Штам bifidobacterium bifidum, композиція, що містить галактоолігосахариди, її застосування та спосіб виробництва речовини для стимулювання росту біфідобактерій

1. Штам Bifidobacterium bifidum, який депонований під інвентарним номером № NCIMB 41171 в Національній колекції промислових та морських бактерій, м. Абердин, Сполучене Королівство, 31 березня 2003, що виявляє здатність продукувати фермент, який має галактозидазну активність, що перетворює лактозу на галактоолігосахаридну суміш, що містить дисахарид Gal(a1-6)-Gal, принаймні один трисахарид, вибраний з Gal(b1-6)Gal(b1-4)-Glc або Gal(b1-3)-Gal(b1-4)-Glc, тетраса 2 (19) 1 3 83027 4 10. Застосування композиції за будь-яким з пп. 3-5 для приготування лікарського препарату для лікування захворювань кишечнику, зокрема такого, як запальне захворювання кишечнику або синдром подразненої кишки. 11. Застосування штаму Bifidobacterium bifidum за п. 1 або за п. 2 для продукування суміші галактоолігосахаридів, визначеної в п. 3 або в п. 4. 12. Застосування за п. 11, де суміш галактоолігосахаридів є частиною продукту, призначеного для поліпшення стану кишечнику. 13. Застосування за п. 12, де продукт вибирають з групи, що складається з молочних продуктів, напоїв, дитячого харчування, круп'яних продуктів, сухого печива, кондитерських виробів, тортів, харчових добавок, добавок до раціону, кормів для тварин, кормів для домашньої птиці або будь-якого іншого продукту харчування або напою. 14. Застосування за п. 13, де молочний продукт вибирають з групи, яка складається з рідкого мо лока, сухого порошкового молока, цільного сухого молока, збираного сухого молока, збагаченого жирами сухого молока, порошкової сироватки, молока для немовлят, морозива, йогурту, сиру, ферментованих молочних продуктів. 15. Спосіб виробництва речовини для стимулювання росту біфідобактерій, який відрізняється тим, що лактозу або лактозовмісний матеріал обробляють штамом Bifidob acterium bifidum за п. 1 або за п. 2. 16. Спосіб за п. 15, де лактозовмісний матеріал вибирають з групи, що складається з комерційної лактози, незбираного молока, напівзбираного молока, збираного молока, сироватки і збагаченого жирами молока. 17. Спосіб за п. 16, де молоко отримують від корів, самиць буйвола, овець або кіз. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 15-17, де після видалення клітин Bifidobacterium b ifidum речовину сушать розпиленням з утворенням порошку. Даний винахід відноситься до нових штамів Bifidobacterium bifidum, які продукують фермент, який виявляє нову галактозидазну активність, за допомогою якої лактоза перетворюється в нову суміш галактоолігосахаридів. Галактоолігосахариди є вуглеводами, що не перетравлюються, стійкими до дії травних ферментів шлунковокишкового тракту ссавців, але які перетравлюються специфічними кишковими бактеріями. Винахід також відноситься до застосування біфідобактеріального штаму для продукування нової галактоолігосахаридної композиції, що виявляє здатність стимулювати зростання біфідобактерій в кишці. Винахід також відноситься до нової композиції галактоолігосахаридних продуктів. Кишкова флора людини включає в себе патогенні, сприятливі і корисні види мікробів. Переважання перших може привести до кишкових розладів, які можуть бути як гострими (наприклад, гастроентерит), так і хронічними (наприклад, запальне кишкове захворювання, синдром подразненої товстої кишки і деякі кишкові злоякісні пухлини). Дослідниками були зроблені спроби вплинути на баланс кишкової флори на користь корисних мікроорганізмів, таких як біфідобактерії, шляхом додання одного або більшої кількості таких мікробних штамів до відповідного харчового носія. Така жива мікробна харчова добавка відома як пробіотик. Однак важко гарантувати життєздатність живих бактерій в продуктах харчування і також після перетравлення. Альтернативним підходом до регулювання кишкової мікрофлори є використання пребіотика, який визначають як харчовий інгредієнт, що не перетравлюється, який благотворно впливає на хазяїна шляхом виборчої стимуляції зростання і/або активності однієї або обмеженого числа бактерій в товстій кишці, що приводить де поліпшення здоров'я хазяїна. Мікрофлора товстої кишки людини набувається при народженні. У вигодуваної груддю дитини переважають біфідобактерії, які легко конкурують з іншими видами. Такий факт пояснюється тим, що компоненти людського молока є стимуляторами. І навпаки, вигодувана молочною сумішшю дитина має більш складну флору, яка нагадує кишку дорослого в тому, що бактероїди, клостридії, біфідобактерії, молочнокислі бактерії, грампозитивні коки, коліформні бактерії і інші групи представлені в досить рівних частинах. Бі фідобактерії звичайно розглядають як захисні мікроорганізми від інфекцій товстої кишки, і ця відмінність, ймовірно, пояснює значно меншу наявність інфекцій у вигодуваних груддю дітей в порівнянні з дітьми, вигодуваними молочною сумішшю. Деякі компоненти кишкової флори залучені до етіології захворювання. Наприклад, мікобактерії, пов'язані з хворобою Крона, виразковий коліт може бути ініційований бактеріями, сприяючими відновленню сульфату, і бактерії можуть бути залучені до розвитку раку кишки. Очевидно, що підтримка вибіркового зростання природних благотворних кишкових бактерій шляхом прийому пребіотика надасть сприятливу дію. Внаслідок такої дії патогенна мікрофлора буде пригнічена. Однією групою сполук, які класифікують як пребіотики, є галактоолігосахариди, які являють собою галактозовмісні олігосахариди типу GIc a14[b GaI 1-6]n, де n=2-5, і які утворюються з лактозного сиропу за допомогою ферменту Ргалактозидази, що виявляє транс-галактозидазну активність [Crittenden, (1999) Probiotics: A Critical Review. Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, pp.141-156]. Зараз три продукти є комерційними препаратами, що мало відрізняються за складом. Перший з них, трансгалактозильовані олігосахариди (TOS), продукуються за допомогою b-галактозидази з Aspergillus oryzae [Tanaka et al., (1983) Bifidobacteria Microflora, 2, 17-24], і складається з три-, тетра-, пента- і гексагалактоолігосахаридів. Другий являє собою Олігомат 55, який отримують за допомогою ферменту р-галактозидази з A. oryzae і Streptococcus thermophilus [Ito et al. (1990), 5 83027 Microbiol Ecology in Health and Disease, 3, 285-292] і містить 36% три-, тетра-, пента- і гексагалактоолігосахаридів, 16% дисахаридів галактозилглюкози і галактозилгалактози, 38% моносахаридів і 10% лактози. І нарешті, препарат трансгалактозильованого дисахариду (TD) отримують за допомогою ферменту b-галактозидази з S. thermophilus [Ito et al. (1993), J. Nutritional Science and Vitaminology, 39, 279-288]. Відомо, що члени сімейства біфідобактерій продукують р-галактозидазні ферменти, які беруть участь в бактерійному метаболізмі лактози. У публікації Moller, P.L. et al. in Appl. & Environ. Microbiol., (2001), 62, (5), 2276-2283 описані виділення і характеристика трьох генів bгалактозидази з штаму Bifidobacterium bifidum. Патентна публікація США №2002/0086358 описує нову b-галактозидазу з Bifidobacterium bifidum, зокрема, зрізаний варіант ферменту, який виявляє високу транс-галактозилюючу активність. Хоча було встановлено, що інкубація з лактозою може мати місце в присутності 0,5-60% лактози, приведений як приклад максимальний вихід галактоолігосахариду, утвореного в реакціях трансгалактозилювання, становив 44% (мг утвореного олігосахариду на мг доданої лактози). Крім того, з визначення, даного в цій патентній публікації США, очевидно, що продукт складається, принаймні, з трьох пов'язаних молекул цукру. Дослідник Dumortier з співавторами в публікації Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123, описують утворення олігосахаридів реакцією транс-галактозилювання при гідролізі лактози за допомогою Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Проведений ними аналіз структури суміші утворених олігосахаридів показав, що зв'язками між молекулами були b-(1->3), b-(1->6) і b-(1->4)-Dгалактозильні зв'язки. Дослідник Dumortier передбачив, що сполуки, які продукуються за допомогою Bifidobacterium bifidum, беруть участь в процесі прилипання бактерій в товстій кишці. У цей час виявлені штами біфідобактерій, які не тільки виявляють здатність продукувати ферменти, що володіють галактозидазною активністю, за допомогою якої лактоза перетворюється в суміш галактоолігосахаридів, але також продукують суміш галактоолігосахаридів, яка містить аж до 35% дисахариду галабіози (Gal(al-6)-Gal). Останній, як відомо [дивись Paton, J.C. & Paton, A.W. (1989), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350], є антиадгезивним засобом, здатним запобігти адгезії токсинів, наприклад, шигатоксину, і патогенів, таких як Е.соlі, до стінки кишки. Згідно з винаходом, пропонується штам Bifidobacterium bifidum, здатний продукувати фермент з галактозидазною активністю, який перетворює лактозу в суміш галактоолігосахаридів, що містить, принаймні, один дисахарид, принаймні, один трисахарид, принаймні, один тетрасахарид і, принаймні, один пентасахарид. Переважно, суміш містить від 20 до 35% мас/об, дисахариду, від 20 до 35% мас/об, трисахариду, від 15 до 25% мас/об, тетрасахариду і від 10 до 20% пентасахариду. 6 Термін «ферментативна активність», що використовується в тексті відносно галактозидазної ферментативної активності згідно з даним винаходом, означає активність, що виявляється, принаймні, одним ферментом галактозидазою. В одному аспекті було виявлено, що суміш галактоолігосахаридів містить дисахарид GaI-GaI, трисахарид GaI-GaI-GIc, тетрасахарид GaI-GaIGaI-GIc і пентасахарид GaI-GaI-GaI-GaI-GIc, де GaI являє собою залишок галактози і GIc являє собою залишок глюкози. За допомогою аналізу шляхом метилування і ферментативного гідролізу суміші галактоолігосахаридів було виявлено, що суміш містить Gal (b16)-Gal(b1-6)-Gal (b1-4)-Glc тетрасахарид; Gal (b16)-Gal(b1-4)-Glc i Gal(b1-3)-Gal(b1-4)-Glc трисахариди; Gal(b1-3)-Glc, GaI(b1-3)-Gal, Gal(b1-6)-Gal і Gal(a1-6)-Gal дисахариди. Штам Bifidobacterium bifidum, здатний продукувати фермент з галактозидазною активністю, який перетворює лактозу в суміш галактоолігосахаридів, як визначено вище, був депонований під інвентарним номером NCIMB 41171 в Національній колекції промислових і морських бактерій, м.Абердин (Шотландія) 31 березня 2003. Такий штам Bifidobacterium bifidum або його біологічно функціональний еквівалент може бути використаний для продукування суміші галактоолігосахаридів, як визначено вище. Суміш галактоолігосахаридів може бути частиною продукту, що використовується для поліпшення стану кишки шляхом стимулювання зростання біфідобактерій в кишці, особливо вихідного штаму-продуценту. Такий продукт може бути вибраний з групи, що складається з молочних продуктів (наприклад, рідкого молока, сухо го порошкового молока, такого як незбиране сухе молоко, збиране сухе молоко, збагачене жирами сухе молоко, порошкова сироватка, молоко для немовлят, морозива, йогурту, сиру, сброджених молочних продуктів), напоїв, дитячого харчування, круп'яних продуктів, хліба, сухого печива, кондитерських виробів, тортів, харчови х добавок, добавок до раціону, кормів для тварин, кормів для домашньої птиці або будь-якого іншого продукту харчування або напою. Суміш олігосахаридів також може бути використана для отримання лікарських препаратів, спрямованих на запобігання адгезії патогенів або токсинів, що продукуються патогенами, до стінки кишки. Суміш може бути введена хворому після курсу терапії антибіотиками, який часто змінює або навіть руйнує нормальний стан кишкової флори, або після операції на кишці, для того, щоб "знову посіяти" або відновити в кишці нормальну флору, властиву здоровій кишці. Суміш галактоолігосахаридів може бути використана в комбінації з штамом Bifidobacterium bifidum, вказаним вище, або біологічно функціональним еквівалентом. Фраза "біологічно функціональний еквівалент" використовується для позначення штаму Bifidobacterium bifidum, який виявляє здатність продукувати фермент з галактозидазною активністю, який перетворює лактозу в суміш галактоолігосахаридів, як визначено вище. 7 83027 Згідно з іншим аспектом даного винаходу пропонується галактоолігосахаридна композиція для стимулювання зростання біфідобактерій, що містить як ефективні компоненти, принаймні, один дисахарид, принаймні, один трисахарид, принаймні, один тетрасахарид і, принаймні, один пентасахарид. Галактоолігосахаридна композиція переважно являє собою суміш галактоолігосахаридів, як описано в тексті вище. Переважно, галактоолігосахаридна композиція містить від 20 до 35% мас./об. дисахариду, від 20 до 35% мас/об, трисахариду(ів), від 15 до 25% мас/об. тетрасахариду і від 10 до 20% мас/об, пентасахариду. Згідно з іншим аспектом винаходу пропонується спосіб виробництва речовини, призначеної для стимулювання зростання біфідобактерій, який відрізняється тим, що лактозу або лактозовмісний матеріал обробляють штамом Bifidobacterium bifidum, як визначено вище. Придатний лактозовмісний матеріал може бути вибраний з комерційної лактози, незбираного молока, напівзбираного молока, збираного молока, сироватки і збагаченого жирами молока. Такі молочні продукти можуть бути отримані з молока корів, самиць буйвола, овець або кіз. Збагачене жирами молоко визначають як незбиране молоко, з якого зібрані вершки для видалення молочних жирів, які згодом замінюють шляхом додання рослинних жирів або масла. Використовуючи середовище для зростання, доповнене вуглеводними субстратами, відмінними від лактози, виявили, що Bifidobacterium bifidum, згідно з винаходом, може утилізувати мальтозу, рафінозу, ксилан і фруктозу. Культивування бактерій в середовищі, доповненому одним з вказаних вуглеводів, індукує експресію a-глюкозидази, a-галактозидази, ксилозидази і bфр уктофуранозидази, відповідно, і, таким чином, приводить до продукування aглюкоолігосахаридів, a-галактоолігосахаридів, ксилоолігосахаридів і фр уктоолігосахаридів, відповідно. У дослідженні, яке привело до даного винаходу, ізольовані кишкові бактерії були перевірені з метою виявлення бактерій, які здатні продукувати галактозидазу і, таким чином, мають високий потенціал для продукування галактоолігосахариду(ів). У результаті було виявлено, що деякі бактерії, які належать до роду біфідобактерій, зокрема Bifidobacterium bifidum, були здатні не тільки продукувати фермент з галактозидазною активністю, але також, що фермент міг перетворювати лактозу в галактоолігосахаридну суміш, що містить від 20 до 35% мас/об, дисахариду, від 20 до 35% мас/об, трисахариду, від 15 до 25% мас/об. тетрасахариду, від 10 до 20% мас/об, пентасахариду. Окремий примірник Bifidobacterium bifidum був депонований 31 березня 2003 в NCIMB, м.Абердин, під інвентарним номером 41171. Для культивування вказаних бактерій може бути використане будь-яке поживне джерело, за умови, що воно може засвоюватися бактеріями. 8 Відповідне культуральне середовище може бути приготоване, наприклад, з вуглеводами, такими як лактоза, сахароза або глюкоза; азотовмісними неорганічними або органічними поживними джерелами, такими як дріжджовий екстракт, триптон, м'ясний екстракт (Lab Lemco) і тому подібне; неорганічними поживними джерелами, такими як фосфати, калій і тому подібне. Для культивування рН поживного середовища повинен знаходитися в діапазоні від 6,0 до 8,0, переважно 7,0, і культивування здійснюють. в анаеробних умовах при температурі, що знаходиться в діапазоні від 35° до 40°C, переважно 37°С, протягом від 40 до 64 годин, переважно 50 годин. Штам може бути культивований будь-яким з відомих способів вирощування культур, таких як стаціонарна культура, анаеробна зважена культура або культура, вирощена при струшуванні. Бактерійні клітини збирають центрифугуванням або фільтрацією, і клітини можуть бути використані як такі як каталізатор реакції без подальшої обробки. Як альтернатива, клітини можуть бути використані в іммобілізованому стані за допомогою відповідної процедури іммобілізації. Бактерії Bifidobacterium bifidum згідно з винаходом можуть бути використані для перетворення лактози як такої або лактози, що міститься в молочному продукті, в нову галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом. Після перетворення бактерійні клітини можуть бути видалені центрифугуванням. Будь-який присутній моносахарид може бути видалений, наприклад, шляхом інкубації з дріжджами Saccharomyees cerevisiae. Згодом суміш може бути піддана центрифугуванню і мікрофільтрації. Отриманий розчин GOS потім може бути висушений розпиленням з утворенням порошку. Молоко, що містить галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом, приготовану даним способом, можуть вживати діти, дорослі або тварини. Як альтернатива, композиція може бути використана для отримання продуктів, таких як хліб, кондитерські вироби або тому подібне, де стійкість галактоолігосахаридів при кислих умовах і при високій температурі робить можливим використати їх без розкладання. Як альтернатива, порошок GOS може бути доданий до продуктів, перерахованих вище. Порошок GOS може бути введений хворим, страждаючим від таких кишкових розладів, як запальне кишкове захворювання і синдром подразненої кишки, в такому випадку хворий може вживати добову доз у від 2 до 20г, переважно від 5 до 10г, найбільш переважно 7г, у вигляді дво х окремих доз. Як альтернатива, галактоолігосахаридна композиція згідно з винаходом може бути змішана з культурою Bifidobacterium bifidum згідно з винаходом для отримання суміші з метою поліпшення стану кишечнику. І таку суміш класифікують як синбіотична, яку визначають як "суміш пробіотика і пребіотика, яка благотворно діє на хазяїна за рахунок поліпшеної життєздатності і: введення живої мікробної харчової добавки в шлунково-кишковий тракт» [дивись Gibson and Roberfroid, 1995, Dietary 9 83027 modulation of the human microbiota: introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition 125, 14011412]. Така комбінація підвищує життєздатність пробіотика в несприятливому середовищі товстої кишки завдяки наданню доступного селективного субстрату. Бактерійний пробіотик може бути мікроінкапсульованим в галактоолігосахаридному пребіотику у вигляді, наприклад, порошку, який потім можна додавати до молочних продуктів, таких як йогурт, або використовувати як харчову добавку. Перевага вживання молока або інших продуктів, що містять галактоолігосахаридну композицію згідно з винаходом, полягає в тому, що воно стимулює підвищення рівнів сприятливих біфідобактерій в кишці, при збіднінні інших менш бажаних бактерій, присутніх в кишковій мікрофлорі, таких як клостридії. Таким чином, відбувається зменшення деяких природних бактерій, які можуть надавати шкідливий вплив на стан здоров'я індивідууму. Цей ефект повинен привести до скорочення інфекцій шлунково-кишкового тракту. Галактоолігосахаридна композиція допомагає запобігти або лікувати коліт, зменшує випадки діареї і знижує ризик хронічних кишкових захворювань, таких як виразковий коліт і рак. Вона також може допомогти в послабленні симптомів синдрому подразненої товстої кишки. Вага сільськогосподарських тварин, що утримуються на кормі з доданою галактоолігосахаридною композицією згідно з винаходом у вигляді, наприклад, порошку, може поліпшуватися завдяки харчуванню. Даний винахід буде описаний далі за допомогою посилання на приклади. Приклад 1 1л середовища (рН 7,0), що містить 10,0г/л триптону, 5,0г/л Lab-LEMCO (м'ясний екстракт), 5,0г/л дріжджового екстракту, 3,0г/л K 2HPO4, 0,05г/л цистеїну·НСІ, 10г/л лактози і 1 мл/л твін 80, стерилізували при 12 ГС протягом 15хв. Після стерилізації середовище засівали 1,0% (об./об.) свіжою культурою Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 і інкубували при анаеробних умовах при 37°C протягом 50год. Бактерійні клітини збирали центрифугуванням (30000g протягом 20хв.). Після промивання двічі фосфатним буфером (0,02M, рН 7,0) клітини були готові до використання в реакціях синтезу олігосахаридів. Бактерійні клітини (40 одиниць ргалактозидазної активності) знову суспендували в 100 мл фосфатного буферу (0,02M, рН 7,0), що містить 50г лактози. Реакцію проводили при 40°C, і після 7год. суміш складалася з 35% (мас/об.) продуктів гідролізу (глюкоза, галактоза), 37% (мас/об.) лактози і 18% (мас/об.) галактоолігосахаридів із мірою полімеризації між 2 і 5. Після видалення бактерійних клітин центрифугуванням (3000g протягом 20хв.) моносахариди (глюкоза і галактоза) видаляли за допомогою інкубації з дріжджами Saccharomyces cerevisiae. Згодом дріжджі видаляли центрифугуванням (10000 g протягом 10хв.), і потім суміш фільтрували через мікрофільтр ОД мкм, щоб забезпечити мікробіологічні показники продукту. Розчин цукру потім сушили розпиленням для отримання порошку. Продукти кількісно аналі 10 зували за допомогою високоефективної рідинної хроматографії, використовуючи систему MerckHitachi LaChrom (Merck, Poole, Dorset, UK), забезпечену колонкою APEX Carbohydrate (Jones Chromatography, Mid Glamorgan, UK) і детектор Merck-Hitachi LaChrom Rl. Як елюент використовували 70% (об./об.) ацетонітрил при 25°C і швидкості потоку 0,8мл/хв. Галактоолігосахаридна суміш складалася з 25% GaI-GaI, 35% GaI-GaI-GIc, 24% GaI-GaI-GaIGIc і 16% GaI-GaI-GaI-GaI-GIc. Приклад 2 Клітини Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 отримували способом прикладу 1 і додавали до 500мл збираного молока в перемішуваному резервуарі, додавали (300 одиниць b-галактозидазної активності). Перетворення лактози відбувалося при 40°C. Після 8год. концентрація галактоолігосахаридів становила 22% (мас/об.), і суміш містила 28% GaI-GaI, 32% GaI-GaI-GIc, 21% GaI-GaIGaI-GIc і 19% GaI-GaI-GaI-GaI-GIc. Приклад 3 In vitro модель кишки Умови, що мають місце в товстій кишці, відтворювали в тристадійному безперервному ферментері [Macfarlane et al., 1998, Microbiol Ecology, 35, 180-187], в який вносили 10% (мас/об.) фекального гомогенату від здорових добровольців в середовищі для зростання без GOS суміші і з 1% (мас/об.) GOS суміші, приготованої способом прикладу 1 (таблиця 2). Модель складалася з трьох посудин, V1, V2 і V3, з відповідними робочими об'ємами 270, 300 і 300мл. Температуру встановлювали на 37°C і її разом з рН контролювали автоматично. рН культур в трьох посудинах підтримували при 5,5, 6,2 і 6,8, відповідно. Кожний ферментер перемішували за допомогою магніту, і в ньому підтримували анаеробні умови шляхом безперервного барботування суміші N2, вільного від O2 (15мл/хв.). Середовище для зростання містило наступні інгредієнти: крохмаль 8г/л, муцин 4г/л, казеїн 3г/л, лептонну воду 5г/л, триптонну воду 5г/л, жовч №3 0,4г/л, дріжджі 4,5г/л, FeSO4 0,005г/л, NaCl 4,5г/л, KCl 4,5г/л, KH2PO4 0,5г/л, MgSO 4·7H2O 1,25г/л, СаСl2·6Н2О 0,15г/л, NaHCO3 1,5г/л, твін 80 1мл, гемін 0,05г/л, цистеїн·НСl 0,8г/л. Середовище подавали до V1 за допомогою перистальтичного насоса, і V1 послідовно забезпечував V2 і V3 через серію трубок. Система працювала при часі втримання приблизно 36 годин. Модель кишки залишали на ніч, щоб врівноважити систему до того, як підключали насос для подачі середовища, і він працював протягом, принаймні, 10 днів до того, як була введене середовище, що містить тестований субстрат, і систему залишали протягом ще 10 днів. Зразки відбирали на початку і в кінці кожного циклу. Об'єм видаленого зразка становив 5мл, і цю кількість використовували для встановлення кількості групи бактерій. Гібридизація in situ із застосуванням флуоресцентно мічених зондів (FISH) Відмінності між бактерійними популяціями оцінювали за допомогою використання методу FISH з олігонуклеотидними зондами, сконструйованими для націлення на діа 11 83027 гностичні області 163 рРНК. Дані олігонуклеотиди були комерційно синтезованими і міченими флуоресцентним барвником Су3 (наданим Eurogentec UK Ltd). Використані молекулярні зонди представлені в таблиці 1. Для загального бактерійного рахунку використали барвник нуклеїнових кислот 4,6діаміно-2-феніліндол (DAPI). Зразки, взяті з ферментаційних посудин, розбавляли в 4% (мас/об.) параформальдегіді і фіксували протягом ночі при 4°C. Потім клітини центрифугували при 1500 х g протягом 5 хвилин, промивали двічі забуференим фосфа том фізіологічним розчином (PBS; 0,1M, рН 7,0), знову суспендували в суміші PBS/99% етанол (1:1 мас/об.) і зберігали при -20°C протягом, при Результати 12 наймні, 1 години. Потім суспензію клітин додавали до гібридизованої суміші і гібридизували при відповідній для кожного зонда температурі протягом ночі. Гібридизовану суміш піддавали вакуумфільтрації, використовуючи мембранний фільтр Isopore 0,2мкм [Millipore Corporation, Herts, UK]. Фільтр відставляли, вміщували на предметне скло з SlowFade [Molecular Probes, Eugan, OR, USA] і перевіряли за допомогою флуоресцентного мікроскопа [Nicon Eclipse, E400]. Клітини, забарвлені за допомогою DAPI, перевіряли в УФ-світлі, і гібридизовані клітини оцінювали, використовуючи фільтр DM510. Для кожного предметного скла було оцінено, принаймні, 15 різних полів зору. 13 83027 Висновок З таблиці 3 видно, що GOS суміш, приготована згідно з даним винаходом, виявляла кращі пребіотичні властивості (тобто, спостерігали більш значне збільшення біфідобактерій, а також зменшення бактероїдів, ніж спостерігали для комерційного еквівалента GOS (дивись таблицю 2). Пребіотичний ефект був більш вираженим в посудині 1 (V1) і 2 (V2), що пояснюється тим фактом, що GOS суміш згідно з даним винаходом складається з низькомолекулярних олігосахаридів. Приклад 4 Метод метилування Синтетичні галактоолігосахаридні продукти, отримані за способом прикладу 1, очищали гельфільтрацією на колонці Biogel P2 (Pharmacia), проводячи елюювання водою з швидкістю 3мл хв.-1. Положення зв'язків для відповідних галактоолігосахаридних препаратів визначали методом метилування. Ліофілізовані зразки (5-6мг) диспергували в сухому диметилсульфоксиді (DMSO) при 20°C протягом 16год. після продування аргоном. Зразки метилували за допомогою послідовного додання порошків гідроокису натрію (0,5г) і йодометану (4мл) [Ciucanu and Kerek, 1984; MacCormick et al., 1993]. Після елюції-екстракції на С18-зв'язаному картриджі [Sep-Pak, Waters, Watford, UK], метиловані вуглеводи сушили, екстрагували сумішшю СНСl3/СН3ОН (1:1, об./об.) і упарювали досуха. Зразки гідролізували за допомогою трифтороцтової кислоти [Blakeney et al., 1983] і перетворювали в частково метиловані алдитолацетати (PMAAs) шляхом відновлення за допомогою NaBD4 і ацетилування оцтовим ангідридом і N-метилімідазолом [Albercheim et al., 1967]. PMAAs аналізували за допомогою ГХ на колонці з поперечно-зв'язаним носієм 50% ціанопропілметил-50% фенілметилполісилоксаном [Thames Chromatography, Maidenhead, UK], використовуючи полум'яно-іонізаційний детектор і температурну програму: 55°С (2хв.), +45°C хв.-1 (1,9 хв.), 1400C (2 хв.), +2°C хв.- 1 (35хв.), 210°C (4.0хв.). PMAAs ідентифікували шляхом вимірювання їх часу втримання відносно міо-інозитолгексаацетату і порівняння відносного часу втримання з часом втримання зовнішніх стандартів. Суміш стандартів для кожного цукру го тували шля хом цільового метилування метилглікозидів [Doares et аі, 1991]. Площі піків були представлені як відносні молярні кількості, використовуючи фактори ефективності відповідей вуглеводнів [Sweet et al., 1975]. Ідентичності PMAAs були підтверджені їх електронно-іонізаційними мас-спектрами [Carpita and Shia, 1989]. Аналіз ГХ-МС виконували на ідентичному ГХ в серії з мас-спектрометром Fisons Analytical Trio IS, використовуючи температуру джерела 200°C і потенціал іонізації 70еВ. Для того, щоб визначити аномерну конфігурацію продукту синтезу, олігосахариди обробляли aгалактозидазою і b-галактозидазою (Melibiase; Sigma) при оптимальних умовах протягом 30хв. Продукти реакції аналізували за допомогою ВЕРХ. 14 Результати Виходячи з описаного вище аналізу, була встановлена структура олігосахаридів, яка була для тетрасахаридної фракції GaI(b1-6)-Gal(b1-6)Gal(b1-4)-GIc, трисахаридної фракції Gal(b1-6)Gal(b1-4)-Glc; GaI(b1-3)-Gal(b1-4)-Glc і дисахаридної фракції Gal(b1-4)-Glc (субстрат лактоза); GaI(b1-3)-Glc; Gal(b1-3)-GaI; Gal(b1-6)-Gal; Gal(a16)-Gal (галабіоза). Gal: галактоза, GIc: глюкоза Посилання: 1. Albersheim P.D., D.J. Nevins, P.D. English and A. Karr. 1967. A method for the analysis of sugars on plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography. Carbohydr Res 5: 340-345. 2. Blakeney A.B., P.J. Harris, R.J. Henry and B.A. Stone. 1983. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr Res 113: 291-299. 3. Carpita N.C. and E.M. Shia. 1989. Linkage structure of carbohydrates by gas chromatographymass spectroscopy (GC-MS) for partially methylated alditol acetates, p.157-216. In CJ. Biermann and G.D. McGinnis (ed.), Analysis of carbohydrates by gasliquid chromatography and mass spectroscopy. CRC Press Boca Raton, FIa. 4. Ciucanu L. and F. Kerek. 1984. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res 131: 209-217. 5. Doares S.H., P. Albersheim and A.G. Darvill. 1991. An improved method for the preparation of standards for the glycosyl-linkage analysis of complex carbohydrates. Carbohydr Res 210: 311-317. 6. MacCormick C.A., J.E. Harris, A. P. Cunning and V.J. Morris. 1993. Characterization of a variant of polysaccharide acetan produced by a mutan of Acetobacter xylinumstrainCR 1/4. J Appl Bacteriol 74: 196-199. 7. Sweet D.P., R. Shapiro and P. Albersheim. 1975. Quantitative analysis by various GLC responsefactor theories for partially methylated and partially ethylated alditol acetates. Carbohydr Res 40: 217225. Приклад 5 Матеріали і методи Клітинна лінія НТ29 була отримана з Європейської колекції культур клітин для прикладної мікробіології і дослідження. Лінії клітин культивували при 37°C в зволоженій 5% CO2 в стандартному середовищі, що включає в себе модифіковане по Дульбекко середовище Ігла (D MEM) з високим вмістом глюкози, доповнене 5% (об./об.) телячою фетальною сироваткою (FBS), 100мМ пеніциліном, 0,1M стрептоміцином, неістотними амінокислотами (NEAAx100) і 200мМ a-глутаміном. Клітини забезпечували харчуванням шляхом зміни середовища кожні 48 годин і пасирували доти, поки клітини не досягали конфлюентного стану. Аналіз чутливості до олігосахаридів Сироваткове стандартне середовище (1% об./об.), доповнене різними концентраціями олігосахаридів (0,01, 0,1, 1, 10, 100мМ), використовували для аналізу чутливості до олігосахаридів по методу Olano-Martin et al., 2003. Клітини «піджив 15 83027 лювали» експериментальним середовищем (що містить цікавлячий олігосахарид) щодня, і вимірювання прилипаючих клітин здійснювали шляхом видалення експериментальних середовищ і промивання клітин фізіологічним розчином без Ca++, забуференим фосфатом (рН 7, 9,6гл-1). Потім прилиплі клітини трипсинізували і нейтралізували рівним об'ємом сироваткового стандартного середовища. Клітинну суспензію розбавляли в Isoton II, і клітини підраховували на лічильнику Coulter Counter. Міру виживання клітин, виражену в процентах, розраховували таким чином (Фіг.1) % виживання = (середнє поглинання оброблених клітин/середнє поглинання контролю) х 100 Аналіз адгезії НТ29 клітини вирощували в 12-ямкових планшетах для культури тканини до стану >90% конфлюентності за допомогою стандартного середовища. Для останнього до виконання аналізу живлення клітин використовували середовище без антибіотика. Патогени вирощували в анаеробних умовах в культуральному середовищі без антибіотика протягом, принаймні, трьох пересівань. У день аналізу свіже заздалегідь відновлене середовище для культури тканини засівали 10% патогенною культурою, вирощеною протягом ночі, і інкубували протягом 4год. до аналізу. Основний розчин випробуваних олігосахаридів готували при концентрації 5M в забуференому фосфа том фізіологічному розчині і піддавали стерилізації фільтруванням. Розбавлення 1/1000 патогенної культури, інкубованої протягом 4год., здійснювали в PBS, і число клітин оцінювали шляхом підрахунку планшетів. Середовище видаляли з планшетів для культури тканини, і клітини промивали один раз в PBS (1мл). Для кожного досліджуваного олігосахариду 0,5мл розчину олігосахариду (5M) додавали до трьох ямок. Забуферений фосфатом фізіологічний розчин (PBS) без якого-небудь олігосахариду включали як контроль. Суспензію культури 0,5мл додавали до всієї ямки, планшет струшували і інкубували в аеробних умовах при 37°C протягом 2год. Культуру видаляли, і всі ямки промивали три рази в стерильному PBS (1мл на ямку). Після кінцевого промивання PBS видаляли, і 70мкл розчину трипсин/EDTA додавали до кожної ямки, перемішували і залишали протягом 5 хвилин при 37°С. На ямку додавали 1мл PBS і піпеткою перемішували для того, щоб пересвідчитися, що всі клітини видалені з дна ямки і злиплі грудки розбиті. Клітинну суспензію в кількості 1мл за допомогою піпетки вміщували в універсальний бутель MRD (Maximum Recovery Diluent) і далі розводили як призначено . Розведені суспензії вміщували на агарові пластини для рахунку (PCA) і інкубували при 37°С протягом 24год. Після інкубації колонії підраховували і інгібування адгезії розраховували як відношення бактерій (КУО мл-1), присутніх в зразку, до контролю (PBS) (Фіг.2). Висновок 16 Результати, представлені на Фіг.2, вказують на значне інгібування адгезії E.соlі EPEC і S. typhimurium в присутності фракції дисахаридів, причому вказане інгібування також властиве суміші GOS. Менший анти-адгезивний ефект спостерігається в присутності фракції більш високої, ніж трисахарид (>три) в суміші, проти S.typhimurium. Аналіз чутливості до олігосахаридів здійснювали для того, щоб пересвідчитися в тому, що олігосахаридна суміш не є токсичною по відношенню до клітин НТ29 (Фіг.1). Посилання: Olano-Martin E., Williams M.R., Gibson G.R., Rastall R.A. 2003 Pectins and pecticoligosaccharides inhibit Eschenchia coli 0157: H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29. FEMS Microbiol Letters 218 (1): 101105. Фіг.1. Виживаність клітин, на які впливали доданням різних концентрацій олігосахаридів (0,01100мМ), після 24 і 48год. інкубації. Фіг.2. Вплив суміші олігосахаридів (всіх) і різних фракцій суміші на адгезію E.coli EPEC, E.coli VTEC і Salmonella typhimurium до клітин НТ29. Приклад 6 Продукт GOS, що використовується в даному експерименті, був зроблений, як описано раніше (приклад 1), і інулін був отриманий від Orafiti (Belgium). Сорок невихолощених поросят, відлучених від матки, придбавали від JSR Genetics Ltd, Southburn, Driffield, Yorkshire. Y025 9ED. Після прибуття в Редінгський університет поросят вміщували в чотири групи по десять поросят протягом періоду сім днів, щоб дати поросятам час заспокоїтися після транспортування і звикнути до секції і харчування. Середня вага поросят при доставці була 14,70кг. Після семиденного періоду звикання поросят переміщували в індивідуальні невеликі загороди, в одній і тій же секції. Середня вага поросят при утриманні в індивідуальній загороді була 17,46кг. Поросят ідентифікували за допомогою унікального татуювання на вуха х, їх також індивідуально нумерували, використовуючи водостійкий маркер. Кожну індивідуальну загороду нумерували таким же ідентифікаційним номером, який використали, щоб позначити кожне поросятко. Десяти поросятам встановлювали одну з чотирьох дієт, контрольну дієту (NEG), дієту з доданням до контрольної дієти 1,6% (мас/мас.) GOS, отриманих способом прикладу 1, дієту з доданням до контрольної дієти 4% (мас/мас.) GOS або дієту з доданням до контрольної дієти 1,6% (мас/мас.) інуліну. Поросятам підстилали тирсу протягом всього дослідження, крім того, забезпечували соломою для поліпшення навколишнього оточення, а також були іграшки, щоб сприяти ослабленню апатії. Протягом всього дослідження поросята отримували гранули Deltawean 15 NGP (ABN, ABN House, PO Box 250, Oundle Rd, Woodston, Peterborough. PE 9QF), повнораціонний комбікорм, яким годували ad-libitum для зростання поросят. 17 83027 Їжа поросят також містила дозволені антиоксиданти, бутильований гідроксіанізол (BHA), бутильований гідрокситолуол (BHT) і етоксихін. Поросят розміщували довільно для обробки, хоча двох або трьох поросят, що піддаються однаковій харчовій обробці, індивідуально вміщували на один і той же майданчик групової загороди. Поросят груп ували таким шляхом, щоб уникнути змішування обробок, на випадок, якщо вони вибігали з індивідуальної загороди, тобто могли їсти тільки їжу, призначену для відповідної харчової обробки такого окремого поросятка. Індивідуально вміщених поросят, в групах з двох або трьох, при однаковій обробці, розміщували довільно по всьому відсіку. 18 Фекальні зразки збирали від кожного поросятка на початку дієти і після чотирьох тижнів утримання на випробуваній дієті, і фекальні мікробні популяції визначали методом FISH (таблиця 4), як описано раніше (приклад 3). У кінці експерименту поросят забивали для отримання зразків вмісту проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки. Величини рН (таблиця 5), коротколанцюжкові жирні кислоти (SCFA) (таблиця 6) і мікробні популяції (таблиця 7) визначали у вмісті проксимальних і дистальних сегментів товстої кишки. Дані представлені як середні значення ± стандартне відхилення (SD). Відмінності аналізували за допомогою t-критерію Стьюдента. Відмінності вважали значними при Р