Вакцина на основі lawsonia та способи її застосування

1. Спосіб забезпечення підвищеного захисту тварини проти інфекції, викликуваної Lawsonia intracellularis, що включає етапи: (а) вакцинації матері зазначеної тварини вакциною, що містить Lawsonia intracellularis, де матір вагітна зазначеною твариною, причому вакцинацію здійснюють на другій або третій стадії вагітності зазначеною твариною; (б) введення тварині в ефективній дозі вакцини на основі Lawsonia intracellularis до того, як тварина досягла 26 денного віку після народження. 2 (19) 1 3 96923 4 19. Спосіб забезпечення підвищеного захисту проти ілеїту в поросяти, який полягає в тому, що здійснюють вакцинацію свиноматки, вагітної зазначеним поросям, з використанням ефективної дози вакцини проти інфекції, викликуваної Lawsonia intracellularis, де вакцинацію свиноматки проводять на другій або третій стадії вагітності, причому свиноматку вакцинують тричі, причому першу вакцинацію здійснюють за 50-60 днів до опоросу зазначеним поросям, другу вакцинацію здійснюють за 30-40 днів до опоросу зазначеним поросям й третю вакцинацію здійснюють на 10-20 день до опоросу зазначеним поросям. 20. Спосіб за п. 19, у якому зазначену вакцинацію 3,0 здійснюють дозуванням принаймні від 3 х 10 до 3 9,0 х 10 доз зараження 50 % культури тканини (ДЗКТ50) живою модифікованою бактерією Lawsonia intracellularis. 21. Спосіб за п. 20, у якому зазначену вакцинацію 4,5 6,0 здійснюють дозуванням від 3 х 10 до 3 х 10 ДЗКТ50 живою модифікованою бактерією Lawsonia intracellularis. 22. Спосіб за п. 19, у якому зазначену вакцинацію здійснюють живою модифікованою бактерією Lawsonia intracellularis. 23. Спосіб за п. 22, у якому жива модифікована бактерія Lawsonia intracellularis є живою модифікованою бактерією, що включена в Enterisol Ileitis B3903. 24. Спосіб за будь-яким із пп. 19-23, який додатково включає етап введення в ефективній дозі вакцини на основі Lawsonia intracellularis до того, як порося досягло 26 денного віку після народження. 25. Спосіб за п. 24, у якому ефективна доза, яка 3 9 вводиться поросяті, містить від 10 до 10 бактерій Lawsonia intracellularis на дозу. 26. Спосіб за п. 24, у якому ефективна доза, яка вводиться поросяті, містить від 3,0 TCID50 до 6,0 TCID50 бактерій Lawsonia intracellularis на дозу. 27. Спосіб за п. 24, у якому поросяті вводять вакцину між 16 та 26 днями після народження. 28. Спосіб за п. 24, у якому поросяті вводять однократну дозу вакцини. 29. Медичне застосування антигену Lawsonia intracellularis в ефективній кількості для приготування лікарського засобу, призначеного для вакцинації молодих тварин з використанням в ефективній дозі вакцини, що має ефективність відносно забезпечення підвищеного захисту проти інфекції, викликуваної Lawsonia intracellularis, відповідно до якого здійснюють вакцинацію матері зазначеної молодої тварини лікарським засобом у той час, коли матір вагітна зазначеною молодою твариною, а саме на другій або третій стадії вагітності зазначеною молодою твариною, та здійснюють вакцинацію молодої тварини у віці щонайменше 10 днів, але молодше трьох тижнів. 30. Медичне застосування за п. 29, у якому молоді тварини являють собою поросят. 31. Медичне застосування за п. 29 або 30, у якому ефективна доза для вакцинації молодої тварини 3 9 містить від 10 до 10 бактерій на дозу. 32. Медичне застосування за будь-яким з пп. 2931, у якому ефективна доза для вакцинації молодої тварини містить від 3,0 TCID50 до 6,0 TCID50 на дозу. 33. Медичне застосування за будь-яким з пп. 2932, у якому молода тварина являє собою порося. 34. Медичне застосування за будь-яким з пп. 2933, у якому вакцину вводять молодій тварині щонайменше через 16 днів після народження. 35. Медичне застосування за будь-яким з пп. 2934, у якому вакцину вводять молодій тварині щонайменше через 19 днів після народження. 36. Медичне застосування за будь-яким з пп. 2935, у якому стадія вакцинації молодої тварини являє собою введення однократної дози вакцини. 37. Медичне застосування за будь-яким з пп. 2936, у якому стадія вакцинації являє собою стадію введення вакцини за допомогою приладу для вливання ліків у ротову порожнину тварини. 38. Медичне застосування за п. 29, у якому матір вакцинують повторними дозами вакцини до опоросу зазначеною молодою твариною. 39. Медичне застосування за п. 29 або 38, у якому матір вакцинують тричі, причому першу вакцинацію здійснюють за 50-60 днів до опоросу зазначеною молодою твариною. 40. Медичне застосування за п. 39, у якому другу вакцинацію здійснюють за 30-40 днів до опоросу зазначеною молодою твариною. 41. Медичне застосування за п. 39 або 40, у якому третю вакцинацію здійснюють за 10-20 днів до опоросу зазначеною молодою твариною. 42. Медичне застосування за п. 29 або 38-41, у якому вакцинацію здійснюють із використанням високої дози антигену Lawsonia intracellularis. 43. Медичне застосування за п. 42,у якому висока доза містить антиген Lawsonia intracellularis у кількості, щонайменше в три рази перевищуючій звичайні кількості антигену Lawsonia, використовувані у вакцинах. 44. Медичне застосування за п. 43, у якому антиген вибирають із групи, що включають модифіковані живі бактерії Lawsonia intracellularis, убиті бактерії Lawsonia intracellularis, одну або більше субодиниць бактерій Lawsonia intracellularis і їх комбінації. 45. Медичне застосування за п. 44, у якому модифіковані живі бактерії Lawsonia intracellularis вибирають із групи, що включає організми, депоновані під реєстраційними номерами ATCC PTA-4926 і ATCC 55783, і їх комбінації. Посилання на споріднену заявку За даною заявкою запитується пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США серійний номер 60/699946, зареєстрованої 15 лип ня 2005 р., суть і зміст якої включені в даний опис як посилання. Передумови створення винаходу Галузь техніки, до якої відноситься винахід 5 Даний винахід у широкому змісті відноситься до поліпшених способів вакцинації з метою імунізації проти проліферативного ентериту свиней, відомого як ілеїт, що викликається облігатною внутрішньоклітинною бактерією Lawsonia intracellularis (Lawsonia або L. intracellularis). Конкретний винахід відноситься до способів, які забезпечують підвищений захист проти L. intracellularis, що полягає у вакцинації вагітних свиноматок; вакцинації вагітних свиноматок і потім наступної вакцинації народжених ними молодих поросят протягом приблизно тритижневого періоду часу після народження; і вакцинації молодих поросят протягом періоду часу, що становить до 25 або 26 днів після народження відповідно. Опис існуючого рівня техніки Проліферативний ентерит свиней (ПЕС) являє собою захворювання, що зустрічається в природних умовах, що може вражати свиней у віці від відібрання до стадії молодої дорослої тварини. Було встановлено, що збудником цього захворювання є Lawsonia intracellularis, що представляє собою облігатну внутрішньоклітинну грамнегативну бактерію, яку не можна культивувати за допомогою звичайних бактеріологічних методів на стандартних безклітинних середовищах, і передбачається, що для свого росту їй необхідні клітини. В S. McOrist і ін., Infection і Immunity, тім 61 (19), 1993, стор. 4286-4292 і G. Lawson і ін., J. of Clinical Microbiology, тім 31 (5), 1993, стор. 11361142 описане культивування L. intracellularis з використанням моношарів щурячих епітеліальних клітин кишечнику лінії ІЕС-18 у стандартних колбах для культури тканини. В US 5714375 і US 5885823, які обоє включені в даний опис як посилання у всій повноті, описане культивування L. intracellularis у суспендованих клітинах-хазяїнах. З існуючого рівня техніки добре відомі патогенні й непатогенні ослаблені штами бактерії L. intracellularis. Наприклад, в WO 96/39629 і WO 05/011731 описані непатогенні ослаблені штами L. intracellularis. Інші ослаблені штами бактерії L. intracellularis описані в WO 02/26250 і WO 03/00665. Суть і зміст кожного із цих документів включені в даний опис як посилання. Захворювання відрізняється, насамперед, своєю макроскопічною й мікроскопічною патологією, а пізніше проявляється в присутності внутрішньоклітинних бактерій в уражених клітинах. Відмітною патологічною ознакою захворювання є проліферація незрілих епітеліальних клітин у криптах клубової кишки (кінцева область тонкого кишечнику), товстого кишечнику або їх обох. Зрізи інфікованої тканини характеризуються почервонілою стовщеною слизуватою оболонкою, що нагадує «садовий шланг», і ентеральними ушкодженнями. Стовщення кишки, зрештою, перешкоджає нормальній функції кишки, абсорбційній здатності й транспорту живильних речовин. Клінічними ознаками захворювання є хронічна втрата ваги, поганий розвиток, діарея, у результаті чого наступає смерть. Захворювання має важливе економічне значення, оскільки приводить до втрат поголів'я внаслідок загибелі, підвищеним витратам на лікування, слабкому приросту маси й зниженому пере 96923 6 творенню корму в уражених тварин. Клінічні випадки ілеїту проявляються найбільш помітно у свиней 6-20-тижневого віку. Однак присутність L. intracellularis було підтверджено (за допомогою ПЦР) у свиней відразу після відібрання (в 3-4тижневому віці), це дозволяє припустити, що контакт із L. intracellularis відбувається в розпліднику й, очевидно, обумовлений Lawsonia-позитивними свиноматками (Mauch і Bilkei, Vet Rec 155, 2004, с. 532; Marsteller і ін., Swine Health Prod 11, 2003, стор. 127-130; Stege і ін., Vet Micro 104, 2004, стор. 197-206). Ці дані підкреслюють важливість використання в системі виробництва стратегій профілактики, таких як вакцинація на більш ранніх стадіях. Існуючі в цей час стратегії вакцинації для імунізації проти ілеїту включають оральне введення вакцини незараженим Lawsonia свиням у віці тільки від трьох тижнів і старше, оскільки більш молоді поросята можуть мати материнські антитіла до L. intracellularis завдяки тому, що свиноматки піддавалися раніше впливу цієї бактерії або були вакциновані. До створення способу, пропонованого в даному винаході, існувала думка, що присутність материнських антитіл або інших лактогенних факторів може впливати (має місце інтерференція) на ефективність вакцинації таких поросят, оскільки материнські антитіла мають здатність нейтралізувати вакцину до того, як імунна система поросяти зможе розпізнати її й почати секретувати свої власні антитіла. Тому, беручи до уваги материнський імунітет, раніше не застосовували вакцинацію молодих поросят. Короткий виклад суті винаходу При створенні даного винаходу були переборені недоліки існуючого рівня техніки й розроблені нові способи, що забезпечують поліпшений захист свиней від ілеїту. Зокрема, у даному винаході запропонований спосіб введення в імунологічно ефективній кількості вакцини свиноматкам і/або молодим поросятам протягом декількох тижнів після народження для того, щоб імунізувати їх проти ілеїту. Було встановлено, що передача материнського імунітету від вакцинованих проти Lawsonia або підданих впливу цієї бактерії свиноматок поросятам забезпечує певний рівень захисту від ілеїту протягом щонайменше 6 тижнів після народження. Однак без вакцинації вони швидко стають чутливими до захворювання. За допомогою способів, пропонованих у даному винаході, несподівано було продемонстровано, що введення вакцини вагітній тварині у високих дозах, повторне введення доз і навіть, коли введення здійснюють на другій або третій стадіях вагітності, є безпечним і ефективним відносно створення материнського імунітету. Таким чином, даний винахід у цілому відноситься до способу вакцинації вагітних тварин (переважно свиней) проти інфекцій, викликуваних L intracellularis, що полягає в тому, що вагітних тварин вакцинують за допомогою антигену L. intracellularis. Відповідно до наступного об'єкта винаходу вакцинацію здійснюють із використанням високих доз і/або повторних доз антигену L. intracellularis. Ще один об'єкт даного винаходу відноситься до способу вакцинації вагітних тварин 7 (переважно свиней) проти інфекцій, викликуваних L. intracellularis, що полягає в тому, що вагітних тварин вакцинують на другій або третій стадіях вагітності, переважно цих вагітних тварин вакцинують із використанням високих доз і/або повторних доз антигену L. intracellularis. Кращим варіантом здійснення винаходу є спосіб вакцинації свиней проти ілеїту, що полягає в тому, що вагітній свиноматці вводять вакцину на основі Lawsonia щонайменше один раз перед опоросом і найбільш переважно три рази перед опоросом («повторні дози»). У деяких варіантах здійснення винаходу вагітних свиноматок вакцинують із використанням високих доз антигену L. intracellularis. Коли вакцину вводять свиноматці три рази, то перше введення варто здійснювати за 50-60 днів до опоросу, переважно за 52-58 днів до опоросу, і найбільш переважно за 54-56 днів до опоросу. Друге введення варто здійснювати за 3040 днів до опоросу, переважно за 32-38 днів до опоросу, і найбільш переважно за 34-36 днів до опоросу. Останнє введення варто здійснювати за 10-20 днів до опоросу, переважно за 12-18 днів до опоросу, і найбільш переважно за 14-16 днів до опоросу. Потім після того, як свиноматка дала потомство, вакцину вводять кожному поросяті в період часу від відібрання до вибою, але переважно до того, як вони досягнуть тритижневого віку, у кожному разі у віці щонайменше від 10 до 25-26 днів відповідно (переважно у віці від 16 до 26 днів), більш переважно у віці від 10 до 21 дня, ще більш переважно у віці від 15 до 21 дня, і найбільш переважно у віці від 19 до 21 дня. В іншому варіанті здійснення даного способу вакцину вводять кожному поросяті до 26-денного віку, переважно у віці від 16 до 26 днів, більш переважно у віці від 18 до 24 днів, ще більш переважно у віці від 19 до 22 днів, і найбільш переважно у віці 21 дня. Таким чином, ще один варіант здійснення даного винаходу відноситься до способу вакцинації вагітних свиноматок, а також народжених поросят. Переважно вагітних свиноматок і народжених поросят вакцинують, як описано вище. Крім того, несподівано було встановлено, що материнський імунітет не робить негативного впливу на успішну вакцинацію поросят відразу після народження, і фактично в поросят, вакцинованих протягом трьох тижнів після народження відповідно до описаного вище способу, макроскопічна патологія, пов'язана із захворюванням, проявляється в меншому ступені, чим у невакцинованих поросят. Таким чином, даний винахід відноситься до способу вакцинації молодих тварин (переважно молодих поросят) протягом трьох тижнів після народження проти інфекції, викликуваної L. intracellularis. Переважно таких молодих тварин (переважно молодих поросят) вакцинують у віці 21 ± 5 днів. Ще більш переважно таких молодих тварин (переважно молодих поросят) вакцинують у віці від 10 до 25 і 26 днів відповідно. Ще більш переважно таких молодих тварин (переважно молодих поросят) вакцинують у віці від 10 до 21 дня. Ще більш переважно таких молодих тварин (переважно молодих поросят) вакцинують у віці від 12 96923 8 до 21 дня відповідно. Ще більш переважно таких молодих тварин (переважно молодих поросят) вакцинують у віці від 15 до 21 дня, найбільш переважно у віці від 19 до 21 дня. В іншому варіанті здійснення цього способу вакцину вводять кожному поросяті до досягнення 26-денного віку, переважно у віці від 16 до 26 днів, більш переважно у віці від 18 до 24 днів, ще більш переважно у віці від 19 до 22 днів, і найбільш переважно у віці 21 дня. Вакцина, застосовувана згідно із даним винаходом, може являти собою будь-яку вакцину, що забезпечує захист від L. intracellularis. Переважно вакцина являє собою вакцину на основі живого вірусу L. intracellularis. Більш переважно вакцина являє собою Enterisol® Ileitis B3903 (фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Вакцину вводять тваринам, переважно ссавцям, і ще більш переважно свиням, будь-яким звичайним методом, найбільш переважно за допомогою приладу для уливання ліків у ротову порожнину тварини. Призначена для введення доза повинна варіюватися залежно від конкретної ситуації, але в кожному разі вона повинна являти собою кількість, достатню для індукції захисної гуморальної імунної відповіді й/або клітинно-обумовленої імунної відповіді проти ілеїту. Правильну дозу можна визначати методами, відомими в даній області без зайвих експериментів і вона повинна в більшості випадків залежати від застосовуваної вакцини. У багатьох випадках придатна добова доза становить від 0,1 до 10 мол, переважно приблизно від 1 до 5 мол. У випадку Enterisol® Ileitis доза переважно становить щонайменше 2 мол на свиню. Для неводних вакцин дози можна розраховувати також на основі співвідношення сухої маси вакцини й маси свині. Досліди, результати яких наведені нижче в прикладах, були проведені для оцінки ефективності вакцини для свиней, що народилися від свиноматок, підданих впливу Lawsonia intracellularis, і Lawsonia-негативних свиноматок. Крім того, у дослідженнях оцінювали, чи був який-небудь негативний материнський вплив, на вакцинацію поросят у тритижневому віці. Докладний опис винаходу Поняття «вакцинація» або «вакцинування» у контексті даного опису означає (але, не обмежуючись їм) процес, що полягає у введенні антигену L. intracellularis тварині, де антиген L. intracellularis, будучи уведеним тварині, викликає або може викликати імунну відповідь у тварини проти L. intracellularis. Поняття «тварина» у контексті даного опису відноситься (але, не обмежуючись ними) до птахів, риб й ссавців, таких як велика рогата худоба, свині, коні й примати. Однак, відповідно до одного з найбільш кращих варіантів здійснення даного винаходу тварина являє собою свиню, переважно поросяти віком від 10 до 25 і 26 днів відповідно, переважно віком від 10 до 21 дня, ще більш переважно віком від 15 до 21 дня, і найбільш переважно віком від 19 до 21 дня. В іншому кращому варіанті здійснення винаходу вік поросяти становить менш 26 днів, переважно вік становить від 16 до 9 26 днів, більш переважно вік становить від 18 до 24 днів, ще більш переважно вік становить від 19 до 22 днів і найбільш переважно вік становить 21 день. Поняття «ефективна доза» або «доза, що володіє ефективністю» у контексті даного опису означає (але, не обмежуючись цим) кількість антигену, що викликає або може викликати імунну відповідь у тварини, якій вводять антиген L. intracellularis у зазначеній ефективній дозі. «Імунологічна або імунна відповідь» на композицію або вакцину являє собою формування в хазяїні клітинної- і/або антитілопосередкованої імунної відповіді на композицію, що представляє інтерес, або вакцину. Таким чином, поняття «викликає або може викликати імунну відповідь» означає (але, не обмежуючись цим) імунологічний процес в організмі-хазяїні, що характеризується тим, що в хазяїна виробляється клітинна- і/або антитілопосередкована імунна відповідь на композицію, що представляє інтерес, або вакцину. Як правило, «імунна відповідь» включає (але, не обмежуючись ними) одну або більше з наступних реакцій: виробництво або активацію антитіл, Bклітин, Т-клітин-хелперів, Т-клітин-супресорів і/або цитотоксичних Т-клітин і/або yd-Т-клітин, спрямованих специфічно на антиген або антигени, включені в композицію, що представляє інтерес, або вакцину. Переважно організм-хазяїн повинен виробляти або терапевтичну, або захисну імунологічну відповідь так, щоб підвищувалася стійкість до нової інфекції й/або знижувалася клінічна серйозність захворювання. Така захисна дія можна виявляти або по зменшенню, включаючи зменшення серйозності, або по відсутності описаних вище симптомів, пов'язаних із зараженням хазяїна. Кількість антигену, що є ефективним відносно викликання імунної відповіді у тварини, залежить від інгредієнтів вакцини й від графіка введення. Як правило, коли у вакцині використовують убитий бактеріальний антиген, то вакцина містить від 3 9 приблизно 10 до приблизно 10 бактерій на дозу, 4 8 переважно від приблизно 10 до приблизно 10 бактерій на дозу, і ще більш переважно від приб5 6 лизно 10 до приблизно 10 бактерій на дозу. Зокрема, коли в комбінованих вакцинах використовують модифіковані живі бактерії L intracellularis, наприклад, ізоляти бактерій, позначені як ізолят В3903, реєстраційний номер АТСС РТА-4926, і ізолят N34NP40wk, реєстраційний номер АТСС 55783 (обидва ізоляти описані в WO 96/39629 і WO 05/011731), то рекомендована доза, що підлягає введенню чутливій тварині, переважно містить від приблизно 3,0 до приблизно 6,0 ТCID50 (кінцева середня цитопатогенна доза для культури тканини)/дозу і більш переважно від приблизно 4,0 до приблизно 5,0 ТСID50/дозу. У кращому варіанті здійснення винаходу титр вакцини становить приблизно 4,9 ТCID50/дозу при визначенні кінцевої середньої цитопатогенної дози для культури тканини методом розведень (ТCID50). Субодиниці вакцин, як правило, уводять із рівнем включення антигену, що становить щонайменше 0,2 мкг антигену на дозу, переважно від приблизно 0,2 до приблизно 400 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,3 до приблизно 200 96923 10 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,35 до приблизно 100 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,4 до приблизно 50 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,45 до приблизно 30 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,6 до приблизно 15 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 0,75 до приблизно 8 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,0 до приблизно 6 мкг/дозу, ще більш переважно від приблизно 1,3 до приблизно 3,0 мкг/дозу. Як правило, коли використовують очищені бактерії, то кількість антигену повинна становити від 2,0 9,0 5 до 5000 мкг, і від 10 до 10 ТCID50, переважно 3,0 6,0 від 10 до 10 TCID50, і більш переважно від 4,0 5,0 10 до 10 ТCID50. У контексті даного опису поняття «високі дози», як правило, означає щонайменше трикратну кількість антигену в порівнянні з кількістю, що втримується в одній дозі, звичайно застосовуваної для вакцинації дорослих тварин. Зокрема, поняття «високі дози» стосовно до живих модифікованих бактерій L. intracellularis означає кількість, що ста3,0 9,0 новить від щонайменше 310 до 310 ТCID50, 4,5 6,0 переважно приблизно від 310 до 310 ТCID50. Зокрема, стосовно вбитого антигену L. intracellularis поняття «високі дози» означає кіль4,0 кість, що становить щонайменше від 310 до 9,0 310 організмів або бактерій, переважно приб6,0 8,0 лизно від 310 до 310 організмів або бактерій. Зокрема, стосовно до будь-якої субодиниці антигену L. intracellularis поняття «високі дози» означає кількість, що становить щонайменше від 30,2 до приблизно 3400 (від 0,6 до приблизно 1200) мкг/дозу. При створенні даного винаходу антиген L. intracellularis у високих дозах уводили вагітним свиноматкам з метою індукції підвищеної імунологічної відповіді у вагітної свиноматки, що повинна передаватися потомству й забезпечувати певний рівень імунітету в народжених поросят. У контексті даного опису поняття «повторні дози» означає введення антигену L. intracellularis щонайменше двічі, переважно тричі. Приклади режимів вакцинації вагітних свиноматок з використанням «повторних доз» наведені вище. У контексті даного опису поняття «підвищений захист» означає (але, не обмежуючись цим) статистично достовірне зменшення ступеню серйозності або частоти зустрічальності одного або декількох клінічних симптомів і/або розвитку ушкоджень, пов'язаних з інфекціями, викликуваними L. intracellularis (наприклад, частоти зустрічальності макроскопічних ушкоджень, які визначають відповідно до методів і критеріїв, зазначеним у прикладі 1, і т.д.) у групі вакцинованих тварин, у порівнянні з контрольною групою невакцинованих тварин. Поняття «статистично достовірне зменшення клінічних симптомів» означає (але, не обмежуючись цим), що частота зустрічальності щонайменше одного клінічного симптому й/або розвитку ушкодження після контрольного зараження інфекційними бактеріями L. Intracellularis у групі вакцинованих тварин щонайменше на 20%, переважно на 30%, ще більш переважно на 40%, ще більш переважно на 50%, ще більш переважно на 60%, ще більш переважно на 70%, ще більш 11 переважно на 80%, ще більш переважно на 90%, і найбільш переважно на 95% менше, ніж у контрольній групі невакцинованих тварин. В контексті даного опису поняття «L. intracellularis» або «Lawsonia» відноситься до внутрішньоклітинних скривлених грамнегативних бактерій, докладно описаних в С Gebhart і ін., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, тім 43, №3, 1993, стор. 533-538 і є S. McOrist і ін., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, тім 45, №4, 1995, стор. 820-825, кожна публікація включена в даний опис як посилання у всій повноті, і включає (але, не обмежуючись ними) ізоляти, описані в WO 96/39629 і WO 05/011731. Зокрема, поняття «L. intracellularis» відноситься також (але, не обмежуючись ними) до ізолятів, депонованим відповідно до Будапештського договору в Американській колекції типових культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт. Віргінія, 20110-2209, під реєстраційним номером АТСС РТА 4926 або під реєстраційним номером АТСС РТА 55783. Обидва ізоляти описані в WO 96/39629 і WO 05/011731 відповідно. Поняття «L. intracellularis» відноситься також (але, не обмежуючись ними) до будь-якого іншого штаму або ізоляту бактерії, що переважно має імуногенні властивості щонайменше одного зі штамів L. intracellularis, описаних в WO 96/39629 і WO 05/011731, зокрема, володіє імуногенними властивостями щонайменше одного з ізолятів, депонованих відповідно до Будапештського договору в Американській колекції типових культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт. Віргінія, 201102209, під реєстраційним номером АТСС РТА 4926 або під реєстраційним номером АТСС РТА 55783. Штам або ізолят володіє «імуногенними властивостями» щонайменше одного зі штамів L. intracellularis, описаних в WO 96/39629 і WO 05/011731, зокрема, ізолятів, депонованих під реєстраційним номером АТСС РТА 4926 або реєстраційним номером АТСС 55783, якщо його можна виявляти з використанням щонайменше одного зі специфічних до L. intracellularis антитіл, описаних в WO 06/01294, за допомогою методу виявлення, також описаного в WO 06/01294. Переважно ці антитіла вибирають із антитіл, що мають посилальні номери 301:39, 287:6, 268:29, 110:9, 113:2 і 268:18. Переважно метод виявлення являє собою сендвич-ELISA, описаний у прикладах 2 і З WO 06/12949, у якому антитіло 110:9 використовують як імобілізоване антитіло й антитіло 268:29 використовують у якості кон'югованого антитіла. Всі антитіла, описані в WO 06/12949, одержують із використанням клітин гібридоми, депонованих у Центрі прикладної мікробіології й наукових досліджень (Centre for Applied Microbiology і Research (CAMR)) і в Європейській колекції клітинних культур (European Collection of Cell Cultures (ECACC)), Солсбері, Уилтшир SP4 OJG, Великобританія, як патентний депозит відповідно до Будапештського договору. Дата депонування: 11 травня 2004 р. Лінія клітин гібридоми 110:9 успішно депонована в ЕСАСС під реєстраційним номером 04092204. Лінія клітин гібридоми 113:2 успішно депонована в ЕСАСС під реєстраційним номером 04092201. Лінія клітин гібридоми 268:18 успішно депонована 96923 12 в ЕСАСС під реєстраційним номером 04092202. Лінія клітин гібридоми 268:29 успішно депонована в ЕСАСС під реєстраційним номером 04092206. Лінія клітин гібридоми 287:6 успішно депонована в ЕСАСС під реєстраційним номером 04092203. Лінія клітин гібридоми 301:39 успішно депонована в ЕСАСС під реєстраційним номером 04092205. Поняття «антиген L, intracellularis» у контексті даного опису відноситься (але, не обмежуючись ними) до будь-якої заявленої композиції, що містить щонайменше один антиген, що при введенні в організм тварини має здатність індукувати, стимулювати або підсилювати імунну відповідь на викликувану L. intracellularis інфекцію. Переважно антиген L. intracellularis являє собою повну бактерію L. intracellularis, насамперед у неактивованій формі (так звану вбиту бактерію), модифіковану живу або ослаблену бактерію L. intracellularis (так звану MLB), будь-яку субодиницю, поліпептид або компонент L intracellularis, або будь-який химерний вектор, що містить щонайменше одну імуногенну амінокислотну послідовність L. intracellularis. Поняття «імуногенний білок», «імуногенний поліпептид» або «імуногенна амінокислотна послідовність» у контексті даного опису відносяться до будь-якої амінокислотної послідовності, що викликає імунну відповідь у хазяїна проти патогена, що містить імуногенний білок, імуногенний поліпептид або імуногенну амінокислотну послідовність. Зокрема, поняття «імуногенний білок», «імуногенний поліпептид» або «імуногенна амінокислотна послідовність» L. intracellularis відноситься до будь-якої амінокислотної послідовності, що кодує антиген, що викликає імунологічну відповідь проти L intracellularis у хазяїна, якому вводять «імуногенний білок», «імуногенний поліпептид» або «імуногенну амінокислотну послідовність». «Імуногенний білок», «імуногенний поліпептид» або «імуногенна амінокислотна послідовність» у контексті даного опису включають (але, не обмежуючись ними) повнорозмірну послідовність будь-яких білків, їхніх аналогів або їхніх імуногенних фрагментів. Поняття «імуногенний фрагмент» означає фрагмент білка, що містить один або більше епітопів і в результаті цього викликається імунологічна відповідь проти відповідного патогена. Такі фрагменти можна ідентифікувати за допомогою кожного із численних методів картирування епітопів, відомих у даній області (див., наприклад, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, тім 66, під ред. Glenn E. Morris, з Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Сутність і зміст цих публікацій включені в даний опис як посилання. Лінійні епітопи можна виявляти, наприклад, здійснюючи конкурентний синтез великої кількості пептидів на твердих підкладках, де пептиди відповідають фрагментам молекули білка, і, піддаючи пептиди взаємодії з антитілами, причому пептиди залишаються прикріпленими до підкладок. Такі методи відомі в даній області й описані, наприклад в US 4708871; в Geysen і ін., Ргос. Natl. Acad. Sei. USA 81, 1984, стор. 3998-4002; Geysen і ін., Molec. Immunol. 23, 1986, стор. 709- 715. Сутність і зміст цих документів включені в даний опис як посилання. Конформаційні епітопи також легко 13 можна ідентифікувати шляхом визначення просторової конформації амінокислот, наприклад, за допомогою рентгенівської кристалографії й 2-мірного ядерного магнітного резонансу (див., наприклад, Epitope Mapping Protocols, вище). Поняття включає також синтетичні антигени, наприклад, поліепітопи, що фланкують епітопи й інші, отримані рекомбінантними або синтетичними методами антигени (див., наприклад, Bergmann і ін., Eur. J. Immunol. 23, 1993, стор. 2777-2781; Bergmann і ін., J. Immunol. 157, 1996, стор. 3242-3249; Suhrbier A., Immunol, і Cell Biol. 75, 1997, стор. 402-408; Gardner і ін., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 червня-3 липня 1998 p.). Сутність і зміст цих документів включені в даний опис як посилання. Придатні антигени L.intracellularis включають (але, не обмежуючись ними) антигени, описані в ЕР 1219711; US 6605696; WO 96/39629; WO97/20050; WO 00/69903; WO 00/69904; WO 00/69905; WO 00/69906; WO 02/38594; WO 02/26250; WO 03/006665; WO 04/033631; WO 05/026200 і WO 05/011731. Таким чином, вакцина, призначена для застосування згідно із даним винаходом, містить будьякий описаний вище антиген L. intracellularis, що викликає або може викликати імунну відповідь проти L. intracellularis. Переважно зазначена вакцина забезпечує щонайменше підвищений захист проти L. intracellularis. Таким чином, ще один об'єкт даного винаходу відноситься до способу вакцинації молодої тварини проти інфекцій, викликуваних L. intracellularis, що полягає в тому, що молодої тварині у віці приблизно до 3 тижнів уводять антиген L. intracellularis в ефективній дозі, де антиген L. intracellularis вибирають із групи, що включають живі модифіковані бактерії L intracellularis, убиті бактерії L. intracellularis або одну або більше субодиниць бактерій L. intracellularis. Як зазначено вище, в одному з варіантів здійснення винаходу вакцинацію переважно здійснюють у віці від 10 до 26 днів, більш переважно у віці від 12 днів до 21 дня, ще більш переважно у віці від 15 днів до 21 дня, і найбільш переважно у віці від 19 днів до 21 дня. В іншому варіанті здійснення винаходу вакцинацію переважно здійснюють до досягнення 26-денного віку, переважно у віці від 16 до 26 днів, більш переважно у віці від 18 до 24 днів, ще більш переважно у віці від 19 до 22 днів, і найбільш переважно у віці 21 дня. Переважно вакцина містить модифіковані живі бактерії L. intracellularis. Більш переважно вакцина являє собою Enterisol® Ileitis В3903 (фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Наступний об'єкт даного винаходу відноситься до способу вакцинації молодої тварини, переважно молодого поросяти проти інфекцій, викликуваних L. intracellularis, що полягає в тому, що молодій тварині у віці від 10 днів включно й до 26денного віку, більш переважно у віці від 12 днів до 21 дня, ще більш переважно у віці від 15 днів до 21 дня, і найбільш переважно у віці від 19 днів до 21 дня, або молодій тварині у віці до 26 днів, переважно у віці від 16 до 26 днів, більш переважно у віці 96923 14 від 18 до 24 днів, ще більш переважно у віці від 19 до 22 днів, і найбільш переважно у віці 21 дня, уводять живі модифіковані бактерії L. intracellularis у дозі від приблизно 3,0 ТCID50 до приблизно 6,0 ТCID50. Переважно зазначені бактерії являють собою бактерії, що втримуються у вакцині Enterisol® Ileitis B3903 (фірма Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.). Ще один об'єкт даного винаходу відноситься до способу вакцинації молодої тварини, переважно молодого поросяти, проти інфекцій, викликуваних L. intracellularis, що полягає в тому, що молодій тварині у віці від 10 днів включно до 26-денного віку, більш переважно у віці від 12 днів до 21 дня, ще більш переважно у віці від 15 днів до 21 дня, і найбільш переважно у віці від 19 днів до 21 дня, або до досягнення 26-денного віку, переважно у віці від 16 до 26 днів, більш переважно у віці від 18 до 24 днів, ще більш переважно у віці від 19 до 22 днів і найбільш переважно у віці 21 дня, уводять антиген L. intracellularis в ефективній дозі, де молода тварина є L. intracelluaris-негативною, і присутності материнського антитіла до L. intracellularis. Наступний об'єкт даного винаходу відноситься також до нового медичного застосування антигену L. intracellularis, узятому в ефективній кількості, для приготування лікарського засобу, переважно композиції вакцини, призначеної для вакцинації молодої тварини, переважно молодого поросяти, у віці від 10 до 26 днів, більш переважно у віці від 12 днів до 21 дня, ще більш переважно у віці від 15 днів до 21 дня, і найбільш переважно у віці від 19 днів до 21 дня, або у віці до 26 днів, переважно у віці від 16 до 26 днів, більш переважно у віці від 18 до 24 днів, ще більш переважно у віці від 19 до 22 днів, і найбільш переважно у віці 21 дня. Згідно ще одному варіанту зазначеного вище медичного застосування антиген L. intracellularis вибирають із групи, що включають живі модифіковані бактерії L. intracellularis, убиті бактерії L. intracellularis або одну або більше субодиниць бактерій L intracellularis. Переважно антиген L. intracellularis являють собою живі модифіковані бактерії L. intracellularis. Більш переважно молодій тварині вводять живі модифіковані бактерії L. intracellularis у дозі, що становить від приблизно 3,0 ТCID50 до приблизно 6,0 ТCID50. Одержання композицій вакцин, що містять антиген L. intracellularis, здійснюють загальноприйнятим у даній області методом, відомим фахівцеві в даній області. Фахівцеві в даній області повинні бути відомі, наприклад, додаткові компоненти, які можна включати в зазначену композицію (див. також Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-вид., з Mack Publ., Easton, 1990). Фахівець може застосовувати відомі ін'єкційні фізіологічно прийнятні стерильні розчини. Для приготування готового до застосування розчину для парентеральної ін'єкції або інфузії легко можна одержувати водні ізотонічні розчини, такі, наприклад, як фізіологічний розчин або розчини, що відповідають білкам плазми. Композиції вакцини можуть перебувати у формі ліофілізатів або безводних препаратів, які можна відновлювати за допомогою відомого ін'єкційного 15 розчину безпосередньо перед застосуванням у стерильних умовах, наприклад, вони можуть являти собою набір компонентів. Крім того, імуногенні й використовувані як вакцини композиції, пропоновані в даному винаході, можуть включати один або більше прийнятних для ветеринарії носіїв. У контексті даного опису поняття «прийнятний для ветеринарії» відноситься до будь-якого й до всіх розчинників, диспергуючих середовищ, покриттів, ад'ювантів, стабілізаторів, розріджувачів, консервантів, антибактеріальних і протигрибкових агентів, агентів для додання ізотонічності, агентів, що сповільнюють адсорбцію і т.п. Поняття «розріджувач» може означати воду, фізіологічний розчин, декстрозу, етанол, гліцерин і т.п. Агенти для додання ізотонічності можуть являти собою серед інших хлорид натрію, декстрозу, маніт, сорбіт і лактозу. До стабілізаторів відносяться серед інших альбумін і лужні солі етилендіамінтетраоцтової кислоти. У контексті даного опису поняття «ад'юванти» може означати гідроксид алюмінію й фосфат алюмінію, сапоніни, наприклад, Quil A, QS-21 (фірма Cambridge Biotech Inc., Кембридж, шт. Массачусетс), GPI- 0100 (фірма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт. Алабама), емульсію типу вода в олії, емульсію типу олія у воді, емульсію типу вода в олії у воді. Емульсія, зокрема, може бути приготовлена на основі легкої рідкої парафінової олії (задовольняючої вимогам Європейської фармакопеї); ізопреноїдної олії, такої як сквалан або сквален; олії, отриманої олігомеризацією алкенів, насамперед ізобутену або децену; ефірів кислот або спиртів, що містять лінійну алкільную групу, більш переважно на основі рослинних олій, етилолеату, ди(каприлату/капрату) пропиленгліколю, три(каприлату/капрату) гліцерину або діолеату пропіленгліколю; ефірів розгалужених жирних кислот або спиртів, насамперед ефірів ізостеаринової кислоти. Для утворення емульсії олію застосовують у сполученні з емульгаторами. Емульгаторами переважно є неіоногенні поверхнево-активні речовини, насамперед складні ефіри сорбітану, маніту (наприклад, безводний манітолеат), гліколю, полігліцерину, пропіленгліколю й олеїнової, ізостеаринової, рицинолової або гідроксистеаринової кислоти, які необов'язково є етоксильованими, і блокспівполімери поліоксипропилену-поліоксиетилену, зокрема, продукти типу плуроник, насамперед L121 (див. Hunter і ін., The Theory і Practical Application of Adjuvants, під ред. Stewart-Tull, D. E. S., з John Wiley і Sons, NY, 1995, стор. 51-94 і Todd і ін., Vaccine 15, 1997, crop. 564-570). Сутність і зміст зазначених публікацій включені в даний опис як посилання. Наприклад, можна застосовувати емульсію SPT, описану на с 147 «Vaccine Design, The Subunit і Adjuvant Approach», під ред. М. Powell і M. Newman, з Plenum Press, 1995, і емульсію MF59, описану на с 183 цієї ж самої книги. Сутність і зміст зазначених публікацій включені в даний опис як посилання. Іншим прикладом ад'юванту є сполука, обрана з полімерів акрилової або метакриловой кислоти й співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільної похідної. Кращими ад'ювантами є полімери акри 96923 16 лової або метакрилової кислоти, що є зшитими, насамперед, із простими поліалкеніловими ефірами цукрів або багатоатомних спиртів. Ці сполуки відомі за назвою карбомери (Phameuropa, тім 8, No. 2, червень 1996 p.). Фахівці в даній області можуть знайти відповідні відомості також в US 2909462, у якому описані такі акрилові полімери, що зшиті з полігідроксильованою сполукою, що має щонайменше 3 гідроксильні групи, переважно не більш 8, причому атоми водню щонайменше в трьох гідроксилах заміщені ненасиченими аліфатичними радикалами, що містять щонайменше 2 атоми вуглецю. Кращими є радикали, що містять від 2 до 4 атомів вуглецю, наприклад, вініли, аліли й інші групи з етиленовим ненасиченим зв'язком. Ненасичені радикали самі можуть містити інші замісники, такі як метил. Найбільш придатними є продукти, що надходять у продаж за назвою карбопол (Carbopol) (фірма BF Goodrich, шт. Огайо, США). Вони є зшитими з алілсахарозою або алілпентаеритритолом. Серед них слід зазначити Carbopol 974Р, 934Р і 971P. Найбільш кращим для застосування є Cabopol 971Р. Серед співполімерів малеїнового ангідриду й алкенільних похідних слід зазначити співполімери ЕМА (фірма Monsanto), що представляють собою співполімери малеїнового ангідриду й етилену. При розчиненні цих полімерів у воді утворюється кислий розчин, який необхідно нейтралізувати, переважно до досягнення фізіологічного значення pH, для того, щоб одержати розчин ад'юванта, у який можна вносити імуногенну, імунологічну або саму композицію, що представляє собою вакцину. Іншими придатними ад'ювантами є серед іншого також (але, не обмежуючись ними) ад'ювантна система RIBI (фірма Ribi Inc.), блок-співполімер (фірма CytRx, Атланта, шт. Джорджия), SAF-M (фірма Chiron, Емервилл, шт. Пометіфорнія), монофосфорил ліпід А, авридин ліпид-аміновий ад'ювант, термолабільний ентеротоксин з Е. соlі (рекомбінантний або отриманий іншим шляхом), холерний ентеротоксин, IMS 1314 або мурамілдипептид. Переважно ад'ювант додають у кількості, що становить від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Більш переважно ад'ювант додають у кількості, що становить від приблизно 100 мкг до приблизно 10 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості, що становить від приблизно 500 мкг до приблизно 5 мг на дозу. Ще більш переважно ад'ювант додають у кількості, що становить від приблизно 750 мкг до приблизно 2,5 мг на дозу. Найбільш переважно ад'ювант додають у кількості, що становить приблизно 1 мг на дозу. Крім того, композиція вакцини може містити один або більше інших імуномодуляторів, таких, наприклад, як інтерлейкіни, інтерферони або інші цитокіни. Композиції вакцин можуть містити також гентаміцин і мертіолат. Хоча фахівець у даній області легко може визначати кількості й концентрації ад'ювантів і добавок, які можна застосовувати згідно із даним винаходом, у даному винаході запропоновані композиції, що містять від приблизно 50 до приблизно 2000 мкг ад'юванта й переважно приблизно 250 мкг ад'юванта/мол дозу композиції 17 вакцини. В іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу запропоновані композиції вакцин, що містять від приблизно 1 до приблизно 60 мкг/мол антибіотиків і більш переважно менш чим приблизно 30 мкг/мол антибіотиків. Вакцину вводять тваринам, переважно ссавцям, і ще більш переважно свиням, будь-яким загальноприйнятим методом, найбільш переважно за допомогою приладу для уливання ліків у ротову порожнину тварини. Доза, що підлягає введенню, повинна залежати від конкретної ситуації, але в кожному разі вона повинна являти собою кількість, достатню для індукції захисної гуморальної імунної відповіді або клітинно-обумовленої імунної відповіді проти ілеїту. Відповідно до іншого об'єкта винаходу вакцини на основі L. intracellularis, застосовувані для вакцинації молодих тварин (переважно молодих поросят), уводять у вигляді однієї або повторних доз. Живу або вбиту вакцину можна вводити 1 або 2 рази з 2-4-тижневими інтервалами після першої вакцинації. У випадку ослаблених живих вакцин переважно використати одну дозу. Переважно перше або єдине введення здійснюють у віці від 16 до 26 днів, більш переважно у віці від 18 до 24 днів, ще більш переважно у віці від 19 до 22 днів і найбільш переважно у віці 21 день, як описано вище, або починаючи у віці від 10 до 26 днів, більш переважно у віці від 12 днів до 21 дня, ще більш переважно у віці від 15 днів до 21 дня, і найбільш переважно у віці від 19 днів до 21 дня. Якщо бажано або необхідно друге введення, то друге введення здійснюють через проміжок часу, що становить від приблизно 1 до приблизно 4 тижнів після першого введення вакцини. Згідно ще одному варіанту здійснення винаходу повторну вакцинацію здійснюють через проміжок часу, що становить від 3 до 12 місяців після будь-якого попереднього введення вакцини. Введення наступних доз вакцини переважно здійснюють із інтервалами, що становлять від 6 місяців до 1 року. Приклади У наведених нижче прикладах представлені репрезентативні кращі варіанти здійснення даного винаходу. Мається на увазі, що вони не повинні розглядатися як обмежуючий загальний обсяг винаходу. Приклад 1 У цьому прикладі оцінювали ефективність вакцини на основі Lawsonia на тритижневих поросятах, що народилися від свиноматок, вакцинованих за допомогою вакцини на основі Lawsonia, і невакцинованих свиноматок і визначали, чи мала місце інтерференція обумовленого вакцинацією свиноматок материнського імунітету, що перешкоджає утворенню імунної відповіді на вакцинацію поросят, що оцінювали по зниженню індукції захворювання після контрольного зараження вірулентною чистою культурою як вакцинованих, так і невакцинованих поросят. Основними досліджуваними параметрами, які використовували для оцінки ефективності, були макроскопічні й мікроскопічні ушкодження клубової кишки й ободової кишки. Крім того, у цьому прикладі оцінювали вакцину Lawsonia відносно безпеки при введенні однократ 96923 18 ної й повторної доз вагітним свиноматкам, що перебувають на другій і третій стадіях вагітності. Матеріали й методи Для проведення досліду одержували шістнадцять здорових вагітних свиноматок, у яких не було виявлено присутності Lawsonia у сироватці (серонегативні у відношенні Lawsonia свиноматки), і розділяли довільним образом на 2 групи, А і Б, по 8 свиноматок у кожній. Тваринам в групі А уводили 3 дози Enterisol Ileitis B3903 за допомогою приладу для уливання ліків у ротову порожнину тварини в дні -55, -35 і -14 для того, щоб індукувати високий рівень материнського імунітету перед опоросом. Свиноматкам у групі Б уводили плацебо перед опоросом, і вони служили як негативні контролі. Свиноматок спочатку містили на нелікувальному раціоні для вагітних тварин, що є в продажу, після чого переводили на не лікувальну, стимулюючу лактацію, дієту. Були створені умови для однакового запліднення й опоросу всіх свиноматок, однак були певні варіації (10 днів) у строках опоросу. Для того, щоб уникнути проблем, пов'язаних з варіабельністю, які могли виникати при проведенні вакцинації й контрольного зараження в кілька різних днів, як день 0 досліду був обраний день, що доводиться на середину періоду, протягом якого відбувалися опороси. Всі поросята, які брали участь на стадії введення вакцини й контрольного зараження, у момент проведення вакцинації (день 21) мали вік 21±5 днів. Поросят спочатку тримали на нелікувальному стартері, після чого переводили на нелікувальний раціон для розплідників, а потім на нелікувальний раціон для завершального періоду відгодівлі. Зразки для серологічного аналізу брали у свиней у справжній день народження, у віці 7 днів і у віці 14 днів для забезпечення точної оцінки материнського антитіла, якщо воно присутнє. Зразки для серологічного аналізу брали у свиноматок перед опоросом. Потім у день 22 свиноматок піддавали аутопсії, проводили макроскопічне обстеження тканин їх клубової кишки й ободової кишки, проводили аналіз за допомогою ПЦР клубової кишки, ободової кишки, брижових лімфатичних вузлів і мигдалин, мертвонароджених свиней аналізували за допомогою ПЦР, а репродуктивну здатність свиноматок оцінювали шляхом реєстрації живонароджених, мертвонароджених або муміфікованих свиней у день опоросу. Після опоросу (у день 21 досліду) 100 здорових поросят відбирали з помету й потім розподіляли довільним образом по шести групах обробки, кожну з яких містили окремо в процесі досліду. Поросят, отриманих від вакцинованих свиноматок (група А) довільно розділяли на групи обробки 1-3. Поросят, отриманих від невакцинованих свиноматок (група Б) довільним образом розділяли на групи обробки 4-6. У день 21 тваринам в групах обробки 1 і 4, по 20 поросят у кожній, уводили дозу вакцини Enterisol Ileitis В3903 обсягом 2 мол 5,0 (110 log10 ТCID50/дозу) шляхом безпосереднього уливання через прилад для уливання ліків у ротову порожнину тварини. Тваринам в групах 2 і 5, по 20 поросят у кожній групі, уводили по 2 мол плацебо шляхом безпосереднього уливання через 19 прилад для уливання ліків у ротову порожнину тварини. Тварин у групах 3 і 6, по 10 поросят у кожній групі, не піддавали обробці, і вони служили як строгі контролі для підтвердження чутливості джерела свиней до інфекції, викликуваної Lawsonia. Через три тижні після вакцинації (день 42 дослідження) піддослідних поросят у групах обробки 1, 2, 4 і 5 піддавали контрольному зараженню шляхом введення за допомогою шлункового зонда 7,3 однієї дози обсягом 10 мол (1 х 10 log10 ТCID50/дозу) вірулентної отриманої в результаті невеликої кількості пасажів чистої культури гетерологичного ізолята Lawsonia N101494. Однак як бактерій для контрольного зараження можна використати будь-який інший ізолят Lawsonia дикого типу або отриманий після невеликої кількості пасажів. У день 63 дослідження (через три тижні після контрольного зараження) тварин у всіх групах обробки (1-6) забивали й робили аутопсию для аналізу макроскопічних і мікроскопічних ушкоджень, викликаних ПЕС. Основним критерієм, що використовували для оцінки на поросятах ефективності вакцини Enterisol Ileitis B3903 проти контрольного зараження гетерологічною вірулентною чистою культурою, служило виявлення утворення ушкоджень на основі макроскопічних і мікроскопічних методів виявлення ушкоджень у повздошній кишці й ободовій кишці. Макроскопічні ушкодження оцінювали в зрізах клубової кишки, в області стику клубової кишки й сліпої кишки й в ободової кишці в момент закінчення дослідження. Ушкодження кишечника оцінювали в балах по ступеню їхньої серйозності й з кожної інфікованої області тканини брали додаткові зразки для ПЦР-, ІГХ- (імуногістохімічний аналіз) і Н&Е- (фарбування гематоксиліном і еозином) аналізів. Серйозність ушкоджень оцінювали по ступеню стовщення слизуватої оболонки, виявленого в слизуватому шарі клубової кишки. Бал ушкоджень 0 означав відсутність стовщення слизуватої оболонки, набряку, фляків/складок на слизуватій оболонці або виступів, обумовлених серозною ретикуляцією. Бал ушкоджень 1 означав наявність слабкого стовщення, включаючи невеликі фляки/складки в слизуватій оболонці, слабкого набряку поверхні слизуватої оболонки й у деяких випадках гіперемії. Балом ушкоджень 2 оцінювали наявність стовщення й/або запалення середнього ступеня. Це проявлялося в наявності значних фляків/складок у слизуватій оболонці, набряку поверхні слизуватої оболонки середнього ступеня, ретикуляції серозних оболонок і в деяких випадках гіперемії. Бал ушкоджень З означав присутність серйозного стовщення й/або запалення, що проявляються в наявності серйозних і глибоких фляків/складок у слизуватій оболонці, набряку поверхні слизуватої оболонки середнього ступеня, ретикуляції серозних оболонок і в деяких випадках гіперемії. Бал ушкоджень 4 означав наявність серйозного стовщення й/або запалення й/або присутність крові. Ушкодження, оцінюване цим балом, проявлялося у вигляді серйозних і глибоких фляків/складок у слизуватій оболонці, набряку поверхні слизуватої оболонки середнього ступеня, рети 96923 20 куляції серозних оболонок, присутності також у деяких випадках гіперемії й/або згустків крові. І, нарешті, бал ушкоджень 5 свідчив про некроз, що проявлялося в наявності серйозних ушкоджень слизуватої оболонки, так що був присутній некроз або в деяких випадках мало місце відшарування або відділення всієї поверхні слизуватої оболонки внаслідок серйозності ушкодження. Мікроскопічні ушкодження, викликувані Lawsonia, є патогномонічними для ПЕС. Гістопатологічні ушкодження, викликувані захворюванням, включають епітеліальну гіперплазію, насамперед у криптах слизуватої оболонки з явною відсутністю бопометоподібних клітин. Lawsonia, як правило, є присутньою у проліферуючих епітеліальних клітинах крипт слизуватої оболонки. Зрізи клубової кишки довжиною приблизно 2-4 см поміщали в забуферений формалін для гістологічного аналізу з використанням методів фарбування гематоксиліном і еозином (Н&Е) і ІГХ-фарбування. Н&Е-фарбування дозволяє виявляти присутність гіперплазії крипт, обумовлених інфекцією, викликуваної Lawsonia, у той час як метод ІГХфарбування заснований на використанні специфічності моноклонального антитіла до Lawsonia для підтвердження присутності організму й утворення мікроскопічного ушкодження в уражених тканинах. Моноклональне антитіло до Lawsonia специфічно розпізнає цілу клітину Lawsonia у результаті спрямованого переносу до білка зовнішньої мембрани, що є у всіх ізолятах Lawsonia. Це моноклональне антитіло було отримано з лінії клітин гібридоми VPM53, створеної дослідниками Університету Единбурга, Шотландія. Присутність організмів Lawsonia і ступінь серйозності мікроскопічних ушкоджень, що виявляють за допомогою ІГХфарбування зрізів клубової кишки, оцінювали в балах з використанням шкали, де бал 0 означав відсутність проліферативних ентероцитів (ушкоджень), бал 1 означав наявність невеликих осередкових ушкоджень, бал 2 означав наявність середніх дифузійних ушкоджень і бал 3 означав наявність серйозних дифузійних ушкоджень. Відносно присутності організмів використовували бальну систему оцінки на основі ІГХ, у якій відсутності організмів відповідав бал 0, присутності невеликої кількості організмів, локалізованих у вигляді вогнищ, - бал 1, присутності середньої кількості дифузно розповсюджених організмів бал 2, і присутності великої кількості дифузно розповсюджених організмів - бал 3. Вторинним критерієм при дослідженнях було виявлення клінічних симптомів, виявлення присутності Lawsonia в узятих за допомогою тампона пробах фекалій і в тканинах за допомогою ПЦР, оцінка ADWG (середній добовий приріст маси) і сероконверсії (метод непрямої імунофлуоресценції (IFAT)), обумовлених впливом Lawsonia на порося. Обстеження стану здоров'я проводили щодня від дня початку досліду до дня контрольного зараження кожного тестованої тварини. Клінічні параметри здоров'я, включаючи діарею, поводження й стан тіла, оцінювали в балах, щодня починаючи від дня контрольного зараження (день 42) до дня, 21 що передує закінченню досліду (день 62). Бали відбивали ступінь серйозності захворювання. Стосовно діареї бал 1 відповідав нормальним фекаліям, бал 2 відповідав напівтвердим фекаліям без ознак крові, бал 3 відповідав водянистим фекаліям, але без присутності крові або фекалій темних кольорів, і бал 4 відповідав пофарбованим кров'ю фекаліям, які могли бути рідкими або сформованими. Стосовно до поводження бал 1 відповідав нормальному поводженню, бал 2 відповідав подавленому в невеликому або середньому ступені поводженню (тварина хоче стояти окремо від інших) і бал 3 відповідав стану сильної депресії або тому, що тварина хоче перебувати лежачи. Стосовно до стану тіла бал 1 відповідав нормальному стану тіла, бал 2 відповідав стану схуднення тіла від слабкого до середнього ступеня, і бал 3 відповідав сильному схуднення тіла. Виділення Lawsonia з фекаліями оцінювали за допомогою ПЦР для виявлення ілеїту (ілеїт-ПЦР) шляхом аналізу взятих за допомогою тампона проб фекалій (f-ПЦР) у дні -55, -35, -14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 і 63 досліду. Узяті за допомогою тампона проби фекалій аналізували за допомогою ПЦР відносно присутності ДНК Lawsonia у фекаліях. По закінченні досліду в день 63 брали свіжі зрізи тканини від кожної тварини. У день 63 досліду проводили якісний аналіз бактеріального вмісту в тканинах за допомогою ілеїт-ПЦР (t-ПЦР), а також гістологічну оцінку присутності Lawsonia у повздошній кишці, ободовій кишці, мигдалинах і брижовому лімфатичному вузлі. ПЦР-анализ був розроблений Jones зі співавторами, і він заснований на використанні специфічності двох олігонуклеотидних праймерів (кожний довжиною 20 пар основ) для одержання фрагмента геномної ДНК Lawsonia довжиною 319 пар основ. Мішенню для цих праймеров є раніше визначена послідовність геномної ДНК, специфічна для Lawsonia. Отримані в результаті ПЦР фрагменти ДНК порівнювали з ілеїтпозитивними й ілеїт-негативними контролями, отриманими за допомогою екстракції ДНК і здійснення ПЦР, для підтвердження «позитивного» або «непозитивного» (негативного) результату. Позитивний контроль, отриманий шляхом екстракції ДНК, являв собою цілі клітки Lawsonia разом з інфікованими клітками лінії McCoy в 1-кратному забуференому фосфатом фізіологічному розчині (ЗФР) (200 мкл/пробірку). Негативний контроль, отриманий шляхом екстракції ДНК, являв собою неінфіковані клітки лінії McCoy в 1ЗФР (200 мкл/пробірку). Позитивні контролі, використовувані в ілеїт-ПЦР, являли собою геномну ДНК Lawsonia, очищену із зібраного матеріалу клітинної культури (Lawsonia + клітки лінії McCoy), у той час як негативний контроль являв собою вільну від РНКази воду (фірма Amresco, Солоний, шт. Огайо). Позитивний у відношенні ДНК Lawsonia тест-зразок повинен приводити до одержання фрагмента ДНК такого ж розміру (319 пари основ), що й обидва контролі (отримані шляхом екстракції й у результаті реакції), що дають позитивні результати при здійсненні ілеїт-ПЦР, у той час як негативні зразки не повинні приводити до одержання фрагмента такого розміру. Препарати екстрагованої ДНК із 96923 22 кожного тестованого зразка одержували за допомогою наборів для екстракції ДНК типу ISO-QUICK (фірма ORCA Research, Inc., Болелл, шт. Вашингтона). Результати, отримані за допомогою ПЦР, використовували для виявлення виділення Lawsonia в організмі поросят, вакцинованих Enterisol Ileitis B3903 і/або підданих контрольному зараженню гетерологічним ізолятом Lawsonia N101494. Вагу тварин визначали в день здійснення вакцинації (день 21), день контрольного зараження (день 42) і в день закінчення досліду (день 63) для того, щоб розраховувати середній добовий приріст маси (ADWG) у кожній групі обробки. ADWG для кожної групи порівнювали з усіма іншими для визначення ADWG після вакцинація й після контрольного зараження. Вагу тіла визначали за допомогою електронної системи за шкалою, каліброваною за допомогою гир у вигляді стрижнів, типу WeighTM Tronix модель 615XL, (фірма Weigh-Tronix Inc., Фермонт, шт. Миннесота), що калібрували з використанням сертифікованих стандартних гир до й після кожного виміру. Сироватку аналізували за допомогою методу непрямої імунофлуоресценції (IFAT) для виявлення антитіл до Lawsonia в організмі тварин. Брали зразки венозної цільної крові у вакуумні пробірки у свиноматок у дні -55, -35 і -14 і у всіх піддослідних тварин у віці 0, 7 і 14 днів і в дні 21, 28, 35, 42, 49, 56 і 63 дослідження. Крові давали згорнутися, після чого її центрифугували й сироватку збирали й заморожували. Потім здійснювали за допомогою IF AT скринінг свинячої сироватки відносно молекул Ig G до Lawsonia. Антитіла до Lawsonia приєднуються до антигенів зовнішньої мембрани цільної клітки Lawsonia, повністю покриваючи організм, що прикріплений до дна кожної лунки 96-лункового титраційного мікропланшета. У кожну лунку вносили кон'югат антитіло типу Ig G - мічене за допомогою FITC вторинне антитіло для зв'язування будьяких комплексів IgG-антиген. Ці пов'язані з FITC комплекси в ультрафіолетовому світлі випускають флуоресцентне зелене світло. У позитивному тестованому зразку виявляють велику кількість яскраво зелених невеликих вигнутих паличок, що нагадують Lawsonia, або інфікованих клітин лінії McCoy, що містять численні бактерії Lawsonia. На IFAT-негативному тестованому зразку видно тьмяне (бліде) зелене тло, що відповідає кліткам лінії McCoy. Результати оцінки за допомогою IF AT використовували для одержання схеми сероконверсії в групах, підданих вакцинації й/або вірулентному контрольному зараженню, що свідчить про вплив Lawsonia на піддослідну тварину. Кінцеве визначення величин ТCID50 проводили з використанням репрезентативних зразків кожної дози вакцини, що вводили піддослідним поросятам у день 21 даного дослідження. П'ять копій репрезентативних тестованих зразків, отриманих -1 -6 десятикратним розведенням (від 10 до 10 ), уводили до й після здійснення вакцинації й контрольного зараження в модифікованому за способом Дульбекко мінімальному незамінному середовищі, посиленому середовищем Хама F12 (DMEM F12) і 5% інактивованою тепловою обробкою сироватки 23 96923 новонароджених телят (NBS) (фірма JRH Biosciences, Ленекса, шт. Канзас). Розведені зразки аналізували для визначення кількості живих бактерій Lawsonia у кожному тестованому зразку. Розраховували середні титри по 5 повторностям до й після введення вакцини й до й після здійснення контрольного зараження й множили на обсяг тестованого матеріалу, що вводили кожному поросяті для визначення величини, що представляє собою log 10 загальної кількості Lawsonia на дозу. Загальні середні титри (log10 ТCID50/дозу) для вакцинації або контрольного зараження визначали на основі середніх результатів визначення титрів до й після (2 титри) вакцинації або контрольного зараження. Порівняння груп обробки проводили на основі аналізу результатів оцінки ADWG, як після вакцинації, так і після контрольного зараження, клінічних балів, рівнів сероконверсії (IFAT), колонізації (tПЦР), виділень із фекаліями (f-ПЦР), утворення акроскопічних ушкоджень і мікроскопічних ушкоджень, обумовлених за допомогою імуногістохімічного аналізу (ІГХ). 24 Три поросяти (один із групи 1 і два із групи 5) померли після вакцинації, але до закінчення досліду. Було проведене обстеження поросяти із групи 1 з метою виявлення інфекції, викликуваної Lawsonia, однак було встановлено, що причиною смерті був(-ла) шок/септицемія, викликаний(-а) високими рівнями Е.соlі. У двох померлих поросят із групи 5 були виявлені більші макроскопічні й мікроскопічні ушкодження, типові для інфекції, викликуваної Lawsonia, тому було визнано, що причиною смерті приблизно є Lawsonia. Результати Результати аналізів зразків фекалій і сироватки, зібраних у даному досліді, показали, що ні в однієї свиноматки як у групі А, так і в групі Б не було виявлено кількостей, що виявляють Lawsonia у фекаліях або в повздошній кишці або ободовій кишці. У групі свиноматок А в 5 з 8 тварин мали виявити із допомогою IFAT титри щонайменше в один момент часу в ході досліду. Протягом цього ж періоду часу жодна зі свиноматок із групи Б не мала виявляти з допомогою IFAT титру. Ці дані узагальнені в наведеній нижче таблиці 1. Таблиця 1 Результати обстеження свиноматок Обробка свиноматок Макроскопічні ушкодження клубової кишки Макроскопічні ушкодження ободової кишки А - вакциновані Б-невакциновані 0/8 0/8 0/8 0/8 Всіх свиноматок піддавали аутопсії й обстежили з метою виявлення макроскопічних ушкоджень, типових для інфекції, викликуваної Lawsonia. Однак не було виявлено свиноматок, для яких були б отримані позитивні результати при оцінці макроскопічних ушкоджень або в аналізі за допомогою tПЦР. Незважаючи на те, що вакцину вводили як протягом 2-го, так і 3-го триместру вагітності, для жодної свиноматки в процесі клінічного досліду не було виявлено ніяких патологій загального стану здоров'я. Результати опоросу свиноматок у групі А і в групі Б також були дуже близькими, у середньому в цих групах народжувалося живими по 9,4 і 7,6 поросяти відповідно. У свиноматок у групі А були випадки мертвонароджених, кількість мертвонароджених поросят на помет у середньому становило 1,8, при цьому не було виявлено муміфікованих поросят або смертельних випадків при опоросі. У свиноматок у групі Б середня кількість мертвонароджених поросят становило 0,9, муміфікованих поросят - 0,1 і загиблих при опоросі поросят -0,1 на помет. У результаті діагностичного обстеження цих мертвонароджених поросят було встановлено, що всі вони були Lawsoniaнегаттними й кількість цих випадків перебуває в межах звичайних втрат, пов'язаних з репродукці Аналіз тканини за допомогою ПЦР (клубова кишка/ободова кишка/брижкові лімфатичні вузли/мигдалини) 0/8 0/8 Імунофлуоресцентний аналіз (IFA) Середня кількість живонароджених поросят/ помет 5/8 0/8 9,4 7,6 єю. Результати серологічного аналізу в невакцинованих свиноматок, як і очікувалося, залишалися серонегативними, а в групі А було виявлено більше серопозитивних тварин. У свиноматок у групі А були більш високі значення параметра кількість поросяти/помет у порівнянні з невакцинованими контролями. Цей результат свідчить про те, що способи вакцинації або кількість вакцини не роблять негативного впливу. Ці дані узагальнені в наведеній вище таблиці 1. Утворення макроскопічного ушкодження в організмі поросяти визначали шляхом обстеження й бальної оцінки клубової кишки й ободової кишки кожної піддослідної тварини відносно макроскопічних ушкоджень, пов'язаних з ПЕС, у момент закінчення досліду. Для поросят із груп 1 і 4 при обстеженні клубової кишки були виставлені найменші бали, що становили 0,16 і 0,15 відповідно. Ці оцінки не є статистично вірогідно різними, але свідчать про ефективність вакцини для поросят, отриманих як від вакцинованих, так і невакцинованих свиноматок. Для груп 2 і 5 бали ушкоджень клубової кишки становили 0,85 і 2,35 відповідно. Ці дані є статистично вірогідно різними (Р