxi) від 56 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxii) від a до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiii) від b до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiv) від 1 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxv) від 56 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvi) від a до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvii) від b до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxviii) від 1 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxix) від 19 до 417 в SEQ ID NO: 2;
lxx) від 19 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxi) від 19 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxii) від 19 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxiii) від 19 до 647 в SEQ ID NO: 2;
lxxiv) від 19 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxv) від 19 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxvi) від 19 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxvii) від 56 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxviii) від 56 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxix) від 56 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxx) від 56 до 647 в SEQ ID NO: 2;
lxxxi) від 56 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxxii) від 56 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxxiii) від 56 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxxiv) від 1 до 649 в SEQ ID NO: 2;
lxxxv) від 1 до 590 в SEQ ID NO: 6;
lxxxvi) від 1 до 594 в SEQ ID NO: 8;
lxxxvii) від 1 до 666 в SEQ ID NO: 4;
lxxxviii) від 18 до 703 в SEQ ID NO: 2;
lxxxix) від 18 до 644 в SEQ ID NO: 6;
xc) від 18 до 648 в SEQ ID NO: 8;
xci) від 18 до 720 в SEQ ID NO: 4;
xcii) від 1 до 648 в SEQ ID NO: 2;
xciii) від 1 до 589 в SEQ ID NO: 6;
xciv) від 1 до 593 в SEQ ID NO: 8;
xcv) від 1 до 665 в SEQ ID NO: 4; та
xcvi) комбінації двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей;
причому a являє собою будь-яке ціле число між 24 і 56, b являє собою будь-яке ціле число між 19 і 21, c являє собою будь-яке ціле число між 472 і 512, c' являє собою будь-яке ціле число між 418 і 453, d являє собою будь-яке ціле число між 514 і 569, d' являє собою будь-яке ціле число між 455 і 510, e являє собою будь-яке ціле число між 570 і 650, e' являє собою будь-яке ціле число між 511 і 591, e'' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 595, e''' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 667; f являє собою будь-яке ціле число між 647 і 671, f' являє собою будь-яке ціле число між 588 і 612, f'' являє собою будь-яке ціле число між 592 і 616, f''' являє собою будь-яке ціле число між 664 і 688.
4. Спосіб in vivo лікування захворювання, розладу або ушкодження, асоційованого з дисмієлінізацією або демієлінізацією, або загибеллю олігодендроцитів, або відсутністю їх диференціювання, або захворювання, розладу або ушкодження, при яких спостерігається руйнування мієліну у ссавця, що включає введення ссавцю, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості композиції, що включає ізольований поліпептид Sema6A, або композиції, що включає виділений полінуклеотид, що кодує поліпептид Sema6A, причому поліпептид Sema6A має амінокислотну послідовність, щонайменше на 80 % ідентичну амінокислотній послідовності порівняння, вибраній з групи, що включає:
i) від 56 до 417 в SEQ ID NO: 2;
ii) від a до 417 в SEQ ID NO: 2;
iii) від b до 417 в SEQ ID NO: 2;
iv) від 1 до 417 в SEQ ID NO: 2;
v) від 56 до c в SEQ ID NO: 2;
vi) від a до c в SEQ ID NO: 2;
vii) від b до c в SEQ ID NO: 2;
viii) від 1 до c в SEQ ID NO: 2;
ix) від 56 до c' в SEQID NO: 6;
x) від a до c' в SEQ ID NO: 6;
xi) від b до c' в SEQ ID NO: 6;
xii) від 1 до c' в SEQ ID NO: 6;
xiii) від 56 до d в SEQ ID NO: 2;
xiv) від a до d в SEQ ID NO: 2;
xv) від b до d в SEQ ID NO: 2;
xvi) від 1 до d в SEQ ID NO: 2;
xvii) від 56 до d' в SEQ ID NO: 6;
xviii) від a до d' в SEQ ID NO: 6;
xix) від b до d' в SEQ ID NO: 6;
xx) від 1 до d' в SEQ ID NO: 6;
xxi) від 56 до e в SEQ ID NO: 2;
xxii) від a до e в SEQ ID NO: 2;
xxiii) від b до e в SEQ ID NO: 2;
xxiv) від 1 до e в SEQ ID NO: 2;
xxv) від 56 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvi) від a до e' в SEQ ID NO: 6;
xxvii) від b до e' в SEQ ID NO: 6;
xxviii) від 1 до e' в SEQ ID NO: 6;
xxix) від 56 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxx) від a до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxi) від b до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxii) від 1 до e'' в SEQ ID NO: 8;
xxxiii) від 56 до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxiv) від a до e''' в SEQ ID NO: 4;
xxxv) від b до e''' в SEQ ID NO: 6;
xxxvi) від 1 до e''' в SEQ ID NO: 8;
xxxvii) від 56 до f в SEQ ID NO: 2;
xxxviii) від a до f в SEQ ID NO: 2;
xxxix) від b до f в SEQ ID NO: 2;
xl) від 1 до f в SEQ ID NO: 2;
xli) від 56 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlii) від a до f' в SEQ ID NO: 6;
xliii) від b до f' в SEQ ID NO: 6;
xliv) від 1 до f' в SEQ ID NO: 6;
xlv) від 56 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvi) від a до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlvii) від b до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlviii) від 1 до f'' в SEQ ID NO: 8;
xlix) від 56 до f''' в SEQ ID NO: 4;
l) від a до f''' в SEQ ID NO: 4;
li) від b до f''' в SEQ ID NO: 4;
lii) від 1 до f''' в SEQ ID NO: 4;
liii) від 56 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
liv) від a до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lv) від b до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvi) від 1 до 1000 в SEQ ID NO: 2;
lvii) від 56 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lviii) від a до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lix) від b до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lx) від 1 до 1047 в SEQ ID NO: 4;
lxi) від 56 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxii) від a до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiii) від b до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxiv) від 1 до 971 в SEQ ID NO: 6;
lxv) від 56 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvi) від a до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxvii) від b до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxviii) від 1 до 975 в SEQ ID NO: 8;
lxix) від 19 до 417 в SEQ ID NO: 2;
lxx) від 19 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxi) від 19 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxii) від 19 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxiii) від 19 до 647 в SEQ ID NO:2;
lxxiv) від 19 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxv) від 19 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxvi) від 19 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxvii) від 56 до 472 в SEQ ID NO: 2;
lxxviii) від 56 до 551 в SEQ ID NO: 2;
lxxix) від 56 до 492 в SEQ ID NO: 6;
lxxx) від 56 до 647 в SEQ ID NO: 2;
lxxxi) від 56 до 588 в SEQ ID NO: 6;
lxxxii) від 56 до 592 в SEQ ID NO: 8;
lxxxiii) від 56 до 664 в SEQ ID NO: 4;
lxxxiv) від 1 до 649 в SEQ ID NO: 2;
lxxxv) від 1 до 590 в SEQ ID NO: 6;
lxxxvi) від 1 до 594 в SEQ ID NO: 8;
lxxxvii) від 1 до 666 в SEQ ID NO: 4;
lxxxviii) від 18 до 703 в SEQ ID NO: 2;
lxxxix) від 18 до 644 в SEQ ID NO: 6;
xc) від 18 до 648 в SEQ ID NO: 8;
xci) від 18 до 720 в SEQ ID NO: 4;
xcii) від 1 до 648 в SEQ ID NO: 2;
xciii) від 1 до 589 в SEQ ID NO: 6;
xciv) від 1 до 593 в SEQ ID NO: 8;
xcv) від 1 до 665 в SEQ ID NO: 4; та
xcvi) комбінації двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей;
причому a являє собою будь-яке ціле число між 24 і 56, b являє собою будь-яке ціле число між 19 і 21, c являє собою будь-яке ціле число між 472 і 512, c' являє собою будь-яке ціле число між 418 і 453, d являє собою будь-яке ціле число між 514 і 569, d' являє собою будь-яке ціле число між 455 і 510, e являє собою будь-яке ціле число між 570 і 650, e' являє собою будь-яке ціле число між 511 і 591, e'' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 595, e''' являє собою будь-яке ціле число між 570 і 667; f являє собою будь-яке ціле число між 647 і 671, f' являє собою будь-яке ціле число між 588 і 612, f'' являє собою будь-яке ціле число між 592 і 616, f''' являє собою будь-яке ціле число між 664 і 688.
5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, у якому поліпептид Sema6A зв'язується з поліпептидом плексин-А2.
6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, у якому амінокислотна послідовність щонайменше на 90 % ідентична амінокислотній послідовності порівняння.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, у якому амінокислотна послідовність ідентична амінокислотній послідовності порівняння.
8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, у якому поліпептид Sema6A є циклічним пептидом.
9. Спосіб за п. 8, у якому циклічний пептид включає молекулу біотину, приєднану до N-кінця, і цистеїновий залишок, приєднаний до С-кінця циклічного пептиду.
10. Спосіб за п. 8, у якому циклічний пептид включає цистеїновий залишок, приєднаний до N- та С-кінців циклічного пептиду, причому N-кінцевий цистеїновий залишок є ацетильованим.
11. Спосіб за п. 9 або 10, у якому C-кінцевий цистеїн містить приєднаний залишок NH2.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, у якому поліпептид приєднаний до залишку, що не є Sema6A.
13. Спосіб за п. 12, у якому залишок, що не є Sema6A, являє собою гетерологічний поліпептид, злитий з поліпептидом Sema6A.
14. Спосіб за п. 13, у якому гетерологічний поліпептид вибирають з групи, що включає поліпептид імуноглобуліну або його фрагмент, поліпептид сироваткового альбуміну або його фрагмент, поліпептид, що направляє, сповіщуючий поліпептид, і поліпептид, що полегшує очищення, та комбінацію двох або більше зазначених гетерологічних поліпептидів.
15. Спосіб за п. 14, у якому гетерологічний поліпептид вибирають з групи, що включає c-myc, людську плацентарну лужну фосфатазу, імуноглобуліновий шарнір і Fc-ділянку, та комбінацію двох або більше зазначених гетерологічних поліпептидів.
16. Спосіб за п. 12, у якому залишок, що не є Sema6A, являє собою полімер, зв'язаний з поліпептидом Sema6A.
17. Спосіб за п. 16, у якому полімер вибраний з групи, що включає поліалкіленгліколь, сахаридний полімер і поліпептид.
18. Спосіб за п. 17, у якому полімер являє собою поліалкіленгліколь.
19. Спосіб за п. 18, у якому поліалкіленгліколь являє собою поліетиленгліколь (ПЕГ).
20. Спосіб за п. 16, у якому поліпептид Sema6A зв'язаний з 1, 2, 3 або 4 полімерами.
21. Спосіб за будь-яким з пп. 16-20, у якому загальна молекулярна маса полімерів становить від 5000 до 100000 Да.
22. Спосіб за п. 3 або п. 4, у якому у ссавця діагностовано захворювання, розлад або ушкодження, при яких спостерігається дисмієлінізація, демієлінізація або нейродегенерація.
23. Спосіб за п. 22, у якому захворювання, розлад або ушкодження вибирають з групи, що включає розсіяний склероз (MS), прогресуючу мультифокальну лейкоенцефалопатію (PML), енцефаломієліт (EPL), мієліноліз моста головного мозку (CPM), адренолейкодистрофію, хворобу Александера, хворобу Пелуцеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоїдно-клітинну лейкодистрофію (хвороба Краббе), уолерівську дегенерацію, ретробульбарний неврит, поперечний мієліт, бічний аміотрофічний склероз (ALS), хворобу Хантінгтона, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, травму спинного мозку, травму головного мозку, променеве ураження, неврологічні ускладнення хіміотерапії, інсульт, ішемічну нейропатію зорового нерва, нестачу вітаміну Е, синдром нестачі ізольованого вітаміну Е, синдром Бесена-Корнцвейга, синдром Марчіафава-Бігнамі, метахроматичну лейкодистрофію, невралгію трійчастого нерва і параліч Белла.
24. Спосіб за п. 22, у якому захворювання, розлад або ушкодження являє собою розсіяний склероз (MS).
25. Спосіб за будь-яким з пп. 3-24, у якому композицію вводять за допомогою болюсної ін'єкції або хронічного вливання.
26. Спосіб за п. 25, у якому композицію вводять безпосередньо в центральну нервову систему.
27. Спосіб за п. 26, у якому композицію вводять безпосередньо в осередок хронічного ураження розсіяного склерозу.
28. Спосіб за п. 1 або п. 2, у якому приведення в контакт включає (a) трансфекцію олігодендроцитів полінуклеотидом, що кодує поліпептид Sema6A і містить активну послідовність для контролю експресії, та (b) ефективну експресію поліпептиду Sema6A.
29. Спосіб за п. 3 або п. 4, у якому полінуклеотид кодує поліпептид Sema6A і містить активну послідовність для контролю експресії.
30. Спосіб за п. 29, у якому полінуклеотид вводять як експресійний вектор.
31. Спосіб за п. 30, у якому експресійний вектор являє собою вірусний вектор.
32. Спосіб за п. 3 або п. 4, у якому введення включає (a) забезпечення культивованих клітин-хазяїнів, що включають полінуклеотид, причому клітини-хазяїни експресують поліпептид Sema6A; та (b) введення культивованих клітин-хазяїнів у ссавця, причому поліпептид Sema6A експресується у зазначеному ссавці.
33. Спосіб за п. 32, у якому введення клітин-хазяїнів проводиться в ділянку нервової системи, уражену захворюванням, розладом або ушкодженням, або безпосередньо близько від неї.
34. Спосіб за п. 32 або 33, у якому культивовані клітини-хазяїни створені з використанням способу, що включає (a) трансформацію або трансфекцію реципієнтних клітин-хазяїнів полінуклеотидом, зазначеним у п. 28 або п. 29, або вектором, зазначеним у п. 30 або 31, та (b) культивування клітин, підданих трансформації або трансфекції.
35. Спосіб за будь-яким із пп. 32-34, у якому культивовані клітини-хазяїни походять з ссавця, якого необхідно лікувати.
36. Спосіб за будь-яким із пп. 3-35, причому поліпептид Sema6A експресується в кількості, достатній для того, щоб зменшити інгібування проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів у ділянці нервової системи, ураженій захворюванням, розладом або ушкодженням, або безпосередньо близько від неї.
37. Спосіб за будь-яким з пп. 3-36, у якому поліпептид Sema6A експресується в кількості, достатній для того, щоб зменшити інгібування мієлінізації нейронів у ділянці нервової системи, ураженій захворюванням, розладом або ушкодженням, або безпосередньо близько від неї.
38. Спосіб за п. 31, у якому вірусний вектор вибирають з групи, що складається з аденовірусного вектора, альфавірусного вектора, ентеровірусного вектора, пестивірусного вектора, лентивірусного вектора, бакуловірусного вектора, герпесвірусного вектора, паповавірусного вектора, поксвірусного вектора.
39. Спосіб за п. 38, у якому герпесвірусний вектор вибирають з групи, що складається з вектора на основі вірусу простого герпесу і вектора на основі вірусу Епштейна-Барра.
40. Спосіб за п. 38, у якому поксвірусний вектор являє собою вектор на основі вірусу вісповакцини.
41. Спосіб за будь-яким з пп. 30, 31 або 38-40, у якому вектор вводять відповідно до шляху, вибраного з групи, що складається з місцевого введення, внутрішньоочного введення, парентерального введення, інтратекального введення, субдурального введення і підшкірного введення.
Текст
Реферат: Винахід належить до способів лікування захворювань, розладів або ушкоджень, при яких спостерігається демієлінізація й дисмієлінізація, у тому числі розсіяного склерозу, шляхом застосування поліпептиду Sema6A. UA 99452 C2 (12) UA 99452 C2 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід відноситься до нейробіології, неврології й фармакології. Більш детально, він відноситься до способів лікування захворювань, що охоплюють мієлінізацію центральної нервової системи, шляхом застосування поліпептиду семафорин 6А ("Sema6A"). Багато захворювань нервової системи асоційовані з демієлінізацією і дисмієлінізацією, включаючи розсіяний склероз (MS), прогресуючу мультифокальну лейкоенцефалопатію (PML), енцефаломієліт (EPL), мієлоліз моста головного мозку (CPM), Уолеровську дегенерацію й деякі спадкові захворювання, такі як адренолейкодистрофія, хвороба Александера й хвороба Пеліцеуса-Мерцбахера (PMZ). Серед цих захворювань найпоширенішим є розсіяний склероз, яким страждають приблизно 2,5 мільйони людей у світі. Зазвичай розсіяний склероз починається з ураження нервової системи з епізодами загострень і ремісій, який переходить потім у хронічну фазу з посиленим ушкодженням нервової системи. Розсіяний склероз асоційований з руйнуванням мієліну, олігодендроцитів й аксонів у межах ділянок хронічного ушкодження. Демієлінізація, що спостерігається при розсіяному склерозі не завжди постійна, і на ранніх стадіях розвитку захворювання відзначалася ремієлінізація. Для ремієлінізації нейронів центральної нервової системи (ЦНС) необхідні олігодендроцити. Стосовно розсіяного склерозу зараз доступні різні способи впливу, що змінюють перебіг захворювання, включаючи використання кортикостероїдів й імуномодуляторів, таких як інтерферон-бета. Додатково, на основі центральної ролі олігодендроцитів та мієлінізації у розвитку розсіяного склерозу, робилися спроби розробки терапевтичного впливу для збільшення кількості олігодендроцитів або для посилення мієелінізації (див., наприклад, Cohen et al., U.S. Pat. No. 5,574,009; Chang et al., N. Engl. J. Med. 346:165-73 (2002)). Проте, вкрай необхідно розробляти додаткові способи лікування розсіяного склерозу. Семафорини являють собою зв'язані з мембраною білки, що контролюють аксональне наведення й міграцію клітин (Kerjan et al., Nat. Neursci. 8(11): 1516-1524 (2005)). Багато трансмембранних семафоринів експресуються при розвитку ЦНС, однак про їх функції in vivo відомо мало. Клас 6 семафоринів містить в собі чотири білки, Sema6A-Sema6D, споріднені до трансмембранних семафорин безхребетних (Fiore & Puschel. Front. Biosci. 8:2484-2499 (2003)). Всі семафорини містять семафориновий домен (Sema) і плексин-семафорин-інтегриновий домен (PSI) (знайдений у плексинах, семафоринах й інтегринах) в N-термінальній екстраклітинній частині. Плексини являють собою родину молекул (плексинову родину), розповсюджених серед різних видів тварин (Murakami et al., Dev. Dynam. 220: 246-258 (2001)). Плексини підрозділяються на чотири підродини, плексин -А, -B, -C й -D. У миші й людини виділені чотири представники підродини плексин-А (плексин-A1, -A2, -A3 й -A4) (див. Kameyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 226: 396-402 (1996); Kameyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 226: 524-529 (1996); Maestrini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 674-678 (1996); Tamagnone et al., Cell 99:71-80 (1999); і Suto et al., Mech. Dev. 120: 385-396 (2003)). Ектодомени білків підродини плексин-А містять ділянку розміром приблизно 500 амінокислотних залишків, що демонструє значну гомологію із сема-доменом, спільним для семафоринів (Murakami et al., Develop. Dyn. 220: 246-258 (2001)). Відомо, що плексини типу А взаємодіють із семафоринами класу 6 (Toyofuku et al., Genes Develop. 18: 435-447 (2004)). Наприклад, Suto й ін. показали, що плексин-А4 є безпосереднім рецептором для Sema6A (J. Neurosci. 25(14): 3628-3637 (2005)). Даний винахід базується на відкритті, що семафорин 6А (Sema6A) експресується в олігодендроцитах й регулює їх диференціювання, виживання та/або мієлінізацію аксонів. Більш того, деякі поліпептиди Sema6A стимулюють виживання, проліферацію та/або диференціювання олігодендроцитів, а також мієлінізацію нейронів. Винахід, що базується на цих відкриттях, в цілому відноситься до способів лікування захворювань, пов'язаних з демієлінізацію та/або дисмієлінізацію (наприклад, розсіяного склерозу), за допомогою застосування поліпептиду Sema6A. У деяких варіантах реалізації, винахід включає спосіб стимулювання проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів, включаючи здійснення контакту олігодендроцитів з ефективною кількістю композиції, що містить виділений поліпептид Sema6A. В інших варіантах реалізації, винахід включає спосіб стимулювання мієлінізації нейронів, опосередкований олігодендроцитами, включаючи здійснення контакту суміші нейронів й олігодендроцитів з ефективною кількістю композиції, що включає виділений поліпептид Sema6A. Даний винахід орієнтований на спосіб стимулювання проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів у ссавців, або на спосіб стимулювання мієлінізації нейронів у 1 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ссавців, включаючи застосування до ссавців, які потребують даного стимулювання, ефективної кількості композиції, що включає поліпептид Sema6A. Також винахід включає спосіб лікування захворювання, розлади або ушкодження, асоційовані з дисмієлінізацію або демієлінізацію, або асоційовані із загибеллю олігодендроцитів або відсутністю їх диференціювання у ссавців, включаючи застосування до ссавців, які потребують даного лікування, ефективних кількостей композиції, що включає поліпептид Sema6A. Далі, винахід включає спосіб лікування захворювання, розлади або ушкодження, при яких відбувається руйнування мієліну в ссавців, який включає застосування терапевтично ефективної кількості композиції, що включає поліпептид Sema6A. Крім того, у даний винахід включений спосіб, при якому поліпептид Sema6A зв'язується з поліпептидом плексин-А2 або поліпептидом плексин-А4. В інших варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A є ізольованим. Подальші варіанти реалізації винаходу включають спосіб лікування захворювання, розлади або ушкодження, при яких відбувається руйнування олігодендроцитів або мієліну, шляхом генної терапії in vivo, яка включає застосування до ссавців (у місці захворювання, розладу або ушкодження, або поблизу нього) вектора, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид Sema6A, для того, щоб поліпептид Sema6A експресувався з цією нуклеотидною послідовністю в ссавця у кількості, достатній для активізації подовження аксонів нейронів, розташованих у місці ушкодження або поблизу нього. У деяких варіантах реалізації, даний винахід включає спосіб стимулювання проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів, або стимулювання мієлінізації нейронів у ссавців, включаючи застосування до ссавців, що потребують даного лікування, ефективних кількостей композиції, яка включає полінуклеотид, що кодує поліпептид Sema6A. Також винахід включає спосіб лікування захворювання, розлади або ушкодження, асоційовані з дисмієлінізацію або демієлінізацію, або асоційовані із загибеллю олігодендроцитів або відсутністю їх диференціювання в ссавців, що включає застосування до ссавців, які потребують даного лікування, терапевтично ефективної кількості композиції, яка включає полінуклеотид, що кодує поліпептид Sema6A. Винахід далі включає спосіб лікування захворювання, розлади або ушкодження, при яких відбувається руйнування мієліну в ссавців, що включає застосування терапевтично ефективної кількості композиції, яка включає полінуклеотид, що кодує поліпептид Sema6A. У деяких варіантах реалізації, поліпептид Sema6A з даного винаходу зв'язується з поліпептидом плексин-А2 або поліпептидом плексин-А4. Полінуклеотид, який використовується у даному способі даного винаходу, може бути ізольованим. У деяких варіантах реалізації винаходу, вектор являє собою вірусний вектор, обраний із групи, що складається із аденовірусного вектора, альфавірусного вектора, ентеровірусного вектора, пестивірусного вектора, лентивірусного вектора, бакуловірусного вектора, герпесвірусного вектора, вектора на основі вірусу Епштейна-Барр, паповавірусного вектора, поксвірусного вектора, вектора на основі вірусу коров'ячої віспи, і вектора на основі вірусу простого герпесу. У деяких варіантах реалізації винаходу, хвороба, розлад, ушкодження або захворювання вибираються із групи, що включає розсіяний склероз (MS), прогресуючу мультифокальну лейкоенцефалопатію (PML), енцефаломієліт (EPL), мієлоліз моста головного мозку (CPM), адренолейкодистрофію, хворобу Александера, хворобу Пеліцеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоїдно-клітинну лейкодистрофію (хвороба Краббе), Уолеровську дегенерацію, ретробульбарний неврит, поперечний мієліт, бічний аміотрофічний склероз (ALS), хворобу Хантінгтона, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, травми спинного мозку, травми головного мозку, променеве ураження, неврологічні ускладнення хіміотерапії, інсульт, ішемічну нейропатію зорового нерва, нестачу вітаміну Е, синдром нестачі ізольованого вітаміну Е, AR, синдром Бесена-Корнцвейга, синдром Марчіафава-Бігнамі, метахроматичну лейкодистрофію, невралгію тройнічного нерва й параліч Белла. У деяких варіантах реалізації винаходу, хазяйські клітини, що культивуються, беруться із ссавця, який підлягає лікуванню. Деякі поліпептиди Sema6A включають, не обмежуючись ними, фрагменти поліпептидів Sema6A, варіанти або похідні поліпептидів Sema6A, позбавлені трансмембранного домена й цитоплазматичного домена. Поліпептиди Sema6A включають поліпептиди, що містять (i) сигнальну послідовність, (ii) sema-домен, (iii) PSI-домен, (iv) екстраклітинний домен, (v) трансмембранний домен, (vi) цитоплазматичний домен, та (vii) комбінацію двох і більше доменів. У деяких варіантах реалізації винаходу, у поліпептиду Sema6A відсутні сигнальна послідовності, sema-домен, PSI-домен, трансмембранний домен, цитоплазматичний домен, або 2 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 комбінація двох і більше доменів. У деяких варіантах, поліпептид Sema6A містить Sema-домен, але позбавлений сигнальної послідовності, PSI-послідовності, трансмембранного домена й цитоплазматичного домена. У деяких варіантах, поліпептид Sema6A містить амінокислотні залишки 1-649 послідовності SEQ ID NO: 2. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A застосовують за допомогою болюсної ін'єкції або хронічного вливання. У деяких варіантах, поліпептид Sema6A застосовується безпосередньо на центральній нервовій системі. У деяких варіантах, поліпептид Sema6A застосовується безпосередньо в ділянці хронічного ушкодження при розсіяному склерозі. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A являє собою поліпептид злиття, що містить компонент, відмінний від Sema6A. У деяких варіантах, компонент, відмінний від Sema6A, вибирається із групи, що складається з компонента антитіла Ig, копмонента сироваткового альбуміну, цільового компонента, репортерного компонента, і компонента, що сприяє очищенню. У деяких варіантах, компонент антитіла Ig являє собою шарнір й Fcкомпонент. У деяких варіантах, поліпептиди з даного винаходу кон'юговані з полімером. У деяких варіантах, полімер вибирається із групи, що складається з поліалкеніл-гліколю, цукрового полімеру й поліпептиду. У деяких варіантах, поліалкеніл-гліколь являє собою поліетиленгліколь (ПЕГ). У деяких варіантах, поліпептиди з даного винаходу кон'юговані з 1, 2, 3 або 4 полімерами. У деяких варіантах, загальна молекулярна вага полімерів становить від 5,000 Да до 100,000 Да. Фіг. 1 являє собою порівняння послідовностей ізоформ поліпептиду Sema6A людини, тобто ізоформ A-D. Фіг. 2 являє собою порівняння послідовностей ізоформ поліпептиду Sema6A миші, тобто ізоформ 1-3. Фіг. 3: Експресія Sema6A у нервовій системі миші. Експресію Sema6A у нервовій системі мишей P15 аналізували за допомогою гібридизації in situ. Більшість клітин, експресуючих Sema6A, виявлені в білій речовині. Клітини, експресуючі Sema6A у білій речовині, являють собою олігодендроцити. Фіг. 4A-4C: Імунологічний аналіз олігодендроцитів Sema6A +/- (A) або Sema6A -/- (B), експресуючих мієліновий протеоліпідний протеїн (PLP), у передній комісурі (АС) мишей Р16. (C) - кількісне визначення клітин, експресуючих PLP в АС на різних стадіях, а саме P16, P30 й P45. Фіг. 5A-5D: (A) - In vitro дозрівання олігодендроцитів Sema6A -/-. Фрактальна розмірність (FD) була виміряна після 48 годин. Ліві стовпчики відбивають FD олігодендроцитів Sema6A -/-, праві стовпчики відбивають FD олігодендроцитів Sema6A +/-. (B) – олігодендроцити Sema6A -/- на стадії 48 годин, візуалізовані за допомогою фазово-контрастної мікроскопії й імунофарбування з антитілами анти-О4. (C): In vitro дозрівання олігодендроцитів Sema6A -/- на стадії 24 годин й 48 годин. Ліві стовпчики відбивають стадію 24 годин, праві – 48 годин. (D): Олігодендроцити Sema6A+/- на стадії 48 годин, візуалізовані за допомогою фазово-контрастної мікроскопії й імунофарбування з антитілами анти-О4. Фіг. 6A-6C: Мієлінізація в спільних культурах клітин задньокорінцевих гангліїв (DRG) та олігодендроцитів з додаванням Sema6A-Fc у різних дозах, (A) негативний контроль, (B) 0.1 мкг/мл; і (C) 0.3 мкг/мл. Ступінь мієлінізації показана за допомогою імунофарбування з атитілами анти-MBP. Фіг. 7. Мишей піддавали дії купризону й досліджували експресію Sema6A при демієлінізації й ремієлінізації. Кількість клітин, експресуючих Sema6A, було виміряно на різних стадіях, а саме 3-6 тижнів. Фіг. 8. (A)-(B) In situ гібридизація з використанням рибопроби Sema6A у людській тканині, порушеній внаслідок розсіяного склерозу, і непорушеній тканині, при збільшенні x1 (A) та x10 (В); (C) імунофарбування людської тканини, порушеної внаслідок розсіяного склерозу, з використанням людського антитіла проти Sema6A при збільшенні x10. Фіг. 9A-D: (A) Вестерн-блот аналіз експресії поліпептиду плексин-А2 у мишей плексин-А2 +/+ (дикий тип), плексин-А2 нульовий нокаут (плексин-A2-/-) і мутанта по плексину-А2, що несе одиночну амінокислотну заміну (A396E) у семафориновому домені (NMF454); (B) вирівнювання послідовностей плексина-А2, плексина-А4, плексина-А1 і плексина-А3 з метою ідентифікації позиції аланіна (396); (C) аналіз зв'язування Sema6A з білком дикого типу плексин-А2, експресованим у клітинах COS; та (D) аналіз зв'язування Sema6A з мутантним білком плексинА2 A396E, експресованим у клітинах COS. 3 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Визначення Якщо не зазначено іншого, всі технічні й наукові терміни, що використані у тексті, мають те ж значення, що зазвичай зрозуміле фахівцями в галузі, до якої відноситься даний винахід. Дана заявка містить визначення, якими потрібно керуватися у випадку протиріч. Терміни в однині включають те ж саме, що у множині, і терміни в множині включають те ж саме, що й у однині, якщо іншого не потрібно по контексту. Всі публікації, патенти й інші джерела, згадані у тексті, включені за допомогою посилання у всій повноті для всіх цілей, ніж якби кожна окрема публікація або патентна заявка була специфічно й індивідуально зазначена як така, що включається за допомогою посилання. Хоча для реалізації або тестування винаходу можна застосовувати способи й матеріали, подібні або еквівалентні описаним у даній заявці, способи й матеріали, що підходять, описані нижче. Матеріали, способи й приклади наведені лише з метою ілюстрації, і їх не слід розглядати як обмеження винаходу. Інші ознаки й переваги даного винаходу стануть зрозумілі з докладного опису й формули винаходу. Для подальшої характеристики даного винаходу наведені наступні терміни й визначення. Слід зазначити, що конкретний термін відноситься до одного або декількох об'єктів; наприклад термін "поліпептид" варто розуміти як такий, що представляє один або декілька поліпептидів. Точно так само, конкретний термін, а також поняття "один або більше" й "щонайменше один" використовуються у тексті як взаємозамінні. У даному описі й формулі винаходу, слово "включати", або його варіації, наприклад, "включає" або "що включає", означають включення будь-якого із зазначених об'єктів або групи об'єктів, але не виключення будь-яких інших об'єктів або груп об'єктів. У даному описі й формулі винаходу, термін "складається з" та його варіації, такі як "складатися з" або "складається з", означають включення будь-якого із зазначених об'єктів або групи об'єктів, причому жоден з додаткових об'єктів або груп об'єктів не може бути доданий до описуваного способу, структури або композиції. У даному описі й формулі винаходу, термін "складається по суті з" та його варіації, такі як "складатися по суті з" або "що складається по суті з", означають включення будь-якого із зазначених об'єктів або групи об'єктів і необов'язкове включення будь-яких інших зазначених об'єктів або групи об'єктів, які принципово не змінюють основи або оригінальні особливості описуваного способу, структури або композиції. У значенні, що використовується у тексті, "антитіло" означає інтактний імуноглобулін або його антиген-єднальний фрагмент. Антитіла, зазначені в даному винаході, можуть відноситися до будь-якого ізотипу або класу (наприклад, D, G, E й A) або підкласу (наприклад, G1-4, A1-2) і можуть мати легкий ланцюг каппа () або лямбда (). У значенні, що використовується у тексті, "Fc" означає частину важкого ланцюга імуноглобуліну, що містить один або більше доменів CH1, CH2 й CH3 константного регіону важкого ланцюга. Наприклад, ділянка константного регіону важкого ланцюга антитіла, що виходить при розщепленні папаїном. У значенні, що використовується у тексті, "олюднене антитіло" означає антитіло, у якому щонайменше частина послідовності, що не є людською, заміщена на послідовність, що належить людині. Приклади способів створення олюднених антитіл можна знайти в United States Patent Nos. 6,054,297, 5,886,152 й 5,877,293. У значенні, що використовується у тексті, "химерне антитіло" означає антитіло, що містить один або більше ділянок з першого антитіла й один або більше ділянок із щонайменше одного іншого антитіла. Перше антитіло й додаткові антитіла можуть належати одному або різним видам тварин. У значенні, що використовується у тексті, "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості, ефективної при необхідному дозуванні й необхідному періоді часу для досягнення бажаного терапевтичного ефекту. Терапевтичним ефектом може бути, наприклад, зменшення симптомів, продовжене виживання, збільшена рухливість тощо. Терапевтичний ефект не обов'язково є "лікуванням". У значенні, що використовується у тексті, "профілактично ефективна кількість" відноситься до кількості, ефективної при необхідному дозуванні й необхідному періоді часу, для досягнення бажаного профілактичного ефекту. Зазвичай, оскільки профілактичне дозування застосовується до розвитку захворювання, або на його ранніх стадіях, профілактично ефективна кількість має менше значення, ніж терапевтично ефективна кількість. У значенні, що використовується у тексті, "полінуклеотид" означає нуклеотидну послідовність повнорозмірної до ДНК, включаючи нетрансльовані 5' й 3'-ділянки, що кодують послідовності, а також фрагменти, епітопи, домени й варіанти послідовностей нуклеїнової 4 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти. Полінуклеотид може являти собою як полірибонуклеотид, так і полідезоксирибонуклеотид, які можуть бути модифікованими або немодифікованими молекулами РНК або ДНК. Наприклад, полінуклеотиди можуть складатися з одно- і двухланцюгової ДНК, причому ДНК являє собою суміш одно- і двухланцюгових ділянок; із РНК, що також являє собою суміш одно- і двухланцюгових ділянок; з гібридних молекул, що складаються із ДНК та РНК, які можуть бути одноланцюговими, або, що більш типово, двухланцюговими, або сумішшю одно- та двухланцюгових ділянок. На додаток, полінуклеотиди можуть складатися із трьохланцюгових ділянок, що містять РНК або ДНК, або РНК разом із ДНК. Полінуклеотиди можуть також містити одну або декілька модифікованих основ у кістяку ДНК або РНК, модифікованих для стабільності або з інших причин. "Модифіковані" основи включають, наприклад, тритильовані основи й незвичайні основи, такі як інозин. У ДНК і РНК можна внести різноманітні модифікації; таким чином, поняття "полінуклеотид" охоплює форми, модифіковані хімічним, ензиматичним або метаболічним шляхом. У даному винаході, поліпептид може складатися з амінокислот, приєднаних один до одного пептидними зв'язками або модифікованими пептидними зв'язками, тобто пептидними ізостерами, і можуть містити амінокислоти, що не відносяться до 20 амінокислот, що кодують генами (наприклад, не існуючі у природі амінокислоти). Поліпептиди, які описуються в даному винаході, можуть бути модифіковані в ході природних процесів, таких як посттрансляційний процесінг, або з використанням підходів хімічних модифікацій, добре відомих фахівцям у даній галузі. Такі модифікації добре описані в різних текстах й, більш детально, у монографіях, а також у широко представленій науковій літературі. Модифікації можуть бути внесені в будь-яку ділянку поліпептиду, включаючи пептидний кістяк, бічні ланцюги амінокислот, і аміно- і карбокси-кінцеві ділянки. Переважно, той самий тип модифікації може бути представлений у тій же манері або в манері, що дещо відрізняється, у різних ділянках даного поліпептиду. Також, заданий поліпептид може містити кілька типів модифікації. Поліпептиди можуть бути розгалуженими, наприклад, у результаті убіквитинування, а також циклічними, з розгалуженнями або без них. Циклічні, розгалужені й розгалужені циклічні поліпептиди можуть утворитися в результаті природних посттрансляційних процесів, або можуть бути створені синтетичними способами. Модифікації включають ацетилування, ацилювання, АДФрибозилювання, амінування, ковалентне приєднання флавіну, ковалентне приєднання гему, ковалентне приєднання нуклеотиду або нуклеотидного похідного, ковалентне приєднання ліпіду або ліпідного похідного, ковалентне приєднання фосфотидилінозитолу, перехресне зшивання, циклізацію, утворення дисульфідних містків, деметилювання, утворення ковалентних перехресних зв'язків, утворення цистеїну, утворення піроглютамату, формілування, гамакарбоксилювання, глікозилювання, формування якоря GPI, гідроксилювання, іодування, метилювання, міристіолювання, окислювання, пегілювання, протеолітичний процесінг, фосфорилювання, пренілювання, рацемізація, приєднання селену, сульфатування, тРНКопосредковане додавання амінокислот до білків, наприклад, аргінілування й убіквітинування (див., наприклад, Proteins-Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)). Терміни "фрагмент", "варіант", "похідне" й "аналог" відносно поліпептиду Sema6A, що зазначений в даному винаході, включають будь-які поліпептиди, які зберігають щонайменше деяку імуногенність, тобто здатність індукувати імунну відповідь проти Sema6А, або що зберігають природну функцію Sema6A, наприклад, здатність зв'язуватися з будь-яким поліпептидом родини плексин-А, тобто плексином-А1, плексином-А2, плексином-А3 або плексином-А4. Прикладом природної функції Sema6A є його здатність зв'язуватися з поліпептидами плексин-А2 і плексин-А4. Поліпептиди Sema6A, як описано у тексті, можуть включати фрагмент, варіант або похідні молекули без обмежень, поки поліпептид Sema6A зберігає імуногенність або одну із природних функцій. Поліпептиди Sema6A, що описуються в даному винаході, можуть включати протеолітичні фрагменти Sema6A, делеційні фрагменти й, зокрема, фрагменти, які більш легко досягають місця своєї дії в організмі тварини. Поліпептидні фрагменти далі включають будь-яку частину поліпептиду, що містить антигенний або імуногенний епітоп нативного поліпептиду, включаючи лінійні, а також тривимірні епітопи. Поліпептиди Sema6A, що описуються в даному винаході, можуть містити варіанти ділянок Sema6A, включаючи фрагменти, описані вище, а також поліпептиди з амінокислотними послідовностями, порушеними внаслідок амінокислотних замін, делецій або вставок. Такі варіанти можуть існувати в природі, як алельні варіанти. Під "алельними варіантами" розуміються альтернативні форми гена, що займає певний локус у хромосомі організму (Genes 5 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)). Неіснуючі в природі варіанти можуть бути одержані з використанням відомих способів мутагенезу. Поліпептиди Sema6A можуть нести консервативні або неконсервативні заміни амінокислот, делеції або додаткові амінокислоти. Поліпептиди Sema6A, що описуються в даному винаході, можуть також включати похідні молекули. Наприклад, поліпептиди Sema6A з даного винаходу можуть включати ділянки Sema6A, змінені таким чином, щоб мати додаткові особливості, не знайдені в природних варіантах поліпептиду. Приклади цього включають білки злиття й білкові кон'югати. В даному дослідженні, поняття "поліпептидний фрагмент" або "білковий фрагмент" відноситься до короткої амінокислотної послідовності поліпептиду Sema6A. Білкові або поліпептидні фрагменти можуть бути "вільно стоячими", або бути частиною більшого поліпептиду, у якому фрагменти формують частину ділянки. Типові приклади поліпептидних фрагментів, що описуються у винаході, включають, наприклад, фрагменти, що складаються із приблизно 5 амінокислот, приблизно 10 амінокислот, приблизно 15 амінокислот, приблизно 20 амінокислот, приблизно 30 амінокислот, приблизно 40 амінокислот, приблизно 50 амінокислот, приблизно 60 амінокислот, приблизно 70 амінокислот, приблизно 80 амінокислот, приблизно 90 амінокислот, і приблизно 100 амінокислот. У значенні, що використовується у тексті, терміни "зв'язаний", "злитий", або "злиття" взаємозамінні. Ці терміни відносяться до з'єднання двох і більше елементів або компонентів, включаючи хімічну кон'югацію й рекомбінантні підходи. "Злиття в рамці" відноситься до з'єднання двох або більше відкритих рамок зчитування (ORF) з утворенням протяжної, більш довгої рамки зчитування, зі збереженням правильної рамки зчитування вихідної ORF. Таким чином, рекомбінантний білок, утворений у результаті злиття, є одиночним білком, що містить два або більше сегменти, які відносяться до поліпептидів, що кодуються вихідними ORF (сегменти яких не поєднуються в природних умовах). Хоча рамка зчитування, таким чином, є безперервною в межах двох злитих фрагментів, сегменти можуть бути фізично або просторово розділені за допомогою, наприклад, лінкерної послідовності в рамці зчитування. Застосовно до поліпептидів, термін "лінійна послідовність", або "послідовність", означає порядок амінокислот у поліпептиді в напрямку від аміно- до карбоксильного кінця, у якому сусідні залишки являють собою безперервну первинну структуру поліпептиду. Термін "експресія" у значенні, що використовується у тексті, відноситься до процесу, за допомогою якого ген продукує біохімічна речовина, наприклад, РНК або поліпептид. Цей процес включає будь-які прояви функціональної присутності гена в клітині, включаючи, без обмеження, нокдаун генів, а також тимчасову й стабільну експресію. Він також включає, без обмежень, транскрипцію гена в матричну РНК (мРНК), транспортну РНК (тРНК), малу шпильову РНК (мшРНК), малу інтерферуючу РНК (міРНК), або будь-який інший РНК-й продукт; і трансляцію такої мРНК у поліпептид(и). Якщо бажаний фінальний продукт є біохімічною речовиною, експресія включає створення цієї речовини й будь-яких його попередників. Під "суб'єктом", або "індивідуумом", або "твариною", або "пацієнтом", або "ссавцем", розуміється будь-який суб'єкт, зокрема, що відноситься до ссавців, відносно до якого бажане проведення діагностики, прогнозування або терапії. Суб'єкти, що відносяться до ссавців, включають, не обмежуючись ними, людей, одомашнених тварин, сільськогосподарсько-цінних тварин, диких тварин, спортивних тварин, свійських тварин, таких як собаки, кішки, морські свинки, кролики, пацюки, миші, коні, велика рогата худоба, корови; приматів, таких як людиноподібні мавпи, мавпи, орангутани й шимпанзе; тваринні сімейства псових, таких як собаки й вовки, сімейства котячих, таких як кішки, леви й тигри, сімейства непарнокопитих, таких як коні, осли й зебри; ведмедів; харчових тварин, таких як корови, свині й вівці; копитних, таких як олені й жирафи; гризунів, таких як миші, пацюки, хом'ячки й морські свинки тощо. У деяких варіантах реалізації винаходу, під ссавцями розуміють людські суб'єкти. Sema6A Винахід базується на відкритті факту, що поліпептиди Sema6A сприяють збільшенню числа олігодендроцитів за допомогою стимулювання їх виживання, проліферації та/або диференціювання. На додаток, винахідники відкрили, що поліпептиди Sema6A сприяють мієлінізації нейронів. Відомо, що існуючий у природі поліпептид Sema6A експресується в мозку, нирках, легенях і печінці, що розвиваються. Sema6A також виявляється в тканинах дорослих людей, наприклад, у шкірі (дендритні клітини) і в плацентарних тканинах з високою здатністю до регенерації. Людський ген Sema6A складається з 20 екзонів, включаючи 2 нетрансльованих екзона, що займають приблизно 60 т.п.н. послідовності генома на 5 хромосомі. Повнорозмірний людський поліпептид Sema6A складається із сигнальної послідовності, екстраклітинного домена, трансмембранного домена й цитоплазматичного домена. 6 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Екстраклітинний домен містить sema-домен і плексин-семафорин-інтегриновий домен (PSI). Повнорозмірні людські поліпептиди Sema6A варіюють у розмірі від приблизно 971 амінокислоти до приблизно 1049 амінокислот, залежно від варіанта (див. Фіг.1). Подібні варіанти існують для мишачого Sema6A (див., наприклад, Фіг. 2). Поліпептидна послідовність із 1030 амінокислот була описана як послідовність людського поліпептиду Sema6A, і була поміщена в базу даних Genbank під номером NP-065847. Послідовність людського поліпептиду Sema6A позначена тут як ізоформа А и SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує SEQ ID NO: 2. Поліпептидна послідовність із 1047 амінокислот була описана як варіант послідовності людського поліпептиду Sema6A, і була поміщена в базу даних Genbank під номером EAW48937. Поліпептид з 1047 амінокислот позначений тут як ізоформа B й SEQ ID NO: 4. Нуклеотидна послідовність, що кодує SEQ ID NO: 4, позначена SEQ ID NO: 3. Ще один варіант людського поліпептиду Sema6A, що складається із 971 амінокислоти, поміщений у базу даних Genbank під номером EAW48935. Поліпептид з 971 амінокислоти позначений тут як ізоформа C й SEQ ID NO: 6. Поліпептидна послідовність із 975 амінокислот була описана як варіант послідовності людського поліпептиду Sema6A, і була поміщена в базу даних Genbank під номером EAW48934. Поліпептид з 975 амінокислот позначений тут як ізоформа D й SEQ ID NO: 8. Варіанти людського Sema6A включають, не обмежуючись ними, поліпептид Sema6A ізоформи А з делецією після амінокислоти 1001, у результаті чого утворюється поліпептид з 1000 амінокислот (Nakayama et al., Genome Res. 12(11): 1773-1784 (2002); Strausberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99(26): 16899-16903 (2002)). Відомі також інші варіанти Sema6A (див., наприклад, Prislei et al. Mol Cancer Ther. 7(1): 233-241 (2007)). Також описана послідовність мишачого поліпептиду Sema6A і його варіанти. Мишачий поліпептид Sema6A з 1031 амінокислоти поміщений у базу даних UniProtKB/Swiss-Prot entry під номером O35464. Цей поліпептид позначений тут як ізоформа 1 і SEQ ID NO: 10. Нуклеотидна послідовність, що кодує SEQ ID NO: 10, позначена SEQ ID NO: 9. Ще одна поліпептидна послідовність із 1005 амінокислот описана як послідовність мишачого поліпептиду Sema6A і поміщена в базу даних Genbank під номером AF288666. Дана поліпептидна послідовність позначена як ізоформа 2 й SEQ ID NO: 12. Нуклеотидна послідовність, що кодує SEQ ID NO: 12, позначена SEQ ID NO: 11. Ще один варіант послідовності мишачого поліпептиду Sema6A поміщений у базу даних UniProtKB/Swiss-Prot entry під номером O35464. Дана поліпептидна послідовність позначена тут як ізоформа 3 й SEQ ID NO: 14. Нуклеотидна послідовність, що кодує SEQ ID NO: 14, позначена SEQ SEQ ID NO: 13. Варіанти мишачого Sema6A включають, не обмежуючись ними, поліпептиди з нижченаведеними мутаціями: A172V, L201P, N337D, S585N, Q685R, TK703-704SE, P735S, Q766E, I856T, або KSPNHGVNLVENLDSLPPKVPQREAS863-888ESSPYVLKQFSEAFNRQGIILSVAVE. Поліпептиди Sema6A, відомі в інших тварин, включають, не обмежуючись ними, поліпептиди шимпанзе, собаки й риби Danio rerio. Відомі варіанти поліпептидів Sema6A шимпанзе, наприклад, поміщені в базу даних Genbank під номерами XP_001150634, XP_001150901, XP_001150706, XP_001151177, XP_001151109, XP_001151041, XP_001150971 й XP_517889. У жодному разі не обмежуючими прикладами варіантів поліпептидів Sema6A собаки є послідовності, поміщені в базу даних Genbank під номерами XP_538552, XP_859002, XP_858964, XP_858921, XP_858886 й XP_858843. Поліпептиди Sema6A та їх варіанти можуть бути знайдені в інших тварин. Позначення функціональних доменів Sema6A визначені нижче: Таблиця 1 Приклади доменів Sema6A у людини Домен Сигнальна послідовність Sema-домен PSI-домен Трансмембранний домен Цитоплазматичний домен Sema6A (ізоформа A) 1030 а/к 1-18 56-472 514-551 650-670 671-1030 Sema6A (ізоформа B) 1047 а/к 1-18 56-472 514-551 667-687 688-1047 7 Sema6A (ізоформа C) 971 а/к 1-18 56-418 456-492 591-611 612-971 Sema6A (ізоформа D) 975 а/к 1-18 56-472 514-551 595-615 616-975 UA 99452 C2 Таблиця 2 Приклади доменів Sema6A у миші Sema6A (ізоформа 1) 1031 а/к Сигнальна послідовність 1-18 Sema-домен 56-474 PSI-домен 514-547 Трансмембранний домен 650-670 Цитоплазматичний домен 671-1031 Домен 5 Sema6A (ізоформа 2) 1005 а/к 1-18 56-448 488-521 624-644 645-1005 Sema6A (ізоформа 3) 976 а/к 1-18 56-474 514-547 595-615 616-976 Як може оцінити фахівець у даній галузі, початкові й кінцеві залишки доменів, наведені у тексті, можуть відрізнятися залежно від комп'ютерної програми, яка використовується для моделювання, або від способу, який використовується для визначення домена. Тому, різні функціональні домени Sema6A можуть відрізнятися від зазначених вище. Наприклад, функціональні домени людського поліпептиду Sema6A ізоформи А, тобто SEQ ID NO: 2, можуть варіювати так: Таблиця 3 Варіації послідовності функціональних доменів SEQ ID NO: 2 Сигнал. посл. SMART 1-18 PROSITE n/a pFam n/a UniPort/ 1-18 Swiss Port NCBI (NP n/a 065847) Klostermann 5-20 et al. Sema-домен PSI-домен 56-487 24-512 56-491 514-569 n/a 514-565 24-512 n/a 56-472 42-564 Трансмемб- Цитоплазма- Ділянка ниранний дотичний до- зької складмен мен ності 648-670 671-1030 937-952 n/a n/a n/a n/a n/a n/a 650-670 514-551 n/a n/a 648-671 671-1030 n/a 671-1030 n/a n/a n/a 10 На основі варіацій послідовності SEQ ID NO: 2, фахівець, що має базові навички в даній галузі, може виявити варіації послідовностей SEQ ID NOs: 4, 6 й 8. Послідовності функціональних доменів в SEQ ID NO: 10, тобто ізоформи 1 мишачого поліпептиду Sema6A, варіюють наступним чином: 15 Таблиця 4 Варіації послідовності функціональних доменів SEQ ID NO: 10 Сигнал. посл. Sema-домен SMART PROSITE pFam UniProtKB/ Swiss Prot NCBI (NP 061214) PSI-домен 1-18 56-487 24-512 56-491 514-569 n/a 514-569 1-18 24-512 n/a n/a n/a n/a 56-474 Трансмембранний домен 648-670 n/a n/a 650-670 514-547 n/a Цитоплазма- Ділянка низьтичний домен кої складності 671-1031 n/a n/a 671-1031 n/a 937-951 n/a n/a n/a n/a На додаток, варіації послідовностей SEQ ID NO: 12 або 14, або інших варіантів у миші або інших тварин можуть бути легко виявлені на основі Таблиць 2-4. 8 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Плексин-A2 Відомо, що поліпептид плексин-А2 зв'язується з поліпептидом Sema6A (Suto et al. Neuron 53: 535 (2007)). Повнорозмірний людський поліпептид плекин-А2 (SEQ ID NO: 15) складається із сигнальної послідовності, екстраклітинного домена, трансмембранного домена й цитоплазматичного домена. Екстраклітинний домен містить sema-домен і чотири IPT/TIGдомена, тобто IPT/TIG 1-4. Sema-домен включає амінокислоти 50-523 в SEQ ID NO: 15. IPT/TIGдомени 1-4 включають амінокислоти 873-967, 967-1053, 1056-1155 й 1158-1251 в SEQ ID NO: 15, відповідно. Фахівець у даній галузі може оцінити, що початкові й кінцеві залишки доменів, наведені у тексті, можуть відрізнятися залежно від комп'ютерної програми, яка використовується для моделювання, або від способу, який використовується для визначення домена. Послідовності повнорозмірних людських поліпептидів плексин-А2 варіюють. Один приклад варіанта поліпептиду плексин-А2 має послідовність із 1894 амінокислот і поміщений у базу даних Genbank під номером NP 079455. Також, послідовності плексина-А2 в інших тварин добре відомі в даній галузі знань. Наприклад, мишачі поліпептиди плексин-А2 описані й поміщені в базу даних Genbank під номерами NP_032908, AAH68155, EDL12938, EDL12937 й NP_786926. Плексин-A4 Також відомо, що плексин-A4 є рецептором поліпептиду Sema6A (Suto et al. Neuron 53: 535 (2007)). Повнорозмірний людський поліпептид плексин-А4 (SEQ ID NO: 16) складається із сигнальної послідовності, екстраклітинного домена, трансмембранного домена й цитоплазматичного домена. Екстраклітинний домен містить sema-домен, три PSI-домена, тобто PSI 1-3, і 4 IPT/TIG-домена, тобто IPT/TIG 1-4. Sema-домен включає амінокислоти 24-507 в SEQ ID NO: 16. PSI-домени включають амінокислоти 509-559, 655-702 й 803-856 в SEQ ID NO: 16, відповідно. IPT/TIG-домени 1-4 у поліпептиді плексин-А4 включають амінокислоти 858-952, 9541037, 1040-1139 й 1142-1230 в SEQ ID NO: 16, відповідно. Фахівець у даній галузі може оцінити, що початкові й кінцеві залишки доменів, наведені у тексті, можуть відрізнятися залежно від комп'ютерної програми, що використовується для моделювання, або від способу, що використовується для визначення домена. Послідовності повнорозмірних людських поліпептидів плексин-А4 варіюють. Наприклад, різні варіанти плексина-А4 поміщені в базу даних Genbank під номерами EAW83796, NP_001099013, EAW83795, AAH28744 і EAL24077. Більше того, описані також послідовності плексина-А4 в інших тварин. Наприклад, послідовності мишачих поліпептидів плексин-А4 поміщені в базу даних Genbank під номерами NP_786926, BAC56599, EDL13705 і EDL13704. Деякі варіанти реалізації винаходу передбачають використання повнорозмірного або зрілого поліпептиду Sema6A, або розчинного поліпептиду Sema6A. Конкретніше, розчинні поліпептиди Sema6A, що описуються в даному винаході, включають фрагменти, варіанти або похідні повнорозмірного або зрілого поліпептиду Sema6A. Наведені вище таблиці 1-4 описують різні функціональні домени поліпептиду Sema6A. Розчинні поліпептиди Sema6A, що описуються в даному винаході, як правило, включають частину або цілий екстраклітинний домен поліпептиду. Розчинні поліпептиди Sema6A, що описуються в даному винаході, як правило, не мають трансмембранного та/або цитоплазматичного домена. Фахівець у даній галузі може оцінити, що цілий екстраклітинний домен Sema6A може містити додаткові амінокислоти, або менше амінокислот, на С- або N-кінці екстраклітинного домена поліпептиду, і може містити внутрішні делеції. Людські поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, включають, не обмежуючись ними, поліпептид Sema6A, який включає, щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, яка використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот від 56 до 417 в SEQ ID NO: 2; від a до 417 в SEQ ID NO:2; від b до 417 в SEQ ID NO:2; від 1 до 417 в SEQ ID NO:2; від 56 до c в SEQ ID NO: 2; від a до c в SEQ ID NO: 2; від b до c в SEQ ID NO: 2; від 1 до c в SEQ ID NO: 2; від 56 до c' в SEQ ID NO: 6; від a до c' в SEQ ID NO: 6; від b до c' в SEQ ID NO: 6; від 1 до c' в SEQ ID NO: 6; від 56 до d в SEQ ID NO: 2; від a до d в SEQ ID NO: 2; від b до d в SEQ ID NO: 2; від 1 до d в SEQ ID NO: 2; від 56 до d' в SEQ ID NO: 6; від a до d' в SEQ ID NO: 6; від b до d' в SEQ ID NO: 6; від 1 до d' в SEQ ID NO: 6; від 56 до e в SEQ ID NO: 2; від a до e в SEQ ID NO: 2; від b до e в SEQ ID NO: 2; від 1 до e в SEQ ID NO: 2; від 56 до e' в SEQ ID NO: 6; від a до e' в SEQ ID NO: 6; від b до e' в SEQ ID NO: 6; від 1 до e' в SEQ ID NO: 6; від 56 до e'' в SEQ ID NO: 8; від a до e'' в SEQ ID NO: 8; від b до e'' в SEQ ID NO: 8; від 1 до e'' в SEQ ID NO: 8; від 56 до e''' в SEQ ID NO: 4; від a до e''' в SEQ ID NO: 4; від b до e''' в SEQ ID NO: 6; від 1 до e''' в SEQ ID NO: 9 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8; від 56 до f в SEQ ID NO: 2; від a до f в SEQ ID NO: 2; від b до f в SEQ ID NO: 2; від 1 до f в SEQ ID NO: 2; від 56 до f' в SEQ ID NO: 6; від a до f' в SEQ ID NO: 6; від b до f' в SEQ ID NO: 6; від 1 до f' в SEQ ID NO: 6; від 56 до f'' в SEQ ID NO: 8; від a до f'' в SEQ ID NO: 8; від b до f'' в SEQ ID NO: 8; від 1 до f'' в SEQ ID NO: 8; від 56 до f''' в SEQ ID NO: 4; від a до f''' в SEQ ID NO: 4; від b до f''' в SEQ ID NO: 4; від 1 до f''' в SEQ ID NO: 4; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей; причому a являє собою будь-яке значення між 24 й 56, b – будь-яке значення між 19 й 21, c – будь-яке значення між 472 і 512, c' – будь-яке значення між 418 й 453, d – будь-яке значення між 514 й 569, d' – будь-яке значення між 455 й 510, e – будьяке значення між 570 й 650, e' – будь-яке значення між 511 й 591, e'' – будь-яке значення між 570 й 595, і e''' – будь-яке значення між 570 й 667; f – будь-яке значення між 647 й 671, f' – будьяке значення між 588 й 612, f'' – будь-яке значення між 592-616, і f''' – будь-яке значення між 664 й 688. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A, який можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, зв'язується з поліпептидом плексинА2 або плексин-А4. Людські поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот від 1 до 975 в SEQ ID NO: 8; від 19 до 417 в SEQ ID NO: 2; від 19 до 472 в SEQ ID NO: 2; від 19 до 551 в SEQ ID NO: 2; від 19 до 492 в SEQ ID NO: 6; від 19 до 647 в SEQ ID NO:2; від 19 до 588 в SEQ ID NO: 6; від 19 до 592 в SEQ ID NO: 8; від 19 до 664 в SEQ ID NO: 4; від 56 до 472 в SEQ ID NO: 2; від 56 до 551 в SEQ ID NO: 2; від 56 до 492 в SEQ ID NO: 6; від 56 до 647 в SEQ ID NO:2; від 56 до 588 в SEQ ID NO: 6; від 56 до 592 в SEQ ID NO: 8; від 56 до 664 в SEQ ID NO: 4; від 1 до 649 в SEQ ID NO: 2; [людський Sema6A-Fc з R&D] від 1 до 590 в SEQ ID NO: 6; від 1 до 594 в SEQ ID NO: 8; від 1 до 666 в SEQ ID NO: 4; від 18 до 703 в SEQ ID NO: 2; від 18 до 644 в SEQ ID NO: 6; від 18 до 648 в SEQ ID NO: 8; від 18 до 720 в SEQ ID NO: 4; від 1 до 648 в SEQ ID NO: 2; від 1 до 589 в SEQ ID NO: 6; від 1 до 593 в SEQ ID NO: 8; від 1 до 665 в SEQ ID NO: 4; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. В інших варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A зв'язується з поліпептидами плексин-а2 або плексин-а4. В іншому варіанті реалізації винаходу, людські поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 56-417 в SEQ ID NO: 2; 55-417 в SEQ ID NO: 2; 54-417 в SEQ ID NO: 2; 53-417 в SEQ ID NO: 2; 52-417 в SEQ ID NO: 2; 51-417 в SEQ ID NO: 2; 50-417 в SEQ ID NO: 2; 49-417 в SEQ ID NO: 2; 48-417 в SEQ ID NO: 2; 47-417 в SEQ ID NO: 2; 46-417 в SEQ ID NO: 2; 45-417 в SEQ ID NO: 2; 44-417 в SEQ ID NO: 2; 43-417 в SEQ ID NO: 2; 42-417 в SEQ ID NO: 2; 41-417 в SEQ ID NO: 2; 40-417 в SEQ ID NO: 2; 39-417 в SEQ ID NO: 2; 38-417 в SEQ ID NO: 2; 37-417 в SEQ ID NO: 2; 36-417 в SEQ ID NO: 2; 35-417 в SEQ ID NO: 2; 34-417 в SEQ ID NO: 2; 33-417 в SEQ ID NO: 2; 32-417 в SEQ ID NO: 2; 31-417 в SEQ ID NO: 2; 30-417 в SEQ ID NO: 2; 29-417 в SEQ ID NO: 2; 28-417 в SEQ ID NO: 2; 27-417 в SEQ ID NO: 2; 26-417 в SEQ ID NO: 2; 25-417 в SEQ ID NO: 2; 24-417 в SEQ ID NO: 2; 23-417 в SEQ ID NO: 2; 22-417 в SEQ ID NO: 2; 21-417 в SEQ ID NO: 2; 20-417 в SEQ ID NO: 2; 19-417 в SEQ ID NO: 2; 18-417 в SEQ ID NO: 2; 17-417 в SEQ ID NO: 2; 16-417 в SEQ ID NO: 2; 15-417 в SEQ ID NO: 2; 14-417 в SEQ ID NO: 2; 13-417 в SEQ ID NO: 2; 12-417 в SEQ ID NO: 2; 11-417 в SEQ ID NO: 2; 10-417 в SEQ ID NO: 2; 9-417 в SEQ ID NO: 2; 8-417 в SEQ ID NO: 2; 7-417 в SEQ ID NO: 2; 6-417 в SEQ ID NO: 2; 5-417 в SEQ ID NO: 2; 4-417 в SEQ ID NO: 2; 3-417 в SEQ ID NO: 2; 2-417 в SEQ ID NO: 2; 1-417 в SEQ ID NO: 2; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей, причому зазначений поліпептид Sema6A зв'язується з поліпептидами плексин-А2. У подальших варіантах реалізації винаходу, людські поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 40-472 в SEQ ID NO: 2; 41-472 в SEQ ID NO: 2; 42-472 в SEQ ID NO: 2; 43-472 в 10 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 2; 44-472 в SEQ ID NO: 2; 45-472 в SEQ ID NO: 2; 46-472 в SEQ ID NO: 2; 47-472 в SEQ ID NO: 2; 48-472 в SEQ ID NO: 2; 49-472 в SEQ ID NO: 2; 50-472 в SEQ ID NO: 2; 51-472 в SEQ ID NO: 2; 52-472 в SEQ ID NO: 2; 53-472 в SEQ ID NO: 2; 54-472 в SEQ ID NO: 2; 55-472 в SEQ ID NO: 2; 56-472 в SEQ ID NO: 2; 57-472 в SEQ ID NO: 2; 58-472 в SEQ ID NO: 2; 59-472 в SEQ ID NO: 2; 60-472 в SEQ ID NO: 2; 56-465 в SEQ ID NO: 2; 56-466 в SEQ ID NO: 2; 56-467 в SEQ ID NO: 2; 56-468 в SEQ ID NO: 2; 56-469 в SEQ ID NO: 2; 56-470 в SEQ ID NO: 2; 56-471 в SEQ ID NO: 2; 56-472 в SEQ ID NO: 2; 56-473 в SEQ ID NO: 2; 56-474 в SEQ ID NO: 2; 56-475 в SEQ ID NO: 2; 56-476 в SEQ ID NO: 2; 56-477 в SEQ ID NO: 2; 56-478 в SEQ ID NO: 2; 56-479 в SEQ ID NO: 2; 56-480 в SEQ ID NO: 2; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. У подальших варіантах реалізації винаходу, людські поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 1-551 в SEQ ID NO: 2; 1-552 в SEQ ID NO: 2; 1-553 в SEQ ID NO: 2; 1-554 в SEQ ID NO: 2; 1-555 в SEQ ID NO: 2; 1-556 в SEQ ID NO: 2; 1-557 в SEQ ID NO: 2; 1-558 в SEQ ID NO: 2; 1-559 в SEQ ID NO: 2; 1-560 в SEQ ID NO: 2; 1-561 в SEQ ID NO: 2; 1-562 в SEQ ID NO: 2; 1-563 в SEQ ID NO: 2; 1-564 в SEQ ID NO: 2; 1-565 в SEQ ID NO: 2; 1-566 в SEQ ID NO: 2; 1-567 в SEQ ID NO: 2; 1-568 в SEQ ID NO: 2; 1-569 в SEQ ID NO: 2; 1-570 в SEQ ID NO: 2; 1-571 в SEQ ID NO: 2; 1-571 в SEQ ID NO: 2; 1-572 в SEQ ID NO: 2; 1-573 в SEQ ID NO: 2; 1-574 в SEQ ID NO: 2; 1575 в SEQ ID NO: 2; 1-576 в SEQ ID NO: 2; 1-577 в SEQ ID NO: 2; 1-578 в SEQ ID NO: 2; 1-579 в SEQ ID NO: 2; 1-580 в SEQ ID NO: 2; 1-581 в SEQ ID NO: 2; 1-582 в SEQ ID NO: 2; 1-583 в SEQ ID NO: 2; 1-584 в SEQ ID NO: 2; 1-585 в SEQ ID NO: 2; 1-586 в SEQ ID NO: 2; 1-587 в SEQ ID NO: 2; 1-588 в SEQ ID NO: 2; 1-589 в SEQ ID NO: 2; 1-590 в SEQ ID NO: 2; 1-591 в SEQ ID NO: 2; 1592 в SEQ ID NO: 2; 1-593 в SEQ ID NO: 2; 1-594 в SEQ ID NO: 2; 1-596 в SEQ ID NO: 2; 1-597 в SEQ ID NO: 2; 1-598 в SEQ ID NO: 2; 1-599 в SEQ ID NO: 2; 1-600 в SEQ ID NO: 2; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. В інших варіантах реалізації винаходу, людські поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 1-649 в SEQ ID NO: 2; 2-649 в SEQ ID NO: 2; 3-649 в -649 в SEQ ID NO: 2; 4-649 в SEQ ID NO: 2; 5-649 в SEQ ID NO: 2; 6-649 в SEQ ID NO: 2; 7-649 в SEQ ID NO: 2; 8-649 в SEQ ID NO: 2; 9-649 в SEQ ID NO: 2; 10-649 в SEQ ID NO: 2; 11-649 в SEQ ID NO: 2; 12-649 в SEQ ID NO: 2; 13-649 в SEQ ID NO: 2; 14-649 в SEQ ID NO: 2; 15-649 в SEQ ID NO: 2; 16-649 в SEQ ID NO: 2; 17-649 в SEQ ID NO: 2; 18-649 в SEQ ID NO: 2; 19-649 в SEQ ID NO: 2; 20-649 в SEQ ID NO: 2; 21-649 в SEQ ID NO: 2; 22-649 в SEQ ID NO: 2; 23-649 в SEQ ID NO: 2; 24-649 в SEQ ID NO: 2; 25-649 в SEQ ID NO: 2; 26-649 в SEQ ID NO: 2; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. Способи даного винаходу далі включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 1-640 в SEQ ID NO: 2; 1-641 в SEQ ID NO: 2; 1-642 в SEQ ID NO: 2; 1-643 в SEQ ID NO: 2; 1-644 в SEQ ID NO: 2; 1-645 в SEQ ID NO: 2; 1-646 в SEQ ID NO: 2; 1-647 в SEQ ID NO: 2; 1-648 в SEQ ID NO: 2; 1-649 в SEQ ID NO: 2; 1-650 в SEQ ID NO: 2; 1-651 в SEQ ID NO: 2; 1-652 в SEQ ID NO: 2; 1-653 в SEQ ID NO: 2; 1654 в SEQ ID NO: 2; 1-655 в SEQ ID NO: 2; 1-656 в SEQ ID NO: 2; 1-657 в SEQ ID NO: 2; 1-658 в SEQ ID NO: 2; 1-659 в SEQ ID NO: 2; 1-660 в SEQ ID NO: 2; 1-661 в SEQ ID NO: 2; 1-662 в SEQ ID NO: 2; 1-663 в SEQ ID NO: 2; 1-664 в SEQ ID NO: 2; 1-665 в SEQ ID NO: 2; 1-666 в SEQ ID NO: 2; 1-667 в SEQ ID NO: 2; 1-668 в SEQ ID NO: 2; 1-669 в SEQ ID NO: 2; 1-670 в SEQ ID NO: 2; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. Способи даного винаходу далі включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для 11 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 1-570 в SEQ ID NO: 4; 1-571 в SEQ ID NO: 4; 1-572 в SEQ ID NO: 4; 1-573 в SEQ ID NO: 4; 1-574 в SEQ ID NO: 4; 1-575 в SEQ ID NO: 4; 1-576 в SEQ ID NO: 4; 1-577 в SEQ ID NO: 4; 1-578 в SEQ ID NO: 4; 1-579 в SEQ ID NO: 4; 1-580 в SEQ ID NO: 4; 1-581 в SEQ ID NO: 4; 1-582 в SEQ ID NO: 4; 1-583 в SEQ ID NO: 4; 1584 в SEQ ID NO: 4; 1-585 в SEQ ID NO: 4; 1-586 в SEQ ID NO: 4; 1-587 в SEQ ID NO: 4; 1-588 в SEQ ID NO: 4; 1-589 в SEQ ID NO: 4; 1-590 в SEQ ID NO: 4; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. Способи даного винаходу далі включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 1-630 в SEQ ID NO: 4; 1-631 в SEQ ID NO: 4; 1-632 в SEQ ID NO: 4; 1-633 в SEQ ID NO: 4; 1-634 в SEQ ID NO: 4; 1-635 в SEQ ID NO: 4; 1-636 в SEQ ID NO: 4; 1-637 в SEQ ID NO: 4; 1-638 в SEQ ID NO: 4; 1-639 в SEQ ID NO: 4; 1-640 в SEQ ID NO: 4; 1-641 в SEQ ID NO: 4; 1-642 в SEQ ID NO: 4; 1-643 в SEQ ID NO: 4; 1644 в SEQ ID NO: 4; 1-645 в SEQ ID NO: 4; 1-646 в SEQ ID NO: 4; 1-647 в SEQ ID NO: 4; 1-648 в SEQ ID NO: 4; 1-649 в SEQ ID NO: 4; 1-650 в SEQ ID NO: 4; 1-651 в SEQ ID NO: 4; 1-652 в SEQ ID NO: 4; 1-653 в SEQ ID NO: 4; 1-654 в SEQ ID NO: 4; 1-655 в SEQ ID NO: 4; 1-656 в SEQ ID NO: 4; 1-657 в SEQ ID NO: 4; 1-658 в SEQ ID NO: 4; 1-659 в SEQ ID NO: 4; 1-660 в SEQ ID NO: 4; 1661 в SEQ ID NO: 4; 1-662 в SEQ ID NO: 4; 1-663 в SEQ ID NO: 4; 1-664 в SEQ ID NO: 4; 1-665 в SEQ ID NO: 4; 1-666 в SEQ ID NO: 4; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. Способи даного винаходу далі включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складає з амінокислот 45-492 в SEQ ID NO: 6; 46-492 в SEQ ID NO: 6; 47-492 в SEQ ID NO: 6; 48-492 в SEQ ID NO: 6; 49-492 в SEQ ID NO: 6; 50-492 в SEQ ID NO: 6; 51-492 в SEQ ID NO: 6; 52-492 в SEQ ID NO: 6; 53-492 в SEQ ID NO: 6; 54-492 в SEQ ID NO: 6; 55-492 в SEQ ID NO: 6; 56-492 в SEQ ID NO: 6; 57-492 в SEQ ID NO: 6; 58-492 в SEQ ID NO: 6; 59-492 в SEQ ID NO: 6; 60-492 в SEQ ID NO: 6; 61-492 в SEQ ID NO: 6; 56-485 в SEQ ID NO: 6; 56-486 в SEQ ID NO: 6; 56-487 в SEQ ID NO: 6; 56-488 в SEQ ID NO: 6; 56-489 в SEQ ID NO: 6; 56-490 в SEQ ID NO: 6; 56-491 в SEQ ID NO: 6; 56-492 в SEQ ID NO: 6; 56-493 в SEQ ID NO: 6; 56-494 в SEQ ID NO: 6; 56-495 в SEQ ID NO: 6; 56-496 в SEQ ID NO: 6; 56-497 в SEQ ID NO: 6; 56-498 в SEQ ID NO: 6; 56-599 в SEQ ID NO: 6; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. Способи даного винаходу далі включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 1-580 в SEQ ID NO: 6; 1-581 в SEQ ID NO: 6; 1-583 в SEQ ID NO: 6; 1-584 в SEQ ID NO: 6; 1-585 в SEQ ID NO: 6; 1-586 в SEQ ID NO: 6; 1-587 в SEQ ID NO: 6; 1-588 в SEQ ID NO: 6; 1-589 в SEQ ID NO: 6; 1-590 в SEQ ID NO: 6; 1-591 в SEQ ID NO: 6; 1-592 в SEQ ID NO: 6; 1-593 в SEQ ID NO: 6; 1-594 в SEQ ID NO: 6; 1595 в SEQ ID NO: 6; 1-596 в SEQ ID NO: 6; 1-597 в SEQ ID NO: 6; 1-598 в SEQ ID NO: 6; 1-599 в SEQ ID NO: 6; 1-600 в SEQ ID NO: 6; 2-590 в SEQ ID NO: 6; 3-590 в SEQ ID NO: 6; 4-590 в SEQ ID NO: 6; 5-590 в SEQ ID NO: 6; 6-590 в SEQ ID NO: 6; 7-590 в SEQ ID NO: 6; 8-590 в SEQ ID NO: 6; 9-590 в SEQ ID NO: 6; 10-590 в SEQ ID NO: 6; 11-590 в SEQ ID NO: 6; 12-590 в SEQ ID NO: 6; 13-590 в SEQ ID NO: 6; 14-590 в SEQ ID NO: 6; 15-590 в SEQ ID NO: 6; 16-590 в SEQ ID NO: 6; 17-590 в SEQ ID NO: 6; 18-590 в SEQ ID NO: 6; 19-590 в SEQ ID NO: 6; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. Способи даного винаходу далі включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 56-580 в SEQ ID NO: 8; 56-581 в SEQ ID NO: 8; 56-583 в SEQ ID NO: 8; 56-584 в SEQ ID NO: 8; 56-585 в SEQ ID NO: 8; 56-586 в SEQ ID NO: 8; 56-587 в SEQ ID NO: 8; 56-588 в SEQ ID NO: 8; 56-589 в SEQ ID NO: 8; 56-590 в SEQ ID NO: 8; 56-591 в SEQ ID NO: 8; 56-592 в SEQ ID NO: 8; 56-593 в SEQ ID NO: 8; 56-594 в SEQ ID NO: 8; 56-595 в SEQ ID NO: 8; 56-596 в SEQ ID NO: 8; 56-597 в SEQ ID NO: 8; 56-598 в 12 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO: 8; 56-599 в SEQ ID NO: 8; 56-600 в SEQ ID NO: 8; 56-601 в SEQ ID NO: 8; 56-602 в SEQ ID NO: 8; 56-603 в SEQ ID NO: 8; 56-604 в SEQ ID NO: 8; 56-605 в SEQ ID NO: 8; 45-595 в SEQ ID NO: 8; 46-595 в SEQ ID NO: 8; 47-595 в SEQ ID NO: 8; 48-595 в SEQ ID NO: 8; 49-595 в SEQ ID NO: 8; 50-595 в SEQ ID NO: 8; 51-595 в SEQ ID NO: 8; 52-595 в SEQ ID NO: 8; 53-595 в SEQ ID NO: 8; 54-595 в SEQ ID NO: 8; 55-595 в SEQ ID NO: 8; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. Способи даного винаходу далі включають поліпептид Sema6A, що включає щонайменше на 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % або 100 % ідентичну амінокислотну послідовність, що складається по суті з, або складається з амінокислотної послідовності, яка використовується для порівняння, причому зазначена амінокислотна послідовність, що використовується для порівняння, вибирається із групи, що складається з амінокислот 1-580 в SEQ ID NO: 8; 1-581 в SEQ ID NO: 8; 1-583 в SEQ ID NO: 8; 1-584 в SEQ ID NO: 8; 1-585 в SEQ ID NO: 8; 1-586 в SEQ ID NO: 8; 1-587 в SEQ ID NO: 8; 1-588 в SEQ ID NO: 8; 1-589 в SEQ ID NO: 8; 1-590 в SEQ ID NO: 8; 1-591 в SEQ ID NO: 8; 1-592 в SEQ ID NO: 8; 1-593 в SEQ ID NO: 8; 1-594 в SEQ ID NO: 8; 1595 в SEQ ID NO: 8; 1-596 в SEQ ID NO: 8; 1-597 в SEQ ID NO: 8; 1-598 в SEQ ID NO: 8; 1-599 в SEQ ID NO: 8; 1-600 в SEQ ID NO: 8; 1-601 в SEQ ID NO: 8; 1-602 в SEQ ID NO: 8; 1-603 в SEQ ID NO: 8; 1-604 в SEQ ID NO: 8; 1-605 в SEQ ID NO: 8; 2-595 в SEQ ID NO: 8; 3-595 в SEQ ID NO: 8; 4-595 в SEQ ID NO: 8; 5-595 в SEQ ID NO: 8; 6-595 в SEQ ID NO: 8; 7-595 в SEQ ID NO: 8; 8595 в SEQ ID NO: 8; 9-595 в SEQ ID NO: 8; 10-595 в SEQ ID NO: 8; 11-595 в SEQ ID NO: 8; 12595 в SEQ ID NO: 8; 13-595 в SEQ ID NO: 8; 14-595 в SEQ ID NO: 8; 15-595 в SEQ ID NO: 8; 16595 в SEQ ID NO: 8; 17-595 в SEQ ID NO: 8; 18-595 в SEQ ID NO: 8; 19-595 в SEQ ID NO: 8; і комбінація двох або більше зазначених амінокислотних послідовностей. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A, що описується у даному винаході, зв'язується з поліпептидами підродини плексин-А. Наприклад, поліпептид Sema6A зв'язується з поліпептидом плексин-А1, з поліпептидом плексин-А2, з поліпептидом плексин-А3, або з поліпептидом плексин-А4. В інших варіантах, Sema6A може бути ізольований. Під "амінокислотною послідовністю, що використовується для порівняння" розуміють зазначену послідовність без внесення яких-небудь амінокислотних замін. Фахівець із базовими знаннями в даній галузі здатен зрозуміти, що якщо амінокислотні заміни відсутні, то "ізольований поліпептид", що описується у даному винаході, складається з амінокислотної послідовності, яка ідентична амінокислотній послідовності, що використовується для порівняння. Поліпептиди Sema6A, описані у тексті, можуть мати різні зміни, такі як заміни, вставки або делеції. Типові амінокислоти, які можуть бути замінені в поліпептиді, включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислими бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) і ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Також розглядаються відповідні фрагменти поліпептидів Sema6A, щонайменше на 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, або 95 % ідентичні поліпептидам і поліпептидам, що використовується для порівняння, які описуються у тексті. Як відомо, "ідентичність послідовностей" між двома поліпептидами визначається за допомогою порівняння амінокислотної послідовності одного поліпептиду з послідовністю іншого поліпептиду. Тут під час обговорення, чи є будь-який окремо взятий поліпептид щонайменше приблизно на 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, або 100 % ідентичним іншому поліпептиду, можна використовувати способи й комп'ютерні програми, відомі в даній галузі, такі як (без обмежень) програма BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT використовує алгоритм локальної гомології Сміта й Уотермана (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)) для визначення сегмента найбільшої гомології міждвома послідовностями. При використанні програми BESTFIT, або будь-якої іншої програми для вирівнювання послідовностей, з метою визначення, чи є конкретна послідовність, наприклад, на 95 % ідентична послідовності, що використовується для порівняння, відповідно до даного винаходу, параметри неодмінно повинні бути встановлені так, щоб відсоток ідентичності розраховувався по всій довжині поліпептидної послідовності, що використовується для порівняння, і допускалися похибки в гомології до 5 % від загального числа амінокислот у послідовності, що використовується для порівняння. 13 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У відповідності до способів даного винаходу, поліпептид Sema6A або поліпептидний фрагмент може бути застосований безпосередньо, як сформований заздалегідь поліпептид. Як зазначається у тексті, поліпептид Sema6A може бути застосований як полінуклеотид, який необхідно внести в клітини й експресувати там. Наприклад, полінуклеотид, що кодує Sema6A, може бути застосований у вірусному векторі. Способи лікування з використанням поліпептидів Sema6A В одному з варіантів реалізації винаходу забезпечується спосіб лікування хвороби, захворювання або ураження, асоційованої з дисмієлінізацію і демієлінізацію, наприклад, розсіяного склерозу, у тварини, що страждає даним захворюванням, причому даний спосіб включає, складається по суті з, або складається із застосування відносно тварини ефективної кількості поліпептиду Sema6A або його фрагмента, розчинного поліпептиду Sema6A, або його варіантів, похідних або аналогів. Додатково, винахід орієнтований на спосіб стимулювання мієлінізації нейронів у ссавців, причому даний спосіб включає, складається по суті з, або складається із застосування до ссавця терапевтично ефективної кількості поліпептиду Sema6A або його фрагмента, розчинного поліпептиду Sema6A, або його варіантів, похідних або аналогів. У додатковому варіанті реалізації винаходу забезпечуються способи лікування хвороби, захворювання або ураження, асоційовані із загибеллю олігодендроцитів або зниженням їх диференціювання, наприклад, розсіяного склерозу, хвороби Пеліцеуса-Мерцбахера або глобоїдно-клітинної лейкодистрофії (хвороби Краббе), у тварин, що страждають від цього захворювання, причому даний спосіб включає, складається по суті з, або складається із застосування до тварини ефективної кількості поліпептиду Sema6A або його фрагмента, розчинного поліпептиду Sema6A, або його варіантів, похідних або аналогів. Інший варіант реалізації винаходу включає спосіб стимулювання проліферації, диференціювання й виживання олігодендроцитів у ссавців, причому даний спосіб включає, складається по суті з, або складається із застосування терапевтично ефективної кількості поліпептиду Sema6A або його фрагмента, розчинного поліпептиду Sema6A, або його варіантів, похідних або аналогів. Даний винахід орієнтований на спосіб стимулювання проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів, включаючи здійснення контакту олігодендроцитів з ефективною кількістю композиції, що містить поліпептид Sema6A. Далі, даний винахід орієнтований на спосіб стимулювання мієлінізації нейронів, опосередкованої олігодендроцитами, включаючи здійснення контакту суміші нейронів й олігодендроцитів з ефективною кількістю композиції, що містить ізольований поліпептид Sema6A. Поліпептид Sema6A, що підлягає використанню в способах лікування, що зазначені у тексті, може бути виготовлений і використаний як терапевтичний агент, який індукує, сприяє, активує або стимулює здатність Sema6A до регуляції мієлінізації нейронів олігодендроцитами. Додатково, поліпептид Sema6A, що підлягає використанню в способах лікування, які зазначені у тексті, може бути виготовлений і використаний як терапевтичний агент, що індукує, сприяє, активує або стимулює здатність Sema6A до регуляції диференціювання, проліферації й виживання олігодендроцитів. Подальші варіанти реалізації винаходу включають спосіб індукції проліферації або виживання олігодендроцитів, з метою лікування захворювання, розладу або ураження, при яких спостерігається руйнування олігодендроцитів або мієліну, причому даний спосіб включає застосування до ссавця, у місці захворювання, розладу або ураження, або поруч із ним, у кількості, достатній для зниження інгібування аксонального подовження й стимулювання мієлінізації. В іншому варіанті реалізації, винахід орієнтований на спосіб стимулювання проліферації, диференціювання або виживання олігодендроцитів у ссавців, причому спосіб включає застосування до ссавця, який потребує лікування, ефективної кількості композиції, що містить ізольований полінуклеотид, який кодує поліпептид Sema6A, зазначений у тексті, або спосіб стимулювання мієлінізації нейронів у ссавців, причому спосіб включає застосування до ссавця ефективної кількості композиції, що містить ізольований полінуклеотид, який кодує поліпептид Sema6A, зазначений у тексті. Винахід також включає спосіб лікування хвороби, розладу або ураження, асоційованих з мієліном, або дисмієлінізацію, або демієлінізацію, або хвороби, розладу або ураження, асоційованих із загибеллю олігодендроцитів або відсутністю їх диференціювання у ссавців, причому спосіб включає застосування до ссавця, який потребує лікування, терапевтично ефективної кількості композиції, що містить ізольований полінуклеотид, який кодує поліпептид Sema6A. 14 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У відповідності із способами даного винаходу, поліпептид Sema6A можна застосовувати шляхом безпосереднього призначення пацієнтові поліпептиду Sema6A. Альтернативно, поліпептид Sema6A можна застосовувати, використовуючи експресійний вектор, який продукує специфічний поліпептид Sema6A. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A застосовується в способі лікування, що включає: (1) трансформацію або трансфекцію хазяйської клітини, що імплантується нуклеїновою кислотою, наприклад, вектором, який експресує поліпептид Sema6A; та (2) імплантування трансформованої хазяйської клітини ссавцеві, у місце захворювання, розладу або ураження. Наприклад, трансформована хазяйська клітина може бути імплантована у місце хронічного ураження при розсіяному склерозі. У деяких варіантах реалізації винаходу, хазяйську клітину, що імплантується, забирають у ссавця, якийсь час культивують, трансформують або здійснюють трансфекцію ізольованою нуклеїновою кислотою, що кодує поліпептид Sema6A, та імплантують назад тому ж ссавцеві, у якого була відібрана клітина. Клітина може бути (хоча й необов'язково) відібрана з того ж місця, куди потім буде імплантована. Такі способи реалізації винаходу, відомі як генна терапія ex vivo, можуть забезпечувати тривале постачання поліпептиду Sema6A, локалізованого в місці дії, протягом обмеженого періоду часу. Захворювання й розлади, які можна лікувати, або полегшувати їх протікання, за допомогою способів, що описуються у даному винаході, включають захворювання, розлади або ураження, які відносяться до дисмієлінізації й демієлінізації нейронів ссавців; більш конкретно, захворювання й розлади, при яких мієлін, що оточує нейрон, відсутній, або не повністю є присутнім, або не формується належним чином, або псується. Такі захворювання включають, не обмежуючись ними, розсіяний склероз, включаючи розсіяний склероз із епізодами загострень і ремісій, вдруге прогресуючі й первинно прогресуючі форми розсіяного склерозу; прогресуючу мультифокальну лейкоенцефалопатію (PML), енцефаломієліт (EPL), мієлоліз моста головного мозку (CPM), адренолейкодистрофію, хворобу Александера, хворобу Пеліцеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоїдно-клітинну лейкодистрофію (хвороба Краббе), Уолеровську дегенерацію, ретробульбарний неврит і поперечний мієліт. Захворювання й розлади, які можна лікувати, або полегшувати їх протікання, за допомогою способів, що описуються у даному винаході, включають нейродегенеративні захворювання або розлади. Такі захворювання включають, не обмежуючись ними, бічний аміотрофічний склероз, хворобу Хантінгтона, хворобу Альцгеймера й хворобу Паркінсона. Приклади додаткових хвороб, розладів і уражень, які можна лікувати, або полегшувати їх протікання, за допомогою способів, що описуються у даному винаході, включають, не обмежуючись ними, травми спинного мозку, хронічну мієлопатію або радикулопатію, травми головного мозку, захворювання моторних нейронів, ушкодження аксонів, контузії, параліч, променеве ураження або інші неврологічні ускладнення хіміотерапії, інсульт, великі лакуни, середні й великі непрохідності судин, лейкоареоз, ішемічну нейропатію зорового нерва, нестачу вітаміну Е (синдром нестачі ізольованого вітаміну Е, AR, синдром Бессена-Корнцвейга), нестачу вітамінів В12, В6 (піридоксин - пелагра), тіаміну, фолата, нікотинової кислоти, синдром Марчіафава-Бігнамі, метахроматичну лейкодистрофію, невралгію тройнічного нерва, параліч Белла, або будь-які ураження нервової системи, при яких необхідна регенерація аксонів, ремієлінізація або виживання, а також диверенцірування/проліферація олігодендроцитів. Білки злиття й кон'юговані поліпептиди Деякі варіанти реалізації винаходу включають використання поліпептиду Sema6A, злитого із частиною гетерологічного білка з утворенням білка злиття. Такі білки злиття можуть бути використані для досягнення різних цілей, наприклад, для збільшення періоду напівжиття сироватки, поліпшення біодоступності, націлювання in vivo на специфічний орган або тип тканини, поліпшення рекомбінантним шляхом ефективності експресії, поліпшення секреції хазяйської клітини, полегшення очищення й збільшення сили зв'язків у молекулі. Залежно від бажаної мети, гетерологічна частина може бути інертною або біологічно активною. Також можна вибрати, щоб ця частина була стабільно зшита з ділянкою поліпептиду Sema6A, що описується у винаході, або щоб її можна було ферментативно відщепити, in vitro або in vivo. Гетерологічні частини, здатні задовольняти зазначеним умовам, відомі в даній галузі знань. Як альтернатива експресії білка злиття, обрана гетерологічна частина може бути створена й хімічно зв'язана з ділянкою поліпептиду Sema6A, що описується у винаході. У більшості випадків, обрана гетерологічна частина повинна функціонувати подібним чином при злитті або зв'язуванні з ділянкою поліпептиду Sema6A. Тому, у нижченаведеному обговоренні гетерологічних амінокислотних послідовностей, якщо не зазначено іншого, буде матися на увазі, що гетерологічна послідовність може бути з'єднана з ділянкою поліпептиду Sema6A у формі білка злиття або продукту хімічного зв'язування (включаючи ковалентні й нековалентні 15 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язки) з поліпептидами або іншими з'єднаннями. Наприклад, поліпептиди Sema6A можуть бути рекомбінантно злиті або хімічно зв'язані з молекулами, які можна використовувати як мітки при детекційному аналізі, і з ефекторними молекулами, наприклад, гетерологічними поліпептидами, ліками, радіонуклідами, або токсинами (див., наприклад, PCT публікації WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Patent No. 5,314,995; і EP 396,387). Поліпептиди Sema6A, які можуть бути використані в способах лікування, що описуються у тексті, включають похідні, які модифіковані, наприклад, за допомогою ковалентного приєднання молекул будь-якого типу, причому ковалентно приєднана до поліпептиду Sema6A молекула не викликає інгібування біологічної функції Sema6A. Наприклад, але не для введення яких-небудь обмежень, поліпептиди Sema6A, що описуються в даному дослідженні, можна модифікувати, наприклад, за допомогою глікозилювання, ацетилування, пегілювання, фосфілювання, фосфорилювання, амінування, утворення похідних білка із введенням відомих захисних/блокуючих груп, протеолітичного розщеплення, зв'язування із клітинними лігандами або іншими білками тощо. Будь-які із численних хімічних модифікацій можуть бути здійснені з використанням відомих способів, включаючи, але не обмежуючись ними, специфічне хімічне розщеплення, ацетилування, формілування, метаболічний синтез тунікаміцину тощо. Додатково, похідне може містити одну або більше некласичних амінокислот. Поліпептиди Sema6A, які можуть бути використані в способах лікування, що описуються у тексті, можуть складатися з амінокислот, з'єднаних між собою пептидними зв'язками або модифікованими пептидними зв'язками, тобто пептидними ізостерами, і можуть містити амінокислоти, що не відносяться до 20 амінокислот, які кодуються генами. Поліпептиди Sema6A можуть бути модифіковані в ході природних процесів, таких як посттрансляційний процесінг, або з використанням підходів хімічних модифікацій, добре відомих фахівцям у даній галузі. Такі модифікації добре описані в різних текстах й, більш детально, у монографіях, а також у широко наведеній науковій літературі. Модифікації можуть бути внесені в будь-яку ділянку поліпептиду Sema6A, включаючи пептидний кістяк, бічні ланцюги амінокислот, та аміно- і карбокси-кінцеві ділянки, або в ділянки небілкової природи, наприклад, вуглеводневі ділянки. Переважно, той самий тип модифікації може бути представлений у тій же манері або в манері, що дещо відрізняється, у різних місцях даного поліпептиду Sema6A. Також, заданий поліпептид Sema6A може містити декілька типів модифікації. Поліпептиди Sema6A можуть бути розгалуженими, наприклад, у результаті убіквітинування, а також циклічними, з розгалуженнями або без них. Циклічні, розгалужені й розгалужені циклічні поліпептиди Sema6A можуть утворитися в результаті природних посттрансляційних процесів, або можуть бути створені синтетичними способами. Модифікації включають ацетилування, ацилювання, АДФ-рибозилювання, амінування, ковалентне приєднання флавіну, ковалентне приєднання гему, ковалентне приєднання нуклеотиду або нуклеотидного похідного, ковалентне приєднання ліпіду або ліпідного похідного, ковалентне приєднання фосфотиділінозитолу, перехресне зшивання, циклізація, утворення дисульфідних містків, деметилювання, утворення ковалентних перехресних зв'язків, утворення цистеїну, утворення піроглютамату, формілування, гаммакарбоксилювання, глікозилювання, формування якоря GPI, гідроксилювання, іодування, метилювання, міристіолювання, окислювання, пегілювання, протеолітичний процесінг, фосфорилювання, пренілювання, рацемізацію, приєднання селену, сульфатування, тРНКопосредоване додавання амінокислот до білку, наприклад, аргінілування й убіквітинування (див., наприклад, Proteins-Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)). Даний винахід також забезпечує білки злиття, що включають, що складаються по суті з, або, що складаються зі злиття поліпептиду Sema6A. У деяких варіантах реалізації винаходу, злиття поліпептиду Sema6A зв'язується із плексином-А2 або плексином-А4. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A, наприклад, поліпептид Sema6A, що містить Semaдомени й PSI-домен, або повний екстраклітинний домен (що відповідає амінокислотам від 1 до 649 в SEQ ID NO: 2), злитий з гетерологичною поліпептидною ділянкою з формуванням злиття поліпептиду Sema6A. Фармакологічно активні поліпептиди можуть швидко деградувати in vivo, викликаючи необхідність використання великих доз для досягнення терапевтично ефективних концентрацій в організмі. На додаток, поліпептиди, що не перевершують 60 кДа, потенційно піддаються гломерулярній фільтрації, що іноді приводить до нефротоксичності. Злиття або зв'язування поліпептидних фрагментів може бути використане для зниження або запобігання ризику такої нефротоксичності. Відомі різні гетерологічні амінокислотні послідовності, тобто поліпептидні 16 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частини або "носії", для збільшення стабільності in vivo, наприклад, напівжиття сироватки, терапевтичних поліпептидів. Завдяки тривалому періоду напівжиття, широкому поширенню in vivo і відсутності ферментативної або імунологічної функції, повнорозмірний людський сироватковий альбумін (HSA), або його фрагмент, широко використовується як гетерологічна частина. Шляхом застосування способів і матеріалів, зазначених у джерелах (Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1904-08 (1992) and Syed et al., Blood 89:3243-52 (1997)), HSA можна використовувати для створення злиття поліпептиду Sema6A, що проявляє фармакологічну дію за рахунок частини Sema6A і при цьому демонструє значно збільшену стабільність in vivo, наприклад, в 10-100 разів вище. С-кінець HSA може бути злитий з N-кінцем частини Sema6A. Оскільки HSA є первинно секретуємим білком, сигнальна послідовність HSA може бути використана, щоб домогтися секреції білка злиття Sema6A у культуральне середовище, якщо білок злиття продукує еукаріотичні експресійні системи, наприклад, клітини ссавців. Сигнальна послідовність являє собою полінуклеотид, що кодує амінокислотну послідовність, що ініціює транспорт білка через мембрану ендоплазматичного ретикулума. Сигнальні послідовності, зручні для створення імуно-злиття, включають сигнальні послідовності легкого ланцюга антитіла, наприклад, антитіло 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth. 125:191-202 (1989)), і сигнальні послідовності важкого ланцюга антитіла, наприклад, сигнальну послідовність важкого ланцюга антитіла MOPC141 (Sakano et al., Nature 286:5774 (1980)). Як альтернатива, можуть використовуватися й інші сигнальні послідовності (див. Watson, Nucl. Acids Res. 12:5145 (1984)). Сигнальний пептид зазвичай відщеплюється в просвіті ендоплазматичного ретикулума за рахунок дії сигнальних пептидаз. Це приводить до секреції білка імуно-злиття, що містить Fcділянку і частину Sema6A. В деяких варіантах реалізації винаходу, послідовність ДНК може кодувати місце протеолітичного розщеплення між касетою секреції й поліпептидом Sema6A. Таке місце розщеплення може забезпечувати, наприклад, протеолітичне розщеплення кодуємого білка злиття, таким чином відокремлюючи Fc-домен від цільового білка. Придатні місця протеолітичного розщеплення включають амінокислотні послідовності, які розпізнаються протеолітичними ферментами, такими як трипсин, плазмін, тромбін, фактор Ха або ентерокіназа К. Касета секреції може бути вбудована в реплікуючийся експресійний вектор. Придатні вектори включають лінійні нуклеїнові кислоти, плазміди, фагміди, косміди тощо. Типовим прикладом експресійного вектора є pdС, у якому транскрипція ДНК імуно-злиття перебуває під контролем енхансера й промотору цитомегаловіруса людини (див., наприклад, Lo et al., Biochim. Biophys. Acta 1088:712 (1991); та Lo et al., Protein Engineering 11:495-500 (1998)). Підходящі хазяйські клітини можуть бути трансформовані або піддані трансфекції ДНК, що кодує поліпептид Sema6A, і використані для експресії й секреції поліпептиду Sema6A. Зазвичай хазяйські клітини, що використовуються включають безсмертні клітини гібридоми, клітини мієломи, клітини 293, клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO), клітини Hela і клітини COS. В одному з варіантів реалізації винаходу, поліпептид Sema6A злитий з шарніром та Fcділянкою, тобто з С-кінцевою ділянкою константної ділянки важкого ланцюг Ig. Потенційні переваги злиття Sema6A-Fc включають розчинність, стабільність in vivo і мультивалентність, наприклад, димерізацію. Fc-ділянка, що використовується, може являти собою Fc-ділянку молекул IgA, IgD, або IgG (шарнір- CH2-CH3). Альтернативно, він може також являти собою Fcділянку молекул IgЕ або IgМ (шарнір- CH2-CH3-CH4). Зазвичай використовується Fc-ділянка молекули IgG, наприклад, Fc-ділянка молекули IgG1 або IgG4. В одному з варіантів реалізації винаходу, для злиття використовується послідовність, що починається в шарнірній ділянці відразу перед місцем розщеплення папаїну, який визначає Fc-ділянку молекули IgG хімічно (тобто залишок 216, що робить перший залишок константної ділянки важкого ланцюга залишком 116, відповідно до системи Kabat), або аналогічними місцями в інших імуноглобулінах. Точне місце, за яким здійснюється злиття, не є критичним; деякі конкретні місця добре відомі й можуть бути обрані для оптимізації біологічної активності, секреції або характеристик зв'язування молекули. Матеріали й способи конструювання й експресії ДНК, що кодує Fc-злиття, відомі в даній галузі знань і можуть бути застосовані для того, щоб одержати злиття Sema6A, без додаткових експериментів. У деяких варіантах реалізації винаходу використовують білок злиття, такий як описаний у джерелі (Capon et al., U.S. Patent Nos. 5,428,130 and 5,565,335). Повністю інтактні ділянки Fc дикого типу проявляють ефекторні функції, які можуть бути необов'язкові й небажані в білках Fc-злиття, що використовуються відповідно до способів даного винаходу. Тому, деякі місця зв'язування зазвичай делетують з Fc-ділянки при конструюванні касети секреції. Наприклад, оскільки спільна експресія з легким ланцюгом 17 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 небажана, місце зв'язування для білка, що зв'язує важкий ланцюг, Bip (Hendershot et al., Immunol. Today 8:111-14 (1987)), делетоване з CH2-домена Fc-ділянки молекули IgЕ, так що дане місце не заважає ефективній секреції імуноглобуліну. Також зазвичай делетують послідовності трансмембранного домена, присутні в молекулі IgМ. Найчастіше використовують Fc-ділянку молекули IgG1. Альтернативно, у секреційній касеті можна використовувати Fc-ділянку молекул інших підкласів імуноглобуліну гама (гама-2, гама-3 та гама-4). Зазвичай в секреційній касеті використовують IgG1 Fc-ділянку імуноглобуліну гама-1, який включає щонайменше частину шарнірної ділянки, C H2-ділянку й CH3-ділянку. У деяких варіантах, Fc-ділянка імуноглобуліну гама-1 являє собою CH2-делетований Fc, що включає частину шарнірної ділянки й CH3-ділянку, але не CH2-ділянку. CH2-делетований Fc був описаний у наступному джерелі (Gillies et al., Hum. Antibod. Hybridomas 1:47 (1990)). У деяких варіантах, використовується Fc-ділянка молекул IgA, IgD, IgE, або IgM. Білки злиття Sema6A-Fc можуть бути сконструйовані в багатьох різних конфігураціях. В одній конфігурації С-кінець частини Sema6A злитий безпосередньо з N-кінцем частини Fcшарніра. У дещо іншій конфігурації, короткий поліпептид, наприклад, з 2-10 амінокислот, включений у злиття між N-кінцем частини Sema6A та С-кінцем частини Fc. Такий лінкер забезпечує конформаційну рухливість, яка може підсилювати біологічну активність при деяких обставинах. Якщо в ділянці Fc збережена значна частина шарнірної ділянки, злиття Sema6A-Fc димеризується, формуючи тим самим двовалентну молекулу. Однорідна популяція мономерних Fc-злиттів містить моноспецифічні, бівалентні димери. Суміш двох мономерних Fc-злиттів, кожне з яких має різну специфічність, містить біспецифічні, бівалентні димери. Будь-який з великого числа перехресних лінкерів, які містять відповідну аміно-реактивну групу й тіол-реактивну групу, можна використовувати для з'єднання поліпептидів Sema6A із сироватковим альбуміном в інших гетерологічних пептидах. Приклади підходящих лінкерів включають аміно-реактивні перехресні лінкери, що вбудовують тіол-реактивний малеімід, наприклад, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, і GMBS. Інші підходящі лінкери вбудовують тіол-реактивну галоацетатну групу, наприклад, SBAP, SIA, SIAB. Лінкери, що надають захищений або незахищений тіол для реакції із сульфогідрильними групами, щоб одержати зв'язок, що допускає ослаблення, включають SPDP, SMPT, SATA, і SATP. Дані реагенти є комерційно доступними (наприклад, Pierce Chemicals). Хімічне зв'язування не обов'язково повинне стосуватися N-кінцевої частини поліпептиду Sema6A або тіольної частини сироваткового альбуміну. Наприклад, злиття Sema6A-альбумін можна одержати, використовуючи підходи генної інженерії, при цьому частина Sema6A може бути злита з геном сироваткового альбуміну на його N-кінці, С-кінці, або обох кінцях молекули. Для полегшення очищення або ідентифікації ділянки Sema6A можна одержувати злиття поліпептидів Sema6A з гетерологічними пептидами. Наприклад, для полегшення очищення Sema6A з використанням комерційно доступного хроматографічного середовища можна приєднувати до Sema6A гістидинову мітку. У деяких варіантах реалізації винаходу, конструкція злиття Sema6A використовується для збільшення продукції ділянки Sema6A у бактеріях. В таких конструкціях бактеріальний білок, у нормі експресуючий та/або секретуючий на високому рівні, використовується як N-кінцевий партнер для злиття з поліпептидом Sema6A (див., наприклад, Smith et al., Gene 67:31 (1988); Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988); La Vallie et al., Biotechnology 11:187 (1993)). При використанні частини Sema6A на аміно- і карбокси-кінцях, що підходять для злиття молекул-партнерів, можуть бути одержані бівалентні або тетравалентні форми поліпептиду Sema6A. Наприклад, частина Sema6A може бути злита з аміно- і карбокси-кінцем Ig частини з метою одержання бівалентного мономерного поліпептиду, що містить дві частини Sema6A. При димеризації двох таких мономерів за рахунок Ig частини утворюється тетравалентна форма білка Sema6A. Такі мультивалентні форми можна використовувати для досягнення підвищеної афінності зв'язування з мішенню. Мультивалентні форми Sema6A також можна одержати шляхом з'єднання частин Sema6A тандемно, з утворенням конкатемерів, які можна використовувати як самі по собі, так і формувати злиття з партнерів злиття, таким як Ig або HSA. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, включають направляючу частину. Направляюча частина включає білок або пептид, який направляє молекулу в певну частину тіла, наприклад, у мозок або його компартменти. У деяких варіантах, поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, приєднані або злиті із частиною, що направляє молекулу в мозок. Частини, що направляють молекулу в мозок, приєднані ковалентно (наприклад, прямо, шляхом трансляційного злиття, або за допомогою хімічного 18 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування або безпосередньо, або через спейсерну молекулу, що при бажанні може бути відщиплена), або нековалентно (наприклад, за допомогою оборотних взаємодій, які здійснюють авідин, біотин, білок А, Ig і т.п.). В інших варіантах реалізації винаходу, поліпептиди Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу, приєднані до ще однієї частини, що направляє молекулу в мозок. В інших варіантах, частина, що направляє молекулу в мозок, приєднана до безлічі поліпептидів Sema6A, які можна використовувати відповідно до способів даного винаходу. Частина, що направляє молекулу в мозок, асоційована з поліпептидом Sema6A, поліпшує доставку в мозок такого поліпептиду Sema6A. Описано велику кількість поліпептидів, які, злившись з білком або терапевтичним агентом, здійснюють доставку цього білка або терапевтичного агента через гематоенцефалічний бар'єр (ВВВ). Приклади, які не слід розглядати як обмежуючі, включають однодоменне антитіло FC5 (Abulrob et al., J. Neurochem. 95, 1201-1214 (2005)); mAB 83-14, моноклональне антитіло до людського рецептора інсуліну (Pardridge et al., Pharmacol. Res. 12, 807-816 (1995)); пептиди В2, В6 й В8, що зв'язуються з людським рецептором трансферину (hTfR) (Xia et al., J. Virol. 74, 11359-11366 (2000)); моноклональне антитіло OX26 до рецептора трансферину (Pardridge et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 259, 66-70 (1991)); і SEQ ID NOs: 1-18 °F U.S. Patent No. 6,306,365. Вміст вище зазначених джерел включено в даний текст у всій повноті за допомогою посилання. Покращена доставка в мозок композиції, що містить Sema6A, визначена за допомогою методів, добре розвинених у даній галузі знань. Наприклад, застосування до тварини радіоактивно міченого поліпептиду Sema6A, зв'язаного із частиною, що направляє молекулу в мозок; визначення локалізації в мозку; і порівняння локалізації з еквівалентним радіоактивно міченим поліпептидом Sema6A, не асоційованим із частиною, що направляє молекулу в мозок. Інші методи визначення покращення доставки білків у мозок описані у вищевказаних джерелах. Зв'язані полімери (відмінні від поліпептидів) Деякі варіанти реалізації винаходу включають поліпептид Sema6A, причому з поліпептидом Sema6A зв'язані (ковалентно) один або більше полімерів. Приклади полімерів, що підходять для такого зв'язування, включають поліпептиди (що обговорювалися вище), сахаридні полімери й ланцюжки поліалкіленгліколей. Зазвичай, хоча й необов'язково, полімер зв'язаний з поліпептидом Sema6A з метою покращення одного або більше пунктів з нижченаведених: розчинність, стабільність або біодоступність. Полімери, що зазвичай використовуються для зв'язування з поліпептидом Sema6A, відносяться до класу поліалкіленгліколей. Найбільш часто використовується поліетиленгліколь (ПЕГ). Частини ПЕГ, наприклад, 1, 2, 3, 4 або 5 полімерів ПЕГ можуть бути зв'язані з кожним поліпептидом Sema6A для збільшення напівжиття сироватки, у порівнянні з поліпептидом Sema6A без додаткових компонентів. ПЕГ частини молекули є не антигенними й практично інертні в біологічному плані. ПЕГ частини, які використовують на практиці, можуть бути розгалуженими або нерозгалуженими. Число частин ПЕГ, приєднаних до поліпептиду Sema6A, а також молекулярна вага окремих ланцюгів ПЕГ, можуть варіюватися. Взагалі, чим вище молекулярна вага полімеру, тим менше полімерних ланцюгів приєднано до поліпептиду. Зазвичай, сумарна маса полімерів, приєднаних до поліпептиду Sema6A, становить від 20 кДа до 40 кДа. Таким чином, якщо приєднано один ланцюг полімеру, його вага у більшості випадків становить 20-40 кДа. Якщо приєднано два ланцюги, їх вага в більшості випадків становить 10-20 кДа. Якщо приєднано три ланцюги, молекулярна вага кожного ланцюга в більшості випадків становить 7-14 кДа. Полімер, наприклад, ПЕГ, може бути зв'язаний з поліпептидом Sema6A через будь-яку підходящу, експоновану хімічно активну групу поліпептиду. Експоновані хімічно активні групи можуть являти собою, наприклад, N-термінальну аміно-групу або епсілон-аміногрупу внутрішнього лізинового залишку, або обидві ці групи. Активований полімер може вступати в реакцію й ковалентно зв'язуватися з кожною з вільних груп поліпептиду Sema6A. Вільні карбоксильні групи, відповідним чином активовані карбонільні групи, гідроксил-, гуанідил-, імідазол-, окислені вуглеводневі групи й меркапто-групи поліпептиду Sema6A (якщо є доступними) також можуть бути використані як хімічно активні групи для приєднання полімеру. У реакції зв'язування зазвичай використовується від приблизно 1.0 до приблизно 10 моль активованого полімеру на моль поліпептиду, залежно від концентрації поліпептиду. Зазвичай вибране співвідношення відображує баланс між максимально можливим виходом прямої реакції й зменшенням побічних реакцій (часто неспецифічних), які можуть впливати на бажану фармакологічну активність поліпептиду Sema6A. Переважно, щоб у результаті зберігалося щонайменше 50 % біологічної активності поліпептиду Sema6A (що може бути продемонстровано, наприклад, за допомогою будь-якого аналізу, описаного у тексті або 19 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відомого в даній галузі знань), і найбільш переважним варіантом є збереження майже 100 % біологічної активності поліпептиду Sema6A. Полімер може бути зв'язаний з поліпептидом Sema6A з використанням звичайних хімічних методів. Наприклад, поліалкілен-глікольна частина може бути з'єднана з лізиновою епсілонаміногрупою поліпептиду Sema6A. Зв'язування з лізиновим бічним ланцюгом може бути здійснене з активним складним ефіром, що містить N-гідроксилсукцинімід (НГС), таким як ПЕГсукциніміділ-сукцинат (ПЕГ-СС) і сукциніміділ-пропіонат (ПЕГ-СП). Підходящі поліалкіленглікольні частини включають, наприклад, карбоксиметил-НГС і норлейцин-Нгс, SC. Дані реагенти є комерційно доступними. Додаткові лінкери ПЕГ з хімічно активними аміно-групами можуть бути замінені на сукцинімідилову частину. Вони включають, наприклад, ізотіоціанати, нітрофенілкарбонати (PNP), епоксиди, бензотріазол-карбонати, SC-PEG, трезилат, альдегід, епоксид, карбонілімідазол й PNP-карбонат. Умови реакції зазвичай оптимізують для досягнення максимальної вибірковості й виходу реакції. Така оптимізація умов реакції відома фахівцям із середнім рівнем знань у даній галузі. ПЕГілювання може бути здійснене шляхом будь-якої з реакцій ПЕГілювання, відомих у даній галузі знань (див., наприклад, Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992), і Європейські патентні заявки EP 0 154 316 й EP 0 401 384). ПЕГілювання може бути проведене з використанням реакцій ацилювання або алкілування з хімічно активними молекулами поліетилен-гліколю (або аналогічного хімічно активного водорозчинного полімеру). ПЕГілювання шляхом ацетилування, як правило, включає реакцію з активним похідним поліетилен-гліколю у виді складного ефіру. Будь-яка хімічно активна молекула ПЕГ може бути залучена в реакцію ПЕГілювання. Часто як активований складний ефір ПЕГ використовують ПЕГ, етерифікований з N-гідроксилсукцинімідом (НГС). У значенні, що використовується у тексті, "ацилювання" включає, без яких-небудь обмежень, що випливають типи зв'язків між терапевтичним білком і водорозчинним полімером, таким як ПЕГ: амідну, карбаматну, уретанову тощо. (див., наприклад, Bioconjugate Chem. 5:133-140, 1994). Умови реакції зазвичай підбираються так, щоб уникнути використання температур, розчинників і значень pН, які можуть зашкодити або інактивувати поліпептид Sema6A. Як правило, зв'язок являє собою амідний зв'язок, і зазвичай щонайменше 95 % продукту, що утворюється в результаті реакції, моно-, ди- або три-пегільовано. Проте, можуть утворюватися також деякі варіанти молекул з більш високим ступенем ПЕГілювання, і їх кількість залежить від специфічних умов реакції. При бажанні, очищені варіанти ПЭГільованих молекул можна відокремити від суміші, зокрема, від молекул, що не вступили в реакцію, за допомогою звичайних способів очищення, включаючи, наприклад, діаліз, висалювання, ультрафільтрацію, іонообмінну хроматографію, гель-фільтраційну хроматографію, хроматографію з гідрофобним обміном й електрофорез. ПЕГілювання за допомогою алкілування зазвичай включає проведення реакції термінального альдегідного похідного ПЕГ з поліпептидом Sema6A у присутності відновника. Додатково, можна змінювати умови реакції, щоб вони сприяли ПЕГілювання головним чином тільки по N-термінальній аміногрупі поліпептиду Sema6A, з утворенням моно-ПЕГільованого білка. У будь-якому разі, включаючи моно-ПЕГілювання або полі-ПЕГілювання, ПЕГ групи зазвичай приєднуються до білка через CH2-NH-групу. З посиланням на CH2-групу, даний тип зв'язку називають "алкільний" зв'язок. Формування похідних шляхом відновлювального алкілування з утворенням N-термінально мічених моно-ПЕГільованих продуктів використовує різну здатність до реагування різних типів первинних аміногруп (лізин у порівнянні з N-термінальною групою), здатних до утворення похідних. Реакцію проводять при значенні pН, що дозволяє використовувати розбіжності pKa між епсілон-аміногрупами лізинових залишків й N-термінальних аміногруп білка. При такому селективному утворенні похідних можна контролювати приєднання водорозчинного полімеру, що містить хімічно активну групу, таку як альдегідна група, до білка: зв'язування з полімером має місце переважно на N-кінці білка, і не спостерігається ніяких значних модифікацій інших хімічно активних груп, таких як лізинові бічні ланцюги аміногруп. Полімерні молекули, які використовуються в підходах ацилювання й алкілування, вибираються з водорозчинних полімерів. Зазвичай обраний полімер модифікований так, щоб мати лише одну хімічно активну групу, наприклад, активну ефірну групу для ацилювання або альдегідну для алкілування, так що рівень полімеризації можна контролювати, відповідно до того, як це забезпечується в описуваній методиці. Типовим прикладом хімічно активного ПЕГ альдегіду є поліетиленгліколь-пропіоновий альдегід, стабільний у водяному розчині, або його моно- C1-C10 – алкокси або арилокси-похідні (див., наприклад, Harris et al., U.S. Pat. No. 5,252,714). Полімер може бути розгалуженим або нерозгалуженим. Полімери, обрані для 20 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 реакцій ацилювання, несуть єдину хімічно активну ефірну групу. Полімери, обрані для реакцій алкілування несуть єдину хімічно активну альдегідну групу. Зазвичай водорозчинний полімер не вибирається із природних глікозильних залишків, оскільки їх більш зручно одержувати в рекомбінантних експресійниї системах ссавців. Способи готування ПЕГільованого поліпептиду Sema6A зазвичай включають етапи: (а) здійснення реакції поліпептиду Sema6A з поліетилен-гліколем (таким, як похідне ПЕГ з хімічно активною ефірною або альдегідною групою) при умовах, в яких молекула являється пришитою до однієї або більше ПЕГ груп, та (б) одержання продуктів реакції. У цілому, оптимальні умови реакції для реакцій ацилювання визначаються для кожного конкретного випадку на основі відомих параметрів і бажаного результату. Наприклад, збільшення співвідношення ПЕГ до білка зазвичай приводить до збільшення кількості полі-ПЕГільованого продукту. Відновлювальне алкілування, що приводить до утворення практично однорідної популяції моно-полімер/поліпептид Sema6A, зазвичай включає етапи: (а) здійснення реакції білка Sema6A або поліпептиду Sema6A з хімічно активною молекулою ПЕГ в умовах, необхідних для відновлювального алкілування, при значеннях pН, що підходять для здійснення вибірної модифікації N-термінальної аміногрупи поліпептиду, та (б) одержання продуктів реакції. Для практично однорідної популяції моно-полімер/поліпептид Sema6A, умовами реакції відновлювального алкілування є ті умови, при яких відбувається селективне приєднання водорозчинної полімерної частини до N-кінця поліпептиду. Такі умови реакції зазвичай визначаються для розбіжностей pKa між аміногрупою лізинового бічного ланцюга й Nтермінальною аміногрупою. Для цілей даного винаходу, значення pН встановлювали зазвичай в інтервалі 3-9, зазвичай 3-6. Поліпептиди Sema6A можуть включати мітку, тобто частину, яка згодом може бути відщиплена в ході протеолізу. Так, лізин може бути селективно модифікований, якщо спочатку провести його реакцію з His-міткою, модифікованою лінкером з низькою молекулярною вагою, такою як реагент Траута (Pierce), який взаємодіє як з лізиному, так і з N-кінцем, а потім відщипити His-мітку. Поліпептид, що утворюється в результаті, буде містити вільну SH-групу, яку можна селективно модифікувати ПЕГ, що містить тіол-реактивну головну групу, наприклад, таку як малеімідна група, вінілсульфонова група, галоацететна група, або вільна або захищена SH-група. Реагент Траута можна замінити на будь-який лінкер, що встановлює специфічне місце для приєднання ПЕГ. Наприклад, його можна замінити на SPDP, SMPT, SATA, або SATP (Pierce). Так само, можна провести реакцію взаємодії білка з аміно-реактивним лінкером, що вбудовує малеімід (наприклад, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS, або GMBS), галоацетатну групу (SBAP, SIA, SIAB) або вінілсульфонову групу, а потім провести реакцію взаємодії продукту, що утворився, з ПЕГ, що містить вільні SH-групи. У деяких варіантах реалізації винаходу, поліалкілен-глікольна частина з'єднана із цистеїновою групою поліпептиду Sema6A. Таке зв'язування можна здійснити, використовуючи, наприклад, малеімідну групу, вінілсульфонову групу, галоацетатну групу або тіольну групу. При бажанні, можна зв'язати поліпептид Sema6A з поліетилен-глікольною частиною через лабільний зв'язок. Лабільний зв'язок можна розщепити при, наприклад, біохімічному гідролізі, протеолізі, або сульфідрильному розщепленні. Наприклад, цей зв'язок можна розщепити в in vivo (фізіологічних) умовах. Реакції можна здійснювати за допомогою будь-якого доступного способу, що використовується для здійснення взаємодії біологічно активних матеріалів з інертними полімерами, зазвичай при значеннях pН, рівних 5-8, наприклад, pН 5, 6, 7 або 8, якщо хімічно активні групи перебувають на альфа-аміногрупі на N-кінці. Зазвичай даний процес складається з готування активованого полімеру й наступного здійснення реакції взаємодії білка з активованим полімером, з утворенням білка, що підходить для використання. Вектори Вектори, які містять нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди Sema6A, можна також використовувати у відповідності до способів даного винаходу. Вибір вектора й послідовностей, що контролюють експресію, з якими з'єднані зазначені нуклеїнові кислоти, залежить від бажаних функціональних характеристик, наприклад, експресії білка й типу клітин-хазяїнів, які піддадуть трансформації. Елементи контролю експресії, корисні для регуляції експресії кодуючої послідовності, добре відомі фахівцям у даній галузі знань. Їх приклади включають, не обмежуючись цим, індуцибельні промотори, конститутивні промотори, сигнали секреції й інші регуляторні елементи. Якщо використовується індуцибельний промотор, можна здійснювати його контроль, 21 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, шляхом зміни статусу харчування, або шляхом зміни температури середовища, у якій ростуть клітини-хазяїни. Вектор може включати прокаріотичний реплікон, тобто послідовність ДНК, здатну до безпосередньої автономної реплікації й підтримки рекомбінантної молекули ДНК екстрахромосомно в бактеріальній клітині-хазяїні. Такі реплікони відомі фахівцям у даній галузі знань. Додатково, вектори, що включають прокаріотичний реплікон, можуть також включати ген, експресія якого являє собою детектуємий маркер, наприклад, стійкість до деяких препаратів. Прикладами бактеріальних генів стійкості до препаратів є гени, що забезпечують стійкість до ампіциліну або тетрацикліну. Вектори, що включають прокаріотичний реплікон, можуть також включати прокаріотичний промотор або промотор бактеріофага, для керування експресією кодуючої послідовності гена в бактеріальній клітині-хазяїні. Промоторні послідовності, сумісні з бактеріальними хазяїнами, зазвичай надаються в плазмідних векторах, що містять підходящі ділянки рестрикції для вставки сегмента ДНК, що буде експресуватися. Прикладами таких плазмідних векторів є pUC8, pUC9, pBR322 й pBR329 (BioRad), pPL й pKK223 (Pharmacia). Будь-які підходящі прокаріотичні клітини-хазяїни можуть бути використані для того, щоб експресувати рекомбінантну молекулу ДНК, що кодує білок, який використовується відповідно до способу даного винаходу. Для цілей даного винаходу можна використовувати численні системи експресійних векторів. Наприклад, в одному класі векторів використовують елементи ДНК, похідні від вірусів тварин, наприклад, вірусу бичачої папіломи, вірусу поліоми, аденовірусу, вірусу коров'ячої віспи, бакуловірусу, ретровірусів (RSV, MMTV або MOMLV) або вірусу SV40. В інших векторах використовуються поліцистронні системи із внутрішніми ділянками зв'язування рибосом. Додатково, можна вести відбір клітин, що включили ДНК у хромосоми, якщо внести в них один або кілька маркерів, що дозволяють вести відбір трансформованих клітин. Маркер може забезпечувати прототрофність ауксотрофному хазяїнові, стійкість до біоцидних речовин (наприклад, антибіотиків), або стійкість до важких металів, наприклад, до міді. Маркерний ген, що використовується для відбору, може бути або безпосередньо зв'язаний з послідовностями ДНК, які будуть експресуватися, або може бути внесений в ту ж клітину при ко-трансформації. Ген неоміцин-фототрансферази (neo) являє приклад маркерного гена, що використовується для відбору (Southern et al., J. Mol. Anal. Genet. 1:327-341 (1982)). Для оптимального синтезу мРНК можуть також вимагатися додаткові елементи. Ці елементи можуть включати сигнальні послідовності, сигнали сплайсингу, а також транскрипційні промотори, енхансери й сигнали термінації. В одному з варіантів реалізації винаходу, можна використовувати запатентований експресійний вектор Biogen IDEC, Inc., який називається NEOSPLA (U.S. patent 6,159,730). Даний вектор містить промотор/енхансер цитомегаловіруса, основний промотор мишачого бетаглобіну, ориджин реплікації SV40, послідовність поліаденілування бичачого гормону росту, екзон 1 й екзон 2 гени неоміцин-фототрансферази, ген дигідрофолат-редуктази й лідерну послідовність. Було показано, що даний вектор здатний до дуже високого рівня експресії при внесенні його в клітини CHO, після відбору на G418-вмісному середовищі й рості на метотрексаті. Зрозуміло, у даному винаході можна використовувати будь-який експресійний вектор, здатний викликати експресію в еукаріотичних клітинах. Приклади підходящих векторів включають, не обмежуючись ними, плазміди pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, і pZeoSV2 (доступні в Invitrogen, San Diego, CA), і плазміду pCI (доступну в Promega, Madison, WI). Інші експресійні вектори для еукаріотичних клітин відомі фахівцям у даній галузі й комерційно доступні. Як правило, такі вектори містять рестрикційні ділянки, що підходять для встановлення бажаного сегмента ДНК. Типові вектори включають pSVL й pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1, pml2d (International Biotechnologies), pTDT1 (ATCC 31255), ретровірусний експресійний вектор pMIG й pLL3.7, аденовірусний шатл-вектор pDC315 і вектори AAV. Інші типові векторні системи описані, наприклад, в U.S. Patent 6,413,777. Взагалі, скринінг великої кількості трансформованих клітин з метою виявлення тих клітин, які експресують досить високий рівень поліпептиду, є рутинним експериментом, який можна здійснювати, наприклад, за допомогою роботизованих систем. Часто використовувані регуляторні послідовності для експресії в клітинах-хазяїнах ссавців включають вірусні елементи, які визначають високий рівень експресії білка в клітинах ссавців, такі як промотори й енхансери, що виходять із ретровірусних LTR, цитомегаловіруса (CMV) (наприклад, промотор/енхансер CMV), мавпячого вірусу 40 (SV40) (наприклад, промотор/енхансер SV40), аденовірусу (наприклад, основний пізній промотор аденовірусу (Adml)), поліоми, і сильні промотори ссавців, наприклад, природні промотори імуноглобуліну й 22 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 актину. Для подальшого опису вірусних регуляторних елементів та їх послідовностей див. джерела (Stinski, U.S. Pat. No. 5,168,062; Bell, U.S. Pat. No. 4,510,245; and Schaffner, U.S. Pat. No. 4,968,615). Рекомбінантні експресійні вектори можуть містити послідовності, які регулюють реплікацію вектора в клітинах-хазяїнах (наприклад, ориджини реплікації) і маркерні гени, що використовуютьсядля відбору. Маркерні гени, що використовуються для відбору, прискорюють відбір клітин-хазяїнів, у які вбудований вектор (див., наприклад, Axel, U.S. Pat. Nos. 4,399,216; 4,634,665 and 5,179,017). Наприклад, зазвичай маркерний ген, що використовується для відбору, забезпечує стійкість до препарату, наприклад, G418, гігроміцину або метотрексату, клітини-хазяїна, у яку вбудовується вектор. Часто використовувані маркерні гени, що використовуються для відбору, включають ген дигідрофолат-редуктази (DHFR) (для використання в dhfr- клітинах-хазяїнах з відбором/ростом на метотрексаті) і ген neo (для відбору G418). Вектори, що кодують поліпептиди Sema6A, можна використовувати для трансформації підходящих клітин-хазяїнів. Трансформацію можна здійснювати будь-яким підходящим способом. Способи внесення екзогенної ДНК у клітини ссавців, добре відомі в даній галузі знань і включають декстран-опосредовану транфекцію, осадження фосфатом кальцію, полібренопосредовану транфекцію, злиття протопластів, електропорацію, енкапсулювання полінуклеотидів у ліпосомах, і пряму мікроін'єкцію ДНК у ядра. Додатково, молекули нуклеїнової кислоти можна вносити в клітини ссавців за допомогою вірусних векторів. Трансформацію клітин-хазяїнів можна здійснювати з використанням традиційних способів, що підходять для використовуваного типу вектора й клітин-хазяїнів. Для трансформації прокаріотичних клітин-хазяїнів можна використовувати електропорацію й спосіб сольового впливу (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110-14 (1972)). Для трансформації клітин хребетних можна використовувати електропорацію, способи катіонно-ліпідного або сольового впливу (див., наприклад, Graham et al., Virology 52:456-467 (1973); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1373-76 (1979)). Лінія клітин-хазяїнів, що використовується для експресії білка, може походити із ссавців; фахівець у даній галузі знань здатний переважно визначити конкретні лінії клітин-хазяїнів, які найкраще підходять для експресії в них бажаного генного продукту. Типові приклади ліній клітин-хазяїнів включають, не обмежуючись ними, клітини NSO, SP2, клітини нирки дитини хом'ячка (BHK), клітини нирки мавпи (COS), клітини людської гепатоклітинної карциноми (наприклад, Hep G2), клітини A549 DG44 й DUXB11 (лінії яєчника китайського хом'ячка, DHFRмінус), HELA (людська цервікальна карцинома), CVI (лінія нирки мавпи), COS (похідне CVI з Тантигеном SV40), R1610 (фібробласти китайського хом'ячка), BALBC/3T3 (мишачі фібробласти), HAK (лінія нирки хом'ячка), SP2/O (мишача мієлома), P3x63-Ag3.653 (мишача мієлома), BFA1c1BPT (клітини ендотелію бика), RAJI (людські лімфоцити) і 293 (людська почка). Лінії клітинхазяїнів зазвичай доступні в комерційних службах, Американській Колекції Клітинних Культур, або в опублікованій літературі. Експресію поліпептидів у лініях продукуючих клітин можна підсилювати, використовуючи відомі методики. Наприклад, для посилення експресії в різних умовах зазвичай використовують глутамін-синтазну (GS) систему (див., наприклад, Європейські патенти № 0 216 846, 0 256 055, і 0 323 997 й Європейську патентну заявку № 89303964.4. Клітини-хазяїни Клітини-хазяїни для експресії поліпептиду Sema6A для використання у відповідності зі способами даного винаходу можуть бути прокаріотичними й еукаріотичними. Типові приклади еукаріотичних клітин-хазяїнів включають, не обмежуючись ними, клітини дріжджів і ссавців, наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка (CHO) (номер CCL61 в АККК), NIH клітини ембріона швейцарської миші NIH-3T3 (номер CRL1658 в АККК), і клітини почки дитини хом'ячка (BHK). Інші підходящі еукаріотичні клітини-хазяїни включають клітини комах і рослин. Типовими прокаріотичними клітинами-хазяїнами є E. coli й Streptomyces. Генна терапія Поліпептид Sema6A можна продукувати in vivo у ссавців, наприклад, у людських пацієнтів, з використанням підходу генної терапії для лікування хвороб нервової системи, захворювань або ушкоджень, при яких стимулювання виживання, проліферації та/або диференціювання олігодендроцитів або стимулювання мієлінізації нейронів може бути терапевтично вигідним. Даний підхід включає застосування підходящої нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид Sema6A, з'єднаної з урахуванням нормальної роботи з підходящими послідовностями, що контролюють експресію. Як правило, дані послідовності вбудовані у вірусний вектор. Вектори, що підходять для такої генної терапії, включають аденовірусний вектор, альфавірусний вектор, 23 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ентеровірусний вектор, пестивірусний вектор, лентивірусний вектор, бакуловірусний вектор, герпесвірусний вектор, вектор на основі вірусу Епштейна-Бар, паповавірусний вектор, поксвірусний вектор, вектор на основі вірусу коров'ячої віспи, вектор на основі аденосателітного вірусу й вектор на основі вірусу простого герпеса. Вірусний вектор може являти собою вектор, нездатний до нормальної реплікації. Зазвичай використовуються аденвірусні вектори з делецією генів Е1 або Е3. Коли використовується вірусний вектор, вектор не містить маркерного гена, що і використовується для відбору. Фармацевтичні композиції Поліпептиди Sema6A, що використовуються у відповідності з способами даного винаходу, можуть входити до складу фармацевтичних композицій для застосування до ссавців, включаючи людину. Фармацевтичні композиції, що використовуються у відповідності з способами даного винаходу, включають фармацевтично прийнятні носії, включаючи, наприклад, іонообміні сполуки, окис алюмінію, стеарат алюмінію, лецитин, сироваткові білки, наприклад, людський сироватковий альбумін, буферні речовини, наприклад, фосфати, гліцин, сорбінова кислота, сорбат калію, суміш фрагментів гліцеридів насичених жирних кислот рослин, воду, солі або електроліти, наприклад, сульфат протаміну, гідрофосфат натрію, гідрофосфат калію, хлорид натрію, солі цинку, колоїдний оксид кремнію, трисилікат магнію, полівінілпіролідон, речовини целюлозної природи, поліетиленгліколь, натрієва карбоксиметилцелюлоза, поліакрилати, воски, полімери із блоків поліетилен-поліоксипропілену, поліетиленгліколь і ланолін. Композиції, що використовуються у відповідності зі способами даного винаходу, можна застосовувати за допомогою будь-якого підходящого способу, наприклад, парентерально, інтравентрикулярно, орально, шляхом інгаляції спреєм, локально, ректально, назально, букально, вагінально або з використанням імплантованого резервуара. Термін "парентерально" у значенні, що використовується у тексті, включає підшкірне, внутрішньовенне, внутрім'язове, інтраартикулярне, внутрісуглобне, підлопаткове, інтратекальне, внутріпечіночне, внутріосередкове й внутрічерепне введення або уливання. Як було описано вище, поліпептиди Sema6A, що застосовуються у відповідності до способів даного винаходу, працюють у нервовій системі, стимулюючи виживання, проліферацію й диференціювання олігодендроцитів і мієлінізацію нейронів. Відповідно, у способах даного винаходу, поліпептиди Sema6A застосовуються таким чином, щоб вони могли проникнути через гематоенцефалічний бар'єр. Таке проникнення здійснюється завдяки фізико-хімічним властивостям, властивим самій молекулі поліпептиду Sema6A, завдяки іншим компонентам фармацевтичної композиції, або за рахунок використання механічного пристосування, наприклад, голки, канюлі або хірургічного інструмента, які дозволяють фізично порушити гематоенцефалічний бар'єр. Якщо поліпептид Sema6A є молекулою, якій не властиве проникнення через гематоенцефалічний бар'єр, наприклад, при злитті із частиною молекули, що підсилює проникнення, підходящими способами введення є, наприклад, інтратекальний і внутрічерепний, тобто безпосередньо у полум'я хронічного ушкодження при розсіяному склерозі. Якщо поліпептид Sema6A є молекулою, якій властиве проникнення через гематоенцефалічний бар'єр, підходящим способом його введення може бути один або більше із різних способів, що описуються нижче. Стерильні ін'єкційні форми композицій, що використовуються відповідно до способів даного винаходу, можуть являти собою водну або масляну суспензію. Дані суспензії можуть бути виготовлені відповідно до підходів, відомих в даній галузі знань, з використанням підходящих диспергуючих або змочувальних речовин і суспендуючих речовин. Стерильний ін'єкційний препарат може також являти собою стерильний ін'єкційний розчин або суспензію в нетоксичному парентерально застосовуваному розчиннику, наприклад, суспензію в 1,3бутандіолі. До підходящих розчинників, які можна використовувати подібним чином, відносяться вода, розчин Рінгера й ізотонічний розчин хлориду натрію. Стерильні нелетучі олії також традиційно використовуються як розчинники або суспендуючі речовини. Для цих цілей можна використовувати будь-яку звичайну нелетучу олію, включаючи синтетичні моно- або дигліцериди. Жирні кислоти, наприклад, олеїнову кислоту та її гліцеринові похідні, можна використовувати для готування ін'єкційних розчинів, так само, як і природні олії, що застосовуються у фармації, наприклад, маслинову олію або касторову олію, особливо їх поліоксиетильовані варіанти. Дані масляні розчини або суспензії можуть також містити довголінцюжковий спирт як розчинник або диспергуючий засіб, наприклад, карбоксиметилцелюлозу або подібну диспергуючу речовину, що зазвичай використовується при готуванні фармацевтично припустимих дозованих форм, включаючи емульсії й суспензії. Також для готування лікарських форм можна застосовувати інші широко використовувані поверхневоактивні речовини, наприклад Tweens, Spans, й інші емульгатори або підсилювачі біодоступності, 24 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 які зазвичай використовуються у виробництві фармацевтично припустимих твердих, рідких або інших дозованих форм. Парентеральне застосування може здійснюватися у виді одиночної болючої дози, уливання, або завантажувальної болючої дози з наступним введенням підтримуючої дози. Ці композиції можуть застосовуватися в специфічно зазначеному або тимчасовому інтервалі, що варіює, наприклад, один раз у день, або "як потрібно". Деякі фармацевтичні композиції, що використовуються відповідно до способів даного винаходу, можна застосовувати орально в припустимих дозованих формах, включаючи, наприклад, капсули, таблетки, водні суспензії й розчини. Деякі фармацевтичні композиції також можна застосовувати у виді назальних аерозолів або інгаляцій. Такі композиції можуть бути приготовлені у виді сольових розчинів, включаючи бензиловий спирт або інші підходящі консерванти, речовини, що сприяють абсорбції, для збільшення біодоступності, та/або інші традиційні розчинники або диспергуючі речовини. Кількість поліпептиду Sema6A, який може бути зв'язаний з матеріалом носіїв для створення одиничної дозованої форми, варіює залежно від організму, що піддається лікуванню, типу використовуваного поліпептиду й конкретного способу застосування. Композицію можна застосовувати у виді одиничної дози, множинних доз або протягом встановленого періоду часу у виді вливань. Дозовий режим також може бути підібраний таким чином, щоб викликати оптимальну бажану відповідь (наприклад, терапевтичну або профілактичну відповідь). У способах даного винаходу використовується "терапевтично ефективна кількість" або "профілактично ефективна кількість" поліпептиду Sema6A. Така терапевтично або профілактично ефективна кількість може варіювати у відповідності з наступними факторами: стан захворювання, вік, стать й вага індивіда. Терапевтично або профілактично ефективна кількість також являє собою ту кількість, при якій терапевтично корисний вплив переважає над будь-якими токсичними або шкідливими ефектами. Специфічні дози й режим протікання для будь-якого окремо взятого пацієнта залежать від значної кількості факторів, включаючи конкретний використовуваний поліпептид Sema6A, вік пацієнта, вагу тіла, загальне здоров'я, стать, дієту, час застосування, рівень екскреції, комбінацію з іншими лікарськими препаратами, і серйозність конкретного захворювання, лікування якого проводиться. Оцінка цих факторів може бути проведена медичними працівниками із середніми знаннями в даній галузі. Кількість також залежить від індивідуального пацієнта, що піддається лікуванню, способу застосування, типу ліків, характеристик використовуваної речовини, серйозності захворювання, й бажаного ефекту. Кількість, яку варто використовувати, може бути визначена на підставі фармакологічних і фармакокінетичних принципів, добре відомих у даній галузі знань. Відповідно до способів даного винаходу, поліпептиди Sema6A зазвичай застосовуються безпосередньо до нервової системи, інтрацеребровентрикулярно або інтратекально, наприклад, у полум'ї хронічного ураження при розсіяному склерозі. Композиції для застосування у відповідності зі способами даного винаходу можна готувати таким чином, щоб вводити дозу поліпептиду Sema6A 0.001 – 10 мг/кг ваги тіла на день. У деяких варіантах реалізації винаходу, дозування становить 0.01 – 1.0 мг/кг ваги тіла на день. У деяких варіантах реалізації винаходу, дозування становить 0.001 – 0.5 мг/кг ваги тіла на день. У багатьох варіантах реалізації винаходу, дозування становить 5 мг/кг – 100 мг/кг ваги тіла на день. В інших варіантах реалізації винаходу, дозування становить 50 мг/кг – 500 мг/кг ваги тіла на день. Даний винахід також включає дозування 100 мг/кг –1 г/кг ваги тіла на день. Приклади дозувань, що не є обмеженнями, які використовуються відповідно до способів даного винаходу, вибираються із групи, що складається з 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 70, 80 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, або 1000 мг/кг ваги тіла на день. Дозування, що використовуються в даному винаході, можуть становити 1 г/кг – 5 г/кг ваги тіла на день. Дозування, що мають проміжні значення між зазначеними вище, також розглядаються в межах даного винаходу. Зазначені дозування можуть застосовуватися до суб'єктів впливу щодня, або не щодня, або щотижня, або відповідно до будь-якого іншого режиму, визначеним емпірично. Типовий приклад лікування визначає порядок застосування в множинних дозах, протягом тривалого періоду, наприклад, протягом, щонайменше шести місяців. Інші типові приклади режимів лікування визначають порядок застосування один раз кожні два тижні, або один раз на місяць, або один раз кожні 3-6 місяців. Типові дозування включають, не обмежуючись ними, 1-10 мг/кг або 15 мг/кг щодня, 30 мг/кг не щодня, або 60 мг/кг один раз на тиждень. У деяких варіантах реалізації винаходу, можна здійснювати лікування суб'єкта шляхом введення молекул нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид Sema6A. Дозування для 25 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнових кислот варіюють у межах приблизно від 10 нг до 1 г, від 100 нг до 100 мг, від 1 мкг до10 мг або від 30 до 300 мкг ДНК на одного пацієнта. Дозування для інфекційних вірусних векторів варіюють від 10 до 100, або більше, віріонів на дозу. У композиції, що використовуються у відповідності зі способами даного дослідження, також можуть бути включені супутні активні компоненти. Наприклад, поліпептид Sema6A або білок злиття може бути сполучений та/або застосований разом з однією або більше додатковими терапевтичними речовинами. Винахід містить у собі будь-який підходящий спосіб доставки поліпептиду Sema6A в обрану тканину-мішень, включаючи болючу ін'єкцію водяного розчину, або імплантацію системи з контрольованим вивільненням речовини. Використання імплантатів з контрольованим вивільненням речовини зменшує число необхідних повторних ін'єкцій. Поліпептиди Sema6A, що використовуються у відповідності до способів даного винаходу, можуть бути безпосередньо влиті в головний мозок. Відомі різноманітні імплантати для прямого вливання в головний мозок, які є ефективними способами для доставки терапевтичних сполук у мозок людських пацієнтів, що страждають нейродегенеративними захворюваннями. Дані способи включають хронічні вливання в мозок з використанням стереотаксично імплантованих насосів, тимчасових внутрітканинних катетерів, постійних внутрічерепних імплантованих катетерів і хірургічно імплантованих, біодеградуємих імплантатів (див., наприклад, Gill et al., supra; Scharfen et al., "High Activity Iodine-125 Interstitial Implant For Gliomas, ” Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 24(4):583-591 (1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas, ” Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 43(5):977-982 (1999); chapter 66, pages 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy, ” in Gildenberg et al., Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998); and Brem et al., "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial, ” J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995). Композиції можуть також містити поліпептид Sema6A, розподілений у біосумісному матеріалі-носії, що функціонує як система доставки сполук або їх підтримки. Підходящі приклади носіїв з безперервним вивільненням речовини включають напівпроникні полімерні матриці у виді формованих предметів, наприклад, супозиторії або капсули. Імплантуємі або мікрокапсульні матриці з безперервним вивільненням речовини включають полілактиди (U.S. Patent No. 3,773,319; EP 58,481), ко-полімери L-глутамінової кислоти й гамма-етил-L-глутамату (Sidman et al., Biopolymers 22:547-56 (1985)); полі(2-гідроксиетил-метакрилат), етиленвінілацетат (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) або полі-D-(-)-3гідроксимасляну кислоту (EP 133,988). В деяких варіантах реалізації винаходу, поліпептид Sema6A застосовується до пацієнта за допомогою прямого вливання у відповідну ділянку головного мозку (див., наприклад, Gill et al., "Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease, ” Nature Med. 9: 589-95 (2003)). Альтернативні підходи також доступні й можуть бути використані, щоб застосувати поліпептид Sema6A відповідно до винаходу. Наприклад, стереотаксична установка катетера або імплантату може бути здійснена з використанням апарата Райхерта-Мундінгера й багатофункціональної навігаційної системи ZD (Zamorano-Dujovny). Комп'ютеризований томографічний сканер (СТ) з посиленням контрастності дозволяє здійснювати тривимірне багатоплощинне планування впливу, при ін'єкції 120 мл омніпаку, 350 мг йоду / мл, з товщиною зрізу 2 мм (STP, Fischer, Freiburg, Germany). Дане устаткування дозволяє планувати лікування на основі вивчення магнітно-резонансних зображень, поєднуючи інформацію, одержану СТ і МРТ, для точного підтвердження. З тією же метою можна використовувати стереотаксичну систему Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA), модифіковану для використання з GE CT сканером (General Electric Company, Milwaukee, WI), а також стереотоксичну систему Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA). Таким чином, на початкових етапах імплантації кільцева основа стереотаксичної рамки BRW може бути прикріплена до черепа пацієнта. Серії СТ зрізів можуть бути одержані з інтервалами в 3 мм, хоча ділянка (тканини-мішені) із графічною рамкою локалізатора скріплена з основною платою. Комп'ютерну програму планування лікування можна запускати на комп'ютері VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass.) з використанням CT координат зображень, одержаних із графітового стрижня, для співставлення результатів CT й BRW. Способи лікування захворювань, пов'язаних з демієлінізацію і дисмієлінізацію, описані у тексті, перед використанням на людині, як правило, тестовані in vitro, а потім in vivo на прийнятній тваринній моделі для оцінки бажаного терапевтичного або профілактичного ефекту. 26 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фахівцеві з базовими знаннями в даній галузі відомі прийнятні тваринні моделі, включаючи трансгенних тварин. Наприклад, у тексті описані аналізи in vitro, що дозволяють продемонструвати вплив поліпептидів Sema6A на диференціювання й виживання олігодендроцитів. Вплив поліпептидів Sema6A на мієлінізацію аксонів або диференціювання олігодендроцитів можна тестувати in vitro, згідно тому, як це описано в Прикладах. На кінець, тести in vivo можна здійснити, одержавши трансгенних мишей, експресуючих поліпептид Sema6A, або вплинувши поліпептидом Sema6A на мишей або пацюків в умовах моделі. Діагностика й моніторинг нейродегенеративних захворювань Деякі варіанти реалізації даного винаходу орієнтовані на спосіб діагностики або моніторингу неврологічного захворювання або стану суб'єкта, за допомогою: (а) одержання зразка, наприклад, тканини або проби біологічної рідини, наприклад, крові або спинномозкової рідини (ЦСР) від суб'єкта, що піддається діагностиці або моніторингу, (b) вимірювання рівня поліпептиду Sema6A у зразку, та (с) співставлення рівня поліпептиду Sema6A зі зразком порівняння. Під терміном "діагностика" розуміють ідентифікацію індивіда який має конкретне захворювання або стан. Під терміном "моніторинг" розуміють постійну та/або періодичну перевірку на наявність даного захворювання або феномена. В одному з варіантів реалізації винаходу, спосіб моніторингу нейродегенеративного захворювання включає відбір проб біологічних рідин у декількох тимчасових точках з інтервалом, як частина моніторингу стану пацієнта при лікуванні нейродегенеративного захворювання. В іншому варіанті реалізації винаходу, спосіб моніторингу нейродегенеративного захворювання включає відбір проб біологічних рідин у декількох тимчасових точках з інтервалом, як частина моніторингу стану пацієнта при лікуванні розсіяного склерозу. В одному з варіантів реалізації винаходу, захворюванням або станом, у відношенні якого необхідно здійснювати діагностику або моніторинг, є розсіяний склероз. В інших варіантах, захворювання або стан може бути обраний із групи, що включає прогресуючу мультифокальну лейкоенцефалопатію (PML), енцефаломієліт (EPL), мієлоліз моста головного мозку (CPM), адренолейкодистрофію, хворобу Александера, хворобу Пеліцеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоїдно-клітинну лейкодистрофію (хвороба Краббе), Уолеровську дегенерацію, ретробульбарний неврит, поперечний мієліт, бічний аміотрофічний склероз (ALS), хворобу Хантінгтона, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, травми спинного мозку, травми головного мозку, променеве ураження, неврологічні ускладнення хіміотерапії, інсульт, ішемічну нейропатію зорового нерва, нестачу вітаміну Е, синдром нестачі ізольованого вітаміну Е, AR, синдром Бесена-Корнцвейга, синдром Марчіафава-Бігнамі, метахроматичну лейкодистрофію, невралгію тройнічного нерва й параліч Белла. Проби біологічних рідин включають, не обмежуючись ними, кров, сечу й спинномозкову рідину (ЦСР). Способи, за допомогою яких можна одержати біологічні рідини, включають, не обмежуючись ними, біопсію тканин, венопункцію, збір сечі й спинномозкову пункцію. В одному з варіантів реалізації винаходу, проба біологічної рідини являє собою ЦСР або кров. Тканини включають, не обмежуючись ними, епітелій, м'язову тканину, сполучну тканину, або нервову тканину. В одному з варіантів реалізації винаходу, тканина являє собою епітелій, наприклад, ділянку шкірної тканини. В іншому варіанті реалізації винаходу, дендритні клітини, відібрані із тканини або біологічної рідини, наприклад, ЦСР або крові, використовують для виявлення експресії Sema6A. Проба біологічної рідини відбирається в суб'єкта. У деяких варіантах реалізації винаходу, суб'єкт відноситься до хребетного. Хребетні включають, не обмежуючись ними, людей, мишей, пацюків, овець, кіз, свиней, рогату худобу, коней, рептилій, риб, амфібій й ембріони птахів, рептилій і риб. В одному з варіантів реалізації винаходу, суб'єкт є людиною. В іншому варіанті реалізації винаходу, суб'єкт є людиною, що страждає, або приблизно страждає неврологічним захворюванням, обраним із списку, що включає прогресуючий розсіяний склероз, мультифокальну лейкоенцефалопатію (PML), енцефаломієліт (EPL), мієлоліз моста головного мозку (CPM), адренолейкодистрофію, хворобу Александера, хворобу Пеліцеуса-Мерцбахера (PMZ), глобоїдно-клітинну лейкодистрофію (хвороба Краббе), Уолеровську дегенерацію, ретробульбарний неврит, поперечний мієліт, бічний аміотрофічний склероз (ALS), хворобу Хантінгтона, хворобу Альцгеймера, хворобу Паркінсона, травми спинного мозку, травми головного мозку, променеве ураження, неврологічні ускладнення хіміотерапії, інсульт, ішемічну нейропатію зорового нерва, нестачу вітаміну Е, синдром нестачі ізольованого вітаміну Е, AR, синдром Бесена-Корнцвейга, синдром Марчіафава-Бігнамі, метахроматичну лейкодистрофію, невралгію тройнічного нерва й параліч Белла. В окремому варіанті реалізації винаходу, суб'єкт є пацієнтом з розсіяним склерозом, у якого нещодавно виявили щонайменше один стан, 27 UA 99452 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 обираний із групи, що включає заціпеніння, слабість, порушення зору, втрата рівноваги, запаморочення, гіперактивність сечового міхура, стомлення й депресія. У значенні, що використовується у тексті, "недавно" може означати 3, 5, 7, 10, 14 або 21 день. Рівень експресії Sema6A у зразку може служити індикатором стану хвороби, наприклад, серйозності захворювання або стану, схильності суб'єкта до захворювання, прогнозу відносно суб'єкта, або ефективності застосовуваної терапії проти захворювання. Даний винахід далі забезпечує способи детекції присутності поліпептиду Sema6A у зразку, одержаному від суб'єкта. Будь-який спосіб, відомий у даній галузі знань, може бути використаний для детекції білків або мРНК. Такі методи включають, не обмежуючись ними, фарбування Кумасі синім, імунодифузію, імуноелектрофорез, імунохімичні способи, аналіз зв'язування ліганд, імуногістохімічні підходи, аглютинація й аналіз комплементу [Basic and Clinical Immunology, 217-262, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, CT, (1991), джерело, включене за допомогою посилання]. Спосіб детекції мРНК Sema6A добре відомий у даній галузі знання (Tuan Rocky, Recombinant Protein Protocols: Detection and Isolation (Methods st in Molecular Biology) (Methods in Molecular Biology) (1 ed. Humana Press, PA 1997)). Прикладами, що не є обмеженням, є нозерн-гібридизація (гібридизація ДНК-РНК), гібридизація in situ, або ОТПЦР. Численні імунологічні аналізи конкурентного й неконкурентного зв'язування білків добре відомі фахівцеві в даній галузі знань. Антитіла, що використовуються в таких аналізах, можуть бути не міченими, наприклад, антитіла, що використовуються в реакції аглютинації, або міченими, для використання в різних методах аналізу. Мітки, які можна використовувати, включають радіонукліди, ферменти, флюорофори, хемілюмінесцентні молекули, субстрати ферментів або кофактори, інгібітори ферментів, частки, барвники тощо для використання в радіоімунологічному аналізі RIA), ферментативних імуноаналізах, наприклад, твердофазному імуноферментному аналізі (ТИФУ, ELISA), флуоресцентному імуноаналізі, вестернівгібридизації тощо. При діагностиці або моніторингу неврологічного захворювання в суб'єкта, рівень поліпептиду Sema6A у зразку можна співставляти з рівнем поліпептиду Sema6A у зразку порівняння. Підходящі зразки порівняння можуть включати, не обмежуючись ними, тканини або проби біологічних рідин, одержані від індивіда, нормального стосовно нервової системи. В одному з варіантів реалізації винаходу, зразок порівняння може бути одержаний від суб'єкта, що не страждає нейродегенеративним захворюванням. В іншому варіанті реалізації винаходу, зразок порівняння може бути одержаний від суб'єкта, що не страждає розсіяним склерозом. Додатково, як внутрішній стандарт або контроль можна використовувати відомий білок, продукуємий суб'єктом, наприклад, альбумін, якщо вимірювати його кількість у сироватці або тотальному білку. Набори для діагностики Набори для діагностики також розглядаються в даному винаході. Такі набори дозволяють проводити детекцію, діагностику або моніторинг нейродегенеративних захворювань. Підхід одиночного тесту, що використовується у даних наборах для діагностики, зменшує час, необхідний для діагностики нейродегенеративного захворювання в індивіда та/або знижує час, необхідний для детекції диференціально експресуючихся білків у пробі біологічної рідини пацієнта, якщо відносно пацієнта проводиться моніторинг прогресії захворювання та/або ефекту від лікування захворювання. Один з варіантів реалізації винаходу орієнтований на створення діагностичного набору для детекції, діагностики або моніторингу нейродегенеративних захворювань у пацієнтів, з використанням антитіла або антиген-єднального фрагмента, які специфічно зв'язуються з поліпептидом Sema6A, що описується у тексті, та детектуємої мітки. В іншому варіанті реалізації, винахід орієнтований на створення діагностичного набору для детекції, діагностики або моніторингу розсіяного склерозу в пацієнтів з використанням антитіла або антигенєднального фрагмента, які специфічно зв'язуються з поліпептидом Sema6A, і детектуємої мітки. У деяких варіантах реалізації винаходу, антитіло позначене ферментами, необхідними для детекції, наприклад пероксидазою хрону, -галактозидазою, люциферазою, лужною фосфатазою, глокозооксидазою тощо. У варіантах, коли воно позначено ферментом, необхідним для детекції, детекція антитіла здійснюється за допомогою додавання додаткових реагентів, які використовуються ферментом для утворення детектуємого продукту реакції. Наприклад, пероксидаза хрону, що взаємодіє з пероксидом водню й діаіинобензидином. Антитіло може бути також позначене біотином, і в цьому випадку його детекцію можна проводити за допомогою непрямого виміру зв'язування авідину або стрептавідину. Антитіло може бути також позначене раніше визначеними поліпептидними епітопами, розпізнаваними 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюUse of semaphorin 6a for promoting myelination and oligodendrocyte differentiation
Автори англійськоюChedotal, Alain, Mi, Sha, Bernard, Frederic
Назва патенту російськоюСпособ стимулирования миелинизации и дифференцирования олигодендроцитов путем применения семафорина 6a
Автори російськоюШедоталь Ален, Ми Ша, Бернар Фредерик
МПК / Мітки
МПК: A61P 25/00, A61K 38/17, A61K 48/00
Мітки: олігодендроцитів, спосіб, диференціювання, семафорину, стимулювання, мієлінізації, застосування, шляхом
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/129-99452-sposib-stimulyuvannya-miehlinizaci-ta-diferenciyuvannya-oligodendrocitiv-shlyakhom-zastosuvannya-semaforinu-6a.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб стимулювання мієлінізації та диференціювання олігодендроцитів шляхом застосування семафорину 6a</a>
Фармакологічний набір для лікування безплідності шляхом програмованого контрольованого стимулювання циклу роботи яєчників
Номер патенту: 72513
Опубліковано: 15.03.2005
Автори: Рітмюллер-Вінцен Хільда, Енгел Юрген
МПК: A61K 38/09, A61K 38/24, A61K 45/06, A61P 15/08, A61K 31/565
Мітки: стимулювання, яєчників, набір, циклу, фармакологічний, шляхом, роботи, лікування, контрольованого, програмованого, безплідності
Формула / Реферат:
1. Фармацевтичний набір для лікування безплідності шляхом програмування контрольованого стимулювання циклу роботи яєчників (COS) і процедур штучного розмноження (ART), що включає:a) LHRH антагоніст для пригнічення передчасної овуляції при контрольованому стимулюванні циклу роботи яєчників (COS) і способах штучного розмноження (ART);b) лише один прогестоген або, альтернативно, комбіновані пероральні контрацептивні препарати для...
Застосування полігексаметиленгуанідингідрохлориду та спосіб стимулювання росту і розвитку олійних культур
Номер патенту: 85356
Опубліковано: 12.01.2009
Автори: Апрасюхін Олександр Іванович, Філонік Ірина Олександрівна, Нікітін Михайло Михайлович
МПК: A01C 1/00, A01P 21/00, A01N 47/40
Мітки: стимулювання, полігексаметиленгуанідингідрохлориду, олійних, росту, застосування, спосіб, культур, розвитку
Формула / Реферат:
1. Застосування полігексаметиленгуанідингідрохлориду загальної формули:,що відповідає молекулярній масі від 5 до 9 тис. ум. од., як стимулятора росту і розвитку олійних культур.2. Спосіб стимуляції росту та розвитку соняшнику та ріпаку, що включає в себе обробку насіння перед сівбою і вегетуючих рослин шляхом їх обприскування, який відрізняється тим,...
Штам bifidobacterium bifidum, композиція, що містить галактоолігосахариди, її застосування та спосіб виробництва речовини для стимулювання росту біфідобактерій
Номер патенту: 83027
Опубліковано: 10.06.2008
Автори: Слупінскі Яцек Вітольд, Цорціс Георгіос, Уінн Ентоні Грехем, Гібсон Гленн
МПК: C12N 1/20, C12P 19/14, A61K 31/702, A61P 1/04, C07H 3/00, A61K 31/7016
Мітки: галактоолігосахариди, штам, речовини, bifidobacterium, виробництва, композиція, застосування, спосіб, містить, біфідобактерій, стимулювання, bifidum, росту
Формула / Реферат:
1. Штам Bifidobacterium bifidum, який депонований під інвентарним номером № NCIMB 41171 в Національній колекції промислових та морських бактерій, м. Абердин, Сполучене Королівство, 31 березня 2003, що виявляє здатність продукувати фермент, який має галактозидазну активність, що перетворює лактозу на галактоолігосахаридну суміш, що містить дисахарид Gal(a1-6)-Gal, принаймні один трисахарид, вибраний з Gal(b1-6)-Gal(b1-4)-Glc або...
Лікувальна речовина для профілактики та стимулювання організму в період розвитку та етіопатогенезу захворювань та спосіб її застосування
Номер патенту: 51916
Опубліковано: 16.12.2002
Автор: Савченко Петро Павлович
МПК: A61H 33/00
Мітки: речовина, лікувальна, профілактики, період, організму, застосування, захворювань, розвитку, стимулювання, етіопатогенезу, спосіб
Формула / Реферат:
1. Застосування озону як лікувальної речовини для профілактики та стимулювання організму в період розвитку та етіопатогенезу захворювань різноманітного типу, що руйнує активний синглетний кисень.2. Спосіб застосування озону, який відрізняється тим, що під час початкової стадії хвороби лікування проводиться озонуванням з кондиціонуванням лікувального помешкання із перебуванням у ньому хворого з контролем концентрації озону у повітрі в...
Застосування спінозинів для стимулювання або прискорення загоювання ран
Номер патенту: 88295
Опубліковано: 12.10.2009
Автори: Гакет Крістіна Кларе, Лоу Лайонел Барі
МПК: A61P 17/02, A61K 31/7048
Мітки: прискорення, застосування, ран, загоювання, спінозинів, стимулювання
Формула / Реферат:
1. Застосування спінозину або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі для виготовлення лікарського засобу для стимулювання або прискорення загоювання ран у ссавця.2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що згаданим спінозином є спінозад або його фізіологічно прийнятна похідна чи сіль.3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що згаданий ссавець не має порушення процесу загоювання.4. Застосування за п....
Попередній патент: Похідні амінонікотинової кислоти та ізонікотинової кислоти як інгібітори дгодг (дигідрооротатдегідрогенази)
Наступний патент: Нагрівальний пристрій на базі матеріалу з карбонового волокна
Випадковий патент: Спосіб хірургічного лікування гемороїдальної хвороби