Спосіб одержання ліпідів з біомаси

Реферат: Винахід належить до способу одержання ліпідів з біомаси, який передбачає піддавання зазначеної біомаси кислотному гідролізу у присутності водного розчину щонайменше одної UA 103205 C2 (12) UA 103205 C2 органічної кислоти, вибраної з алкіл- або арил-сульфонових кислоти, які мають С7-С20 атомів карбону, бажано від С9 до С15 атомів карбону, або з галогенованих карбонових кислот, при температурі від 80 °C до 160 °C, бажано від 100 °C до 150 °C, з одержанням першої суміші, яка включає першу тверду фазу і першу водну фазу, піддавання зазначеної першої суміші ферментативному гідролізу з одержанням другої суміші, яка включає другу тверду фазу і другу водну фазу та піддавання зазначеної другої водної фази ферментації у присутності щонайменше одних жирових дріжджів з одержанням жирової клітинної біомаси, що включає ліпід. UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід стосується способу виробництва ліпідів з біомаси, яка містить щонайменше один полісахарид. Зокрема, винахід стосується способу виробництва ліпідів з біомаси, яка містить щонайменше один полісахарид, який включає піддавання зазначеної біомаси кислотному гідролізу, піддавання суміші, отриманої в результаті зазначеного кислотного гідролізу, ферментативному гідролізу, і піддавання цукрів, отриманих в результаті зазначеного гідролізу, ферментації у присутності щонайменше одних жирових дріжджів. Ліпід, отриманий у такий спосіб, можна використовувати у виробництві біодизелю або сирого дизельного палива, які можуть бути використані як такі або у суміші з іншими паливами для моторних транспортних засобів. Взагалі біомасою є будь-яка речовина з органічною, рослинною або тваринною основою, яка може бути призначена для енергетичних потреб, наприклад, як сировина для виробництва біопалив або компонентів, що можуть бути додані до палив. Отже, біомаса може утворювати відновлюване джерело енергії як альтернативу для традиційної сировини викопного походження, яку звичайно використовують у виробництві палив. Для цього, зокрема, використовують лігноцелюлозну біомасу. Відомим є виробництво цукрів з біомаси, зокрема, з лігноцелюлозної біомаси. Лігноцелюлозна біомаса є комплексною структурою, яка включає три головні компоненти: целюлозу, геміцелюлозу і лігнін. їх кількості можуть варіюватись згідно з способом використання лігноцелюлозної біомаси. У випадку рослин, наприклад, зазначені кількості залежать від виду і віку рослини. Целюлоза є найбільшою складовою частиною лігноцелюлозної біомаси і звичайно присутня у кількості від 30 мас% до 60 мас% відносно повної маси лігноцелюлозної біомаси. Целюлоза складається з молекул глюкози (від приблизно 500 до 10000 одиниць) з'єднаних одна з одною через (3-1,4 глюкозидний зв'язок. Встановлення водневих зв'язків між ланцюгами викликає утворення кристалічних доменів, які забезпечують стійкість і еластичність рослинних волокон. У природі їх можна спостерігати у чистому вигляді у однолітніх рослин, наприклад, бавовні і льоні, а у лігнінних рослинах вони завжди супроводжуються геміцелюлозою і лігніном. Геміцелюлоза, звичайно присутня у кількості від 10 мас% до 40 мас% відносно повної маси лігноцелюлозної біомаси, і виглядає як змішаний відносно короткий розгалужений полімер (10200 молекул), побудований з цукрів з 6 атомів карбону (глюкози, манози, галактози) і цукрів з 5 атомами карбону (ксилози, арабінози). Деякі важливі властивості рослинних волокон зумовлюються наявністю геміцелюлози, головною властивістю якої є сприяння імбібіції зазначених рослинних волокон у присутності води, яке викликає їх розбухання. Геміцелюлоза також має адгезивні якості і тому має здатність до цементації або створення рогоподібної консистенції, завдяки чому зазначені рослинні волокна стають жорсткими і абсорбуються більш повільно. Вміст лігніну звичайно становить 10 % - 30 мас% відносно повної маси лігноцелюлозної біомаси. Його головна функція полягає у зв'язуванні і цементації різних рослинних волокон і наданні рослині компактності і стійкості, а також наданні захисту проти комах, патогенів, пошкоджень і ультрафіолету. Він звичайно використовується як паливо, але останнім часом широко використовується у промисловості як диспергатор, отверджувач, емульгатор для пластикових ламінатів, картонів і гумових виробів. Він може також бути хімічно оброблений для отримання ароматичних сполук, ваніліну, жасмінного альдегіду, п-гідроксибензальдегіду, які можуть бути використані у фармацевтичній хімії або у косметичній і харчовій промисловості. Для оптимізації перетворення лігноцелюлозної біомаси у продукти для енергетичного використання зазначену біомасу попередньо обробляють для відділення лігніну і гідролізу целюлози і геміцелюлози у прості цукри, наприклад, глюкозу і ксилозу. Ці цукри можуть бути використані як джерела карбону у ферментативних процесах у присутності мікроорганізмів для виробництва спиртів і/або ліпіду. У заявці на патент US 2008/0102176, наприклад, описано спосіб екстракції рослинних жирів, який включає: розпилення целюлозовмісної сировини для отримання часток діаметром 1-2 мм; занурення цих часток у сульфатну кислоту концентрацією 1-2 % для підкислення зазначених часток і підвищення цим гідролізу целюлози і доведення рН до 4,5+0,5; видалення часток, підкислених сульфатною кислотою, і додання послідовно целюлаза і жирових дріжджів до підкислених часток і ферментацію протягом 8-9 днів при температурі 25-30 °C і вологості 8590 %; додання аліфатичного вуглеводню як розчинника до продуктів ферментації для екстракції жирів і отримання екстракційної суміші; відділення залишку підкислених часток з екстракційної суміші і відділення жирів від розчинника дистиляцією з отриманням сирого масла. Бажаною целюлазою є Trichoderma viride, а жировими дріжджами - Rhodotorula glutinis. Отримані жири можуть бути перетворені у біодизель естерифікацією. 1 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У Dai et al. "Biodiesel generation from oleaginous yeast.Rhodotorula glutinis with xylose assimilating capacity" (African Journal of Biotechnology, (2007), Vol. 6 (18), p.p. 2130-2134) описано виробництво біодизелю з жирових дріжджів, а саме, лігноцелюлозну біомасу подрібнюють і піддають кислотному гідролізу у присутності сульфатної кислоти. Отримані цукри використовують як джерело карбону у ферментаційному процесі у присутності заздалегідь вибраного штаму Rhodotorula glutinis, придатному також для використання пентози, ксилози, зокрема, для отримання олій, які потім екстрагують Soxhlet і піддають трансестерифікації для отримання біодизелю. Описані процеси мають ряд вад. Для гідролізу обох полісахаридних компонентів біомаси (наприклад, геміцелюлози і целюлози), зокрема, у присутності розрідженої сульфатної кислоти (наприклад, при концентраціях 0,5 % - 11 %) необхідно забезпечувати високу температуру (наприклад, вище 160 °C). При таких температурах відбувається утворення співпродуктів дегідратації цукрів і часткової деполімеризації лігніну. Ці співпродукти, зокрема, фурфураль, гідроксиметил фурфураль, фенольні сполуки, можуть діяти як інгібітори мікроорганізмів, що використовуються у подальших цукрових ферментаційних процесах. Крім того, у присутності розрідженої сульфатної кислоти вихід цукру, зокрема, глюкози, є звичайно низьким (наприклад, нижче 50 %). Перед піддаваннями цукру ферментації може виявитись необхідним нейтралізувати сульфатну кислоту для доведення рН до значень, прийнятних для подальшої ферментації. Нейтралізацію звичайно проводять доданням оксидів і/або гідроксидів, наприклад, оксиду кальцію, гідроксиду кальцію або гідроксиду барію з подальшим утворенням солей (наприклад, сульфату кальцію дигідросульфату кальці ("гіпсу"), сульфату барію), які осаджуються і мають бути відділені від цукрів перед ферментацією. Крім того, ці солі мають бути у подальшому усунуті відповідною обробкою, яка підвищує виробничі витрати. Зазначені неорганічні кислоти неможливо відновити і повторно використати. Було виявлено, що виробництво ліпідів з біомаси, зокрема, з біомаси, що включає щонайменше один полісахарид, може бути успішно здійснене процесом, який включає кислотний гідроліз зазначеної біомаси у присутності водного розчину щонайменше одної органічної кислоти при температурі не вище 160 °C, піддавання суміші, отриманої в результаті зазначеного кислотного гідролізу, ферментативному гідролізу і піддавання отриманого цукру ферментації у присутності щонайменше одних жирових дріжджів. Цей спосіб має багато переваг. Він забезпечує, наприклад, високий вихід пентозних і гексозних цукрів в результаті кислотного гідролізу зазначеної біомаси, які можуть бути у подальшому використані як джерела карбону у ферментаційних процесах виробництва ліпідів. Зазначений ліпід може бути використаний у виробництві біодизелю або сирого дизельного палива, які можуть бути використані як такі або змішані з іншими паливами для моторних транспортних засобів. Крім того, цей спосіб не потребує високих температур, тобто таких, що перевищують 160 °C і забезпечує зниження утворення співпродуктів, наприклад, фурфуралю, гідроксиметил фурфуралю, фенольних сполук, які можуть діяти як інгібітори мікроорганізмів, що звичайно використовуються у подальших ферментаційних процесах цукрів. Інша суттєва перевага полягає у тому, що зазначений спосіб дозволяє відновлення органічної кислоти з подальшою рециклізацією, зокрема, у кислотний гідроліз біомаси. Зазначене відновлення також дозволяє уникнути операції нейтралізації і, отже, утворення солей і їх подальшого усунення. Ще одною перевагою є те, що волога тверда фаза містить уламки клітин, зокрема, білки і полісахариди, що містяться у мембрані клітин жирових дріжджів і наприкінці ферментації можуть бути відновлені і використані в описаних вище процесах, зокрема, у кислотному гідролізі. Кислотний гідроліз цієї вологої твердої фази дозволяє отримати амінокислоти з білків і цукри з полісахаридів, які потім потрапляють в операцію ферментації, завдяки чому знижується кількість нітрогену, який має бути звичайно доданий до культурного середовища, в якому відбувається ферментація, і отримати додаткові цукри для ферментації. Задачею винаходу є спосіб виробництва ліпідів з біомаси, що містить щонайменше один полісахарид, і включає: - піддавання зазначеної біомаси кислотному гідролізу у присутності водного розчину щонайменше одної органічної кислоти, вибраної з алкіл- або арил-сульфонових кислоти, які мають С7 - С20 атомів карбону, бажано, від С9 до С15 атомів карбону, або з галогенованих карбонових кислот, при температурі від 80 °C до 160 °C, бажано, від 100 °C до 150 °C, з отриманням першої суміші, яка включає першу тверду фазу і першу водну фазу; 2 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - піддавання зазначеної першої суміші ферментативному гідролізу з отриманням другої суміші, яка включає другу тверду фазу і другу водну фазу; - піддавання зазначеної другої водної фази ферментації у присутності щонайменше одних жирових дріжджів з отриманням жирової клітинної біомаси, що включає ліпід. У даному описі і у Формулі винаходу визначення числових меж завжди включають екстремальні значення, якщо не зазначено інше. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначений полісахарид може бути вибраний з целюлози, геміцелюлози або їх суміші. Бажаними є целюлоза або суміші геміцелюлози і целюлози. Згідно з іншим бажаним втіленням винаходу, зазначена біомаса є лігноцелюлозною біомасою. Як було відзначено, лігноцелюлозна біомаса включає три компоненти: геміцелюлозу, целюлозу і лігнін. Зазначену лігноцелюлозну біомасу бажано вибирати з: - продуктів культур, що вирощуються для енергетичного використання (наприклад, міскантусу, проса, звичайної тростини), включаючи співпродукти, залишки і відходи зазначених культур або їх обробки; - продуктів сільського господарства, лісорозведення і лісництва, включаючи деревину, рослини, залишки і співпродукти сільськогосподарського виробництва, лісорозведення і лісництва; - сільськогосподарських співпродуктів, призначених для харчування людей, або зоотехнічних залишків без хімічної обробки, або паперової промисловості; - продуктів відходів з зібраних диференційованих твердих міських відходів (наприклад, міських відходів рослинного походження, паперу). Згідно з одним з бажаних втілень винаходу, зазначена біомаса може бути піддана попередньому подрібненню перед операцією кислотного гідролізу. Зазначену біомасу бажано подрібнювати до отримання часток діаметром від 0,1 до 10 мм, більш бажано, від 0,5 до 4 мм. особливо бажаними є частки діаметром менше 1 мм. Згідно з іншим бажаним втіленням винаходу, зазначена біомаса присутня у реакційній суміші у кількості від 5 % до 40 мас%, бажано, від 20 % до 35 мас% відносно повної маси реакційної суміші. В описі і формулі винаходу термін "реакційна суміш" означає суміш, що включає біомасу і водний розчин зазначеної щонайменше одної органічної кислоти. Згідно з ще одним бажаним втіленням винаходу, зазначена щонайменше одна органічна кислота є розчинною у воді і може бути екстрагована органічним розчинником, нерозчинним у воді. В описі і формулі винаходу термін "органічна кислота, розчинна у воді" означає органічну кислоту, розчинну у дистильованій воді при 25 °C у кількості щонайменше 0,5 г/100 мл дистильованої води, бажано, щонайменше 2 г/100 мл дистильованої води. В описі і формулі винаходу термін "органічна кислота, яка може бути екстрагована органічним розчинником, нерозчинним у воді" означає органічну кислоту, яка може бути екстрагована органічним розчинником, нерозчинним у воді з виходом щонайменше 80 %, бажано, щонайменше 90 %, обчисленим відносно повної кількості органічної кислоти у водному розчині. В описі і формулі винаходу термін "органічний розчинник, нерозчинний у воді" означає органічний розчинник, розчинний у воді при 25 °C у кількості менше 4 % за об'ємом, бажано, менше 2 % за об'ємом. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначені алкіл- або арил-сульфонові кислоти можуть бути вибрані з: додецил-сульфонової кислоти, пара-толуол-сульфонової кислоти 1-нафталінсульфонової кислоти, 2-нафталін-сульфонової кислоти, 1,5-нафталін-дисульфонової кислоти або їх сумішей. Бажаними є пара-толуол-сульфонова кислота, 2-нафталін-сульфонова кислота, 1,5-нафталін-дисульфонова кислота або їх суміші. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначені галогеновані карбонові кислоти можуть бути вибрані з тих, що мають не більше 20 атомів карбону, бажано, від 2 до 15, наприклад, трифлуороцтової кислоти, дихлороцтової кислоти, трихлороцтової кислоти, перфлуороктанової кислоти або їх сумішей. Згідно з іншим бажаним втіленням винаходу, зазначена щонайменше одна органічна кислота у водному розчині має концентрацію від 0,1 % до 5 мас%, бажано, від 0,5 % до 2,5 мас% відносно повної маси водного розчину. Зазначені органічні кислоти діють як каталізатор кислотного гідролізу зазначеної біомаси, , зокрема, коли початковою біомасою є лігноцелюлозна біомаса, зазначена органічна кислота діє 3 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 як каталізатор кислотного гідролізу геміцелюлози. Слід зазначити, що спосіб згідно з винаходом у випадку, коли початковою біомасою є лігноцелюлозна біомаса, не лише забезпечує кислотний гідроліз геміцелюлози, але також поліпшує стан целюлози, тобто зазначена целюлоза залишається суттєво негідролізованою для подальшого ферментативного гідролізу завдяки поліпшеній деструктуризації початкової біомаси. Згідно з ще одним бажаним втіленням винаходу, зазначений кислотний гідроліз може бути проведений протягом від 20 хвил. до 6 год., бажано, від 30 хвил. до 3 год. Зазначений кислотний гідроліз може бути проведений у реакторах, відомих у галузі, наприклад, автоклавах або екструдерах. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначена перша тверда фаза включає лігнін і целюлозу і зазначена перша водна фаза включає щонайменше один цукор, який має від С 5 до С8 атомів карбону, і зазначену щонайменше одну органічну кислоту. Бажаним зазначеним цукром є ксилоза, бажано, отримана кислотним гідролізом геміцелюлози. Зазначений кислотний гідроліз дає щонайменше один цукор з С 5 - С6 атомами карбону, зокрема, ксилозу, отриману кислотним гідролізом геміцелюлози з високим виходом. Зокрема, зазначений кислотний гідроліз забезпечує вихід не менше 80 %, обчислений відносно повної кількості ксилози у початковій біомасі. Зазначений кислотний гідроліз також забезпечує високий вихід целюлози і лігніну. Для відновлення зазначеної щонайменше одної органічної кислоти зазначена перша суміш може бути піддана екстракції органічним розчинником, розчинним у воді. Згідно з іншим бажаним втіленням винаходу, зазначений спосіб також включає піддавання зазначеної першої суміші екстракції щонайменше одним органічним розчинником, нерозчинним у воді. Бажано, щоб зазначений органічний розчинник, нерозчинний у воді, був вибраний з: галогенованих вуглеводнів, наприклад, метиленхлориду, монохлорбензолу, дихлорбензолу або їх сумішей; ароматичних вуглеводнів, наприклад, толуолу, ксилолу або їх сумішей; аліфатичних спиртів, які мають від С4 до С6 атомів карбону, наприклад, н-бутанолу, н-пентанолу або їх сумішей. Бажаними є суміші толуолу і н-бутанолу. Зазначений органічний розчинник, нерозчинний у воді, потім випарюють і отримують додаткову тверду фазу, яка включає зазначену щонайменше одну органічну кислоту. Як було відзначено, спосіб згідно з винаходом дозволяє виділяти зазначену щонайменше одну органічну кислоту з високим виходом, зокрема, з виходом щонайменше 80 %, бажано, щонайменше 90 %, обчисленим відносно повної кількості цієї кислоти у зазначеному водному розчині. Зазначена щонайменше одна органічна кислота може бути у подальшому використана повторно згідно з способом винаходу. Слід відзначити, що, коли відновлення зазначеної щонайменше одної органічної кислоти становить 100 %, зазначена перша водна фаза буде вільною від зазначеної щонайменше одної органічної кислоти. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначений спосіб також включає повторне використання зазначеної щонайменше одної органічної кислоти у зазначеному кислотному гідролізі. Згідно з способом винаходу, зазначений ферментативний гідроліз може проведений, як це описано, наприклад, у патентах США US 5 628 830, US 5 916 780 і US 6 090 595, з використанням комерційних ферментів, наприклад, Celluclast 1,5L (Novozymes), Econase CE (Rohm Enzymes), Spezyme (Genecor), Novozym 18 8 (Novozymes), індивідуально або у суміші один з одним. Для доведення рН до значень 4-6, бажано, 4,5-5,5, до зазначеної першої суміші перед ферментативним гідролізом може бути додана льодяна оцтова кислота у належній кількості. Згідно з іншим бажаним втіленням винаходу, зазначена друга тверда фаза включає лігнін і зазначена друга водна фаза включає щонайменше один цукор, який має від С5 до С6 атомів карбону, бажано, ксилозу, глюкозу, целобіозу або їх суміші. Зокрема, зазначена друга водна фаза включає ксилозу, отриману з кислотного гідролізу геміцелюлози, глюкозу і целобіозу, отримані з ферментативного гідролізу целюлози. Зокрема, цей ферментативний гідроліз забезпечує високий вихід глюкози, зокрема, більше 90 %, обчислений відносно повної кількості глюкози у початковій біомасі. Кількості цукрів у початковій біомасі, а також кількості цукрів, отриманих після гідролізу (кислотного і/або ферментативного), можуть бути визначені відомими способами, наприклад, рідинною хроматографією високої ефективності (РХВЕ). Зазначена друга тверда фаза і зазначена друга водна фаза можуть бути відокремлені відомими способами, наприклад, фільтрацією, центрифугуванням. Зазначені фази бажано відокремлювати фільтрацією. 4 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Зазначена друга тверда фаза, що включає лігнін, може бути доведена до паливної якості, наприклад, як паливо для генерування енергії, потрібної для підтримання процесів обробки біомаси. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначена ферментація може бути проведена при температурі від 20 °C до 40 °C, бажано, від 25 °C до 35 °C, протягом 3-10 днів, бажано, 4-8 днів, при рН від 4,5 до 6,5, бажано, від 5 до 6. Для підтримання рН у бажаних межах до культурного середовища, що використовується для ферментації, можна додавати водний розчин щонайменше одної неорганічної основи, наприклад, гідроксиду натрію, гідроксиду калію, гідроксиду кальцію, гідроксиду магнію або їх сумішей у кількості, необхідній для бажаного рН. Згідно з іншим бажаним втіленням винаходу, зазначені жирові дріжджі можуть бути вибрані з: Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Lipomices starkeyi, Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis, Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Pichia stipitis, Torulopsis sp. Згідно з ще одним бажаним втіленням винаходу, зазначена ферментація є пакетною ферментацією. Перед використанням у зазначеній ферментації зазначені жирові дріжджі бажано вирощувати у культурному середовищі, яке містить ксилозу, целобіозу, глюкозу або їх суміші у концентрації, бажано, від 1 % до 2 мас% відносно повної маси зазначеного культурного середовища. Зазначену ферментацію можна проводити у відомих у галузі бродильних чанах у присутності придатного для цього культурного середовища, яке містить живильні компоненти, наприклад, нітроген, фосфат калію, магній, солі, вітаміни. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначений спосіб також включає піддавання зазначеної жирової клітинної біомаси механічній обробці, яку можна проводити на звичайному обладнанні відомими способами. Зазначену механічну обробку можна проводити, наприклад, використовуючи гомогенізатори високого тиску, бажано, під тиском від 300 до 500 бар (наприклад, гомогенізатор Polytron), або "French press cell". Механічну обробку бажано проводити на French press cell під тиском від 20 до 50 кфунт/кв. дюйм (1400-3500 ат), бажано, від 35 до 45 кфунт/кв. дюйм (2450-3150 ат). Для концентрації жирової клітинної біомаси перед механічною обробкою, зазначену біомасу можна центрифугувати. Зазначене центрифугування можна проводити протягом від 5 до 30 хвил., бажано, від 15 до 25 хвил., з швидкістю від 3000 до 9000 об./хвил., бажано, від 4000 до 8000 об./хвил. Для деактивації ліполітичних ферментів (наприклад, ліпази), зазначену жирову клітинну біомасу перед механічною обробкою можна піддати термічній обробці. Зазначена термічна обробка може бути проведена при температурі від 70 °C до 90 °C, бажано, від 75 °C до 85 °C протягом від 30 хвил. до 3 год., бажано, від 1 до 2 год. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначений спосіб після механічної обробки включає піддавання зазначеної жирової клітинної біомаси центрифугуванню протягом від 5 до 30 хвил., бажано, від 10 до 25 хвил., при швидкості від 3000 до 9000 об./хвил., бажано, від 4000 до 8000 об./хвил. Після центрифуги утворюються такі фази: (і) олійна фаза, що включає ліпід; (іі) водна фаза, що включає залишки невідділеного ліпіду і неферментовані цукри; (ііі) волога тверда фаза, що включає уламки клітин і залишки невідділеного ліпіду. Спосіб згідно з винаходом дозволяє відновлювати ліпід з виходом у межах від 50 % до 90 %, бажано, від 55 % до 80 %, обчисленого відносно повної кількості ліпідів у жировій клітинній біомасі, отриманій після ферментації. Бажано, щоб ліпіди, що містяться у зазначеній олійній фазі (і), були тригліцеридами, більш бажано, естерами гліцерину з жирними кислотами, які мають від С14 до С20 атомів карбону, наприклад, пальмітиновою кислотою, стеариновою кислотою, олеїновою кислотою, αлінолеїновою кислотою, у кількості не менше 80 %, бажано, не менше 90 мас% відносно повної маси ліпідів. Іншими ліпідами, які можуть бути присутні у зазначеній олійній фазі, є фосфоліпіди, моногліцериди, дигліцериди або їх суміші. Кількість ліпідів у жировій клітинній біомасі, отриманій після ферментації, а також кількість ліпідів у зазначеній олійній фазі можуть бути визначені відомими способами, наприклад, колориметрією, базуючись на реакції ліпідів з фосфорною кислотою і фосфо-ваніліном: Подальші деталі стосовно цього способу можна знайти, наприклад, у "Chemical Basis of Sulpho 5 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 phospho-vanillin Reaction for Estimating Total Serum Lipid", J. A. Knight et al., "Clinical Chemistry" (1972), Vol. 18, No. 3, p…p. 199-202. Як було відзначено, волога тверда фаза (ііі) містить уламки клітин, зокрема, білки і полісахариди, що містяться у мембрані клітин жирових дріжджів, і може бути виділена і використана у способі винаходу, зокрема, у кислотному гідролізі. Білки і полісахариди мембрани гідролізують до амінокислот і простих цукрів (наприклад, глюкози, манози), які можуть бути використані як джерело нітрогену і карбону у подальшій ферментації. Важливим є те, що відновлення і використання зазначеної вологої твердої фази (ііі) дозволяють подачу нітрогену у культурне середовище ферментації, знижуючи кількість нітрогену, що звичайно додають до культурного середовища, в якому проходить ферментація, і забезпечує додаткові цукри для ферментації. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначений спосіб також полягає у піддаванні зазначеної вологої твердої фази (ііі) кислотному гідролізу. У цьому випадку зазначена перша водна фаза на додаток до зазначеного щонайменше одного цукру з С 5 - С6 атомами карбону і зазначеної щонайменше одної органічної кислоти, міститиме амінокислоти і прості цукри (наприклад, глюкозу і манозу), отримані в результаті кислотного гідролізу білків і полісахаридів мембрани, а зазначена перша тверда фаза міститиме на додаток до целюлози і лігніну негідролізовані уламки клітин. Для отримання високого виходу ліпідів, тобто вище 90 %, зазначену водну фазу (іі) і/або зазначену вологу тверду фазу (ііі) можна екстрагувати розчинником або сумішшю спирт/розчинник. Згідно з бажаним втіленням винаходу, зазначений спосіб також включає екстракцію зазначеної водної фази (іі) і/або зазначеної вологої твердої фази (ііі) щонайменше одним розчинником, який може бути вибраний з аліфатичних вуглеводнів, які мають від С 3 до С10 атомів карбону, наприклад, пентану, n-гексану, октану або їх сумішей; або сумішшю, що включає щонайменше один аліфатичний спирт, який має від С3 до С5 атомів карбону і може бути вибраний, наприклад, з ізопропанолу, н-бутанолу і їх сумішей, і щонайменше один аліфатичний вуглеводень, який має від С3 до С10 атомів карбону і вибраний з зазначених вище. Зазначений органічний розчинник і/або зазначену суміш потім випарюють і отримують додаткову олійну фазу, що включає ліпід, додаткову водну фазу, що включає неферментовані цукри і додаткову вологу тверду фазу, що включає уламки клітин. Як описано вище для вологої твердої фази (ііі), зазначена додаткова волога тверда фаза, отримана екстракцією, може бути відновлена і використана у кислотному гідролізі. Ліпід, отриманий способом згідно з винаходом може бути естерифікований у присутності спирту, який має від 1 до 4 атомів карбону, бажано, метанолу, етанолу, і кислотного або основного каталізатора для отримання гліцерину і алкільних естерів, зокрема, метил-естерів або етилестерів (біодизель). В іншому варіанті зазначений ліпід може бути гідрогенований/деоксигенований у присутності водню і каталізатору для отримання сирого дизельного палива. Процеси гідрогенування/деоксигенування є відомими (див., наприклад, заявку на патент ЕР 20 1 728 844. Далі наведено ілюстративний опис винаходу з посиланнями на фіг. 1. Згідно з типовим втіленням способу винаходу, біомасу (наприклад, заздалегідь подрібнену лігноцелюлозну біомасу) піддають кислотному гідролізу у присутності органічної кислоти (наприклад, 2-нафталін-сульфонової кислоти) і отримують першу суміш, яка включає першу водну фазу, що містить ксилозу як результат гідролізу геміцелюлоз і зазначеної органічної кислоти, і першу тверду фазу, що містить лігнін і целюлозу. Як показано на фіг. 1, зазначену першу суміш екстрагують органічним розчинником, нерозчинним у воді (наприклад, сумішшю толуолу і н-бутанолу) для відновлення зазначеної органічної кислоти і її рециклізації після випарювання розчинника до зазначеного кислотного гідролізу. Після екстракції розчинником зазначену першу суміш піддають ферментативному гідролізу у присутності ферменту (наприклад, водного розчину Celluclast 1,5L і Novozym 188), отримуючи другу суміш, яка включає другу водну фазу, що містить ксилозу як результат кислотного гідролізу геміцелюлози, глюкозу і целобіозу, отримані з ферментативного гідролізу целюлози, і другу тверду фазу, що містить лігнін. Перед ферментативним гідролізом до зазначеної першої суміші може бути додана льодяна оцтова кислота для корекції рН до значень 4-6 (не показано на фіг 1). Зазначену другу водну фазу і зазначену другу тверду фазу відділяють фільтрацією (не показано на фіг. 1). 6 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зазначену другу водну фазу піддають ферментації у присутності жирових дріжджів (наприклад, Lypomyces starkey NRRL 1389). Наприкінці ферментації утворюється клітинна біомаса, яку піддають механічній обробці (наприклад, French press cell), і подальшим центрифугуванням отримують три фази: (і) олійна фаза, яка включає ліпід; (іі) водна фаза, яка включає залишки невідділеного ліпіду і неферментовані цукри; (ііі) волога тверда фаза, яка включає уламки клітин і залишки невідділеного ліпіду. Для концентрації жирової клітинної біомаси перед механічною обробкою зазначена біомаса може бути піддана центрифугуванню (фіг. 1). Для деактивації ліполітичних ферментів (наприклад, ліпази) перед механічною обробкою зазначена жирова клітинна біомаса може бути піддана термічній обробці (не показано на фіг. 1). Як показано на фіг. 1, зазначену вологу тверду фазу (ііі) надсилають до кислотного гідролізу. Для підвищення виходу ліпідів зазначену водну фазу (іі) і зазначену вологу тверду фазу (ііі) екстрагують у присутності суміші, що містить щонайменше один аліфатичний спирт і щонайменше один аліфатичний вуглеводень (наприклад, суміш ізопропанолу і n-гексану) (не показано на фіг. 1). Для ілюстрації винаходу далі наведено необмежуючі приклади ПРИКЛАД 1 Кислотний гідроліз біомаси 300 г подрібненої хвойної деревини (діаметр часток < 1 мм) додають до розчину 20 г 2нафталінсульфонової кислоти у 1 л води. Склад початкової біомаси: 50 мас% целюлози, 25 мас% геміцелюлози, 25 мас% лігніну відносно повної маси початкової біомаси. Цю реакційну суміш витримують з перемішуванням в автоклаві при 140 °C протягом 1 год., отримуючи першу суміш, яка включає 225 г (сухої маси) першої твердої фази (включає целюлозу і лігнін) і 1,095 г першої водної фази (включає ксилозу, отриману з гідролізу геміцелюлози і 2- нафталін-сульфонової кислоти). Після охолодження до 25 °C зазначену першу суміш екстрагують сумішшю толуолу і нбутанолу (3/1 за об'ємом). Суміш толуолу і н-бутанолу потім відділяють і випарюють під зниженим тиском, отримуючи додаткову тверду фазу, яка включає 19,6 г (суха маса) 2-нафталінсульфонової кислоти (вихід 98 %, обчислений відносно повної кількості кислоти, присутньої у водному розчині). Після відділення кислоти додають льодяну оцтову кислотну до зазначеної першої суміші до отримання рН зазначеної першої водної фази 5. Далі додають водний розчин ферменту Celluclast 1,5L (Novozymes), що відповідає 1485 FPU (одиниць Фільтрувального Паперу) і ферменту Novozym 188 (від Novozymes), що відповідає 18000 BGU (одиниць Бета-Глюканази). Суспензію перемішують протягом 72 год. при 45 °C. Наприкінці ферментативного гідролізу фільтрацією відділяють 90 г (суха маса) другої твердої фази, яка включає лігнін (75 г сухої маси) і негідролізовану целюлозу (15 г сухої маси), і 1,200 г другої водної фази, яка включає глюкозу (152 г сухої маси) і ксилозу (72 г сухої маси). Ферментація 250 мл отриманої зазначеної другої водної фази, яка містить 200 г/л цукрів розріджують дистильованою водою до концентрації цукрів 50 г/л. До цього розчину додають такі живильні речовини: сульфат амонію 0,1 %, КН2РO4 0,1 %, MgSO4 7H2O-0,005 %, NaCI 0,001 %, СаСІ2 0,001 %, дріжджовий екстракт 0,1 %. Отримане культурне середовище окулюють у бродильному чані дріжджовими клітинами (Lypomices starkey NRRL 1389) (2,5 г/л, суха маса) для ферментаційного об'єму 1 л і рН встановлюють 5,5 доданням водного розчину NaOH 0,1M. Дріжджові клітини вирощують з перемішуванням при 500 об./хвил. і 30 °C, з аерацією - 0,5 л/хвил. стерильного повітря. Додаткові 250 мл зазначеної другої водної фази, отриманої гідролізом біомаси, які містять 200 г/л цукрів, розріджують дистильованою водою до концентрації цукрів 50 г/л і додають у бродильний чан. Через 150 год., дріжджові клітини збирають і центрифугують при 7000 об./хвил. протягом 20 хвил., отримуючи 52 г (суха маса) жирової клітинної біомаси. Відновлення ліпідів Отриману жирову клітинну біомасу витримують при 80 °C протягом 2 год. для пригнічення ліполітичних ферментів і потім ресуспендують у 200 мл води. Цю суспензію піддають механічній обробці на French press cell під тиском 39 кфунт/кв. дюйм (2600 ат), отримуючи клітинний лізилат. 7 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Зазначений клітинний лізилат центрифугують при 7000 об./хвил. протягом 20 хвил., отримуючи три фази: олійну фазу, нерозчинну у воді, водну фазу і вологу тверду фазу. Олійну фазу, нерозчинну у воді, відділяють і сушать у печі при 60 °C, отримуючи 19 г (суха маса) олійного залишку, що містить ліпід. Водну фазу, що містить залишки невідділеного ліпіду і неферментованих цукрів, і вологу тверду фазу, що включає уламки клітин і залишки невідділеного ліпіду, екстрагують у 50 мл суміші n-гексану і ізопропанолу (3:1). Суміш розчинників випарюють під зниженим тиском і отримують ще 12,2 г (суха маса) олійного залишку, який включає ліпід, додаткову вологу тверду фазу і додаткову водну фазу. Отже, повна кількість ліпідів становить 31,2 г (суха маса) (вихід 60 %, обчислений відносно повної кількості жирової клітинної біомаси, отриманої після ферментації). Ліпід визначають колориметрією, базуючись на реакції ліпідів з фосфорною кислотою і фосфованіліном. Додаткова волога тверда фаза, отримана після екстракції ліпідів, містить воду і уламки клітин, включаючи 42 мас% (суха маса) полісахаридів і 45 мас% білків (суха маса). ЇЇ відділяють центрифугуванням від додаткової водної фази, яка включає неферментовані цукри. ПРИКЛАД 2 Додаткову вологу тверду фазу, отриману після екстракції ліпідів, як описано у Прикладі 1, надсилають до кислотного гідролізу, підтримуючи умови, описані нижче. 42 г (суха маса) зазначеної додаткової вологої твердої фази і 260 г подрібненої хвойної деревини (діаметр часток < 1 мм) додають до розчину 20 г 2-нафталінсульфонової кислоти у воді. Склад початкової біомаси: 50 мас% целюлози, 25 мас% геміцелюлози, 25 мас% лігніну відносно повної маси початкової біомаси. Отриману реакційну суміш витримують з перемішуванням в автоклаві при 140 °C протягом 1 год., отримуючи першу суміш, яка включає 198 г (суха маса) першої твердої фази (включає целюлозу, лігнін і уламки клітин) і 1100 г першої водної фази 5 (включає ксилозу, отриману з гідролізу геміцелюлози, глюкозу, манозу і амінокислоти, отримані з гідролізу полісахаридів і мембранних білків, присутніх в уламках клітин, і 2-нафталінсульфонової кислоти). Після охолодження до 25 °C зазначену першу суміш екстрагують сумішшю толуолу і нбутанолу (3/1 за об'ємом). Далі суміш толуолу і н-бутанолу відділяють і випарюють під зниженим тиском, отримуючи додаткову тверду фазу, яка включає 19,5 г (суха маса) 2-нафталінсульфонової кислоти (вихід 98 %, обчислений відносно повної кількості кислоти, присутньої у водному розчині). Після відділення кислоти до зазначеної першої суміші додають льодяну оцтову кислоту до рН зазначеної першої водної фази значення 5,0. Далі додають водний розчин ферменту Celluclast 1,5L (Novozymes), що відповідає 1400 FPU і ферменту Novozym 188 (від Novozymes), що відповідає 18000 BGU. Отриману суспензію перемішують протягом 72 год. при 45 °C. Наприкінці ферментативного гідролізу фільтрацією відділяють 80 г (суха маса) другої твердої фази, що включає лігнін (65 г, суха маса), негідролізовану целюлозу (13 г - суха маса) і уламки клітин (2 г- суха маса), і 1220 г другої водної фази, що включає глюкозу (13 9 г- суха маса), манозу (9 г- суха маса), ксилозу (67 г - суха маса) і амінокислоти (20 г - суха маса). Зазначена друга водна фаза може бути піддана ферментації, як описано у Прикладі 1. 45 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 1. Спосіб одержання ліпідів з біомаси, що містить щонайменше один полісахарид, який полягає у нижченаведеному: - піддавання зазначеної біомаси кислотному гідролізу у присутності водного розчину щонайменше одної органічної кислоти, вибраної з алкіл- або арил-сульфонових кислот, які мають С7-С20 атомів карбону, або з галогенованих карбонових кислот, при температурі від 80 °C до 160 °C, з отриманням першої суміші, яка включає першу тверду фазу і першу водну фазу; - піддавання зазначеної першої суміші ферментативному гідролізу з отриманням другої суміші, яка включає другу тверду фазу і другу водну фазу; - піддавання зазначеної другої водної фази ферментації у присутності щонайменше одних жирових дріжджів з отриманням жирової клітинної біомаси, що включає ліпід. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що зазначені алкіл- або арил-сульфонові кислоти мають від С9 до С15 атомів карбону. 8 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що зазначені температурні межі становлять від 100 °C до 150 °C. 4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначений полісахарид вибрано з целюлози, геміцелюлози або їх сумішей. 5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена біомаса є лігноцелюлозною біомасою. 6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що зазначена лігноцелюлозна біомаса вибрана з: - продуктів культур, що вирощують для енергетичного використання, таких як міскантус, просо, звичайна тростина, включаючи співпродукти, залишки і відходи зазначених культур або їх обробки; - продуктів сільського господарства, лісорозведення і лісництва, включаючи деревину, рослини, залишки і співпродукти сільськогосподарського виробництва, лісорозведення і лісництва; - сільськогосподарських співпродуктів, призначених для харчування людей, або на зоотехнічні потреби; - залишків без хімічної обробки в паперовій промисловості; - продуктів з відходів зібраних диференційованих твердих міських відходів. 7. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що перед кислотним гідролізом зазначену біомасу піддають попередньому подрібненню. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що зазначену біомасу подрібнюють до отримання часток діаметром від 0,1 мм до 10 мм. 9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що зазначену біомасу подрібнюють до отримання часток діаметром менше 1 мм. 10. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена біомаса присутня у реакційній суміші у кількості від 5 % до 40 мас. % відносно повної маси реакційної суміші. 11. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена щонайменше одна органічна кислота є розчинною у воді і може бути екстрагована органічним розчинником, нерозчинним у воді. 12. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені алкіл- або арилсульфонові кислоти вибрано з додецилсульфонової кислоти, паратолуолсульфонової кислоти, 1-нафталінсульфонової кислоти, 2-нафталінсульфонової кислоти, 1,5нафталіндисульфонової кислоти або їх сумішей; галогенованих карбонових кислот, таких як дифлуороцтової кислоти, трифлуороцтової кислоти, трихлороцтової кислоти, перфлуороктанової кислоти або їх сумішей; чи їх сумішей. 13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що зазначену щонайменше одну органічну кислоту вибрано з паратолуолсульфонової кислоти, 2-нафталінсульфонової кислоти, 1,5нафталіндисульфонової кислоти або їх сумішей. 14. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені галогеновані карбонові кислоти вибрано з тих, що мають не більше 20 атомів карбону, таких як трифлуороцтової кислоти, дихлороцтової кислоти, трихлороцтової кислоти, перфлуороктанової кислоти або їх сумішей. 15. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена щонайменше одна органічна кислота присутня у водному розчині з концентрацією від 0,1 % до 5 мас. % відносно повної маси водного розчину. 16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначений кислотний гідроліз проводять протягом від 20 хв. до 6 год. 17. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена перша тверда фаза включає лігнін і целюлозу. 18. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена перша водна фаза включає щонайменше один цукор, який має від С 5 до С6 атомів карбону, і зазначену щонайменше одну органічну кислоту. 19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що зазначеним щонайменше одним цукром є ксилоза. 20. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену першу суміш екстрагують органічним розчинником, нерозчинним у воді. 21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що зазначений органічний розчинник, нерозчинний у воді, вибрано з галогенованих вуглеводнів, наприклад, метилен хлориду, монохлорбензолу, дихлорбензолу або їх сумішей; ароматичних вуглеводнів, наприклад, толуолу, ксилолу або їх сумішей; аліфатичних спиртів, що мають від С4 до С6 атомів карбону, таких як н-бутанолу, нпентанолу або їх сумішей; або їх сумішей. 9 UA 103205 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що зазначений органічний розчинник, нерозчинний у воді, вибрано з сумішей толуолу і н-бутанолу. 23. Спосіб за будь-яким з пп. 20-22, який відрізняється тим, що зазначений органічний розчинник, нерозчинний у воді, випарюють, отримуючи додаткову тверду фазу, яка включає зазначену щонайменше одну органічну кислоту. 24. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що включає повторне використання зазначеної щонайменше одної органічної кислоти у зазначеному кислотному гідролізі. 25. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена друга тверда фаза включає лігнін. 26. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена друга водна фаза включає щонайменше один цукор, який має від С5 до С6 атомів карбону. 27. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена друга водна фаза включає ксилозу, глюкозу і целобіозу. 28. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену ферментацію проводять при температурі від 20 °C до 40 °C. 29. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену ферментацію проводять протягом 3-10 днів. 30. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену ферментацію проводять при рН від 4,5 до 6,5. 31. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначені жирові дріжджі вибрано з Rhodotorula glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis, Lypomices starkeyi, Lypomices lipofer, Trigonopsis variabilis, Candida kefyr, Candida curvata, Candida lipolytica, Pichia stipitis, Torulopsis sp. 32. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначена ферментація є пакетною ферментацією. 33. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену жирову клітинну біомасу піддають механічній обробці. 34. Спосіб за п. 33, який відрізняється тим, що зазначену механічну обробку проводять, використовуючи "French press cell" під тиском від 20 до 50 кфунт/кв. дюйм (1400-3500 ат). 35. Спосіб за п. 33 або п. 34, який відрізняється тим, що зазначену жирову клітинну біомасу центрифугують після механічної обробки. 36. Спосіб за п. 35, який відрізняється тим, що зазначене центрифугування виконують протягом від 5 до 30 хв. 37. Спосіб за п. 35 або п. 36, який відрізняється тим, що зазначене центрифугування виконують при швидкості обертання від 3000 до 9000 об./хвил. 38. Спосіб за будь-яким з пп. 35-37, який відрізняється тим, що в результаті центрифугування утворюються три фази: (І) олійна фаза, яка включає ліпід; (ІІ) водна фаза, яка включає незначні залишки невідділеного ліпіду і неферментовані цукри; (ІІІ) волога тверда фаза, яка включає уламки клітин і незначні залишки невідділеного ліпіду. 39. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену вологу тверду фазу (ІІІ) надсилають до кислотного гідролізу. 40. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який відрізняється тим, що зазначену водну фазу (ІІ) і/або зазначену вологу тверду фазу (ІІІ) екстрагують щонайменше одним розчинником, вибраним з аліфатичних вуглеводнів, що мають від С 3 до С10 атомів карбону; або сумішшю, що включає щонайменше один аліфатичний спирт, який має від С 3 до С5 атомів карбону і щонайменше один аліфатичний вуглеводень, що має від С3 до С10 атомів карбону. 41. Біодизель або сире дизельне паливо, що отримано з ліпіду, виготовленого способом за будь-яким з попередніх пунктів. 10 UA 103205 C2 Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 11