Вакцина для захисту від lawsonia intracellularis

Реферат: Винахід стосується застосування неживої композиції, що містить вуглевод, при цьому цей вуглевод також виявляється у живих клітинах Lawsonia intracellularis у зв'язку із зовнішньою клітинною мембраною цих клітин, для виробництва вакцини для захисту від інфекції Lawsonia intracellularis, при цьому вакцина має форму, призначену для системного введення. UA 100047 C2 (12) UA 100047 C2 UA 100047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід належить до вакцини для захисту від інфекції Lawsonia intracellularis, при цьому вакцина у цьому сенсі являє собою композицію, яка принаймні забезпечує зменшення негативного впливу інфекції Lawsonia intracellularis, причому такий негативний вплив - це, наприклад, пошкодження тканин та/ або клінічні ознаки, такі як зниження приросту ваги, діарея тощо. Проліферативна ентеропатія (також називається ентерит або ілеїт) у багатьох тварин, особливо у свиней, представляє клінічну ознаку та патологічний синдром з гіперплазією слизової оболонки незрілих криптогенних епітеліальних клітин, переважно у кінцевій клубовій кишці. Інші ділянки кишечнику, які можуть бути ураженими, включають порожню кишку, сліпу кишку та товсту кишку. На поросят та молодих дорослих свиней особливо впливають звичайні клінічні прояви, такі як швидка втрата ваги та зневоднення. Природна клінічна хвороба у свиней виникає в усьому світі. Хвороба загальноприйнято пов'язується з присутністю внутрішньоклітинних кривих бактерій, які зараз відомі як Lawsonia intracellularis. Взагалі, було продемонстровано, що пероральна вакцинація проти Lawsonia intracellularis є економічно ефективним засобом для контролю ілеїту та дозволяє краще застосовувати генетичний потенціал росту свині (Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3.0, July 2006; доступний від Boehringer Ingelheim). Крім того, пероральна вакцинація, на відміну від парентеральної вакцинації, зменшить передачу інфекцій, що переносяться з кров'ю, таких як PRRS, через багаторазові голки та дозволить запобігти реакцій на ділянці ін'єкції та біля голок, що утримуються у тушах. Вона дозволить зменшити стрес тварини та людини, знизити витрати часу та праці та зусилля порівняно з індивідуальною вакцинацією (McOrist: "Ileitis-One Pathogen, th Several Diseases" в IPVS Ileitis Symposium in Hamburg, June 28 , 2004). Звичайно зрозуміло, що перевага введення ослабленої живої вакцини полягає у тому, що ефективність імунітету є зазвичай відносно гарною, оскільки імунна система хазяїна піддається впливу усіх антигенних властивостей організму у більш "природній" манері. Особливо для внутрішньоклітинних бактеріальних агентів, таких як Lawsonia intracellularis, вважається, що введення ослабленої живої вакцини надає найкращий доступний захист для вакцинованих тварин завдяки повній та відповідній імунній реакції на основі Т-клітин. Це відрізняється від мінливого та поганого імунітету, пов'язаного з типами вбитої вакцини або вакцини-субодиниці для внутрішньоклітинних бактерій. Це також є особливо вірним для суворих внутрішньоклітинних бактерій, таких як Lawsonia intracellularis або Chlamydia sp, які спричиняють патогенні інфекції усередині слизової оболонки. Дослідження показують, що цілі живі ослаблені форми внутрішньоклітинних бактерій, що розглядаються, найкращим чином доставляються до слизової оболонки-мішені, що вони є необхідними як цілі живі бактеріальні форми для виробництва повної захисної імунної реакції у слизовій оболонці-мішені, проте також що вони є імунологічно переважними порівняно із застосуванням часткових бактеріальних компонентів. Стало загально зрозумілим, що вакцину проти Lawsonia intracellularis необхідно вводити перорально (дивись, наприклад, Technical Manual 3.0, на що є посилання вище у цьому описі). Підставою для цього є той факт, що основою стійкості організму до ілеїту є місцевий імунітет у кишечнику, який є продуктом клітинного імунітету та місцевого захисту завдяки антитілам, особливо IgA. Згідно з сучасними знаннями, сироваткові антитіла (IgG) не надають будь-якого захисту просто тому, що вони не досягають кишкової порожнини. Було продемонстровано у дослідженнях, що внаслідок пероральної вакцинації виробляється клітинний імунітет, а також відбувається місцеве виробництво IgA у кишечнику (Murtaugh, в Agrar- und Veterinär-Akademie, Nutztierpraxis Aktuell, Ausgabe 9, Juni 2004; та Hyland et al. в Veterinary Immunology and Immunopathology 102 (2004) 329-338). На відміну від цього, внутрішньом'язове введення не приводить до захисту. Крім того, поряд із загальним розумінням того, що успішна вакцина проти внутрішньоклітинних бактерій мусить індукувати клітинний імунітет, а також виробництво місцевих антитіл, досвідчені фахівці-практики знають, що лише дуже низький відсоток антигенів, що перетравлюються перорально, насправді абсорбуються ентероцитами та що включення Lawsonia intracellularis у клітину - це активний процес, який розпочинає ця бактерія. Отже, внаслідок введення інактивованої вакцини у кишечнику буде вироблятися недостатня кількість імуногенного антигену (Haesebrouck et al. в Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268). Ось чому вважають, що тільки ослаблені живі вакцини індукують достатній клітинний захист у клітинах кишечнику (дивись Technical Manual 3.0, на що є посилання вище у цьому описі). На цей час на ринку існує тільки одна вакцина для захисту від Lawsonia intracellularis, а саме Enterisol® Ileitis, яка продається на ринку компанією Boehringer Ingelheim. Ця вакцина - це жива вакцина дійсно для перорального введення. Мета цього винаходу - створення альтернативної вакцини для захисту від інфекції Lawsonia intracellularis. З цією метою було вирішено застосовувати неживу композицію, що містить 1 UA 100047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вуглевод, при цьому вуглевод також виявляється у живих клітинах Lawsonia intracellularis у зв'язку із зовнішньою клітинною мембраною цих клітин, для виробництва вакцини для захисту від інфекції Lawsonia intracellularis, при цьому вакцина має форму, придатну для системного введення. Несподівано, незважаючи на стійке загальне розуміння того, як боротися з Lawsonia intracellularis, було знайдено, що, застосовуючи неживу композицію, яка містить вуглевод, наприклад, здобутий із зовнішньої клітинної мембрани Lawsonia intracellularis, як антиген у вакцині, можна індукувати захист від Lawsonia intracellularis, який є порівняльним або навіть ® покращеним відносно захисту, забезпечуваного застосуванням живої вакцини Enterisol Ileitis (яка вводиться згідно з відповідними інструкціями), коли антиген вводиться системно, тобто способом, при якому він потрапляє до серцево-судинної системи організму (яка включає серцево-судинну та лімфатичну систему), тим самим впливаючи на організм в цілому, а не на специфічне місце, таке як шлунково-кишковий тракт. Системне введення можна виконувати, наприклад, шляхом введення антигенів у м'язову тканину (внутрішньом'язово), у шкіру (інтрадермально), під шкіру (підшкірно), під слизову оболонку (підслизово), у вени (внутрівенно) тощо. Окрім дуже гарного захисту, який можна отримати, важлива перевага цієї неживої вакцини полягає у тому, що їй притаманна безпека порівняно з живою вакциною. Взагалі, композицію, що містить вуглевод, можна застосовувати для виробництва вакцини із використанням відомих у галузі способів, які по суті включають змішування антигенної композиції, що містить вуглевод (або композиції, що походить з неї, такої як розведення, або концентрат оригінальної композиції, або екстракт, один або більше очищених компонентів тощо), з фармацевтично прийнятним носієм, наприклад, рідким носієм, таким як вода (необов'язково з буфером), або з твердим носієм, таким як носій, який традиційно застосовується для отримання ліофілізованих вакцин. По суті, виробництво може відбуватися у промислових умовах, проте також антигени можна змішати з іншими складниками вакцини на місці (тобто, у ветеринарній клініці, на фермі тощо), наприклад, (безпосередньо) перед початком дійсного введення тварині. У вакцині антигени повинні бути присутніми в імунологічно ефективній кількості, тобто у кількості, що є спроможною стимулювати імунну систему тваринимішені на рівні, достатньому принаймні для зменшення негативної дії зараження мікроорганізмами живого типу після вакцинації. Залежно від призначення або необхідних властивостей вакцини необов'язково додають інші речовини, такі як ад'юванти, стабілізатори, загусники або інші складники. Для системної вакцинації придатними є багато форм, зокрема рідкі фармацевтичні склади (з розчиненими, емульсованими або суспендованими антигенами), а також тверді фармацевтичні склади, такі як імплантати, або проміжна форма, така як твердий носій для антигену, суспендованого у рідині. Системна вакцинація, зокрема парентеральна вакцинація (тобто не через травний шлях), та придатні (фізичні) форми вакцин для системної вакцинації відомі протягом більш ніж 200 років. Слід відзначити, що про субодиниці клітин Lawsonia intracellularis повідомлялося як про антигени у вакцині для захисту від цієї бактерії. Проте, вони є здебільшого рекомбінантними білками, та тому не було доведено, що будь-який з них є спроможнім надавати належного захисту. Також припускається, що вбиті бактерії (які, по суті, містять вуглевод, який також виявляється у живих клітинах Lawsonia intracellularis у зв'язку із зовнішньою клітинною мембраною) є антигенами у вакцинах проти Lawsonia intracellularis, проте жодну вакцину на основі вбитих цілих клітин насправді не тестували, та про них не повідомлялося, що вони надають гарного захисту. Окрім цього, системне введення не застосовувалося у зв'язку з цими вбитими бактеріями, тому що існує загальне розуміння того, що нема підстав сподіватися на успіх для системного введення антигенів з метою місцево (тобто, у кишечнику) подолати Lawsonia intracellularis. У цьому відношенні слід відзначити, що у WO 97/20050 (Daratech PTY Ltd) згадується про застосування вбитих бактерій Lawsonia intracellularis для імунізації свиней. Проте, системне введення не згадується. На підставі сучасного уявлення про те, що вакцинація є ефективною тільки після перорального введення, є загально зрозумілим, що пероральний спосіб введення був способом введення, обраним для експериментів, описаних у заявці Daratech. Інша патентна заявка, у якій згадується про вбиті бактерії, - це WO 2005/011731 (Boehringer Ingelheim). Проте, насправді описано тільки застосування живої вакцини, яка вводиться перорально. Не показано, що вбита вакцина може бути ефективною, не говорячи вже про те, що вбиту вакцину можна вводити системно. В ЕР 843818 (Boehringer Ingelheim) описується внутрішньом'язове введення вбитої вакцини (параграф [0115] у комбінації з параграфом [0119]). У параграфі [0115] стверджується, що бактерій вбили шляхом зберігання їх при 4 °C при нормальних атмосферних умовах. Проте, як загально відомо, за таких умов бактерії Lawsonia intracellularis виживають. Отже, цей документ не надає ідеї цього винаходу. Слід також відзначити, що про композицію, 2 UA 100047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 яка містить вуглевод, причому вуглевод також виявляється у живих клітинах Lawsonia intracellularis у зв'язку із зовнішньою клітинною мембраною цих клітин, відомо з роботи Kroll et al. (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, June 2005, 693-699). Проте, ця композиція використовується для діагностики. Її не випробовували як захисний антиген з причин, про які повідомляється вище у цьому описі. У варіанті здійснення композиція, яка містить вуглевод, - це матеріал, отриманий внаслідок спричинення смерті бактерій Lawsonia intracellularis. Було визначено, що дуже зручним способом отримання вуглеводу для застосування згідно з цим винаходом є просто вбити клітини Lawsonia intracellularis та застосовувати отриманий внаслідок цього матеріал як джерело вуглеводу. Теоретично можна здобути вуглевод з живих клітин (аналогічно до утворення живих клітин-хазяїнів шляхом видалення клітинної стінки), проте для цього потрібні більш складне та, внаслідок цього, більш дороге технологічне устаткування. Цей матеріал у цілковитому вигляді можна застосовувати, наприклад, як суспензію цілих клітин або як лізат клітин Lawsonia intracellularis, або можна очистити або навіть відокремити вуглевод від матеріалу. Цей спосіб можна виконувати, застосовуючи відносно просте технологічне устаткування, відоме у галузі. У переважному варіанті здійснення композиція, що містить вуглевод, містить цілі клітини вбитих бактерій Lawsonia intracellularis. Було доведено, що це є найбільш зручним способом отримання вуглеводу як антигену у вакцині. Крім того, ефективність вакцини навіть далі підвищується, можливо тому, що цей спосіб надання антигену імунній системі тварини-мішені кращим чином імітує природне середовище вуглеводу. У варіанті здійснення вакцина включає ад'ювант "олива-у-воді", який містить краплі оливи субмікрометрового розміру. Зазвичай, ад'ювант є неспецифічним імуностимулюючим агентом. В принципі, як ад'ювант, можна визначити будь-яку речовину, яка є спроможною сприяти або підсилювати певний процес у каскаді імунологічних подій, які зрештою індукують кращу імунологічну реакцію (тобто, комплексну реакцію організму на антиген, зокрема реакцію, яка опосередковується лімфоцитами та яка зазвичай залучає розпізнавання антигенів специфічними антитілами або заздалегідь синтезованими лімфоцитами). Було показано, що застосування ад'юванту "олива-у-воді", який містить краплі оливи субмікрометрового розміру, надає дуже гарного захисту від Lawsonia intracellularis. Насправді, застосування ад'ювантів "олива-у-воді", як таких, є звичайним для неживих антигенів. Проте, взагалі відомо, що найкращих імуностимулюючих властивостей досягають, коли краплі оливи мають великий діаметр. Зокрема, краплі оливи діаметром, меншим ніж 1 мікрометр, особливо застосовуються, коли вважають, що безпека - це важлива проблема. У цьому випадку можна застосовувати дрібні краплі, оскільки відомо, що вони спричиняють менше пошкодження тканин, менші клінічні ознаки тощо. Проте, у випадку надання захисту від пов'язаного з кишечником розладу за допомогою системної вакцинації (як у випадку цього винаходу), оберуть великі краплі, оскільки очікується, що імунна реакція повинна суттєво підсилитися. На відміну від цього, ми визначили, що наслідком застосування дрібних крапель оливи у композиції було отримання дуже гарних результатів стосовно захисту від Lawsonia intracellularis. У більш переважному варіанті здійснення ад'ювант включає краплі оливи, здатної до біологічного розкладання, та краплі мінеральної оливи, при цьому краплі оливи, здатної до біологічного розкладання, мають середній розмір, який відрізняється від середнього розміру крапель мінеральної оливи. Було показано, що застосування суміші оливи, здатної до біологічного розкладання, та мінеральної оливи надає дуже гарних результатів стосовно ефективності та безпеки. У додаток до цього, стійкість композиції є дуже високою, що є важливою економічною перевагою. Було доведено, що стабільність є дуже гарною, зокрема, коли середній (оцінений за об'ємом) розмір або крапель оливи, здатної до біологічного розкладання, або мінеральних крапель становить менш ніж 500 нм (переважно приблизно 400 нм). У варіанті здійснення вакцина далі включає антигени Mycoplasma hyopneumoniae та свинячого цирковірусу. До цього часу у попередньому рівні техніки було запропоновано комбінаційні вакцини Lawsonia intracellularis. Проте, небагато таких комбінацій дійсно випробовували стосовно їхньої ефективності. Причина цього полягає у тому, що зазвичай зрозуміло, що наслідком комбінації антигенів з антигенами Lawsonia intracellularis може бути успішний захист, тільки якщо антигени Lawsonia застосовуються як живі (ослаблені) клітини. Стосовно цього ми посилаємося на WO 2005/011731, де також пропонуються усі види комбінаційних вакцин на основі Lawsonia intracellularis. Проте, що стосується опису та структури формули винаходу цієї патентної заявки, здається, що правонаступник (Boehringer Ingelheim) є переконаним у тому, що очікувати, що комбінаційні вакцини мають обґрунтований шанс на 3 UA 100047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 успіх, можна тільки тоді, коли антигени Lawsonia є присутніми у формі живих клітин. Те ж саме є справедливим і для WO 2006/099561, який також належить Boehringer Ingelheim. Дійсно, на підставі звичайного загального знання це є очевидним. Винахід буде далі пояснено із застосуванням наступних прикладів. Приклад 1 описує спосіб отримання композиції, яка містить вуглевод та є суттєво вільною від білка, та вакцини, яка виробляється із застосуванням цієї композиції. Приклад 2 описує експеримент, у якому друга вакцина згідно з цим винаходом порівнюється з вакциною, яка зараз є на ринку, та з експериментальною вакциною, яка включає білки субодиниць Lawsonia intracellularis. Приклад 3 описує експеримент, у якому дві різні вакцини згідно з цим винаходом порівнюються з вакциною, яка зараз є на ринку. Приклад 4 описує експеримент, у якому встановлюється вплив дозування вакцини згідно з винаходом. Приклад 1 У цьому прикладі описується спосіб отримання суттєво вільної від білків композиції, яка містить вуглевод, пов'язаний із зовнішньою клітинною мембраною клітин Lawsonia intracellularis, та вакцини, яку можна виготовити, застосовуючи цю композицію. Взагалі, вуглевод - це органічна сполука, що містить вуглець, водень та кисень, зазвичай у співвідношенні 1:2:1. Прикладами вуглеводів є цукри (сахариди), крохмалі, целюлози та камеді. Зазвичай вони служать як головне джерело енергії при харчуванні тварин. Lawsonia intracellularis - це грамнегативна бактерія, яка, відповідно, містить зовнішню мембрану, яка побудована не тільки з фосфоліпіду та білка, проте також містить вуглеводи, зокрема полісахарид (зазвичай полісахариди, такі як ліпополісахарид, ліпоолігосахарид або навіть полісахариди, що не містять ліпідів). Вуглеводна фракція для приготування вакцини Взяли двадцять мілілітрів води з буфером (0,04 М PBS, сольовий розчин з фосфатним 8 буфером), яка містила клітини Lawsonia intracellularis у концентрації 3,7 Е8 (= 3,7×10 ) клітин/мл. Клітини лізували, витримуючи їх при 100 °C протягом 10 хвилин. Протеїназу К (10 мг/мл) у 0,04 М PBS додавали, доки не отримали кінцевої концентрації 1,7 мг/мл. Цю суміш інкубували при 60 °C протягом 60 хвилин з метою руйнування усіх білків та зберігання вуглеводів недоторканими. Після цього суміш інкубували при 100 °C протягом 10 хвилин, щоб інактивувати протеїназу К. Отриманий матеріал, який є композицією, яка містить вуглевод, зокрема містить вуглеводи, які є присутніми у живих бактеріях Lawsonia intracellularis у зв'язку з їхньою зовнішньою клітинною мембраною (дивись параграф нижче), зберігали при 2-8 °C до подальшого застосування. Композицію склали в ад'юванті Diluvac forte. Цей ад'ювант (дивись також ЕР 0 382 271) включає7,5 масових відсотків крапель ацетату вітаміну Е, середній розмір яких оцінений відносно об'єму становить приблизно 400 нм, суспендованих у воді та стабілізованих 0,5 масовими відсотками Tween 80 (поліоксіетилену сорбітанмоноолеат). Кожен мілілітр вакцини містив матеріал, який здобули з 1,2Е8 клітин Lawsonia intracellularis. Імунна преципітація вуглеводних антигенів Lawsonia Дві партії моноклональних антитіл (МоАb), утворених проти цілої клітини Lawsonia intracellularis, осадили насиченою Na2SO4 при кімнатній температурі згідно зі стандартними процедурами. Преципітат гранулювали шляхом центрифугування (10000 g протягом 10 хвилин). Гранули промили 20 % Na2SO4 та знов суспендували у 0,04 М PBS. Активовані тилозилом гранули Dynal (DynaBeads, DK) заздалегідь промили 0,1 М NaPO 4 (рН 7,4) згідно з інструкцією виробника. З кожної партії взяли 140 мкг МоАb та додали до попередньо промитих гранул 2Е8 та інкубували протягом ночі при 37 °C. Гранули гранулювали шляхом центрифугування та незв'язані МоАb видалили шляхом аспірації надосадової рідини. Спектрофотометричні вимірювання показали, що від 20 до 35 % доданих МоАb зв'язалися з гранулами. Дві партії 1 мл клітин Lawsonia intracellularis (3,7Е8/мл) у 0,04 М PBS руйнували ультразвуком протягом 1 хвилини. Отримані клітинні лізати додали до активованих тилозилом гранул-моноклональних комплексів та інкубували протягом ночі при 4 °C. Активовані тилозилом гранули-моноклональні комплекси промили тричі 0,1 M NaPO4 (рН 7,4). Зв'язані сполуки елюювали шляхом послідовного промивання гранул у 0,5 мл 8М сечовини у 0,04 М PBS (Е1); 0,5 мл 10 мМ гліцину рН 2,5 (Е2) та 0,5 мл 50 мМ НСl (Е3). Після елюювання Е2 та Е3 нейтралізували або 100 мкл, або 200 мкл 1М Tris/HCl (pH 8,0). Зразки узяли з кожного етапу та завантажили на гель SDS-PAGE. Гель забарвили, застосовуючи барвники Commassie Brilliant Blue (CBB) та Silver, або зразки піддали блотингу. Блоти утворили, застосовуючи такі самі МоАb, які згадуються вище у цьому описі. Обстеження зразків гелю та блотів показало, що МоАb розпізнавали смуги з видимою молекулярною масою 21 та 24 кДа, які не були видимими 4 UA 100047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 на гелях СВВ, проте були видимими на гелях, забарвлених Silver. Також, визначили, що фракція клітин, які зв'язуються з МоАb, була стійкою до протеїнази К. Отже, на підставі цих результатів можна зробити висновок, що ця фракція містить вуглеводи (а саме: увесь білок є лізованим, та зруйновані ультразвуком фракції ДНК не будуть демонструвати очевидну смугу у барвнику Silver) та що вуглеводи знаходяться у зв'язку (тобто утворюють частину або є зв'язаними з) із зовнішньою клітинною мембраною Lawsonia intracellularis (а саме: МоАb, що утворилися проти цієї фракції також розпізнавали цілі клітини Lawsonia intracellularis). Враховуючи той факт, що Lawsonia intracellularis - це грам-негативна бактерія, вважають, що вуглеводна композиція включає полісахарид(и). Приклад 2 Цей експеримент здійснювали, щоб випробувати зручний спосіб включення вуглеводного антигену у вакцину, а саме за допомогою вбитої цілої клітини (також називається бактерин). Як ® контрольні застосовували комерційно доступну вакцину проти ілеїту Enterisol Ileitis та експериментальну вакцину з субодиниць, яка включає субодиниці білку. Після цього як контрольні застосовували невакцинованих тварин. Схема експерименту Прикладу 2 Інактивовану вакцину з цілих клітин отримали наступним способом. Зібрали живі клітини Lawsonia intracellularis, які походять з кишечнику свиней зі свинячою проліферативною ентеропатією (РРЕ). Клітини інактивували 0,01 % BPL (бета-пропіолактоном). Отриманий матеріал, який по суті є неживою композицією, що містить вуглевод, у сенсі цього винаходу (зокрема тому, що вона містить вуглеводи, які є присутніми у живих бактеріях Lawsonia intracellularis у зв'язку з їхньою зовнішньою клітинною мембраною), використали для складання 8 суміші в ад'юванті Diluvac forte (дивись Приклад 1) у концентрації приблизно 2,8×10 клітин на мл вакцини. Вакцина субодиниць містила рекомбінатні білки Р1/2 та Р4, що відомо з ЕР 1219711 (білки розміром 19/21 та 37 кДа, відповідно), та ці рекомбінатні білки експресувалися генами 5074, 4320 та 5464, як описано у WO 2005/070958. Білки використали для складання суміші в ад'юванті Diluvac forte. Вакцина містила приблизно 50 мкг кожного з білків на мілілітр. Застосовували свиней SPF віком 6 тижнів. Свиней розподілили на 4 групи по 10 свиней на кожну. Групу 1 вакцинували один раз перорально (при Т=0) 2 мл живої вакцини проти ілеїту "Enterisol® Ileitis" (Boehringer Ingelheim) згідно з інструкціями виробника. Групи 2 та 3 вакцинували двічі внутрішньом'язово (при Т=0 та Т=4 тижні) 2 мл інактивованої вакцини цілих клітин Lawsonia та комбінаційною вакциною рекомбінантних субодиниць, які описані вище у цьому описі, відповідно. Групу 4 залишили без вакцинації як контрольну. При Т=6 тижнів усіх свиней піддали перорально контрольному зараженню гомогенізованим слизом, інфікованим Lawsonia intracellularis. Після цього усіх свиней щоденно обстежували стосовно клінічних ознак свинячої проліферативної ентеропатії (РРЕ). Регулярно до та після контрольного зараження у свиней брали зразки сироватки крові (для серологічного дослідження) та фекалій (для ПЛР). При Т = 9 тижнів усіх свиней умертвили та здійснили розтин трупів. Взяли гістологічні зразки клубової кишки та досліджували їх під мікроскопом. Інокулят для контрольного зараження отримали з інфікованого слизу: 500 грамів інфікованого слизу (зіскрібок з інфікованого кишечнику) змішали з 500 мл фізіологічного сольового розчину. Цю суміш гомогенізували у повсюдному змішувачі протягом однієї хвилини на повній швидкості на льоду. Усім свиням для контрольного зараження ввели перорально по 20 мл інокуляту контрольного зараження на Т = 6 тижнів. При Т = 0, 4, 6, 7, 8 та 9 тижнів зразки фекалій (у кількості декількох грамів) та зразки сироватки крові взяли від кожної свині та зберігали замороженими до початку тестування. Зразки фекалій тестували за допомогою кількісної ПЛР (Q-PCR) та представили як логарифм кількості, визначеної у пікограмах (пг). Зразки сироватки тестували за допомогою реакції імунофлюоресценції (IFT), що зазвичай застосовується (реакції імунофлюоресценції антитіла для виявлення антитіл проти цілих клітин Lawsonia intracellularis у сироватці). Для серологічного рахування взяли відповідний зразок клубової кишки, зафіксували його у 4 % формаліні з буфером, звичайним способом залили та порізали на мікроскопічні препарати. Ці мікроскопічні препарати забарвили гематоксиліном-еозином (барвником НЕ) та імуногістохімічним барвником, застосовуючи моноклональні антитіла проти Lawsonia intracellularis (барвник ІНС). Мікроскопічні препарати досліджували під мікроскопом. Гістологічні показники є наступними: 5 UA 100047 C2 5 10 15 Барвник НЕ: жодної аномалії не виявлено показник = 0 сумнівне ураження показник = 1/2 легке ураження показник = 1 помірне ураження показник = 2 суворе ураження показник = 3 Барвник ІНС: не помітили бактерії L. intracellularis показник = 0 сумнівна присутність бактерій показник = 1/2 присутність єдиної/невеликої кількості бактерій у препараті показник = 1 присутність помірної кількості бактерій у препараті показник = 2 присутність великої кількості бактерій у препараті показник = 3 Усі дані зареєстрували індивідуально для кожної свині. Показник на групу розрахували як середню кількість позитивних тварин для різних параметрів після введення контрольного зараження. Непараметричний U-критерій Манна-Уїтні (Mann-Whitney) застосовували для визначення статистичної значущості (розрахували за двостороннім критерієм, та рівень значущості встановлено на 0,05). Результати Прикладу 2 Серологія До початку першої вакцинації в усіх свиней сироватка була негативною стосовно титрів антитіла за IFT. Після вакцинації бактерином цілих клітин (група 2) у свиней розвинулися високі титри антитіла за IFT, проте контрольні свині та свині, вакциновані вакциною субодиниць, залишилися негативними після контрольного зараження (Таблиця 1). У двох свиней з групи, ® вакцинованої вакциною Enterisol (група 1), розвинулися помірні титри за IFT, проте сироватка усіх інших свиней з цієї групи залишилася негативною. Після контрольного зараження в усіх свинях розвинулися високі титри антитіла за IFT. Середні значення результатів наведено у таблиці 1 (з використовуваним розведенням, 1,0 був рівнем детекції на більш низькому боці). Таблиця 1 Середні показники титрів антитіл за IFT (2log) сироватки свиней після вакцинації та контрольного зараження Група 1 2 3 4 20 25 Т = 0 тижнів