Авірулентний ізолят lawsonia intracellularis європейського походження, вакцини для імунізації тварин, застосування заявленого авірулентного ізоляту lawsonia intracellularis як вакцини, спосіб одержання вакцини,

1. Авірулентний ізолят Lawsonia intracellularis, де авірулентний ізолят являє собою ізолят Lawsonia intracellularis, депонований під реєстраційним номером ATCC PTA-4926, або будь-який авірулентний ізолят Lawsonia intracellularis європейського походження, який відрізняється тим, що зазначений авірулентний Lawsonia intracellularis не виділяється з фекаліями на 14 день після вакцинації. 2. Вакцина для імунізації тварини, яка містить фармацевтично ефективну кількість авірулентного ізоляту Lawsonia intracellularis за п. 1 і фармацевтично прийнятний носій. 3. Вакцина за п. 2, у якій фармацевтично ефективна кількість авірулентного ізоляту Lawsonia intracellularis становить від 103 TCID50 до 106 TCID50 на дозу. 4. Вакцина для імунізації тварини, яка містить авірулентний ізолят Lawsonia intracellularis за п. 1 й антигенний матеріал принаймні з одного з наступних патогенів: Salmonella spp., Erysipelothrix spp., 2 (19) 1 3 87665 4 intracellularis за п. 1 у культурі клітин, які знахо18. Спосіб за п. 11, який додатково включає стадію дяться у суспензії, при концентрації кисню менше (г), на якій здійснюють ліофілізацію ослабленого 10 %; і (б) змішують культивовані бактерії з фарізоляту. мацевтично прийнятним носієм. 19. Спосіб за п. 18, у якому процес ліофілізації 11. Спосіб культивування Lawsonia intracellularis за включає стадію основного сушіння й стадію втоп. 1, який полягає в тому, що: ринного сушіння. (а) заражають культивовані клітини інокулятом, 20. Спосіб діагностики проліферативної ентеропаякий містить вірулентний ізолят зазначеного тії свиней, який полягає в тому, що проводять Lawsonia intracellularis за п. 1, аналіз для виявлення антитіл до Lawsonia (б) інкубують заражені клітини при концентрації intracellularis в організмі тварини, крім людини, при кисню менше 10 %, підтримуючи за допомогою якому: перемішування заражені клітини в суспензії, і (а) приводять у контакт зразок, взятий з організму (в) збирають принаймні частину Lawsonia тварини, з ізолятом Lawsonia intracellularis за п. 1 з intracellularis. утворенням комплексу антиген-антитіло; і 12. Спосіб за п. 11, у якому концентрація кисню (б) здійснюють виявлення утворення комплексу, становить від 0 до 8 %. де присутність комплексу позитивно корелює з 13. Спосіб за п. 11, у якому концентрація кисню діагнозом проліферативної ентеропатії свиней. становить від 0 до 3 %. 21. Спосіб за п. 20, у якому аналіз являє собою 14. Спосіб за п. 11, у якому інкубацію проводять аналіз, вибраний із групи, яка включає: радіоімунпри концентрації діоксиду вуглецю від 6 до 10 %. ний аналіз, твердофазний імуноферментний ана15. Спосіб за п. 11, у якому культивовані клітини ліз, імунофлуоресцентний аналіз й імуноелектровибрані із групи, яка включає: клітини ліній HEp-2, форетичний аналіз. McCoy й IEC-18. 22. Спосіб одержання антисироватки до Lawsonia 16. Спосіб за п. 11, у якому клітини лінії IEC-18 intracellularis в організмі тварини, крім людини, культивують на мікроносіях. який полягає в тому, що: 17. Спосіб за п. 13, у якому заражені клітини інку(а) вводять ізолят Lawsonia intracellularis за п. 1 бують на стадії (в) протягом періоду часу від 2 до тварині, крім людини, в кількості, ефективній для 10 днів. викликання імунної відповіді; і (б) збирають антисироватку або плазму, яка містить антитіла до Lawsonia intracellularis. За даною заявкою заявляється пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США серійний номер 60/490001, поданої 25 липня 2003p., зміст якої включений в даний опис повністю як посилання. Даний винахід стосується вакцин на основі Lawsonia intracellularis (вакцин Lawsonia intracellularis) і способів захисту від інфекції, яка виклається L. Intracellularis, і діагностики вказаної інфекції. Продукти й способи, запропоновані у винаході, можна реалізовувати на практиці, зокрема, у результаті розробки вдосконаленого способу великомасштабного культивування L. intracellularis, включаючи новий ізолят L. intracellularis європейського походження, і способу одержання ліофілізованого продукту, який представляє собою вакцину, яка містить ослаблений європейський ізолят. L. intracellularis, збудник проліферативної ентеропатії свиней ("ПЕС"), уражає практично всіх тварин, включаючи кроликів, тхорів, хом'яків, лисиць, коней і різних представників інших класів тварин, таких як страуси й ему. L. intracellularis є найбільш поширеною причиною втрат поголів'я свиней у Європі, а також у Сполучених Штатах. Характерною рисою ПЕС є присутність інтрацитоплазматичних незв'язаних з мембраною вигнутих бацил всередині ентероцитів в інфікованих ділянках кишечнику. Бактерії, зв'язані з ПЕС. були названі "Campylobacter-подібними організмами" (S. McOrist й ін., Vet. Pathol., том 26, 1989, стор.260264). Потім бактерії-збудники були охарактеризовані як новий таксономічний рід й вид під загаль новживаною назвою Heal symbiont (IS) intracellularis (С. Gebhart й ін., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, том.43(3), 1993, стор.533-538). В останні роки ці новим бактеріям була дана таксономічна назва Lawsonia (L.) intracellularis (S. McOrist й ін., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, том 45 (4), 1995, стор.820-825). Ці три назви використовували взаємозамінно для позначення того самого організму, як він ідентифікований й описаний далі в даному описі. L. intracellularis є облігатною внутрішньоклітинною бактерією, яку не можна культивувати за допомогою звичайних бактеріологічних методів на стандартних безклітинних середовищах, і передбачається, що для свого росту вони повинні приєднатися до епітеліальних клітин. В S. McOrist й ін., Infection and Immunity, том 61 (19), 1993, стор.4286-4292 й G. Lawson й ін., J. of Clinical Microbiology, том 31 (5), 1993, стор.1136-1142 описане культивування L. intracellularis з використанням моношарів щурячих епітеліальних клітин кишечнику лінії ІЕС-18 у стандартних колбах для культури тканини. Крім того, в Н. Stills, Infection and Immunity, том 59 (9), 1991, стор.3227-3236 описане застосування моношарів людських ембріональних клітин кишечнику лінії Intestine 407 і моношарів клітин аденокарциноми ободової кишки лінії GPC16 морської свинки для культивування в стандартних колбах для культури тканини. В останні роки в Сполучених Штатах було дозволене застосування вакцини L. intracellularis, де вакцина заснована на ізолятах L. intracellularis, описаних і заявлених в US 5714375 й 5885823, 5 87665 6 обидва патенти включені в даний опис як поси2209, 9 січня 2003р. під реєстраційним номером лання повністю. Вказана вище вакцина надходить АТСС РТА-4926. у продаж від фірми Boehringer Ingelheim Ослаблений ізолят, запропонований у винахоVetmedica, Inc., 2621 North Belt Highway, Сентді, можна застосовувати як імуноген в антимікробДжозеф, шт. Міссурі, 64506-2002, під товарним них вакцинах для тварин, включаючи птахів, риб і знаком ENTERISOL® Ileitis. ссавців, таких як велика рогата худоба, свині, коні Однією із цілей винаходу є створення вдоской примати. Такі вакцини можна одержувати метоналеної вакцини L. intracellularis з використанням дами, відомими фахівцям у даній галузі, з викориізоляту європейського походження. станням вказівок, наведених у даному описі. Така Іншою метою винаходу є розробка вдосконавакцина повинна містити імунологічно ефективну леного способу великомасштабного культивуванкількість ослабленого ізоляту у фармацевтично ня L. intracellularis й удосконаленого способу вироприйнятному носії. Вакцину можна вводити у вибництва вакцини L. intracellularis. гляді однієї або декількох доз. Імунологічно ефекДля досягнення цих й інших цілей і відповідно тивну кількість визначають методами, відомими в до задачі винаходу, як вона представлена й доданій галузі, без проведення додаткових експерикладна описана в даному описі, у даному винаході ментів, керуючись вказівками, наведеними в дазапропонований новий виділений ізолят L. ному описі. Кількість авірулентних бактерій повиintracellularis європейського походження, спосіб нна бути достатньою для стимуляції імунної ослаблення такого ізоляту і його ослаблений ізовідповіді в чутливих до захворювання тварин, залят. У даному винаході запропонована також ваклишаючись при цьому авірулентною. Це залежить цина, яка містить ослаблений ізолят. У даному від конкретної тварини, бактерій і розглянутого описі запропонований також спосіб одержання захворювання. Рекомендована доза, призначена вакцини, яка містить ослаблений ізолят у ліофілідля введення чутливій тварині, переважно станозованій формі, призначеній для відновлення при вить від приблизно 3,0 TCID50 (кінцеве значення введенні, і ліофілізований продукт, який представінфікуючої дози, здатної викликати зараження 50% ляє собою вказану вакцину. тканинної культури)/дозу до приблизно 6,0 В одному з варіантів здійснення винаходу ноTCID50/дозу й більш переважно від приблизно 4,0 вий виділений ізолят DK 15540 L. intracellularis TCID50/дозу до приблизно 5, 0 TCID50/дозу. У пеєвропейського походження являє собою ізолят, реважному варіанті здійснення винаходу титр вакдепонований в АТСС (Американська колекція тицини становить приблизно 4,9 TCID50/дозу відповіпових культур) під реєстраційним номером РТАдно до методу розведень для визначення 4927. В іншому варіанті здійснення винаходу значення інфікуючої дози, здатної викликати зараослаблений ізолят, виведений з ізоляту DK 15540, ження 50% тканинної культури (TCID50). Носії віявляє собою ізолят, позначений як В3903, реєстдомі фахівцям у даній галузі, і вони включають раційний номер АТСС РТА-4926. стабілізатори й розріджувачі. Така вакцина може У контексті даного опису поняття "Z,. містити також відповідний ад'ювант. Вакцини, заintracellularis" позначає внутрішньоклітинні викривпропоновані у винаході, можна застосовувати талені грамнегативні бактерії, докладно описані в С. кож у сполученні з іншими вакцинами, наприклад, Gebhart й ін., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, як розріджувач для іншої вакцини. Препарати вактом.43 (3), 1993, стор.533-538 й S. McOrist й ін., цин можна сушити, наприклад, за допомогою суInt'l. J. of Systemic Bacteriology, том 45 (4), 1995, шіння виморожуванням, для цілей зберігання або стор.820-825, кожна публікація включена в даний для наступного приготування препаратів у вигляді опис як посилання повністю, і включає (але, не рідких вакцин. обмежуючись ними) ізолят, позначений DK 15540, Таким чином, під обсяг винаходу підпадає який був депонований відповідно до Будапештсьспосіб індукції імунної відповіді на вірулентні баккого договору в Американській колекції типових терії L. intracellularis дикого типу у тварини-хазяїна культур, 10801 University Boulevard, Манассас, шт. з метою захисту хазяїна від таких бактерій. Спосіб Віргінія, 20110-2209, 9 січня 2003р. під реєстраційполягає в тому, що хазяїнові вводять імунологічно ним номером АТСС РТА-4927; бактерії-збудники, ефективну кількість ослаблених бактерій або вбиякі можна одержувати із зараженої ПЕС свині або тих бактерій, запропонованих у винаході, і переінших тварин, які живуть в усьому світі, на основі важно хазяїнові вводять вакцину, запропоновану у знань у даній галузі й вказівок, наведених у дановинаході. му описі; і варіанти або мутанти будь-якої із вказаУ контексті даного винаходу поняття "великоних вище бактерій, отримані спонтанно або штучмасштабне культивування" означає рівень культиним шляхом. вування L. intracellularis, який перевищує приблизУ контексті даного опису поняття "ослаблений но 2,0-3,0л і включає виробництво в масштабі ізолят" означає будь-який ізолят L. intracellularis, 100л або більше. "Культивування" у контексті даотриманий за допомогою методів культивування й ного опису означає процес стимуляції росту, репересівання, наведених у даному описі, для досяпродукції й/або проліферації L. intracellularis. гнення авірулентності при збереженні імуногенних L. intracellularis можна культивувати за доповластивостей при введенні тварині-хазяїнові, могою методів, відомих у даній галузі, переважно включаючи (але, не обмежуючись ним) ослаблевідповідно до методу, описаного в патентах US ний ізолят, позначений В-3903, який був депоно5714375 й 5885823. Наприклад, клітинну культуру ваний відповідно до Будапештського договору в можна спочатку інокулювати інокулятом, який місАмериканській колекції типових культур, 10801 тить бактерії L. intracellularis так, щоб здійснити University Boulevard, Манассас, шт. Віргінія, 20110зараження клітин бактеріями. Для здійснення на 7 87665 8 практиці винаходу можна використовувати багато стійкість, такий як ванкоміцин, амфотерицин В або клітинних ліній, включаючи (але, не обмежуючись представників антибіотиків, які несуть аміногліконими) ІЕС-18 (АТСС 1589) - епітеліальні клітини зидну групу, включаючи вказані як приклад гентакишечнику щура, НЕр-2 (АТСС 23) - клітини плосміцин і неоміцин, для пригнічення забруднюючих коклітинного раку людини, McCoys (АТСС 1696) бактерій при збереженні росту L. intracellularis. мишині неспецифічні клітини, BGMK (Biowhittaker Незалежно від того, чи є інокулят чистою культу№71-176) - клітини нирки зеленої мавпи-буффало рою або кишковим гомогенатом, інокуляцію клій епітеліальні клітини кишечнику свині. Переважтинної культури можна здійснювати різними метоними клітинними культурами є клітини лінії НЕр-2, дами, відомими в даній галузі, з використанням McCoys або ІЕС-18. вказівок, наведених у даному описі. Якщо використовують клітинну культуру, то Потім бактерії та/або інокульовані клітинні перед інокуляцією клітини можуть знаходитися у культури інкубують при зниженій концентрації розформі моношару. Для утворення моношару клітичиненого О2. При концентрації розчиненого кисню ни можна висівати в стандартні колби. У кожну вище 10% ріст L. intracellularis відбувається з меншою швидкістю в порівнянні з оптимальною, приколбу висівають від приблизно 1´105 до приблизно чому, зрештою, припиняється, коли концентрація 10´105 клітин на колбу або ролер-флакон площею кисню виходить із вказаного діапазону. Переважно 25, 75, 150, 850см2, змішаних з живильним серебактерії й/або інокульовану клітинну культуру інкудовище. Живильні середовища можуть представбують при концентрації розчиненого кисню в діаляти собою будь-які середовища для культивупазоні від приблизно 0 до приблизно 10%. Більш вання клітин, які містять джерело азоту, необхідні переважно бактерії й/або клітини інкубують при фактори росту для вибраної клітинної культури й концентрації кисню в діапазоні від приблизно 0 до джерело вуглецю, таке як глюкоза або лактоза. приблизно 8%, причому найбільш переважною є Переважним середовищем є DMEM, збагачене концентрація кисню від приблизно 0 до приблизно середовищем Хема F 12, що містить 1-5% фета3,0%. льної бичачої сироватки, хоча можна застосовуваОптимальна концентрація діоксиду вуглецю ти також інші середовища, які надходять у продаж, також є важливою для необхідного росту L. що дозволяють одержувати хороші результати. intracellularis. При концентрації діоксиду вуглецю Ефективність культивування L. intracellularis від 0 до 4% відбувається неоптимальний ріст, припідсилюють, підтримуючи клітинну культуру на чому ріст зрештою припиняється, коли концентрастаціонарній фазі росту. Отже, моношар клітинної ція діоксиду вуглецю знаходиться в вказаному культури повинен мати в момент інокуляції від діапазоні. Переважно концентрація діоксиду вугприблизно 20 до приблизно 50%-ну конфлюентлецю знаходиться в діапазоні від приблизно 6 до ність. Переважно клітини повинні мати в момент приблизно 10%, причому найбільш переважною є інокуляції від приблизно 30 до приблизно 40%-ну концентрація діоксиду вуглецю приблизно 8,8%. конфлюентність, найбільш переважно приблизно Крім того, клітини переважно інкубують при 30%-ну конфлюентність. концентрації водню в діапазоні від приблизно 4 до В альтернативному варіанті клітини перед іноприблизно 10%. Найбільш переважно клітини інкукуляцією можна вирощувати в суспензії, як описабують при концентрації О2 від приблизно 0 до прино нижче. Переважно клітини спочатку вирощують близно 8,0%, концентрації СО2 приблизно 8,8% і до 100%-ної конфлюентності у формі моношару в концентрації Н2 приблизно 4%. Азот застосовують системі адгезивного шару, наприклад, у системі для росту розглянутого організму як "балансу" у ролер-флаконів, і потім переносять у посудину газовій суміші, яка містить азот (96%) і водень об'ємом 3-3000л і вирощують у суспензії. В альте(4%) або азот (80%), діоксид вуглецю (10%) і ворнативному варіанті клітини можна вирощувати день (10%). Клітини переважно інкубують при конперед інокуляцією в суспензії до досягнення необцентрації азоту в діапазоні від приблизно 80 до хідної щільності клітин, наприклад 2´105 клітин/мл, 96%. Таким чином, клітини найбільш переважно у посудині об'ємом 3-3000л (біореактор, ферменінкубують при концентрації О2 від приблизно 0 до тер, обертова колба й т.д.) з використанням параприблизно 8,0%, концентрації СО2 приблизно метрів, придатних для росту в такій системі. 8,8%, концентрації Н2 приблизно 4%, концентрації Інокулят може являти собою чисту культуру L. N2 приблизно 96%. intracellularis, отриману з інфікованої свині або Інокульовані клітини можна інкубувати у поінших тварин. Переважно інокулят може являти двійному газовому інкубаторі або інших газових собою чисту культуру L.ilntracellularis, отриману з камерах, які містять необхідні концентрації водню, культури, яка знаходиться в АТСС під реєстраційкисню й діоксиду вуглецю і які дозволяють підтриним номером РТА-4927. мувати клітини в суспендованому стані в процесі Інокулят може являти собою кишковий гомогеінкубації. Камера повинна мати пристрої для піднат, отриманий шляхом зіскрібування слизової тримання інокульованих клітин у суспензії й газооболонки клубової кишки свині або іншої тварини, вий монітор, і джерело живлення для подачі й підзараженої ПЕС. Коли готують кишковий гомогенат, тримання необхідних газових концентрацій. зрізи клубової кишки, вибрані для одержання кульТемпература інкубації повинна знаходитися в діатури, повинні мати серйозні пошкодження, які хапазоні від 30 до приблизно 45°С і більш переважно рактеризуються більшим потовщенням кишки. в діапазоні від приблизно 36 до приблизно 38°С. Внаслідок недовговічності бактерій зразки після Найбільш переважно температура становить приздійснення аутопсії переважно слід якнайшвидше близно 37°С. Необхідне обладнання для культипоміщати на зберігання при -70°С. До інокуляту вування й ослаблення добре відоме й доступне додають антибіотик, до якого L. intracellularis має 9 87665 10 фахівцям у даній галузі й воно вказане в даному Пересівання L. intracellularis у суспензійних описі. Одним із прикладів обладнання, придатного культурах можна здійснювати шляхом вилучення для здійснення даного винаходу, є подвійний газочастини вихідної культури й внесення її в нову вий інкубатор, наприклад модель 480 (Lab-Line, колбу, яка містить свіжу клітинну культуру. Якщо Мелрозе Парк, шт. Іллінойс) у сполученні з обервихідна культура має велику кількість бактерій/мл, товими колбами для підтримання клітин у суспеннаприклад, більш приблизно 104бактерій/мл, її зії. Переважне в цей час обладнання включає фепереважно додають у кількості від приблизно 1 до рментер, біореактор, шейкер із перемішуваною 10об.% культури із зараженої колби по відношенпластиною або роторний шейкер, який вміщає ню до культури свіжих клітин, які знаходяться у принаймні приблизно 2л середовищ, і здатний новій колбі. Це переважно здійснюють, коли зарапідтримувати клітинну культуру в суспензії за дожено 50-100% клітин. Якщо заражено менше 50% помогою продування газом відповідної концентраклітин, то пересівання переважно здійснюють ції або за допомогою інших засобів механічного шляхом розділення культури в співвідношенні 1:2 перемішування, і який дозволяє здійснювати безу новій колбі й збільшення об'єму за допомогою перервний моніторинг рівнів розчиненого О2 у седодавання свіжої тканинної клітинної культури й редовищах. Фірма New Brunswick, Braun й інші середовищ. У будь-якому разі не потрібно здійскомпанії виготовляють придатні для цієї мети фенювати лізис клітин й інші стадії в повній протилерментери й біореактори. жності від пересівання моношарних культур, заМаксимального росту клітин й отже L. стосовуваного в прототипах. intracellularis досягають шляхом підтримання іноПісля досягнення достатнього збільшення клікульованих клітин у суспендованому стані в протинної культури й наступного зараження L. цесі інкубації за рахунок збільшення контакту індиintracellularis, що визначають за допомогою фарвідуальних клітин з живильним середовищем і із бування відповідно до методу непрямої імунофлуприсутності необхідної суміші водню, кисню й діокоресценції (антитіл) (IFА), оцінки значення ТСІD50 сиду вуглецю. Клітинні культури можна перемішуабо за допомогою будь-якого порівнянного методу, вати й підтримувати в суспензії різноманітними збирають принаймні частину культивованих бакметодами, відомими в даній галузі, з використантерій L. intracellularis. Збір, як правило, здійснюють ням, наприклад, колб для культур, ролерпри клітинної інфікованості, що становить приблифлаконів, мембранних культур, біоконтейнерів, зно 60% або більше; однак фахівцеві в даній галузі біореакторних систем WAVE™, ферментерів й відомо, що збір можна здійснювати при клітинної обертових колб. Клітини можна підтримувати в інфікованості менше 60%. Стадію збору можна суспензії в процесі інкубації шляхом інкубації кліздійснювати шляхом відділення бактерій від сутин в обертовій колбі всередині подвійного газовоспензії за допомогою різних методів, відомих звиго інкубатора або аналогічного пристрою. Поняття чайним фахівцям у даній галузі, з використанням "обертова колба", у контексті даного винаходу вказівок, наведених у даному описі. Переважно означає колбу або інший контейнер, у якому для бактерії L. intracellularis збирають шляхом центриперемішування культури й підтримання її в суфугування всього вмісту або частини суспензії з спензії використається лопатева мішалка, пропеутворенням дебрису клітинної культури, ресуспенлерна мішалка або інші засоби. дування утворених дебрисів клітин і лізису інфікоУ переважному варіанті здійснення винаходу ваних клітин. Як правило, принаймні частину вмісінокульовані клітини інкубують до досягнення конту центрифугують при приблизно 3000´g протягом флюентності клітин, і потім клітини поміщають в приблизно 20хв. для того, щоб одержати дебрис обертову колбу, яка містить живильні середовища клітин і бактерій. Потім дебрис можна ресуспендуй інкубують у подвійному газовому інкубаторі при вати, наприклад у сахарозо-фосфат-глутаматом обертанні колби. Переважно інокульовані клітини (СФГ) розчині, і пропускати приблизно 20 разів зскрібають або трипсинізують і пересівають в обечерез голку 25 розміру для здійснення лізису кліртову колбу. Це можна здійснювати різними метотин. Якщо потрібне додаткове очищення, то зразки дами, відомими в даній галузі, наприклад, з викоможна центрифугувати при приблизно 145´g прористанням скребка для клітин для відділення тягом приблизно п'яти хвилин для видалення кліклітин. Після внесення клітин в обертову колбу тинних ядер і дебрису. Потім супернатант можна лопать обертової колби, як правило, обертається центрифугувати при приблизно 3000´g протягом зі швидкістю від приблизно 5 до приблизно приблизно двадцяти хвилин і утворений дебрис 500об./хв. на магнітній перемішуваній пластині для ресуспендувати у відповідному розчиннику, такому підтримання інфікованих клітин у суспензії. як СФГ, доповненому фетальною бичачою сироПотім частину культивованих L. intracellularis ваткою (щоб зробити зібрані бактерії придатними пересівають на свіжу культуру для збільшення для ліофілізації, заморожування або використання виробництва бактерій L. intracellularis. Поняття як інокуляту), або в живильних середовищах (щоб "пересівання" або його варіанти в контексті даного зробити зібрані бактерії придатними для пересіопису означає процес переносу частини культивовання на свіжі клітини). ваних L. intracellularis на свіжу клітинну культуру Як зазначалося раніше, ефективний ріст L. для здійснення зараження свіжих клітин бактерією. intracellularis для великомасштабного виробництва Поняття "свіжий", у контексті даного опису означає підсилюється при підтримці активного росту ткаклітини, які ще не були заражені L. intracellularis. нинних клітин. У випадку моношарів, коли культури Переважно вік таких клітин у середньому станостають конфлюентними, швидкість поділу клітин вить не більше приблизно одного дня. істотно зменшується. Спроби вирощувати L. intracellularis на моношарних тканинних культурах 11 87665 12 не мали великого успіху й у цьому випадку збільімуногенів, контрольованих регульованими навкошення масштабу виробництва виявлялося неможлишнім середовищем генами, і продуктів їх ексливим. Однак використання суспензійних культур пресії. значно полегшує підтримання активного росту Утворені ослаблені ізоляти можна культивуваклітин і дозволяє здійснювати безперервне збільти в моношарах тканинних культур, але переважно шення об'єму культури й підвищення масштабу їх культивують у суспензійних культурах. Як інші виробництва. При використанні ферментера й методи ослаблення можна застосовувати хімічне концентрації розчиненого О2 від приблизно 0 до ослаблення з використанням, наприклад, N3%, як це вказано вище, виявляється можливим метилнітрозогуанідину, або інші методи, відомі в досягати концентрації аж до 108бактерій/мл і виданій галузі. Як за допомогою багаторазових переще. сівань, так і за допомогою хімічних засобів, одерКоли використовують клітини лінії ІЕС-18, то жують ослаблену L. intracellularis і здійснюють сепоряд з живильними середовищами переважно лекцію для одержання вакцини. У переважному додають желатин, агарозу, колаген, акриламід або варіанті здійснення винаходу отриманий ослаблекремнієві гранули, такі як пористі мікроносії типу ний ізолят являє собою ізолят з реєстраційним Cultisphere-G (фірма НуСіопе Laboratories, Доган, номером АТСС РТА-4926. шт. Юта). Однак для клітин лінії НЕр-2 й інших Антиген, використовуваний для приготування ліній клітин не потрібні мікроносії при використанні вакцини, можна збирати шляхом центрифугування способів, запропонованих у винаході. або мікрофільтрації як описано вище. Потім антиПри використанні культур клітин лінії НЕр-2 ген стандартизують до певного рівня на основі для підтримання культури переважно 25-50% оптимальної імунної відповіді тварини-хазяїна, що культури видаляють із тижневими інтервалами й визначають титруванням доз для різних видів твазаміняють свіжими середовищами. Для клітинних рин-хазяїв. Бактерії можна інактивувати методами, культур з мікроносіями або гранулами переважно відомими в даній галузі, наприклад, шляхом виковидаляють 25-50% культури й заміняють свіжими ристання 0,3%-ного формаліну або інших інактисередовищами 1-2 рази в тиждень. Для підвищенвуючих агентів для одержання вбитої вакцини. ня масштабу виробництва до культури можна доПотім антиген вносять у придатний ад'ювант, тадатково додавати 25-50% середовищ або середокий як гідроксид алюмінію або мінеральне масло, вищ із мікроносіями. для посилення імунної відповіді. Після цього антиЗалежно від швидкості, з якою відбувається ген застосовують для вакцинації хазяїна (у випадзараження клітинної культури, пересівання на свіжі ку свиней досвіди проводять на особинах віком 3-4 клітини, як правило, здійснюють із інтервалом часу тижня) шляхом внутрішньом'язового або підшкірвід приблизно 2 до приблизно 7 днів. Беручи до ного зараження, використовуючи при необхідності уваги, що клітинна культура стає зараженою прибустер-дозу. наймні на 70% протягом 2-7 днів, пересівання пеПереважно здійснюють серійні пересівання реважно здійснюють приблизно через кожні 5-7 бактерій для індукції й селекції ослабленої авіруднів. лентної живої культури. Культуру тестують на тваУ даному винаході запропоновані також вакрині-хазяїні для виявлення ознак ослаблення. цини й способи одержання вакцин проти нового Культуру збирають відповідно до описаного вище ізоляту L. intracellularis європейського походження. методу й ліофілізують. Свиней, наприклад, піддаПереважно після підтримання заражених клітин у ють вакцинації пероральним шляхом з викориссуспензії протягом тривалого періоду часу (напританням 1´104-1´106 бактерій. Приблизно через 28 клад протягом 6-8 місяців) збирають принаймні днів після вакцинації свиней інокулюють перорачастину культивованих бактерій L. intracellularis і льним шляхом, використовуючи приблизно 1´107 здійснюють моніторинг можливого ослаблення. організмів, отриманих після невеликої кількості Такий моніторинг переважно здійснюють із викопересівань (менше 30 пересівань in vitro після перистанням контрольного зараження тваринирвинного виділення з кишкового гомогенату) вірухазяїна або на моделі контрольного зараження з лентної культури L. intracellularis. Інфікованих твавикористанням тварини для відбору ослабленого рин піддають аутопсії через 21 день після ізоляту. Такі ослаблені ізоляти використовують у контрольного зараження й роблять обстеження вакцинах, відповідно до способів, представлених у тонкого кишечнику з метою виявлення, як макроданому описі. скопічних пошкоджень, так і мікроскопічних пошкоДаний винахід дозволяє здійснювати швидке джень. Слід проводити також ПЛР, дослідження розмноження культури, збільшувати вихід в 100методом непрямої імунофлуоресценції (IFA) або 1000 разів і зменшувати вартість виробництва L. імуногістохімічним методом (ІГХ). Приблизно 80% intracellularis європейського походження. У резульконтрольних тварин повинні мати значні або міктаті велику кількість продукованих бактерій L. роскопічні пошкодження й давати позитивну реакintracellularis легко можна ослабляти з метою одецію в тесті на присутність L. intracellularis у клітиржання вакцини. Спосіб вирощування L. нах слизової оболонки кишечнику при intracellularis у суспензії дозволяє значно полегшувикористанні будь-якого з методів тестування, вати одержання, підвищувати швидкість і кількість ПЛР, IFA або ІГХ. Вакциновані тварини повинні бактерій, придатних для цієї мети. Чим більша мати здорові поверхні слизової оболонки за даникількість клітин і поділів клітин, що відбуваються, ми гістологічних досліджень і давати негативну тим вище рівень виникаючих мутацій, що є сприяреакцію в тесті з використанням ПЛР через 3-4 тливим з погляду створення вакцини. Так вирощутижні після інокуляції. вання в суспензії підвищує експресію важливих 13 87665 14 Як правило, ослаблений імуногенний ізолят L. Clostridium difficile), Streptococcus spp. intracellularis одержують після безперервного куль(Streptococcus suis), Brachyspira spp. (наприклад тивування протягом періоду часу від приблизно Brachyspira hyodysenteriae), Bordetella (наприклад 150 до приблизно 250 днів, протягом цього періоду Bordetella bronchiseptica), Pasteurella spp. (напричасу культуру пересівають приблизно 50-100 разів. клад Pasteurella multocidd), цирковірус (наприклад Однак фахівцеві в даній галузі відомо, що шляхом цирковірус типу 2 свиней), вірус репродуктивного й змінювання цих параметрів можна одержувати респіраторного синдрому свиней (PRRS), вірус інші ослаблені культури. грипу свиней (SIV), короновірус (наприклад вірус, Продукт у вигляді вакцини, запропонованої у який передається шлунково-кишковим шляхом винаході, можна ліофілізувати. Після збору ізолят (TGE), респіраторний коронавірус свиней), парвоможна концентрувати різними методами, відомими вірус або Escherichia coli; і фармацевтично прийнв даній галузі, і можна змішувати зі стабілізатором, ятний носій. наприклад із сахарозо-желатиновим стабілізатоВ одному з варіантів здійснення винаходу ром. Потім продукт у вигляді вакцини можна підкомбінована вакцина містить ослаблений ізолят L. давати заморожуванню й сушінню (ліофілізація). Intracellularis, реєстраційний номер РТА-4926, і Як правило, стадія заморожування полягає в стуантигенний матеріал з Salmonella choleraesuis, пінчатому зниженні температури до приблизно Erysipelothrix spp., Clostridium spp, Brachyspira spp., 45°С±3°С і витримуванні при цій температурі провірус, який передається шлунково-кишковим шлятягом періоду часу від приблизно 150 до приблизхом (TGE), й Escherichia coli; і фармацевтично но 480хв. Стадія сушіння може включати основну прийнятний носій. Антигенний матеріал з й вторинну стадії сушіння. Наприклад, основна Clostridium spp. може включати (але, не обмежуюстадія сушіння може полягати в тому, що: (а) стучись ним) антигенний матеріал з Clostridium пічато знижують температуру до рівня, що станоperfingens й Clostridium difficil. Антигенний матерівить від приблизно -30 до приблизно -5°С, і виал з Erysipelothrx spp. може включати (але, не обтримують при цій температурі протягом періоду межуючись ним) антигенний матеріал з часу від приблизно 120 до приблизно 1000хв., і Erysipelothrx rhusiopathiae. необов'язково (б) ступічато знижують температуру В іншому варіанті здійснення винаходу комбідо рівня, що становить від приблизно -5 до принована вакцина містить ослаблений ізолят L. близно 5°С і витримують при цій температурі проintracellularis, АТСС, реєстраційний номер АТСС тягом періоду часу від приблизно 150 до приблизРТА-4926, і антигенний матеріал з Salmonella но 2000хв. Друга стадія, як правило, полягає в choleraesuis й Erysipelothrx spp.; і фармацевтично тому, що ступічато змінюють температуру до приприйнятний носій. Ще в одному варіанті здійсненблизно 27°С±5°С і витримують при цій температурі ня винаходу комбінована вакцина містить ослабпротягом періоду часу, що становить від приблизлений ізолят L. intracellularis isolate, реєстраційний но 330 до приблизно 1120хв. Фахівцеві в даній номер АТСС РТА-4926, і антигенний матеріал з галузі відомо, що вказані діапазони можна регулюSalmonella choleraesuis й Erysipelothrx вати залежно від умов, наприклад, від вихідного rhusiopathiae; і фармацевтично прийнятний носій. об'єму. У наступному варіанті здійснення винаходу Після цього одержують вакцину, яка містить комбінована вакцина містить ослаблений ізолят L. імунологічно ефективну кількість ослабленої L. intracellularis, реєстраційний номер АТСС РТАintracellularis у фармацевтично прийнятному носії. 4926, антигенний матеріал принаймні з одного У переважному варіанті здійснення винаходу вакіншого патогену, включаючи (але, не обмежуючись цина містить ізолят з реєстраційним номером ними) Clostridium spp. (наприклад, Clostridium АТСС РТА-4926 у фармацевтично прийнятному tetani), вірус грипу коней (EIV) (наприклад, EIV-1, носії. Об'єднані імуноген і носій можуть знаходитиEIV-2), вірус герпесу коней (EHV) (наприклад, ся у вигляді водного розчину, емульсії або суспенEHV-1, EHV-2, EHV-3, EHV-4, EHV-5, EHV-6, EHVзії. Імунологічно ефективну кількість визначають 7), альфавірус (наприклад, вірус східного енцефаметодами, відомими в даній галузі, без додаткових літу, вірус західного енцефаліту, вірус венесуельекспериментів, керуючись вказівками, наведеними ського енцефаліту) або вірус Західного Нілу, і фав даному описі. Як правило, при використанні рмацевтично прийнятний носій. очищених бактерій кількість імуногену становить Вакцини, запропоновані у винаході, як правивід 5 до 5000 мкг і від 102,0 до 109,0 TCID50, перевало, вводять чутливій тварині, переважно свині, у жно від 103,0до 106,0ТСID50, більш переважно від вигляді однієї або декількох доз. Живу або вбиту 104,0 до 105,0 ТСID50. вакцину можна вводити 1 або 2 рази з 2Під обсяг даного винаходу підпадають також тижневими інтервалами. Ослаблену живу вакцину комбіновані вакцини, які містять ослаблений ізолят переважно вводять у вигляді однієї дози. ПереваL. intracellularis з реєстраційним номером АТСС жними шляхами введення ослаблених живих ізоРТА-4926 й антигенний матеріал принаймні з одлятів є внутрішньом'язовий, пероральний або інного іншого патогену, включаючи (але, не обметраназальний шляхи введення, а для вбитої жуючись ними): Salmonella spp. (наприклад вакцини найбільш переважним є введення шляхом Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium), внутрішньом'язової або підшкірної ін'єкції. Erysipelothrix spp. (наприклад Erysipelothrix Перешкодою для ефективної діагностики РРЕ rhusiopathiae), Haemophilus spp. (наприклад є час, необхідний для культивування бактерій, які Haemophilus parasuis), Mycoplasma spp. (напривикликають захворювання. У результаті створення клад Mycoplasma hyopneumonia), Leptospira spp., даного винаходу в цей час є можливість розробки Clostridium spp. (наприклад Clostridium perfingens, діагностичних засобів, які забезпечують швидкий і 15 87665 16 точний аналіз присутності L. intracellularis у біоло8. Додають субстрат на 10хв. або доти, поки гічних зразках, взятих з організму свині й інших не виникає виражений бендинг. тварин, чутливих до РРЕ. 9. Промивають ЗФР. Бактерії L. intracellularis європейського похо10. Сушать на повітрі й поміщають на зберідження, запропоновані в даному винаході, або гання в темряву. компоненти, отримані із цих бактерій, можна заБактерії L. intracellularis європейського похостосовувати як антиген в ELISA або іншому імунодження, запропоновані в даному винаході, або аналізі, такому як метод непрямої імунофлуорескомпоненти, отримані з таких бактерій, можна виценції ("IFA"), для виявлення антитіл до L. користовувати також для виготовлення антисироintracellularis у сироватці або іншій загальній воді ватки або антитіл для діагностичного, профілактиорганізму тварин, у відношенні яких є припущення, чного або терапевтичного застосування. Бактерії що вони заражені бактеріями. У цей час переважL. intracellularis європейського походження, запроним імуноаналізом є IFA, описаний нижче в припоновані в даному винаході, або компоненти, кладі. В альтернативному варіанті бактерії, запроотримані з таких бактерій, можна вводити тварині поновані в даному винаході, можна застосовувати крім людини в кількості, ефективній для викликанв аналізі методом Вестерн-блотингу. ня імунної відповіді, і антисироватку або плазму, Переважним протоколом ELISA, запропоноваяка містить антитіла до бактерій L. intracellularis, ним у винаході, є наступний протокол: або компонентів, отриманих з таких бактерій, мож1. Додають антиген у кількості 0,1мл/лунку, на збирати відповідно до методів, відомих у даній розведений в буфері для сенсибілізації. Інкубують галузі й представлених у даному описі. протягом 18год. при 4°С. Нижче винахід більш докладно проілюстрова2. Промивають 3 рази ЗФР. ний на прикладах, які представлені тільки з метою 3. У кожну лунку планшета додають 0,25мл ілюстрації й не спрямовані на обмеження обсягу блокуючого буфера. Інкубують протягом 1-2год. винаходу. Зокрема, фахівцеві в даній галузі повипри 37°С. нні бути очевидні інші варіанти здійснення винахо4. Промивають 3 рази буфером для відмиванду. ня. Всі цитовані в даному описі публікації й патен5. Розбавляють сироватку блокуючим буфети включені в опис як посилання повністю. ром і додають 0,1мл у перші лунки планшета. Приклад 1 Здійснюють серійні розведення в співвідношенні Одержання вакцини L. intracellularis 1:2 у наступних лунках планшета. Інкубують протяВиділення L. intracellularis з кишечників єврогом 1год. при 37°С. пейських свиней, свиней, які страждають від про6. Промивають 3-5 разів буфером для відмиліферативної ентеропатії (ПЕС), і ослаблення вкавання. заної бактерії: 7. Розбавляють кон'югат блокуючим буфером і Вірулентний ізолят L. intracellularis DK 15540 додають по 0,1мл у лунки планшета й інкубують (позначення DK 15540, DK-15540 й 15540 викориспротягом 1год. при 37°С. товуються в даному описі взаємозамінно) був ви8. Промивають 3-5 разів буфером для відмиділений у Мінесотському університеті з гомогенату вання. клубової кишки датської свині, зараженої гострою 9. Додають субстрат. геморагічною ентеропатією свиней. Цей ізолят був 10. Вимірюють абсорбцію світла за допомогою поміщений відповідно до Будапештського договоспектрофотометра. ру в Американську колекцію типових культур, 11. Лунки, у які не додавали антиген, викорис10801 University Boulevard, Манассас, шт. Віргінія, товують як контролі. 20110-2209, 9 січня 2003р. під реєстраційним но12. У кожному тесті слід використовувати тамером РТА-4927. Процес виділення включав зісккож свинячу сироватку як позитивний й негативний рібування слизової оболонки з клубової кишки, контроль. гомогенізацію, обробку трипсином протягом 30хв. Переважним протоколом Вестерн-блотингу є й обробку за допомогою гомогенізатора тканини. наступний протокол: Потім гомогенат клубової кишки пропускали через 1. Здійснюють електрофорез із використанням ряд фільтрів з розмірами отворів 5,0, 1,0 й 12% ДСН-ПААГ і переносять на нітроцелюлозну 0,65мкм. Гомогенат розбавляли сахарозо-фосфатмембрану. глутаматним буфером, доповненим 10% феталь2. Поміщають мембрану в блокуючий буфер ною бичачою сироватки (ФБС). Відбирали аліквоти на 2год. (6´1мл) гомогенату й поміщали на зберігання при 3. Видаляють блокуючий буфер і промивають температурі нижче -70°С. Гомогенат використовуЗФР протягом 1хв. вали як інокулят для зараження клітин лінії McCoy 4. Розбавляють сироватку блокуючим буфеу колбах Т-75см2. Щодня здійснювали моніторинг ром і наносять на мембрану. Інкубують протягом культур відносно зараження клітин лінії McCoy, 2год. при кімнатній температурі. для чого зскрібали моношари клітин лінії McCoy, 5. Промивають 3 рази буфером для відмиванпроводили лізис клітин за допомогою обробки ня (5хв. для кожного відмивання). хлоридом калію, поміщали концентрований клі6. Розбавляють кон'югат блокуючим буфером і тинний дебрис на предметні стекла мікроскопа й наносять на мембрану. Інкубують протягом 1год. здійснювали фарбування методом IFA з викориспри кімнатній температурі. танням моноклональних антитіл, специфічних для 7. Промивають 3 рази буфером для відмиванL. intracellularis. Після 11 пересівань на закріплені ня. клітинні культури інокулят, отриманий після 11-го 17 87665 18 пересівання, переносили в обертову колбу місткісДжерело тканини тю 250мл, яка містила клітини лінії McCoy, і вироПосівний матеріал L. intracellularis і продукуючі щували в суспензії до здійснення збору. Датський організми вирощували в основній лінії клітин ізолят L. intracellularis (реєстраційний номер АТСС McCoy (реєстраційний номер АТСС CRL 1696, РТА-4927) ослабляли шляхом безперервного пеномер партії F-10422). Лінію основних клітин після ресівання in vitro у клітини лінії McCoy протягом 80 10-го пересівання (пересівання X) позначили як тижнів і тестували з метою ідентифікації за допо3894MMCSS. Лінію основних клітин пересівали ще могою моноклональних антитіл. Ослаблений ізо6 разів і позначили як MCS EU McCoy Х+0. Клітини лят був позначений В3903 (позначення В3903, В MCS EU McCoy, пересівання Х+0, зберігали при 3903 й В-3903 у даному описі використовуються температурі -70°С±5°С або при більш низькій темвзаємозамінно). Ізолят B3903 був поміщений відпературі. Одержання вакцини здійснювали в отриповідно до Будапештського договору в Американманої пасивуванням лінії клітин MCS EU McCoy ську колекцію типових культур, 10801 University при 40-ому пересіванні. Boulevard, Манассас, шт. Віргінія 20110-2209, 9 Контейнери для культури січня 2003р. під реєстраційним номером АТСС MCS EU McCoy розмножували в колбах для РТА-4926. культур тканини, які мають площу поверхні 25Культури: 150см2, у клітинних комірках типу Costar, у ролерІдентифікація флаконах, які мають площу 850-22250см2, в оберДля ідентифікації основних (майстер-) і роботових колбах місткістю аж до 40л і в біореакторах чих посівних матеріалів L. intracellularis використооб'ємом 3-500л. вували вимоги до особливостей росту, ПЛРКультури L. intracellularis, призначені для зареакції й реакції з використанням моноклональностосування як посівний матеріал, вирощували в го антитіла. обертових колбах місткістю 250-40000мл, ролерЧистота флаконах, які мають площу 850-2250см2, колбах Чистоту основного посівного матеріалу й родля культур тканини, які мають площу поверхні 25бочого посівного матеріалу L. intracellularis визна150см2, або в біореакторах об'ємом 3-500л. чали шляхом дослідження культур за допомогою Культури L. intracellularis, призначені для одефарбування моноклональними антитілами, звиржання продукту, вирощували в обертових колбах чайних тестів з використанням інших агентів на місткістю 6-40л або в біореакторах об'ємом 3присутність бактерій і вірусів і за допомогою тестів 500л. на стерильність мікоплазми. Методи одержання суспензій для посіву або Вірулентність інокуляції Основні посівні матеріали L. intracellularis були Культури для посіву невірулентними, про що свідчило відсутність здатЗаморожені або свіжі основні або розмножені ності основного посівного матеріалу й інокуляту робочі посівні матеріали L. intracellularis піддавали для зворотного пересівання викликати клінічні розморожуванню при кімнатній температурі симптоми й макроскопічні пошкодження, які спо(25±3°С) або при 37±2°С. Біореактори, обертові стерігалися в чутливої свині після зараження віруколби або флакони, попередньо засіяні клітинами лентної L. intracellularis, що додатково проілюстролінії McCoy із щільністю клітин 50000вано в прикладі 2, нижче. 500000клітин/мл, заражали L. intracellularis у конКількість пересівань центрації 1-10об.% або із множинністю зараження Кінцевий зібраний матеріал при продукуванні (МОI), що становить 0,08-1,0. Заражену культуру L. intracellularis одержували в результаті не більш інкубували при знижених концентраціях кисню ніж 11 пересівань основного посівного матеріалу. шляхом введення в простір над культурою газової Склад середовища суміші, яка містить 86% N2, 4% Н2 й 10% СО2. Основну (майстер-) лінію клітин (MCS) EU Культуру інкубували протягом 3-10 днів при McCoy вирощували й підтримували в модифікова37±2°С, рН6,7-7,3 при безперервному перемішуному за способом Дульбекко середовищі Ігла з ванні (10-100об./хв.) для підтримування перемішудодаванням посиленого середовища Хема F12 вання, необхідного для збереження клітин у су(DMEM/F12) і 1-10об.% сироватки новонароджених спензії. телят (НТС) або фетальної бичачої сироватки Культури для одержання продукту (ФБС) (живильне й підтримуюче середовища). Заморожені або свіжі основні або розмножені Основний і робочий посівний матеріали зберіробочі посівні матеріали L. intracellularis піддавали гали в середовищі DMEM/F12 з додаванням 1розморожуванню при кімнатній температурі 10об.% НТС або ФБС й 5-15об.% гліцерину (осно(25±3°С) або при 37±2°С. Біореактори або обертовне й робоче середовища для зберігання посівнові колби (місткістю 3-500л), попередньо засіяні (за го матеріалу). 0-7 днів до зараження) клітинами лінії McCoy із Кінцевий зібраний продукт зберігали в сахарощільністю клітин 50000-500000клітин/мл, заражали зо-желатиновому стабілізаторі (СЖС) (середовиL. intracellularis у концентрації 1-10об.% або з МОI, ща для зберігання кінцевого продукту). що становить 0,08-1,0. Заражену культуру інкубуРозмноження вали при знижених концентраціях кисню шляхом Основну й робочу культури посівного матеріавведення в простір над культурою газової суміші, лу L. intracellularis розмножували в MCS EU McCoy що містить 96% N2, 4% Н2, або шляхом барботуз використанням описаних вище живильного й вання вказаною сумішшю. Культуру інкубували підтримуючого середовищ для клітин і зберігали протягом 3-8 днів при 37±2°С, рН6,7-1,3 при безпри температурі нижче приблизно -35°С. перервному перемішуванні (10-100об./хв.) для 19 87665 20 підтримування перемішування, необхідного для Клітини й рідкий вміст біореактора, обертових збереження клітин у суспензії. колб і флаконів, у яких знаходилася культура для Методи інокуляції культур посівного матеріалу одержання продукту, частково або повністю збий культур для одержання продукту рали в стерильну посудину для збору. Збір з кожЗдійснювали інокуляцію аж до 10об.% основного біореактора, обертової колби й флакона, у ного або робочого посівного матеріалу (МОІ=0,08яких знаходилася культура для одержання проду1,0) у живильне середовище, яке знаходиться в кту, здійснювали індивідуально або об'єднували біореакторах, обертових колбах або флаконах, яке вміст декількох посудин, додавали СЖС і поміщазасівали за 0-7 днів до інокуляції клітинами лінії ли на зберігання при 1-7°С або при більш низькій McCoy. температурі. Із зібраної культури для одержання Культури для одержання продукту продукту брали зразок для оцінки активності на Здійснювали інокуляцію аж до 10об.% посівнооснові ТСID50 й ідентифікації за допомогою фарго матеріалу для одержання продукту (МОІ=0,08бування методом IFA. 1,0) у відповідний об'єм живильного середовища, Культури для одержання продукту характерищо знаходиться в посудинах об'ємом 3-500л, яке зувалися значенням ТСID50/мл, що становить призасівали за 0-7 днів до інокуляції клітинами лінії наймні 4,9, при фарбуванні методом IFA і не мали McCoy з відповідною щільністю клітин лінії McCoy. ніяких ознак забруднення за даними мікроскопічІнкубація мікроорганізмів ного дослідження. Культури інкубували при 37±2°С протягом 3-10 Одержання продукту у вигляді вакцини днів в атмосфері зі зниженим вмістом кисню при Методи концентрування перемішуванні для підтримання суспензії. Для Продукт у вигляді вакцини можна концентрупродовження процесу росту можна додавати довати різними методами, наприклад, даючи культудаткову кількість середовища й/або клітин лінії рі осадитися й здійснюючи потім декантацію супеMcCoy. рнатанту, шляхом фільтрації через мембрану (з Протягом інкубаційного періоду здійснювали розміром пор 0,22мкм або менш), перфузії або макроскопічну оцінку культур з метою виявлення центрифугування. аномального росту або ознак забруднення. Сахарозо-желатиновий стабілізатор (СЖС) Збір: Гідролізований розчин желатину одержували Обробка й одержання культур шляхом змішування желатину з деіонізованою Культури оцінювали відносно ознак адекватноводою або водою для ін'єкцій до об'єму, що станого бактеріального росту за допомогою фарбування вить приблизно 25% кінцевого об'єму партії СЖС, і за методом непрямої імунофлуоресценції (IFА). гідролізували в автоклаві протягом 120хв. при Готові до збору культури характеризувалися клі121°С. тинною інфікованістю, що становить 60-100%. ВідПотім гідролізований розчин желатину соток інфікованості визначали шляхом вивчення (40,0г/л) змішували з деіонізованою водою або принаймні трьох полів, кожне поле містило кільводою для ін'єкцій до об'єму, що становить прикість клітин лінії McCoy, достатнє для заповнення близно 75% кінцевого об'єму партії СЖС. Додавапринаймні 80% площі. Культура вважалася зарали гідроксид калію аналітичної чистоти (AR) женою, якщо приблизно 50% клітин містили бакте(0,548г/л), L-глутамінову кислоту (1,440г/л), вторії. ринний кислий фосфат калію (AR) (2,508г/л), перАктивність зібраної культури тестували шлявинний кислий фосфат калію (AR) (1,030г/л) і сахом титрування зразка клітин лінії McCoy, які фікхарозу (AR) (150,00г/л) і розчин ретельно сували й фарбували з використанням специфічноперемішували. Потім значення рН стабілізатора го моноклонального антитіла (моноклонального доводили до 6,8-7,0 за допомогою розчинів соляантитіла до L. intracellularis VPM 53 партія 31599 ної кислоти або гідроксиду натрію. Додавали деіоабо його еквівалента); кон'югата антимишиний нізовану воду або воду для ін'єкцій для доведення IgG-флуоресцеїн (ФІТЦ) (ICN No.55499) після 6 об'єму до 100% необхідного кінцевого об'єму днів інкубації при 37±2°С. СЖС. Повний стабілізатор ретельно перемішували Робили візуальну оцінку культур для виявленй весь розчин стерилізували фільтрацією через ня будь-яких помітних ознак забруднення. Збір фільтр із розміром отворів 0,1мкм. здійснювали через 3-10 днів після інокуляції. Приклад складу компонентів для приготування Методи збору й специфікації партії наведений у таблиці 1: Таблиця 1 L. intracellularis Сахарозо-желатиновий стабілізатор (СЖС) DMEM/F12 (можна додавати для стандартизації продукту) Загальний об'єм Об'єм середньої партії становив 50-500л. Ліофілізація Продукт у вигляді вакцини ліофілізували відповідно до процедури, наведеної в таблиці 2 для 200000-300000мл 100000мл (25об.%) 0-150000мл 400000мл циклу виготовлення 10 доз (об'єм кожної 6,0мл) або в таблиці 3 для циклу виготовлення 50/100 доз (об'єм кожної 10,0мл). 21 87665 22 Таблиця 2 Стадії Попереднє охолодження* Заморожування 1-а стадія сушіння, 1-ий етап 1-а стадія сушіння, 2-ий етап 2-а стадія сушіння, 1-ий етап 2-а стадія сушіння, 2-ий етап °С 5° -47°±3° -15°±2° 0°±2° 32°±2° 26°±2° Швидкість (хв.) NA Якнайшвидше 120 120 240 240 Витримування (хв.) NA 150 120 180 180 Якнайшвидше Тиск (мТорр) Атм. Атм. 100-150 100-150 60-80 60-80 Загальний час: 1352хв. (22,5год.) * Полиці попередньо охолоджували до 5°±2°С при завантаженні ліофілізатору. NA - не потрібно задавати Таблиця 3 Стадії Попереднє охолодження* Заморожування 1-а стадія сушіння 2-а стадія сушіння °С 5° -48°±3° -15°±2° 26°±2° Тривалість (хв.) NA 60 60 60 Витримування (хв.) NA 90 1500 600 Тиск (мТорр) Атм. Атм. 100-150 60-80 Загальний час: 2370хв. (39,5год.) * Полиці попередньо охолоджували до 5°±2°С при завантаженні ліофілізатору. NA - не потрібно задавати Приклад 2 Безпека вакцини L. Intracellularis Ціль: Дане дослідження мало дві мети. Перша мета даного дослідження полягала в оцінці й порівнянні випадків захворювання, які викликаються трьома різними ізолятами L. intracellularis, отриманими після невеликої кількості пересівань (два минулі виявлені в США й один мав європейське походження) у свиней 6,5-тижневого віку. Другою метою була оцінка безпеки двох ізолятів L. intracellularis, отриманих після великої кількості пересівань (обидва мали європейське походження), на свинях 6,5-тижневого віку. Матеріали й методи: Тестовані субстанції 1. L. intracellularis, U.S.-ізолят (ізолят, виявлений у США) N343, отриманий після невеликої кількості пересівань; 2. L. intracellularis, U.S.-ізолят N101494, отриманий після невеликої кількості пересівань N101494; 3. L. intracellularis, EU-ізолят (ізолят європейського походження) DK 15540 р20, отриманий після невеликої кількості пересівань; 4. L. intracellularis, EU-ізолят DK 15540 р60, отриманий після великої кількості пересівань; 5. L. intracellularis, EU-ізолят DK 15540 р80 (основний посівний матеріал, позначений В3903). Приготування тестованих субстанцій Ізоляти, отримані після невеликої кількості пересівань, вирощували безперервно протягом 1020 тижнів після виділення в суспензії клітин лінії McCoy. Ізоляти, отримані після великої кількості пересівань, вирощували безперервно протягом 60-80 тижнів після виділення в суспензії клітин лінії McCoy. Всі культури збирали центрифугуванням при 10000об./хв. протягом 15хв. Дебрис культури клітин лінії McCoy, що містять Lawsonia, ресуспендували в сахарозо-фосфат-глутаміновому (СФГ) розчині, доповненому 10% ФБС. Зберігання тестованих субстанцій Зібрані культури зберігали при -70°С до дня здійснення контрольного зараження. Використовувані для контрольного зараження культури того самого ізоляту, але зібрані в різні дні, піддавали розморожуванню й об'єднували в пластикових флаконах для вакцини, постачали ярликом і поміщали на зберігання при 4°С або на льоді до дня здійснення контрольного зараження. Аналіз тестованих субстанцій Значення TCID50 визначали для всіх об'єднаних ізолятів, використовуваних для контрольного зараження, у момент здійснення контрольного зараження (день 0). Середні титри (n=3) (ТСID50/мл) наведені нижче в таблиці 4: Таблиця 4 Тестована субстанція L. intracellularis N343 L. intracellularis N101494 L. intracellularis DK 15540 p20 L. intracellularis DK 15540 p60 L. intracellularis DK 15540 p80 Середній титр (ТСID50/мл) 6,4 6,1 6,2 6,87 7,4 План дослідження Дослідження проводили на п'ятьох експериментальних групах й одній контрольній групі. У день 0 дослідження групі 1 (10 свиней 6,5тижневого віку) вводили одну дозу 10мл або еквівалентну внутрішньошлункову (ВШ) дозу USізоляту N343 L. intracellularis, отриманого після 23 87665 24 невеликої кількості пересівань. Групі 2 (10 свиней зараження (день 0) і до закінчення дослідження 6,5-тижневого віку) вводили одну дозу 10мл або (день 21) оцінювали в балах (бальна шкала від 1 еквівалентну ВШ-дозу US-ізоляту N101494 L. до 4) клінічний стан здоров'я (поведінка, апетит, intracellularis, отриманого після невеликої кількості стан тіла, волосяний покрив і консистенцію випопересівань. Групі 3 (10 свиней 6,5-тижневого віку) рожнень). Розраховували середній добовий привводили одну дозу 10мл або еквівалентну ВШріст ваги (СДПВ) починаючи від дня контрольного дозу EU-ізоляту DK15540 р20 L. intracellularis, зараження (день 0) і до закінчення дослідження отриманого після невеликої кількості пересівань. (день 21). Виділення L. intracellularis з фекаліями Групі 4 (10 свиней 6,5-тижневого віку) вводили оцінювали в дні 0, 7, 14 й 21. Одна тварина (із груодну дозу 10мл або еквівалентну ВШ-дозу EU ізопи 1), яка загинула в процесі дослідження, була ляту DK15540 р60 (60 тижнів) L. intracellularis, обстежена у відношенні макроскопічних і мікроскоотриманого після великої кількості пересівань. пічних пошкоджень. Було встановлено, що смерть Групі 5 (20 свиней 6-тижневого віку) вводили одну наступила в результаті пошкоджень, зв'язаних з дозу 10мл або еквівалентну дозу EU-ізоляту DK ПЕС, що було підтверджено гістологічним і ПЛР15540 р80 L. intracellularis, отриманого після велианалізом, тварину, яка загинула, не заміняли. Якікої кількості пересівань. Групу 6 (10 свиней 6,5сний аналіз присутності Lawsonia у фекаліях протижневого віку) позначену як "строгі контролі" не водили за допомогою ПЛР поряд з гістологічною піддавали обробці. оцінкою присутності L. intracellularis у клубової киЗ моменту початку дослідження й до дня контшці й ободовій кишці. Зразки сироватки брали в рольного зараження відповідних піддослідних твадні 0, 7, 14 й 21 дослідження. рин щодня здійснювали спостереження за станом Результати здоров'я. Щодня, починаючи від дня контрольного Узагальнення результатів дослідження Таблиця 5 Група 1 2 3 4 5 6 У свиТитр Виділення з Макроскопічні Клінічні Серологія ПЛР FA Гістологія СДПВ ней (TCID50/мл) фекаліями пошкодження бали N343 9 7,4 19% 11% 0% 11% 44% 1 0,61 5,23 N101494 10 7,1 10% 10% 10% 30% 30% 1,2 0,8 5,15 DK15540p20 10 7,2 18% 13% 30% 10% 20% 1,2 0,86 5,01 DK15540p60 10 7,87 5% 0% 0% 0% 10% 1 0,9 5 DK15540p80 20 8,4 0% 0% 0% 0% 0% 1 1,05 5 Строгі конт10 0 0% 0% 0% 0% 0% 1,05 0,91 5 ролі Обробка Загальні спостереження До здійснення контрольного зараження проводили щоденні обстеження стану здоров'я. Клінічний стан тварин оцінювали щодня після контрольного зараження протягом періоду дослідження. Показники включали: поведінку, апетит, стан тіла, волосяний покрив і консистенцію випорожнень. Клінічний стан цих тварин оцінювали на основі числової бальної системи, яка відображає серйозність захворювання. Діапазон балів для кожного параметра становив від 1 до 4. Бал 1 давали тварині з нормальним здоровим зовнішнім виглядом, бал 3 давали тварині, яка має серйозні клінічні симптоми, а бал 4 - загиблій тварині. Середній щоденний бал для строгих контролів, DK15540 р60 й DK15540 р80, становив 5,0. Середні щоденні бали для груп, оброблених матеріалами, отриманими після невеликої кількості пересівань, становили: 5,23 для N343, 5,15 для N101494 й 5,01 для DK15540 р20. Статистичний аналіз цих результатів з використанням критерію рангової суми КрускалаУолліса не виявив відмінностей між групами обробки й контрольних груп. Середні добові прирости ваги (СД11В) Середні добові прирости ваги розраховували з моменту контрольного зараження (день 0) і до закінчення дослідження (день 21). Середній добовий приріст ваги в групі строгого контролю становив 0,9 фунта. Середній добовий приріст ваги в групах, оброблених матеріалом, отриманим після невеликої кількості пересівань, становив лише 0,6 (N343), 0,8 (N101494) і 0,86 (DK15540 р20) фунта/день. У групах, оброблених матеріалом, отриманим після великої кількості пересівань, відбувався такий же або більший добовий приріст ваги, що й у групі строгого контролю, яку не піддавали контрольному зараженню, а саме 0,9 фунта/день (DK15540 р60) і 1,05 фунта/день (DK15540 р80) відповідно. У день 21 дослідження середня різниця в середньому добовому приросту ваги в групі, обробленій N343, була значно меншою, ніж у групах оброблених матеріалом, отриманим після великої кількості пересівань (DK15540 р60 й р80), і в групі строгого контролю (р