Застосування спінозинів для стимулювання або прискорення загоювання ран

1. Застосування спінозину або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі для виготовлення лікарського засобу для стимулювання або прискорення загоювання ран у ссавця. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що згаданим спінозином є спінозад або його фізіологічно прийнятна похідна чи сіль. C2 2 (13) 1 3 клад, реепітелізація шкірних ран розпочинається у межах годин (Сінгер (Singer) та Кларк (Clark), New Eng. J. Med., 341(10):738-746 (1999)). Процес загоювання ран ініціюється мієлінізованими аферентними чутливими нервами, які, у свою чергу, опосередковують нейрогенне запалення, імунологічні реакції (Еглезос (Eglezos) та інші, Adv. Ехр. Вiol. Med., 273:499-503 (1989); Immunol. Cell Biol., 69:285-294 (1991)) і судинний тонус (Халіл (Khalil) та Хелм (Helme), Brain Res., 500:256-262 (1989); Brain Res., 527:292-298 (1990)), усі з яких є суттєвими складовими загоювання. Після ініціювання загоювання чутливими нервами, процес загоювання регулюється факторами росту і цитокінами, які впливають на міграцію клітин, проліферацію і продукування білків. На стадії гемостазу, білки, наприклад, фібрин і фібронектин, взаємодіють із згортанням крові, а цитокіни і фактори росту активуються. Після пошкодження розпочинається запалення. Запальні реакції відбуваються трьома різними фазами, кожна з яких явно опосередковується різними механізмами: (1) гостра тимчасова фаза, яка характеризується місцевим розширенням кровоносних судин і підвищеною проникністю капілярів; (2) уповільнена підгостра фаза, найсуттєвішою характерною особливістю якої є інфільтрація лейкоцитів і фагоцитів; і (3) хронічна проліферативна фаза, під час якої відбувається дегенерація тканин і фіброз. До запального процесу залучається багато різних механізмів. Здатність до запальної реакції є суттєвим фактором виживаності перед лицем патогенних мікроорганізмів навколишнього середовища і пошкодження, хоча у деяких ситуаціях і при деяких захворюваннях запальна реакція може бути надмірною і утримуватись без жодної явної корисної причини. Під час запалення рана інфільтрується нейтрофілами (поліморфонуклеарними лейкоцитами), моноцитами і макрофагами. Ці фагоцити вивільнюють фактори росту для проліферативної фази, ферментативні медіатори (протеази), які розкладають білки і фагоцитують бактерії, мертві клітини та клітини, що гинуть, тим самим видаляючи чужорідні тіла з рани. На наступній фазі розпочинається проліферація. Відбувається відкладення колагену з утворенням рубцевої тканини. Фібробласти продукують протеоглікани, які зв'язують між собою колагенові волокна. З часом, колаген розкладається протеазами і реконструюється у міцнішу рубцеву структуру. Спінозини (відомі також, як фактори А83453) є пестицидами, що застосовуються у сільському господарстві, для обробки худоби і домашніх тварин, які продемонстрували активність проти 1) комах ряду Lepidoptera, 2) членів ряду Homoptera, 3) членів ряду комах Diptera, 4) членів ряду Coleoptera і 5) членів ряду Anoplura. До лікарських форм, придатних для застосування у сільському господарстві, для введення худобі і домашнім тваринам, належать різні суспензії, розчини, таблетки, капсули, рідини і протруйники. Спінозад (продукт, до складу якого входять, головним чином, спінозин А (85%) та спінозин D (15%)) зараз є схваленим у Австралії та Новій Зе 88295 4 ландії для боротьби з вошами у овець, а також для лікування і запобігання відкладання падальною мухою яєць під шкіру овець. У Бразилії спінозад є схваленим для місцевого застосування і боротьби з певними кліщами, блохами і вошами та як антисептик і репелент, що сприяє рубцюванню, для лікування міазів, що викликаються личинками падальної мухи, і шкірних ран у великої рогатої худоби, овець, кіз, коней, свиней, птахів і собак. Відомою є придатність спінозинів для боротьби з педикульозом у людини (патент США № 6,063,771 і ЕР 1 252 820). У згаданих патентах наведено також опис лікарських форм, придатних для лікування педикульозу у людей. Незважаючи на те, що відомо відносно ектопаразитоцидної активності спінозинів і існування комерційних схвалень, зараз було відкрито, що спінозин або його фізіологічно прийнятна похідна чи сіль мають ранозагоювальну активність, незалежно від лікарської форми, що містить антисептичний/ дезінфекційний засіб. Суть винаходу Цей винахід має відношення до способів лікування ран у людей для стимулювання або прискорення загоювання ран, у тому числі ран, що погано загоюються або хронічних ран, шкірних захворювань і алергічних захворювань, зокрема, розладів, пов'язаних зі шкірою та станів або симптомів, пов'язаних із цим, шляхом введення спінозину або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі, людині, яка цього потребує. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, ці способи практично здійснюють шляхом введення спінозаду або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі. Докладний опис винаходу Цей винахід пропонує способи стимулювання або прискорення загоювання ран у людей, що включає введення спінозину або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі людині, яка цього потребує. За іншим аспектом, цей винахід пропонує застосування спінозину або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі, лікарської форми, що містить спінозин або його фізіологічно прийнятну похідну чи сіль, для виготовлення лікарського засобу для стимулювання або прискорення загоювання ран у людини. Спінозини являють собою продукти ферментації, які одержують природним шляхом. Це макролідні антибіотики, які продукуються шляхом культивування Saccharopolyspora spinosa. Під час ферментації продукується декілька факторів, у тому числі спінозин А і спінозин D (які називають також А83543А і A83543D). Спінозин А і спінозин D є двома спінозинами, які демонструють найбільшу активність як інсектициди. Сільськогосподарський продукт, що містить, головним чином, ці два спінозини (приблизно 85% А і 15% D), є комерційно доступним від фірми Dow AgroSciences під назвою спінозад. Ектопаразитарний продукт, що містить спінозад, є комерційно доступним від фірми Eli Lilly and Company. Назва "спінозад" походить від скорочення спінозинів "А" і "D". Кожний спінозин має 12-членне макроциклічне ядро, що становить частину тетрациклічної структури, до якої приєднуються два різні цукри, аміно 5 цукор форозамін і нейтральний цукор 2N,3N,4Nтри-O-метилрамноза. Ця унікальна структура відокремлює спінозини від інших макроциклічних сполук. Спінозин А (А83543А) був першим спінозином, який виділили та ідентифікували з ферментаційного живильного середовища Saccharopolyspora spinosa. Подальшим дослідженням згаданого ферментаційного живильного середовища було виявлено, що батьківський штам S. spinosa продукує ряд спінозинів, які були позначені літерами від А до J (A83543A до J). Порівняно зі спінозином А, спінозини B-J характеризуються різницями характеру заміщення на аміногрупі форозаміну, на вибраних ділянках тетрациклічної структури та на 2N,3N,4N-три-O-метилрамнозi. Штами S. spinosa, що застосовуються на сучасному етапі, продукують суміш спінозинів, головними складовими серед яких є спінозин А (~85%) та спінозин D (-15%). Додаткові спінозини, помічені літерами від К до W, були ідентифіковані з мутантних штамів S. spinosa. Термін "спінозин або його фізіологічно прийнятна похідна чи сіль", що застосовується у цьому описі, означає окремий спінозиновий фактор (А, В, С, D, Е, F, G, Н, J, К, L, М, N, О, Р, Q, R, S, Т, R, U, W або Y), N-диметиловану похідну окремого спінозинового фактора, їх комбінацію або фізіологічно прийнятну сіль. Для зручності, термін "спінозин" буде також застосовуватись у цьому описі для означення окремого спінозину, його фізіологічно прийнятної похідної чи солі або їх комбінації. Найбільш прийнятним для загоювання ран у людей є спінозад або його фізіологічно прийнятна похідна чи сіль. У ЕР 375 316 наведено опис спінозинів А-Н і J (які були названі факторами А83543А, В, С, D, Е, F, G, Η і J) та їх солей. Міндерс (Mynderse) та іншими було наведено опис спінозинів L-N (які вони назвали факторами A83543L, Μ і N), їхніх Nдиметилованих похідних та їхніх солей у патенті США № 5,202,242; Тернером (Turner) та іншими було наведено опис спінозинів Q-T (які вони назвали факторами A83543Q, R, S і Т), їхніх Nдиметилованих похідних та їхніх солей у патенті США № 5,591,606 і патенті США № 5,631,155. Ці патенти включено до цього опису шляхом посилання. Спінозини К, О, Р, U, V, W та Υ описують, наприклад, Карл В. ДеАміціс (Carl V. DeAmicis), Джеймс Ε. Дріппс (James Ε. Dripps), Кріс Дж. Хаттон (Chris J. Hatton) і Лаура І. Kapp (Laura I. Karr) у American Chemical Society's Symposium Series: Phytochemicals for Pest Control, розділ 11, "Physical and Biological Properties of Spinosyns: Novel Macrolide Pest-Control Agents from Fermentation", стор. 146-154 (1997). У патенті США № 6,001,981 описані різні синтетичні похідні спінозинів; у патенті США № 6,455,504 описані різні аналоги спінозинів. Обидва згадані патенти включені до цього опису шляхом посилання. У цих посиланнях наведені подробиці щодо ферментації та виділення спінозинів і методики одержання синтетичних похідних. У кожній заявці на патент США і патент ЕР описують лікарські форми різних типів, паразитоцидну активність і варіанти введення тваринам і застосування у сільському господарстві спінозинів 88295 6 та їхніх фізіологічно прийнятних похідних або солей. У патентах США № 6,063,771 та № 6,342,482 та у ЕР 1 252 820 описані лікарські форми та застосування спінозинів або їхньої фізіологічно прийнятної похідної чи солі для боротьби з вошами у людей та способи одержання цих лікарських форм. Як вказувалось вище, лікарські форми спінозаду є комерційно доступними від фірми Dow AgroSciences, 9330 Zionsville Road, Indianapolis, штат Індіана, 46268-1054, США та фірми Elanco Animal Health, підрозділу фірми Eli Lilly and Company, P.O. Box 708, 2001 W. Main Street, Greenfield, штат Індіана, 46140, США. На додаток до цього, S.spinosa та мутантні штами були депоновані у колекції Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) National Center for Agricultural Utilization Research, ARS, USDA, 1815 North University Street, Peoria, штат Іллінойс, 61604, (NRRL 18395, 18537, 18538, 18539, 18719, 18720, 18743, 18823 та 30141 (патент США № 6,455,504)). Спінозини можуть вступати у реакцію з утворенням солей. Фізіологічно прийнятні солі також є придатними для способів за цим винаходом. Згадані солі одержують за стандартними методиками одержання солей. Наприклад, спінозин А може нейтралізуватись за допомогою відповідної кислоти з утворенням солі, яку одержують доданням кислоти. Особливо придатними є солі спінозинів, які одержують доданням кислоти. Репрезентативними солями, які одержують доданням кислоти, є солі, одержані шляхом реакції з органічною або неорганічною кислотою, наприклад, сірчаною, хлористоводневою, фосфорною, оцтовою, бурштиновою, лимонною, молочною, малеїновою, фумаровою, холевою, памовою, слизовою, глутаміновою, камфорною, глутаровою, гліколевою, фталевою, винною, мурашиною, лауриновою, стеариновою, саліциловою, метансульфоновою, бензолсульфоновою, сорбіновою, пікриновою, бензойною, коричною і т.п. кислотами. Усі співвідношення, відсотки та частини, які обговорюються у цьому описі, є "масовими", якщо не вказується інше. "Рана" означає пошкодження людини, у разі якого тканина розрізається, розривається, ламається, обпікається або травмується іншим чином, чи наслідки розладу або захворювання, яке спричинює таке пошкодження. "Загоювання", яке пропонується цим винаходом, являє собою стимулювання або прискорення у часі з моменту виникнення рани (вводиться спінозин) до закриття рани (повне стягування рани). Термін "тканина" означає масу клітин у людському тілі, які згруповуються для здійснення специфічної функції. Тканини включають (але без обмеження) кістку, шкіру, сполучну тканину, нервові тканини, наприклад, спинний мозок. Терміни "лікувати", "лікування" і "терапія", що застосовуються у цьому описі, означають лікування. До числа тих, що потребують лікування, належать люди, які мають рану, розлад або захворювання. 7 Введення "у комбінації з" одним або декількома додатковими терапевтичними засобами включає одночасне (супутнє) і послідовне введення людям у будь-якому порядку. "Терапевтично ефективною кількістю" є мінімальна кількість активного агенту (наприклад, спінозину, а відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, спінозаду), яка є необхідною для забезпечення терапевтичного корисного впливу на людину. Наприклад, "терапевтично ефективною кількістю" для людини, що страждає на рану, є така кількість, яка індукує, стимулює, пришвидшує або іншим чином спричинює поліпшення патологічних симптомів, прогресування загоювання, пов'язаних із цим фізіологічним станом, або зменшує несприйнятливість до загоювання. Термін "носії", який застосовують у цьому описі, означає фармацевтично прийнятні носії, наповнювачі або стабілізатори, які є нетоксичними для людини, що зазнає їхнього впливу у застосованих дозах та концентраціях. Часто фізіологічно прийнятним носієм є водний pH забуферений розчин. Прикладами фізіологічно прийнятних носіїв є буфери, наприклад, фосфат, цитрат та інші органічні кислоти; антиоксиданти, у тому числі аскорбінова кислота; гідрофільні полімери, наприклад, полівінілпіролідон; амінокислоти, наприклад, гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди та інші вуглеводи, у тому числі глюкоза, маноза або декстрини; хелатоутворювачі, наприклад, етилендіамінтетраоцтова кислота; спирти з цукру, наприклад, маніт або сорбіт; солетворні протиіони, наприклад, натрій; та/або неіонні поверхнево-активні речовини, наприклад, складні ефіри жирної кислоти поліоксетиленсорбітану (TWEEN®), поліетиленгліколь (PEG) та блокспівполімери поліоксіетилену/поліоксипропілену (PLURONIC®). Спінозини за цим винаходом і, найконкретніше, спінозад, стимулюють нейрогенну активацію загоювання і подальшу запальну активність, залучену до росту і проліферації клітин. Відповідним чином, композиції за цим винаходом можуть застосовуватись для стимулювання проліферації епітеліальних клітин і базальних кератиноцитів для загоювання ран, зокрема, шкірних ран. Ці рани можуть мати поверхневий характер або можуть бути глибокими і залучати пошкодження дерми та епідермісу шкіри. Спінозини є придатними для лікування ряду ран і станів. Наприклад, спінозини є активними in vivo у різноманітних моделях загоювання ран. У людини, якій вводять спінозини, рани можуть загоюватись із нормальною швидкістю або процес загоювання може бути порушеним. У разі введення індивіду, процес загоювання у якого не є порушеним, спінозини вводять для прискорення нормального процесу загоювання. У разі введення індивіду, процес загоювання у якого є порушеним, спінозини вводять для полегшення загоювання ран, які б інакше загоювались повільно або не загоювались би зовсім. Порушення процесу загоювання може бути наслідком ряду захворювань і станів. До числа цих захворювань і станів нале 88295 8 жать діабет (наприклад, цукровий діабет типу II), лікування як стероїдами, так і нестероїдними фармакологічними засобами, ішемічна блокада або пошкодження. Було показано, що ряд факторів росту стимулює загоювання ран у індивідів із порушеним процесом загоювання. До числа цих факторів росту належать соматоліберин, тромбоцитарний фактор росту і основний фактор росту фібробластів. Таким чином, цей винахід включає також введення щонайменше одного спінозину у поєднанні з одним або декількома факторами росту або іншим засобом, що стимулює загоювання ран. Спінозини за цим винаходом стимулюють загоювання анастомозних та інших ран, спричинених хірургічними процедурами у людей, рани у яких загоюються з нормальною швидкістю або які мають порушений процес загоювання. Спінозини за цим винаходом і, зокрема, спінозад, є клінічно придатними для стимулювання загоювання ран, у тому числі хірургічних ран, ран, які виникли унаслідок резекції, глибоких ран із пошкодженням дерми і епідермісу, пошкодження м'яких тканин, наприклад, розривів м'язів, ран очних тканин, ран зубних тканин, ран ротової порожнини, ран та виразок слизової оболонки шлунковокишкового тракту, діабетичних виразок, шкірних виразок, виразок ліктів, артеріальних виразок, виразок унаслідок венозного стазу та опіків, що є наслідком нагрівання, впливу екстремально високих або низьких температур, впливу хімічних речовин у нормальних індивідів та тих, хто зазнав впливу станів, які викликають аномальне загоювання ран, наприклад, уремії, недостатності харчування, вітамінної недостатності, ожиріння, інфекції, імуносупресії та ускладнень, пов'язаних із системним лікуванням стероїдами, променевою терапією та антинеопластичними лікарськими засобами та антиметаболітами. Згадані композиції є придатними також для стимулювання загоювання ран, пов'язаних з ішемією та ішемічним пошкодженням, наприклад, хронічних виразок ножних вен, спричинених порушенням та/або недостатністю венозного відтікання; для стимулювання відновлення дерми після її втрати; підвищення межі міцності епідермісу при розтягненні та товщини епідермісу; і посилення міцності прилипання повношарових шкірних лоскутів до основи рани і стимулювання реепітелізації з основи рани. Терміном "індивід", який вживають у цьому винаході, означають людину. У лікарських формах спінозину можуть застосовуватись відповідні фармацевтичні розріджувачі, які, як відомо, є придатними для фармацевтичних композицій. До таких розріджувачів належать (але без обмеження) фізіологічний розчин, забуферений фізіологічний розчин, декстроза, вода, гліцерин, етанол та їх комбінації. Лікарська форма повинна відповідати способу введення. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, фармацевтичним композиціям надають форму, придатну для введення. Спінозини можуть вводитись у фармацевтичних композиціях у комбінації з одним або декількома фармацевтично прийнятними наповнювача 9 ми. Буде зрозуміло, що, у разі введення хворій людині, сумарна добова доза фармацевтичних композицій за цим винаходом буде визначатись штатним лікарем лікарні у межах розумних медичних оцінок. Специфічна терапевтично ефективна доза для будь-якого конкретного хворого буде залежати від цілого ряду факторів, у тому числі типу та ступеня реакції, якого необхідно досягти; специфічної композиції, у тому числі з урахуванням того, чи застосовується будь-який інший засіб; віку, маси тіла, загального стану здоров'я, статі і раціону хворого; часу введення, шляху введення і швидкості виведення композиції; тривалості лікування; лікарських засобів (наприклад, хіміотерапевтичного засобу), що застосовується у комбінації або одночасно із специфічною композицією; і т.п. факторів, добре відомих у медичній галузі. Відповідні лікарські форми, відомі у цій галузі, можуть бути знайдені у довіднику Remington's Pharmaceutical Sciences (останнє видання), Mach Publishing Company, Easton, штат Пенсільванія. Таким чином, "ефективна кількість" спінозинів для вищенаведених цілей (із включенням ефективної кількості спінозину) визначається такими міркуваннями. Фармацевтичні композиції за цим винаходом можуть вводитись традиційним способом, наприклад, пероральним, ректальним, місцевим, внутрішньовенним, внутрішньоочеревинним, внутрішньом'язовим, внутрішньосуглобовим, підшкірним, інтраназальним, інгаляційним, внутрішньоочним або внутрішньошкірним шляхами. Шляхами введення, яким віддають перевагу, є парентеральна та місцева доставка. Термін "парентеральний", який застосовують у цьому описі, означає способи введення, які включають внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоочеревинну, внутрішньогрудинну, підшкірну і внутрішньосуглобову ін'єкцію та вливання. Фармацевтичні композиції вводять у кількості, що є ефективною для лікування специфічного показання. У більшості випадків, доза спінозину становить від приблизно 0,5 мкг/кг до приблизно 50 мкг/кг маси тіла на добу, беручи до уваги шляхи введення, симптоми тощо. Доза, однак, може становити всього 0,05 мкг/кг маси тіла. Наприклад, у конкретному випадку місцевого введення, дози для введення, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, становлять від приблизно 0,2 мкг/см2 до 2 мкг/см2. У разі інтраназального та внутрішньоочного введення, дози для введення, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, становлять від приблизно 0,05 мкг/кг маси тіла до приблизно 50 мкг/кг маси тіла, а за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від приблизно 0,5 мкг/кг маси тіла до приблизно 5 мкг/кг маси тіла. Як загальна пропозиція, сумарна фармацевтично ефективна кількість спінозину, введена парентеральним шляхом, буде знаходитись у межах від приблизно 0,5 мкг/кг до 5 мг/кг маси тіла пацієнта на добу, хоча, як зазначалось вище, це буде вирішуватись за розсудом лікаря. У разі безперервного введення, спінозин, як правило, вводять у дозі від приблизно 10 мкг/кг/год до приблизно 100 мкг/кг/годину 1-4 ін'єкціями на добу або шляхом безперервного підшкірного вливання, наприклад, 88295 10 за допомогою мінінасоса. Може застосовуватись також розчин для внутрішньовенного введення з мішечків або флаконів. Курс лікування спінозином видається оптимальним, якщо він триває довше певної мінімальної кількості днів, від 1 до 5 днів для людей. Тривалість лікування, необхідна для спостереження за змінами і перерва після лікування для появи реакцій будуть змінюватись у залежності від бажаного ефекту. Для парентерального введення у дозованій лікарській формі для ін'єкцій (розчин, суспензія, емульсія), за одним із варіантів здійснення, спінозин із бажаним ступенем чистоти змішують із фармацевтично прийнятним носієм, тобто носієм, який є нетоксичним для реципієнтів у застосованих дозах та концентраціях і є сумісним з іншими інгредієнтами лікарської форми. Взагалі, лікарські форми одержують шляхом однорідного та щільного контактування спінозину з рідкими носіями або тонко диспергованими твердими носіями чи з тим та іншим. Після цього, у разі необхідності, продукту надають бажану лікарську форму. У разі парентерального носія, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, застосовують розчин, ізотонічний із кров'ю реципієнта. Прикладами таких носіїв є вода, фізіологічний розчин, розчин Рінгера-Локка і розчин декстрози. У разі цього винаходу, придатними є також неводні носії, наприклад, нелеткі масла і етилолеат, а також ліпосоми. Відповідні лікарські форми, відомі у цій галузі техніки, можна знайти у довіднику Remington's Pharmaceutical Sciences (останнє видання), Mach Publishing Company, Easton, штат Пенсільванія. Для місцевого введення такі лікарські форми, як мазі, креми та гелі можуть застосовуватись у дозах, які були описані вище для композицій. Відповідні лікарські форми, відомі у цій галузі, можна знайти у довіднику Remington's Pharmaceutical Sciences (останнє видання), Mach Publishing Company, Easton, штат Пенсільванія. Мазі, як правило, виготовляють із застосуванням (1) маслянистої основи, тобто основи, що містить нелеткі масла або вуглеводні, наприклад, медичний вазелін або мінеральне масло, чи (2) абсорбційної основи, тобто основи, що містить будь-яку безводну речовину або речовини, які можуть абсорбувати воду, наприклад, безводний ланолін. Як правило, після одержання основи, будь то маслянистої чи абсорбційної, активний інгредієнт (спінозини) додають у кількості, що забезпечує одержання бажаної концентрації. Креми є масляними/водними емульсіями. Вони складаються з масляної фази (внутрішня фаза), що містить, як правило, нелеткі масла, вуглеводні тощо, наприклад, смоли, вазелін, мінеральне масло і т.ін., та водної фази (суцільна фаза), що містить воду і будь-які водорозчинні речовини, наприклад, додані солі. Дві фази стабілізуються за допомогою емульгатора, наприклад, поверхневоактивної речовини, наприклад, лаурилсульфату натрію; гідрофільних колоїдних розчинів, наприклад, колоїдних глин із доданням аравійської камеді, вігума тощо. Після одержання емульсії, акти 11 вний інгредієнт (спінозини), як правило, додають у кількості, що забезпечує одержання бажаної концентрації. Гелі містять основу, вибрану з-посеред маслянистої основи, води або емульсійно-суспензійної основи, наприклад, як описано вище. До згаданої основи додають желеутворювальну речовину, яка утворює матрицю у згаданій основі, що підвищує її в'язкість. Прикладами желеутворювальних речовин є гідроксипропілцелюлоза, полімери акрилової кислоти тощо. Як правило, активний інгредієнт (спінозини) додають до лікарської форми з одержанням бажаної концентрації на стадії, яка передує доданню желеутворювальної речовини. Пероральні фармацевтичні лікарські форми одержують за допомогою відомих методів із застосуванням добре відомих і легкодоступних інгредієнтів. Під час одержання композицій, активний інгредієнт, як правило, змішують із фармацевтично прийнятним носієм або розбавляють носієм або вводять до носія, який може мати форму капсули, саше, паперового контейнера тощо. У разі, коли носій відіграє роль розріджувача, він може бути твердим, напівтвердим або рідким матеріалом, який виступає у ролі носія, наповнювача або середовища для активного інгредієнта. Так, композиції можуть мати форму таблеток, драже, порошків, льодяників, суспензій, емульсій, розчинів, сиропів, м'яких та твердих желатинових капсул тощо. На додаток до активного або терапевтичного інгредієнта, у дозах, опис яких наведено вище для композицій, таблетки містять ряд інертних матеріалів, відомих як домішки або наповнювачі. Ці матеріали допомагають надати лікарській формі задовільних технологічних і пресувальних властивостей і включають розріджувачі, в'яжучі речовини, ковзні речовини та змащувальні агенти. Додаткова група речовин, що додаються, допомагає надати готовій таблетці додаткових бажаних фізичних характеристик. До цієї групи входять розпушувальні речовини, барвники, та, у разі жувальних таблеток, ароматизатори та підсолоджувальні речовини, а у разі таблеток пролонгованої дії, полімери, смоли або інші матеріали, що уповільнюють розчинність. Словосполучення "фармацевтично прийнятний" означає, що носій, розріджувач або наповнювач повинен бути сумісним з іншими інгредієнтами лікарської форми і не шкідливим для реципієнта. Додаткові подробиці, у тому числі типові лікарські форми, можна віднайти у довіднику Remington's Pharmaceutical Sciences (останнє видання), Mach Publishing Company, Easton, штат Пенсільванія. Ці композиції передбачають також пов'язки або перев'язки для лікування ран, що містять терапевтично ефективну кількість спінозину або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі. Пов'язки або перев'язки для лікування ран включають зовнішню тканинну основу, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, еластомерну тканинну основу, і внутрішню м'яку прокладку, де згадана внутрішня м'яка прокладка включає зовнішню мембранну поверхню, виготовлену, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, з матеріалу, який утворює плівку, яка містить терапевтично 88295 12 ефективну кількість спінозину або його фізіологічно прийнятної похідної чи солі, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, спінозад або його фізіологічно прийнятну похідну чи сіль, у дозах, описаних вище для композицій у матриці. Згадана м'яка прокладка може утворювати єдине ціле із зовнішньою тканинною основою або бути відокремленою від неї. Спінозин ідеально включається до мембранної матриці, однак може також включатись до матеріалу внутрішньої м'якої прокладки, який знаходиться у мембрані. Терапевтично активний засіб утримується у полімерній матриці таким чином, що запобігається його переміщення із забезпеченням поступового виділення спінозину. За іншим аспектом, перев'язка для рани містить абсорбційну м'яку прокладку, що має проникну для рідини бічну прокладку, окремий зовнішній покривний шар, факультативно, непроникний для рідини, з абсорбційною масою між ними. Внутрішню та/або абсорбційну масу виготовляють із матеріалів, які включають терапевтично ефективну кількість спінозину у матриці або проміжному просторі для забезпечення постійної тісної близькості спінозину до рани. Внутрішню поверхню або м'яку прокладку перев'язки, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, виготовляють із природного або синтетичного матеріалу, який утворює мембрану або плівку, органічного чи неорганічного, тваринного або рослинного походження або із пластичних матеріалів. Наприклад, із желатину або з рослинних смол чи з гідрофільних або гідрофобних пластичних матеріалів, які утворюють плівку, наприклад, полівінілхлоридполіацетатів або поліамідів, які відливають або які наносять як плівку або мембрану звичайним способом. Відповідними полімерними матеріалами є (але без обмеження) силастиковий матеріал або інший матеріал на основі силікону, поліетилентерефталат (PET), дакрон, плетений дакрон, велюровий дакрон, поліглацин, найлон, шовк, поліетилен (РЕ), поліуретан, полівінілхлориди, силастиковий еластомер, силікон, каучук, РММА (полі(метилметакрилат)), латекс, поліпропілен (РР), поліолефін, целюлоза, полівініловий спирт (PVA), полі(гідроксіетилметакрилат) (РНЕМА), полі(гліколева кислота), полі(акрилонітрил) (PAN), співполімер тетрафторетилену та гексафторпропілену (FEP), тефлон (ПТФЕ), їхні співполімери та їхні суміші. Найпростішим способом включення терапевтично активних сполук до полімерного матеріалу є безпосереднє змішування терапевтично активної речовини із пластифікованою смолою перед відливанням тощо. Плівка або мембрана ідеально виробляється з гідрофобного полімеру, який є проникним як для рідини, так і для газу, але непроникним для проходження мікроорганізмів. Гідрофобність плівки або мембрани є корисною особливістю, оскільки завдяки цьому знижується схильність плівки або мембрани до приєднання до ділянки рани. 13 Кількість спінозинів, що включається до лікарської форми, не є критичною; концентрація лише повинна знаходитись у діапазоні, достатньому для забезпечення легкого нанесення лікарської форми на ділянку рани у кількості, яка доставить бажану кількість спінозинів. Звичайна кількість лікарської форми для нанесення на рану буде залежати від розміру рани та концентрації спінозинів у згаданій лікарській формі. Взагалі, лікарська форма буде наноситись на рану у кількості, яка забезпечує від приблизно 0,1 мкг до приблизно 5 мкг спінозинів на 1 см2 рани. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, нанесена кількість спінозинів буде коливатись у межах від приблизно 0,2 мкг/см2 до приблизно 2 мкг/см2, а відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, від приблизно 0,25 мкг/см2 до приблизно 0,5 мкг/см2. Спінозини можуть також вводитись до ока для лікування пошкоджень, розладів та патологій слізних залоз у людей у вигляді рідини, крапель, загущеної рідини, гелю. Спінозини можуть вводитись також інтраназально до слизової оболонки носу для лікування розладів, пошкоджень та патологій слизової оболонки носу та епітелію носових пазух у людей у вигляді рідких крапель або спрея. Спінозини, як правило, вводять до носіїв із концентрацією приблизно від 0,01 мкг/мл до 50 мг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, від 0,01 мкг/мл до 10 мг/мл при pH від приблизно 5 до приблизно 8, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, від приблизно 6 до приблизно 7, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, приблизно 6,2. Буде зрозуміло, що наслідком застосування певних із вищенаведених наповнювачів, носіїв або стабілізаторів буде одержання солей спінозинів. Спінозини, як правило, будуть зберігатись у однодозових або багатодозових контейнерах, наприклад, герметизованих ампулах або флаконах, у вигляді водного розчину або ліофілізованої лікарської форми для відновлення. Як приклад ліофілізованої лікарської форми, флакони місткістю 3 мл заповнюють 1 мл профільтрованого за стерильних умов 1% (у відношенні маси до об'єму) водного розчину спінозину, і одержану суміш ліофілізують. Розчин для вливання одержують шляхом відновлення ліофілізованого спінозину за допомогою води для ін'єкцій, яка може факультативно включати один або декілька антиоксидантів. Дози можуть підбиратись специфічним для хворого чином, щоб забезпечити попередньо визначену концентрацію активності спінозину у крові, 88295 14 що визначається, наприклад, за допомогою радіоімуноаналізу. Так, доза для пацієнта може підбиратись таким чином, щоб забезпечити регулярні постійні кінцеві рівні у крові, за визначенням за допомогою радіоімуноаналізу, порядку від 50 нг/мл до 1000 нг/мл, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, від 150 нг/мл до 500 нг/мл. Приклад 1 Місцеве застосування спінозаду поліпшує загоювання ран після оперативного видалення шкіри у овець (Номер дослідження T9CAL0205) Кастрованих ягнят мериносів із підрізаним хвостом піддавали хірургічній операції, яка полягала у видаленні шкіри з вовною на лопатковій ділянці. Завдяки цій операції, після загоювання рани, знижується сприйнятливість овець до відкладання крилатими комахами яєць під шкіру. П'ятдесят овець подібній обробці не піддавали, а групу із 381 вівці обробляли 7,1 г спінозаду у вигляді аерозолю (4 мг/г) (пропис дивись у Таблиці 1). Спінозад у вигляді аерозолю наносять місцево на рану, доки вона не зволожиться продуктом. При цьому слід подбати про те, щоб вовна була розсунута. Таблиця 1 Лікарська форма спінозаду у вигляді аерозолю Складова Спінозад 89,9% Спирт 100AGF4 Хлоргексидину диглюконат 20% Брильянтова голуба FCF Пропілгалат Молочна кислота 85% Пропіленгліколь Деіонізована вода Твій 20 Полівінілпіролідон КЗО Кількість % (мас.) 0,445 20 0,08 0,02 0,01 0,06 10 64,43 2 3 Рани після хірургічної операції у 18 ягнят на групу ретельно оглядали і оцінювали на ознаки загоювання на 7 день та 17 день після обробки (Таблиця 1). Утворення кірки та стягування рани оцінюють у балах від 0 (повне або нормальне загоювання) до 3 (еквівалент відсутності ознак загоювання). Кровотечу/серозний випіт та порушений процес загоювання візуально оцінюють у балах від 0 (відсутність кровотечі/випоту і нормальне загоювання) до 3 (сильна кровотеча або порушений процес загоювання). 15 88295 16 Таблиця 2 Вплив місцевого застосування спінозаду на загоювання ран у овець після хірургічної операції з видаленням шкіри Група День Без обробки Спінозад у вигляді аерозолю # # # 7 0,04 17 0,57 7 0,12 17 0,88 Кровотеча /серозний випіт 7 17 0,12 0,08 0,04 0 0,08 0,36 0,12 Утворення кірки # Стягування рани @ Порушення процесу загоювання 7 17 0 0 0 0 0 Геометричні середні значення. Низька оцінка у балах означає краще загоювання. Кількість уражених овець з 18. @ На 7 день після операції з видалення шкіри вівці, оброблені спінозадом, демонстрували більше стягування ран, аніж контрольні тварини, яких обробці не піддавали, що визначено нижчими середніми оцінками у балах для стягування рани. Через 17 днів після операції у овець, які були оброблені спінозадом, спостерігалось краще утворення кірки, стягування рани і слабкіша кровотеча і серозний випіт, що свідчило про поліпшене загоювання ран, порівняно з контрольними вівцями, яких обробці не піддавали. Наслідком місцевого нанесення спінозаду на оперативні рани овець після видалення шкіри було поліпшене загоювання ран через 17 днів після обробки, порівняно із тваринами, яких не піддавали обробці. Згадане поліпшення загоювання ран відбувається за відсутності погіршуючих факторів, наприклад, відкладання падальною мухою яєць під шкіру. Однак лікарська форма, застосована у цьому прикладі, включала також антибактеріальну сполуку, хлоргексидин. Здатність хлоргексидину до пригнічення бактеріальної інфекції може також позитивно впливати на загоювання ран у цьому прикладі. Приклад 2 Місцеве застосування спінозаду поліпшує загоювання ран після оперативного видалення шкіри у овець (Номер дослідження T9CAL0206) Кастрованих ягнят мериносів із підрізаним хвостом піддавали хірургічній операції, яка полягала у видаленні шкіри з вовною на лопатковій ділянці. Приблизно 46 мл розбавленого (125 млн-1) екстинозаду (пропис дивись у Таблиці 3) наносять на оперативні рани 150 ягнят за допомогою невеликого (на 2 л або 5 л) садового обприскувача підвищеного тиску, який можна придбати у роздрібних магазинах садово-городнього реманенту. Контейнер або резервуар має конічну форму; тиск підвищують шляхом ручного накачування. Спрей подається через конічну насадку. Спінозад у формі аерозолю (4 мг/г) (пропис лікарської форми дивись у Таблиці 1) наносять на рану доти, доки продукт не зволожить рану і вовну навколо неї. П'ятдесят овець після згаданої хірургічної операції обробці не піддають (контроль). Таблиця 3 Лікарська форма екстинозаду (25 г/л спінозаду) Складова Спінозад 92% Вігум Проксел (Proxel) GXL Пропіленгліколь Ксантанова смола Плуроник Р123 або Плуроник Р105 Протиспінювальна речовина С (30%) Ломар (Lomar) PWA (44,5% розчин) Деіонізована вода Кількість % (мас.) 2,7 1 0,2 10 0,2 1,0 0,2 4,5 80,2 Через чотирнадцять днів після обробки ягнят оглядають і розміщують у кошарах. За ягнятами спостерігаютьвпродовж 15 хв, і виявляють тварин з ознаками відкладання крилатими комахами яєць під шкіру, наприклад, із посіпуванням хвоста, покусуванням ділянки з відкладеними під шкірою яйцями або постукуванням ратицями. Двадцять п'ять ягнят із кожної групи довільно вибирають і вміщують під захисний брусок. Оперативні рани у цих тварин оглядають для виявлення ознак відкладання крилатими комахами яєць під шкіру і загоювання ран (Таблиця 4). Утворення кірки та стягування рани оцінюють у балах від 0 (повне або нормальне загоювання) до 3 (еквівалент відсутності ознак загоювання). Кровотечу/серозний випіт та порушений процес загоювання візуально оцінюють у балах від 0 (відсутність кровотечі/випоту і нормальне загоювання) до 3 (сильна кровотеча або порушений процес загоювання). 17 88295 18 Таблиця 4 Вплив місцевого застосування спінозаду (2 різні лікарські форми) на загоювання ран і присутність відкладання крилатими комахами яєць під шкіру та інфекції у овець через 14 днів після хірургічної операції з видаленням шкіри і обробки # Група Необроблені Екстинозад (спінозад 125 мг/л) Спінозад у формі аерозолю (4 мг/л) # Утворення кірки # Стягування рани @ Порушення @ПрисутКровотеча процесу заго- ність личи/серозний випіт ювання нок 0,15 4 4 # @ Присутність інфекції 0,15 0,15 6 0,06 0,03 0 0 1 0 0,03 0,06 0 0 0 0 Геометричні середні значення. Низька оцінка у балах означає краще загоювання. Кількість уражених овець із 25. @ Вівці, яких обробляли спінозадом (лікарська форма у вигляді аерозолю (4 мг/л) або спрея (125 мг/л), який розпилювали вручну), демонструють поліпшене загоювання ран, про що свідчить знижена оцінка утворення кірки, стягування ран і присутності кровотечі і серозного випоту у балах на ділянці ран. На додаток до цього, жодна із 25 овець, яких оглядали у кожній експериментальній групі, не мала порушення процесу загоювання, порівняно із 4 тваринами з порушеним процесом загоювання у контрольній групі, яку не піддавали обробці. Личинки Lucilia cuprina є присутніми у 4 овець із 25 овець з контрольної групи, яку обробці не піддавали, порівняно з однією вівцею із групи, яку обробляли екстинозадом і жодною вівцею із групи, яку обробляли спінозадом у формі аерозолю. Інфекція на ділянці ран реєструється у 6 овець із 25 овець у групі, яку обробці не піддавали, однак вона відсутня у групах, які були оброблені спінозадом. Наслідком місцевої обробки оперативних ран після видалення шкіри спінозадом є поліпшення загоювання ран, порівняно з контрольними тваринами, яких обробці не піддавали, як показано у наведеному вище Прикладі 1. Це поліпшення процесу загоювання ран супроводжується нижчими рівнями інфікованості і зменшеною кількістю личинок Lucilia cuprina у ранах. Поліпшення процесу загоювання ран відбувається незалежно від лікарської форми або дози спінозаду, яку наносили на рани після хірургічної операції. Більше того, спінозад, за відсутності хлоргексидину (екстинозад) є здатним до стимулювання процесу загоювання ран. Ці дані дозволяють зробити припущення про те, що підсилене загоювання ран, яке спостерігалось у Прикладі 1 і Прикладі 2, може бути впливом самого спінозаду, а не властивостей хлоргексидину, які полягають у пригніченні інфекції. Приклад 3 Спінозад поліпшує загоювання ран у пацюків із застосуванням моделі термічного пошкодження а) Вплив спінозаду на загоювання ран, спричинених лазером, у нормальних молодих пацюків Молодим аутбредним пацюкам-самцям лінії Sprague-Dawley тримісячного віку, масою приблизно 300 г, за 24 год до спричинення ран видаляють шерсть на міжлопатковій ділянці. Пацюків анестезують і за допомогою СО2 лазера спричинюють термічний опік (чотири послідовні періоди стимулювання, кожен потужністю 25 Вт, імпульс тривалістю 0,5 с з діаметром плями променя, який дорівнює 10 мм) з одержанням кільцевої рани площею 2 см2. Групи із 12 пацюків обробляють фізіологічним розчином, лимонною кислотою (5%) або спінозадом (0,5% розчин у 5% лимонній кислоті). Обробки здійснюють двічі на день впродовж 5 днів після спричинення ран шляхом 2 внутрішньошкірних 100 мкл ін'єкцій на протилежних боках рани. Утворення кірки спричинює тимчасове зниження швидкості стягування рани (Сноуден (Snowden) та інші, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 60:73-82 (1982)). З цієї причини кірку та злегка прилиплий струп, у разі виявлення, обережно видаляють для забезпечення можливості порівняння усіх ран і точного визначення контурів ділянки ран. Рани вимірюють кожного дня впродовж 6 послідовних днів після спричинення ран і кожні 48 год у подальшому, доки не відбудеться повне стягування/реепітелізація ран. Контури площі опіку (максимальний діаметр рани) визначали за допомогою стереоскопічного мікроскопа для точності, після чого вимірювали за допомогою цифрового планіметра. Кінцевою точкою загоювання є закінчення повного стягування рани (Таблиця 5). 19 88295 20 Таблиця 5 Вплив спінозаду (0,5%) на швидкість загоювання ран у пацюків, які зазнали термічного опікового пошкодження, порівняно з контрольними тваринами, яких піддавали обробці фізіологічним розчином та лимонною кислотою Дні після спричинення рани 1 2 3 4 5 7 9 11 12 13 15 16 Розмір рани, см2 (групове середнє±середня квадратична помилка середнього, n=12) Фізіологічний розчин Лимонна кислота Спінозад 0,5% 2,5±0 2,6±0,1 2,6±0,1 2,8±0,1 3,1±0,1 1,9±0,1 4,1±0,2 4,5±0,2 1,7±0,1 4,3±0,1 4,4±0,2 1,4±0,1 4,5±0,1 4,8±0,1 1,3±0,1 3,4±0,1 3,6+0,2 1,2±0,1 2,3±0,3 2,5±0,1 1,0+0,1 1,9±0,1 1,5+0,2 0,4±0,1 * * Рана загоїлась 1,1±0,1 0,6±0,2 0,4±0,2 0,1±0 Рана загоїлась Рана загоїлась Вплив спінозаду на загоювання ран стає помітним через 2 дні після спричинення ран, коли площа ран у пацюків, оброблених спінозадом, стає на 30% меншою, порівняно із площею ран у контрольних тварин, які були оброблені фізіологічним розчином та лимонною кислотою. У пацюків, які були оброблені спінозадом, спостерігалось повне загоювання ран на 12 день, тобто на 4 дні раніше, аніж у їхніх двійників, які були оброблені фізіологічним розчином або лимонною кислотою. Ці дані показують, що простий водний розчин спінозаду може прискорити загоювання ран у нормальних, молодих здорових пацюків. b) Вплив спінозаду на загоювання ран, спричинених лазером, у пацюків-діабетиків (тварин із порушенням процесу загоювання) Індукція діабету за допомогою стрептозотоцину Діабет індукують у аутбредних пацюків-самців лінії Sprague-Dawley тримісячного віку за допомогою стрептозотоцину (STZ). Стрептозотоцин (75 мг/кг) розчиняють у 0,1 Μ холодному буферному розчині цитрату натрію (pH 4) і зберігають на льоду для запобігання розкладу. Після 24 год голодування пацюкам внутрішньоочеревинно ін'єктують одну дозу свіжоодержаного (холодного) STZ (Ракентен (Rakienten) та інші, Cancer Chemotherapy Report, 29:73-82 (1963)). Симптоми діабету стають очевидними у цих пацюків у межах 2-3 днів і їхній діабетичний стан підтверджують пробою на глюкозу у сечі. Лікування інсуліном застосовують для одержання регулярного тимчасового полегшення від катаболічного домінування згаданого стану з одночасним забезпеченням регулярної і тяжкої гіперглікемії (Уілларс (Willars), J. Neurol. Sci., 91:153-164 (1989)). Захворілим пацюкамдіабетикам підшкірно роблять від однієї до двох ін'єкцій інсуліну (протофан, 2 МОд/100 г) у залежності від тяжкості їхнього фізичного стану (наприклад, незначне споживання корму або води, втрата маси до приблизно 115 г, надмірна пасивність). Пацюків, у яких не з'явилось ознак поліпшення або які втратили більше 15% маси тіла, умертвляють. Пацюкам-діабетикам масою приблизно 200 г, за 24 год до спричинення ран видаляли шерсть на міжлопатковій ділянці. Пацюків анестезують і за допомогою СO2 лазера спричинюють термічний опік (чотири послідовні періоди стимулювання, кожен потужністю 25 Вт, імпульс тривалістю 0,5 с з діаметром плями променя, який дорівнює 10 мм) з одержанням кільцевої рани площею 2 см2. Групи із 12 пацюків обробляють фізіологічним розчином або спінозадом (0,5% розчин у 5% лимонній кислоті). Місцеві обробки здійснюють двічі на день впродовж 5 днів після спричинення ран шляхом закапування 100 мкл розчину безпосередньо на ділянку рани. Кірку та злегка прилиплий струп, у разі виявлення, обережно видаляють для забезпечення можливості порівняння усіх ран і точного визначення контурів ділянки ран. Рани вимірюють, як описувалось вище (Приклад 3а), до явного закриття рани (Таблиця 6). 21 88295 22 Таблиця 6 Вплив спінозаду (0,5%) на швидкість загоювання ран у пацюків-діабетиків, які зазнали термічного опікового пошкодження, порівняно з контрольними тваринами, яких піддавали обробці фізіологічним розчином Дні після спричинення рани 1 2 3 4 5 6 8 10 12 13 14 16 17 Розмір рани, см2 (групове середнє, n=12) Фізіологічний розчин Спінозад 0,5% 2,2±0 2,1±0 2,2±0,1 2,1±0,1 2,1±0,1 1,5±0,1 2,1±0,1 1,6±0,1 2,4±0,2 1,9±0,1 3±0 2,5±0,2 3±0,1 2,1±0,1 2,3±0,2 1,2±0,2 1,2+0,1 0,6±0,1 * Рана загоїлась 0,6±0,1 0,2±0,1 Рана загоїлась У пацюків-діабетиків, яких піддавали місцевому лікуванню спінозадом, спостерігається поліпшене загоювання ран, порівняно з контрольними тваринами, яких лікували фізіологічним розчином, через 3 дні після спричинення ран, про що свідчить зменшена площа ран. Зменшення розміру ран відбувається швидше у пацюків, яких лікували спінозадом, наслідком чого є загоєння ран на 13 день, тобто на 4 дні раніше, аніж відбувається загоєння ран у контрольних тварин, яких лікували фізіологічним розчином. с) Вплив спінозаду на загоювання ран, спричинених лазером, у старих (з порушенням процесу загоювання) пацюків Аутбредним пацюкам-самцям лінії SpragueDawley, віком 24 міс, масою приблизно 600 г, за 24 год до спричинення ран видаляли шерсть на міжлопатковій ділянці. Пацюків анестезують і за до помогою СО2 лазера спричинюють термічний опік (чотири послідовні періоди стимулювання, кожен потужністю 25 Вт, імпульс тривалістю 0,5 с з діаметром плями променя, який дорівнює 10 мм) з одержанням кільцевої рани площею 2 см2. Групи із 12 пацюків обробляють фізіологічним розчином або спінозадом (0,5% розчин у 5% лимонній кислоті). Місцеві обробки здійснюють двічі на день впродовж 5 днів після спричинення ран шляхом закапування 100 мкл розчину безпосередньо на ділянку рани. Кірку та злегка прилиплий струп, у разі виявлення, обережно видаляють для забезпечення можливості порівняння усіх ран і точного визначення контурів ділянки ран. Рани вимірюють, як описувалось вище (Приклад 3а), до явного закриття рани (Таблиця 7). Таблиця 7 Вплив спінозаду (0,5%) на швидкість загоювання ран у старих пацюків, які зазнали термічного опікового пошкодження, порівняно з контрольними тваринами, яких піддавали обробці фізіологічним розчином Дні після спричинення рани 1 2 3 4 5 6 8 10 12 14 15 16 18 20 21 Розмір рани, см2 (групове середнє, n=12) Фізіологічний розчин Спінозад 0,5% 2,3±0 2,4±0 2,3+0 2,9±0,1 3,5±0,2 2,7±0,2 4±0,2 2,3±0,2 4,9±0,2 2±0,2 5,6±0,2 3,3±0,1 4,6±0,1 3,5±0,1 3,2±0,1 2,5±0,2 2,2±0,1 1,2±0,1 1,6±0,1 0,8±0,1 * Рана загоїлась 1,2±0 0,9±0,1 0,5±0,1 Рана загоїлась 23 У старих пацюків, яких піддавали місцевому лікуванню спінозадом, спостерігається поліпшене загоювання ран, порівняно з контрольними тваринами, яких лікували фізіологічним розчином, через 3 дні після спричинення ран, про що свідчить зменшена площа ран. Розмір ран у пацюків, які зазнали лікування спінозадом, продовжує зменшуватись до 6 дня; впродовж цього періоду часу розмір ран у пацюків, які зазнали лікування фізіологічним розчином, збільшується. Розмір ран у пацюків, які зазнали лікування спінозадом, продовжує зменшуватись, порівняно з контрольними тваринами, які зазнали лікування фізіологічним розчином, внаслідок чого загоєння ран у них відбувається на 15 день, тобто на 6 днів раніше загоєння ран у контрольних тварин, які зазнали лікування фізіологічним розчином. Спінозад підвищує швидкість загоювання ран у разі місцевого або внутрішньошкірного застосування. Спінозад поліпшує загоювання ран у старих пацюків, які мають хронічну недостатність чутливих нервів. Такі дані дозволяють зробити припущення про те, що спінозад може стимулювати загоювання ран як через залежні, так і через незалежні від чутливих нервів механізми. Таким чином, спінозад може лікувати хронічне укривання виразками, пов'язане зі старінням. Спінозад поліпшує загоювання ран у пацюків з індукованим діабетом, іншою формою недостатності чутливих нервів. Ці дані також дозволяють припустити, що ранозагоювальні властивості спінозаду можуть модулюватись як через залежні, так і через незалежні чутливі нервові провідні шляхи. Таким чином, спінозад може лікувати хронічне укривання виразками та інші рани, пов'язані з поганим загоюванням у діабетиків. Спінозад поліпшує загоювання у нормальних, молодих здорових пацюків з інтактними чутливими нервами. Такі дані дозволяють припустити, що спінозад може чинити свою дію або через незалежний від чутливих нервів механізм, або його вплив може стимулюватись функціонуванням чутливих нервів. Таким чином, спінозад може стимулювати загоювання ран у здорових людей, наприклад, рани, що виникають унаслідок пошкодження або хірургічного втручання. Результати Прикладу 3 вказують на те, що спінозад може стимулювати загоювання ран за допомогою ряду механізмів і може бути ефективним як у людей з нормальним процесом загоювання, так і у людей з порушенням процесу загоювання. У діабетичних та старих пацюків, як правило, спостерігається період відставання, який передує появі будь-якої значної реакції на пошкодження (Таблиці 6-7), порівняно зі здоровими молодими пацюками (Таблиця 5). Цей період відставання відносять на рахунок загального зниження активності аферентних чутливих нейронів діабетичних (Джібран (Gibran) та інші, J. Surg. Res., 108:122:128 (2002)) та старих (Халіл (Khalil), Хелм (Helme), J. Gerontol. Biol. Sci., 51A(5): B354-B361 (1996)) пацюків, яке є очевидним на запальній фазі процесу 88295 24 загоювання ран. Те, що спінозад є здатним до справляння ефекту загоювання ран у пацюківдіабетиків, може бути наслідком стимулювання місцевих аферентних чутливих нервів або застосування механізмів, які не залежать відмеханізмів активації аферентних чутливих нервів. Вплив спінозаду є більш вираженим у контрольних тварин з інтактними чутливими нервами (Таблиця 5). Цей вплив є особливо очевидним на ранній запальній фазі (дні 2-5), ранній складовій проліферативної фази (дні 2-6), з додатковим позитивним впливом впродовж пізньої складової проліферативної фази (дні 6-8) і реконструктивної фази (дні 9-12). Виявляється також, що спінозад має вплив на реконструктивній фазі загоювання рани, який включає інфільтрацію і проліферацію клітин. Дерма реагує на пошкодження на цій фазі продукуванням колагену і білків матриці, наслідком чого є стягування і загоювання рани. Таким чином, спінозад може впливати на посередники, які впливають на інфільтрацію і активацію клітин, наприклад, на цитокіни, хемокіни та інші сигналізатори клітин, або може безпосередньо стимулювати продукування матриці і реконструкцію шкіри на ділянці рани. Приклад 3 показує, що спінозад поліпшує загоювання ран впродовж 3 фаз загоювання. Дані Прикладу 3 підтверджують результати Прикладів 1 і 2, що спінозад допомагає загоюванню ран, спричинених хірургічним втручанням або опіком. Спінозад стимулював загоєння ран у 2 видів. Приклад 4 Дослідження способу дії спінозаду при стимулюванні загоєння ран у пацюків із застосуванням пухирцевої моделі нейрогенного запалення а) Вплив дози спінозаду на судинний кровотік Нейрогенні запальні реакції оцінюють за допомогою добре розробленого способу (Халіл (Khalil), Хелм (Helme), Brain Res., 527:292-298 (1990)). Аутбредних пацюків-самців лінії Sprague-Dawley анестезують пентобарбітоном натрію (60 мг/кг внутрішньоочеревинно). Загальну анестезію підтримують додатковими ін'єкціями 15 мг/кг. Було показано, що цей спосіб анестезії не змінює основних судинорозширювальних реакцій периферичної мікроциркуляторної частини судинного русла (Халіл (Khalil), Хелм (Helme), Brain Res., 500:256-262 (1989)). Ліву яремну вену канюлюють поліетиленовою трубкою для внутрішньовенного введення розчину гепарину/фізіологічного розчину або лікарських засобів. Температуру тіла підтримують на рівні 37°С. Після завершення експерименту тварин умертвляють підвищеною дозою барбітурату. Пухирі спричинюють на середній частині задньої лапки у анестезованих пацюків за допомогою вакууму (-40 кПа впродовж 30 хв) через металеві присисні насадки, нагріті до температури 40°С. Після появи пухирів, епідерміс (поверхневий епітелій) видаляють і над основою пухиря закріплюють плексигласову камеру із вхідним і вихідним отворами. Для визначення вихідних показань, над поверхнею пухиря за допомогою перистальтично 25 88295 го насоса з витратою 4 мл/год пропускають розчин Рінгера-Локка. Відносний часовий кровотік контролюють за допомогою лазерного доплервитратоміра через зонд, розміщений безпосередньо над основою пухиря, а відносне надлишкове виділення крові (вольти) постійно контролюють за допомогою самописа. Спінозад розбавляють у 5% лимонній кислоті у розчині Рінгера-Локка і пропускають над основою пухирів впродовж періоду часу до 30 хв. Таблиця 8 Вплив різних концентрацій спінозаду на кровотік над основою пухиря, порівняно з розчином Рінгера-Локка Концентрація спі0,05% 0,5% 5% нозаду 32(±5) 113,6(±9,4) 62,4(±4,8) Площа під кривою, см2 (середнє значення±середня квадратична помилка середнього, n=6) Спінозад, який пропускали через пухирцеву рану з концентрацією 0,5%, найбільше впливав на судинний кровотік із точки зору як інтенсивності реакції, так і її тривалості. 0,05% розчин спінозаду позитивно впливає на кровотік, хоча інтенсивність реакції є зниженою, порівняно з 0,5% розчином спінозаду. Розчин спінозаду з концентрацією 5% викликає проміжну реакцію з максимумом зниженої тривалості та інтенсивністю, порівняною з реакцією, яка була одержана з 0,5% розчином спінозаду. Підтримувана інтенсивність реакції, що спостерігалась у разі застосування 0,5% розчину спінозаду, дозволяє припустити взаємодію з нервовими провідними шляхами пептиду, пов'язаного з геном кальцитоніну (CGRP), у той час як десенсибілізацію, що спостерігалась у разі підвищеної концентрації спінозаду, часто асоціюють зі шляхами, які опосередковуються субстанцією Р. Ці дані показують, що спінозад позитивно впливає на судинний кровотік, що є обов'язковою умовою загоювання ран. Ця дія може обумовлюватись безпосереднім впливом на кровоносні судини або виділенням пептидів, наприклад, CGRP і субстанції Р, із чутливих нервів, що, своєю чергою, опосередковують судинну реакцію. 26 b) Вплив антагоністів пептиду чутливих нервів та інгібітору синтази оксиду азоту на судинну реакцію пацюків на 0,5% розчин спінозаду Нейрогенні запальні реакції оцінюють за допомогою добре розробленого способу (Халіл (Khalil), Хелм (Helme), Brain Res., 527:292-298 (1990)). Аутбредних пацюків-самців лінії SpragueDawley анестезують пентобарбітоном натрію (60 мг/кг внутрішньоочеревинно). Загальну анестезію підтримують додатковими ін'єкціями 15 мг/кг. Було показано, що цей спосіб анестезії не змінює основних судинорозширювальних реакцій периферичної мікроциркуляторної частини судинного русла (Халіл (Khalil), Хелм (Helme), Brain Res., 500:256262 (1989)). Ліву яремну вену канюлюють поліетиленовою трубкою для внутрішньовенного введення розчину гепарину/фізіологічного розчину або лікарських засобів. Температуру тіла підтримують на рівні 37°С. Після завершення експерименту тварин умертвляють підвищеною дозою барбітурату. Пухирі спричинюють на середній частині задньої лапки у анестезованих пацюків за допомогою вакууму (-40 кПа впродовж 30 хв) через металеві присисні насадки, нагріті до температури 40°С. Після появи пухирів епідерміс (поверхневий епітелій) видаляють і над основою пухиря закріплюють плексигласову камеру із вхідним і вихідним отворами. Для визначення вихідних показань над поверхнею пухиря за допомогою перистальтичного насоса з витратою 4 мл/год пропускають розчин Рінгера-Локка. Відносний часовий кровотік контролюють за допомогою лазерного доплервитратоміра через зонд, розміщений безпосередньо над основою пухиря, а відносне надлишкове виділення крові (вольти) постійно контролюють за допомогою самописа. Спінозад розбавляють у 5% лимонній кислоті у розчині Рінгера-Локка і пропускають над основою пухирів впродовж періоду часу до 30 хв. Над подушечкою однієї лапки кожного пацюка пропускають 0,5% розчин спінозаду, у той час як над подушечкою іншої лапки кожного пацюка спочатку впродовж 10 хв пропускають антагоніст або інгібітор, з подальшим одночасним пропусканням впродовж 30 хв 0,5% розчину спінозаду. Над подушечками лапок пацюків пропускають 1 мкМ розчин CGRP8-37 (антагоніст CGRP; фірма Auspep, VIC, Австралія), 100 мкМ розчин метилового складного ефіру N-нітро-L-аргініну (L-NAME, інгібітор ендотеліальної синтази оксиду азоту; фірма Cayman Chemical Co., штат Мічиган, США) та 10 мкМ розчин спантиду II (антагоніст II субстанції Р; фірма Auspep, VIC, Австралія). 27 88295 28 Таблиця 9 Вплив антагоністів пептиду чутливих нервів та інгібітора ендотеліальної синтази оксиду азоту (eNOS) на судинну реакцію пухирів подушечки лапки пацюків на пропускання 0,5% розчину спінозаду і відносний внесок ефекторів на активність спінозаду Пропущена речовина Контроль L-NAME CGRP8-37 Спантид Ефектор Відсутній ENOS CGRP Субстанція Ρ Кровотік як площа під кривою (см2) середнє значення±стандартна квадратична помилка середнього, n=6 113,6 (±9,4) 87,2 (±5,2) 83,2 (±6,5) 74,9 (±3,6) Кровотік у відповідь на стимуляцію спінозадом зменшується у присутності антагоністів CGRP і пептиду субстанції Ρ та інгібітора NOS (Таблиця 9). Ці дані вказують на те, що вплив спінозаду на судинний кровотік опосередковується через шляхи CGRP, субстанції Ρ і оксиду азоту. Внесок CGRP, субстанції Ρ і eNO до впливу спінозаду становить 27%, 34% і 24%, відповідно (Таблиця 9). Профіль судинної реакції у присутності антагоніста CGRP має однакову інтенсивність реакції впродовж пропускання, що дозволяє зробити припущення про те, що опосередковування впливу спінозаду CGRP є постійним у часі. Профілі судинної реакції у присутності антагоніста субстанції Ρ (спантид) або інгібітора eNOS (L-NAME) показують, що згадана реакція з часом знижується. Це дозволяє припустити, що субстанція Ρ і eNOS є більшою мірою залученими до опосередковування впливу спінозаду впродовж пізніших стадій згаданої реакції. Ці дані, у сукупності, показують, що вплив спінозаду на судинний кровотік опосередковується через пептиди чутливих нервів, субстанцію Ρ і CGRP, та через ендотеліальний оксид азоту. Залучення eNO до цього процесу дозволяє припустити, що спінозад може діяти безпосередньо на ендотелій кровоносних судин, а також через іннервацію кровоносних судин у ранах чутливими нервами. На додаток до цього, вплив спінозаду є довготривалим і опосередковується через різні ефектори на різних стадіях реакції. Такі дані можуть пояснити різниці у профілях загоювання ран між пацюками, яких лікували спінозадом і контрольними пацюками у моделі теплового пошкодження (Приклад 3), зокрема, раннє загоювання ран у пацюків (старих або діабетичних) із порушеним процесом загоювання. Здатність нейропептидних інгібіторів та антагоністів до пригнічення дії спінозаду на судинний кровотік дозволяє припустити, що здатність спінозаду до раннього загоювання ран реалізується через чутливі нервові провідні шляхи і залучає комбінацію нейропептидів. Така активність стимулювала б ранню запальну стадію процесу загоєння ран, яка ініціюється, головним чином, активністю чутливих нервів (Стейнхоф (Steinhoff) та інші, Arch. Dermatol., 139:1479-1488 (2003)). Дійсно, дані Прикладу 3 показують, що у нормальних молодих пацюків і у пацюків із пору Відсоток внеску ефектора до судинної реакції спінозаду 100 24 27 34 шеним процесом загоювання вплив спінозаду на стягування ран є явно вираженим впродовж перших 5 днів загоювання. с) Вплив спінозаду на судинну реакцію на ранній та пізній фазах гострого запалення Нейрогенні запальні реакції оцінюють за допомогою добре розробленого способу (Халіл (Khalil), Хелм (Helme), Brain Res., 527:292-298 (1990)). Аутбредних пацюків-самців лінії Sprague-Dawley анестезують пентобарбітоном натрію (60 мг/кг внутрішньоочеревинно). Загальну анестезію підтримують додатковими ін'єкціями 15 мг/кг. Було показано, що цей спосіб анестезії не змінює основних судинорозширювальних реакцій периферичної мікроциркуляторної частини судинного русла (Халіл (Khalil), Хелм (Helme), Brain Res., 500:256-262 (1989)). Ліву яремну вену канюлюють поліетиленовою трубкою для внутрішньовенного введення розчину гепарину/фізіологічного розчину або лікарських засобів. Температуру тіла підтримують на рівні 37°С. Після завершення експерименту тварин умертвляють підвищеною дозою барбітурату. Пухирі спричинюють на середній частині задньої лапки у анестезованих пацюків за допомогою вакууму (-40 кПа впродовж 30 хв) через металеві присисні насадки, нагріті до температури 40°С. Після появи пухирів епідерміс (поверхневий епітелій) видаляють, і над основою пухиря закріплюють плексигласову камеру із вхідним і вихідним отворами. Для визначення вихідних показань, над поверхнею пухиря за допомогою перистальтичного насоса з витратою 4 мл/год пропускають розчин Рінгера-Локка. Відносний часовий кровотік контролюють за допомогою лазерного доплервитратоміра через зонд, розміщений безпосередньо над основою пухиря, а відносне надлишкове виділення крові (вольти) постійно контролюють за допомогою самописа. Спінозад розбавляють у 5% лимонній кислоті у розчині Рінгера-Локка, і пропускають над основою пухирів впродовж періоду часу до 30 хв. Над пухирем на подушечці однієї лапки кожного пацюка негайно пропускають спінозад (рання фаза), у той час як над пухирем на подушечці іншої лапки пропускання розпочинають лише через 5 год після спричинення пухиря (пізня фаза). 29 88295 30 Таблиця 10 Вплив 0,5% розчину спінозаду на судинну реакцію пухирів на подушечках лапок впродовж ранньої (негайно після пошкодження) та пізньої (5 год після пошкодження) фаз гострого запалення Фаза запалення Площа під кривою (см2) Середнє значення±середня квадратична помилка середнього, n=6 Нейрогенні ефектори залучені, головним чином, до ранньої фази запальної реакції, у той час як пізня фаза запальної реакції залучає такі складові імунної системи, як нейтрофіли та моноцити. Те, що спінозад має майже однаковий вплив на ранній і пізній фазах запальної реакції (Таблиця 10) дозволяє припустити, що спінозад діє не лише на нейрогенні медіатори запалення (також показано у Прикладі 4b), але має також значний вплив на імунологічні медіатори запальної реакції. Цей результат є суттєвим унаслідок залучення імунних Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Рання фаза 113,6 (±9,4) Пізня фаза 95,5 (±9,3) медіаторів до рекрутменту і активації клітин впродовж проліферативної і реконструктивної фаз процесу загоювання ран (дні 6-12). Як вказувалось вище у Прикладі 3, вплив спінозаду на процес загоювання ран спостерігається на запальній, проліферативній і реконструктивній фазах. Дані цього прикладу надають свідчення того, що спінозад стимулює як нейрогенні, так і імунологічні шляхи для опосередкування свого ефекту загоювання ран. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601