Химерне моноклональне антитіло, одержане із мишачого антиідіотипічного моноклонального антитіла 1е10, що розпізнає мишаче mabp3

1. Химерне моноклональне антитіло, одержане із мишачого антиідіотипічного моноклонального антитіла 1Е10, що розпізнає мишаче МАbР3, яке продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під № 97112901, де гіперваріабельні домени важкого та легкого ланцюгів згаданого антитіла мають такі послідовності: ВАЖКИЙ ЛАНЦЮГ: 3 86768 4 7. Фармацевтична композиція для локалізації та ідентифікації in vivo злоякісних пухлин молочної залози та меланом, їхніх метастазів та рецидивів, яка містить будь-яке з моноклональних антитіл за пп. 1-4. 8. Застосування моноклонального антитіла за будь-яким із пп. 1-4 для виготовлення лікарського засобу, придатного для лікування злоякісних пухлин молочної залози та меланом, їхніх метастазів та рецидивів. Цей винахід має відношення до біотехнології, зокрема, до нових рекомбінантних антитіл, які одержують шляхом генної інженерії, зокрема, до химерних та гуманізованих антитіл, які одержують із мишачого моноклонального антитіла Р3 (МАb Р3) та його антиідіотипового мишачого моноклонального антитіла 1Е10 (MAbai 1E10). Зокрема, цей винахід має відношення до антитіл, які зв'язуються з гангліозидами, що включають N-гліколільовану сіалову кислоту, але не з ацетильованими формами гангліозидів, а також не з нейтральними гліколіпідами. Гангліозиди, що включають N-гліколільовану сіалову кислоту, є антигенами, які широко експресуються раковими пухлинами молочної залози та меланомами. З іншого боку, протипухлинний ефект MAbai 1E10 демонстрували також на експериментальних моделях. Цей винахід має також відношення до фармацевтичних композицій, що включають рекомбінантні антитіла, опис яких наводили раніше, придатних для діагностування та лікування раку, зокрема, раку молочної залози та меланом. Гангліозиди є глікосфінголіпідами, що включають сіалову кислоту і входять до складу плазматичної мембрани клітин хребетних (Стултс (Stults) та інші (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179:167-214). У літературі повідомлялось, що деякі з цих молекул є антигенами, асоційованими з пухлинами або пухлинними маркерами (Хакоморі (Hakomori) та інші (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3:646-653). З цього приводу застосування антигангліозидних антитіл описують, як придатне у діагностиці та терапії раку (Хафтон (Hougton) та інші (1985): Mouse monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82:1242-1246; Жанг (Zhang) та інші (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochernistry. I. Focus on gangliosides, Int. J. Cancer, 73:42-49). Сіаловими кислотами, що частіше експресуються тваринами, є N-ацетилнейрамінова (NeuAc) та N-гліколілнейрамінова (NeuGc) кислоти (Корфілд (Corfield) та інші (1982): Occurrence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10:5-50). NeuGc не експресується нормальними людськими та курячими тканинами взагалі, однак вона є широко розповсюдженою серед інших хребетних (Ліден (Leeden) та Ю (Yu) (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. У: Biological Role of Sialic Acid. Роземберг A (Rosemberg А) та Шенгтранд Кл. (Shengtrund СІ.) (Редактори) Plenum Press, New York, 1-48; Каваі (Kawai) та інші (1991): Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectromentry, Cancer Research, 51:1242-1246). Існують, однак, повідомлення, які показують, що анти-NeuGc антитіла розпізнають деякі людські пухлини та лінії пухлинних клітин (Хігаші (Higashi) та інші (1988): Detection of gangliosides as N-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79:952-956; Фукуі (Fukui) та інші (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated HanganutziuDeicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). Підвищені рівні GM3 (NeuGc) гангліозидів були виявлені у ракових пухлинах людської молочної залози (Маркіна (Marquina) та інші (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 1996; 56: 5165-5171). Такий результат робить привабливим застосування цієї молекули як мішені для лікування раку. Моноклональне антитіло (MAb) P3 продукується лінією клітин, депонованою у ЕСАСС (Європейська колекція культивованих клітин тварин)·під № 94113026 (європейський патент ЕР 0657471В1). Це мишаче моноклональне антитіло з ізотипом IgM, яке одержали шляхом злиття мишачих спленоцитів мишей лінії BALB/c, імунізованих ліпосомами, що включають GM3 (NeuGc) та правцевий анатоксин, із клітинами лінії P3-X63-Ag8.653, які представляють собою лінію клітин мишачої мієломи. Це МАb Р3 активно реагує з гангліозидами, що містять N-гліколільовану сіалову кислоту, і не реагують ні з ацетильованими формами гангліозидів, ні з нейтральними гліколіпідами. Дані імуноцитохімічних та імуногістохімічних досліджень, проведених із лініями клітин та тканинами злоякісних та неопластичних пухлин, продемонстрували, що МАb Р3 розпізнає рак молочної залози (Васкес (Vazquez) та інші (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14:551-556) та меланому. MAb Р3 індукує антиідіотипову імунну відповідь (Аb2) у мишей лінії BALB/c (сингенна модель) навіть без ад'юванту та білка-носія (Васкес (Vazquez) та інші (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGe-conteining ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17:527534). Роль електронегативних груп, сіалової кислоти (для гангліозидів) та SCV (для сульфатидів), 5 у розпізнавальних властивостях цього антитіла була встановлена шляхом імунохімічного аналізу (Морено (Moreno) та інші (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for Nglyclylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8:695-705). Антиідіотипове MAb 1E10 (MAbai 1E10) підтипу IgG1 одержали від мишей лінії BALB/c, імунізованих МАb Р3, сполученим із KLH (гемоціанін лімфи равлика) (патент США № 6,063,379, лінія клітини, депонована у ЕСАСС під № 97112901). MAbai 1E10 розпізнає конкретно МАb Р3 і не зв'язує інші IgM антигангліозидні антитіла. Більше того, MAbai 1E10 пригнічує специфічне зв'язування МАb Р3 з GM3 (NeuGc) і з лінією клітин MDA-MB-435, яку одержали з ракової пухлини протоки молочної залози (позитивна на зв'язування MAb P3). MAbai 1E10 індукує активну імунну відповідь (антитіла Аb3) у разі імунізації мишей сингенних або алогенних моделей; ці антитіла Аb3 не демонструють тієї саме специфічності, що МАb Р3, навіть у тому разі, коли вони несуть набори ідіотипових детермінант, подібні до тих, що переносяться антитілом Аb1 (Васкес (Vazquez) та інші (1998): Syngeneic antiidiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGccontaining ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17:527-534). MAbai 1E10 індукує сильний протипухлинний ефект як у сингенних, так і у алогенних мишей. Ріст лінії клітин F3II карциноми молочної залози був значно уповільнений повторною дозою MAbai 1Е10, сполученого з KLH, у ад'юванті Фрейнда у разі імунізації мишей лінії BALB/c. Крім того, після імунізації зменшилась кількість спонтанних легеневих метастаз. Інтравенозне введення MAbai 1E10 мишам лінії C57BL/6 через 10-14 днів після інтравенозного введення останнім клітин меланоми В16, викликало різке зменшення кількості легеневих метастаз, порівняно з мишами, які одержували сторонній IgG. Ці результати дозволяють зробити припущення про те, що відбувається запуск більш ніж одного механізму протипухлинного ефекту (Васкес (Vazquez) та інші (2000): Antitumor properties of an antiidiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolylcontaining gangliosides, Oncol. Rep., 7:751-756, 2000). Незважаючи на те, що технологія моноклональних антитіл розробляється впродовж останніх 15 років (Келер (Koehler) та Мілстайн (Milstein) (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495497), а також на те, що моноклональні антитіла все ще залишаються дуже корисними у діагностиці та дослідженнях, вони не продемонстрували своєї терапевтичної ефективності на людях. Це обумовлюється, головним чином, їх нетривалим часом напівжиття у крові, тим, що мишачі ефекторні функції виявились непридатними для людської імунної системи, а також людською імунною відповіддю, що полягає у продукуванні антимишачих антитіл. Окрім того, генно-інженерна технологія революціонізувала потенціал придатності моноклональних антитіл, оскільки завдяки маніпулюванню імуноглобуліновими генами можна одержати модифіковані антитіла послабленої антигенності, а 86768 6 також поліпшити їх ефекторні функції для лікування або діагностування певних патологій. Головна мета способів послаблення імуногенносгі імуноглобулінів полягає у зменшені різниць між мишачим антитілом та людським імуноглобуліном, без зміни антигенної розпізнавальної специфічності (Моррісон (Morrison) та Уі (Оі) (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv. Immunol., 44:65-92). Нещодавно було розроблено декілька способів гуманізації мишачих або щурячих антитіл і, таким чином, послаблення ксеногенної імунної відповіді проти чужорідних білків, у разі їх введення людям. Одним із перших варіантів підходу до послаблення антигенних властивостей були химерні антитіла, у яких варіабельні домени мишачого білка вставляють до константних доменів людських молекул, що демонструють таку саме специфічність, але послаблену імуногенність, порівняно з їх мишачими двійниками, причому химерні антитіла зберігають людські ефекторні функції (Моррісон (Morrison) та інші (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigenbinding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81:6851-6855). Навіть у тому разі, коли химерні антитіла мають таку саме специфічність, що і мишачі двійники, на варіабельні ділянки гризунів часто спостерігається імунна відповідь. З метою додаткового послаблення імуногенності химерних антитіл, до людських остовних ділянок трансплантували лише гіперваріабельні ділянки моноклонального антитіла гризунів і ця гібридна варіабельна ділянка експресувалась разом із людськими константними ділянками (Джоне (Jones) та інші (1986): Replacing the complementary-determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321:522524: Верхейєн (Verhoeyen) та інші (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science 239, 1534-1536). Цей варіант підходу, однак, має декілька недоліків: головний з них полягає у тому, що одержане антитіло втрачає афінність, порівняно з мишачим двійником, унаслідок чого деякі залишки основних ділянок необхідно відновлювати відповідниками у мишачому імуноглобуліні (Річман (Rietchmann) та інші (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Nature, 332: 323-327; Куш (Queen) та інші (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86:10029-10033; Темпест (Tempest) та інші (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9:266272). На додаток до цього, у антитіл із трансплантованими гіперваріабельними ділянками часто спостерігається стійка імуногенність. Матео (Mateo) та співробітники (патент США №5712120) навели опис способу послаблення імуногенності мишачих антитіл. За цим способом модифікації обмежуються варіабельними доменами і, конкретно, мишачими остовними ділянками химерних антитіл. Більше того, заміни здійснюються лише на тих частинах остовних ділянок, які мають амфіпатичні послідовності, і, таким чином, є потенційними антигенними детермінантами, що 7 розпізнаються Т-клітинами. Згаданий спосіб включає розважливу заміну декількох амінокислотних залишків, розміщених у потенційно імуногенних антигенних детермінантах, відповідними залишками найгомологічнішої людської послідовності; подібній заміні не підлягають амінокислоти, які, головним чином, несуть відповідальність за канонічні структури, а також залишки, що знаходяться у безпосередній близькості до гіперваріабельних ділянок або у зоні Верн'є. Одержане антитіло зберігає свою антигензв'язувальну специфічність і є менш імуногенним, аніж його мишачий або химерний попередник (Матео (Mateo) та інші (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma 19:463-71); ці властивості підвищують їх терапевтичну придатність. За цим способом необхідно здійснювати лише нечисленні мутації та вдаватись, звичайно, до меншого обсягу генетичних маніпуляцій. Докладний опис винаходу Цей винахід має відношення до рекомбінантних антитіл, одержаних засобами генної інженерії. Зокрема, цей винахід має відношення до химерного антитіла, що одержують із мишачого моноклонального антитіла РЗ, яке продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під №94113026. МАb Р3 розпізнає антиген, що експресується клітинами пухлини молочної залози та меланомами. МАb Р3 відрізняється такими послідовностями гіперваріабельних ділянок (CDRs) важкого та легкого ланцюгів: Важкий ланцюг: CDR1: RYSVH CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS CDR3: SGVREGRAQAWFAY Легкий ланцюг: CDR1: KASQDVSTAVA CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTFWT За варіантом, якому віддається перевага, послідовності остовних ділянок важкого та легкого ланцюга є такими: Важкий ланцюг: FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS FR2: WVRQPPGKGLEWLG FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR FR4: WGQGTLV Легкий ланцюг: FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC FR2: WYQQKPGQSPKLLIY FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC FR4: FGGGTKL За варіантом, якому віддається перевага, химерне антитіло за цим винаходом включає константну ділянку важкого ланцюга людського IgG1 і константну ділянку легкого ланцюга людського Ск. За іншим аспектом, цей винахід має відношення до гуманізованого антитіла, яке одержують із МАb Р3, що продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під № 94113026, що відрізня 86768 8 ється тим, що включає константну ділянку важкого ланцюга людського IgG1 та константну ділянку легкого ланцюга людського Ск і остовні ділянки легкого ланцюга включають будь-яку з наведених далі точкових мутацій: Легкий ланцюг: Положення 8: His на Pro Положення 9: Lys на Ser Положення 10: Phe на Ser Положення 11: Met на Leu Положення 13: Thr на Ala За іншим аспектом, цей винахід має відношення до химерного антитіла, яке одержують із мишачого моноклонального антитіла 1E10, що продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під № 97112901, і яке є антиідіотиповим антитілом, що розпізнає МАb Р3. MAbai 1E10 відрізняється такими послідовностями гіперваріабельних ділянок (CDR) важкого та легкого ланцюгів: Важкий ланцюг: CDR1: SYDIN CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG CDR3: EDYYDNSYYFDY Легкий ланцюг: CDR1: RASQDISNYLN CDR2: YTSRLHSG CDR3: QQGNTLPWT За варіантом, якому віддається перевага, послідовності остовних ділянок важкого та легкого ланцюга є такими: Важкий ланцюг: FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT FR2: WVRQRPEQGLEWIG FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR FR4: WGQGTTLTV Легкий ланцюг: FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC FR2: WYQQKPDGTVKLLIY FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC FR4: FGGGTKLESK За варіантом, якому віддається перевага, химерне антитіло за цим винаходом включає константну ділянку важкого ланцюга людського IgG1 і константну ділянку легкого ланцюга людського Ск. За іншим аспектом, цей винахід має відношення до гуманізованого антитіла, яке одержують з МАb 1Е10, що продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під №97112901, що відрізняється тим, що включає константну ділянку важкого ланцюга людського IgG1 та константну ділянку легкого ланцюга людського Ск і остовні ділянки важкого та легкого ланцюга включають будь-яку з наведених далі точкових мутацій: Легкий ланцюг: Положення 7: Thr на Ser Положення 8: Thr на Pro Положення 15: Leu на Val Важкий ланцюг: Положення 5: Gln на Val Положення 40: Arg на Ala Положення 42: Glu на Gly 9 Положення 87 (83 за нумерацією Кабата (Rabat)): Thr на Arg За іншим аспектом, цей винахід має відношення до ліній клітин, що експресують химерні та гуманізовані антитіла, опис яких наведено; на додаток до цього, винахід має відношення до фармацевтичних композицій, що містять антитіла, опис яких наведено. За варіантом, якому віддається перевага, цей винахід має відношення до фармацевтичних композицій для лікування пухлин молочної залози, легень, шлунково-кишкової системи, сечовостатевої системи, меланом, сарком та пухлин нейроектодермічного походження, їхніх метастаз та рецидивів, що містять антитіла, опис яких наведено, та відповідний наповнювач. За іншим варіантом втілення цього винаходу фармацевтичні композиції можуть застосовуватись для локалізації та діагнозу in vivo пухлин молочної залози, легень, шлунково-кишкової системи, сечово-статевої системи, меланом, сарком та пухлин нейроектодермічного походження, їхніх метастаз та рецидивів, і включати антитіла, опис яких наведено. Синтез кДНК та ампліфікація засобами полімеразної ланцюгової реакції (PCR) варіабельної ділянки MAb P3 та MAbai 1E10 Цитоплазматичну РНК екстрагували із приблизно 106 клітин гібридоми Р3 (мишаче IgM Mab, що розпізнає GM3 N-гліколільований гангліозид) або 1Е10 (антиідіотипове анти-Р3 антитіло). РНК екстрагували за допомогою реактиву TRIZOL (фірма GIBCO BRL, Grand Island, Нью-Йорк) за інструкціями виробника. Реакцію синтезу кДНК здійснювали шляхом змішування 5 мкг РНК, 25 пмоль Vh (комплементарного до константної ділянки мишачого IgM для VHP3 та константної ділянки мишачого IgGl для VH 1E10) або Vk (комплементарного до константної мишачої каппа-ділянки для обох антитіл), 2,5 мМ розчину дезоксинуклеозид-5'-трифосфату (dNTP), 50 мМ розчину трис-НСІ (рН 7,5), 75 мМ розчину КСl, 10 мМ розчину дитіотреїтолу (DTT), 8 мМ розчину MgCl2 та 15 одиниць інгібітору РНКази у 50 мкл реакційної суміші. Суміш нагрівали при температурі 70°С впродовж 10 хв і повільно охолоджували до температури 37°С. Після цього додавали 100 одиниць РНК-залежної ДНКполімерази, і інкубування продовжували при температурі 42°С впродовж 1 год. Варіабельні ділянки VK та VH кДНК ампліфікували засобами полімеразної ланцюгової реакції. Стисло, 5 мкл кДНК VH або VK змішували з 25 пмоль специфічного іграймера, 2,5 мМ розчином dNTP, 5 мкл складових буфера 10Х Taqполімерази та 1 одиницею цього ферменту. Зразки піддавали 25 термічним циклам при температурі 94°С, 30 с; 50°С, 30 с; 72°С, 1 хв і, нарешті, інкубуванню впродовж 5 хв при температурі 72°С. Клонування та секвенування ампліфікованої кДНК Продукти PCR VH та VK (Р3 та 1Е10, відповідно) клонували до вектора ТА (набір для клонування Та Cloning kit, фірма Promega, США). Одержані клони секвенували дидезокси методом встанов 86768 10 лення первинної структури ДНК із застосуванням Т7 ДНК-полімерази (набір для секвенування Т7 sequencing kit, фірма Pharmacia, Швеція). Конструювання химерних генів Гени варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів (VH та VK) вирізували з векторів ТА шляхом ферментативного розщеплення і клонували до відповідних векторів експресії (Колома (Coloma) та інші (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Гени VH вирізували з вектора ТА шляхом ферментативного розщеплення за допомогою EcoRV та Nhel і клонували до вектора експресії (РАН 4604), що включав варіабельну ділянку людського IgG1 і ген стійкості до гістидинолу. Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як P3VHPAH4604 та 1E10VH-PAH4604. Гени VK вирізували з вектора ТА шляхом ферментативного розщеплення за допомогою EcoRV та Sall і клонували до вектора експресії (PAG4622). Цей вектор включав ген стійкості до мікофенолової кислоти та людську константну каппа-ділянку. Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як P3VK-PAG4622 та 1E10VK-PAG4622. Експресія химерних антитіл, одержаних із МАb Р3 та MAbai 1E10 Клітини NS-0 піддавали електропорації 10 мкг P3VK-PAG4622 або 1E10VK-PAG4622K; клони, що експресували людські легкі каппа-ланцюги, трансфікували 10мкг P3VH-PAH4604 або 1E10VHPAH4604. ДНК лінеаризували шляхом розщеплення ферментом Pvul, осаджували етанолом та розчиняли у 50 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину. Приблизно 107 клітин збирали шляхом центрифугування і ресуспендували у 0,5 мл забуференого фосфатом фізіологічного розчину разом із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. Після 10 хв на льоду клітини піддавались імпульсу електричного току (200 В, 960 мкФ) і залишались на льоду додатково впродовж 10 хв. Після цього клітини розподіляли до 96-лункового планшета з модифікованим за способом Дульбекко живильним середовищем Ігла F12 плюс 10% фетальної телячої сироватки. Через два або чотири дні додавали селективне середовище (модифіковане за способом Дульбекко живильне середовище Ігла F12 з мікофеноловою кислотою (0,45 мкг/мл) або гістидинолом (10 мМ розчин), відповідно). Трансфіковані клони спостерігались неозброєним оком через 14 днів. Присутність людського антитіла у живильному середовищі лунок, що містили трансфіковані клони, визначали шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Лунки титраційного мікропланшета сенсибілізували козячим антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, що продукують людський каппа-ланцюг) або антилюдськими IgG (специфічними для гаммаланцюга) (для клонів, що продукують повне антитіло) антитілами. Після промивання PBS-T (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,05% Твін-20) розбавлене культуральне 11 середовище лунок, що містять трансфектанти, додавали до кожної лунки титраційного мікропланшета на 1 год при температурі 37°С. Лунки промивали PBS-T, додавали козячий антилюдський легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидазою із хрону або козячий антилюдський IgG, кон'югований із лужною фосфатазою (специфічний для гамма-ланцюга), та інкубували при температурі 37°С впродовж 1 год. Лунки промивали PBS-T і додавали субстратний буфер, що містив офенілендіамін або р-нітрофенілфосфат, відповідно. Через півгодини визначали оптичну густину при 492 нм або 405 нм, відповідно. Конструювання гуманізованих антитіл P3hu та 1E10hu шляхом гуманізації антигенних детермінант Т-клітин. Прогнозування антигенних детермінант Т-клітин Послідовності варіабельних ділянок Р3 та 1Е10 аналізували за допомогою алгоритму АМРНІ (Маргаліт (Margalit) та інші (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138:2213-2229). За його допомогою розшукують спіральні амфіпатичні сегменти з 7-11 амінокислотними залишками, які асоціюються з Т-імуногенністю. Спіральні гідрофобні сегменти прогнозували також за допомогою програми SOHHA (Елліот (Elliot) та інші (1987). An hypothesis on the binding of an amphipatic, alpha helical sequence in li to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2449-2952). Обидва алгоритми прогнозували, які сегменти з послідовностей варіабельних ділянок антитіл Р3 та 1Е10 могли б бути презентовані Т-клітинам-помічникам у контексті молекул II класу головного комплексу гістосумісності. Аналіз гомології з людськими імуноглобулінами Амінокислотні послідовності мишачих варіабельних ділянок порівнювали з імуноглобуліновими послідовностями, включеними до бази даних GeneBank та EMBL (доступна у Інтернеті). Для кожного антитіла було визначено найгомологічнішу послідовність людської варіабельної ділянки. Для пошуку гомологічних послідовностей було використано програмне забезпечення PC-TWO НІВIO PROSIS 06-00 (Hitachi). Аналіз на послаблення імуногенності Метою способу є послаблення імуногенності шляхом руйнування або гуманізації потенційних імуногенних Т-антигенних детермінант із мінімальною кількістю мутацій. Згаданий спосіб включає розважливу заміну декількох амінокислотних залишків, що знаходяться у межах спіральних амфіпатичних сегментів. Амінокислоти, які несуть, головним чином, відповідальність за канонічні структури, а також залишки у безпосередній близькості до гіперваріабельних ділянок або у зоні Верн'є, повинні зберігатись. За цим способом порівнюють послідовності варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів мишачого імуноглобуліну з найгомологічнішими людськими послідовностями з ідентифікуваням залишків, якими різняться мишача та людська послідовності, лише у амфіпатичних сегментів, що знаходяться у межах остовних ділянок (Кабат 86768 12 (Kabat) (1991), Sequences of proteins of immunological interest, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Раніше визначені залишки замінювали залишками, присутніми у найгомологічнішій людській послідовності. Заміни здійснювали методами прямого мутагенезу. Залишки, залучені до тривимірної структури місця зв'язування, мутаціям не піддавали; це могло негативно вплинути на розпізнавання антигену. Додаткову інформацію відносно впливу замін у третинній структурі можна одержати шляхом молекулярного моделювання місця зв'язування антигену. Слід звернути увагу на присутність пролінових залишків у спіральному амфіпатичному сегменті, а також на те, що певні мишачі залишки не з'являються у тому саме положенні у найгомологічнішій людській послідовності, однак часто зустрічаються у інших людських імуноглобулінах. Із цієї причини не існує унікального набору мишачих амінокислот до заміни у основних ділянках. Можна одержати різні варіанти модифікованого антитіла з різною кількістю замін. Мутації здійснювали шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій. Клонування та експресія гуманізованих антитіл P3hu та 1E10hu Генно-інженерні конструкції, що відповідали P3hu та 1Е10hu, клонували у векторах експресії за способом, опис якого наведено для химерних антитіл. Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як P3VKhu-Pag4622 або 1E10VkhuPAG4622 та P3VHhu-PAH4604 і 1E10VHhuPAH4604. Вони були трансфіковані до клітин NS-0 за методикою, опис якої було наведено перед тим для химерних антитіл. Очищення рекомбінантних антитіл Рекомбінантні антитіла очищали засобами афінної хроматографії із застосуванням білка А (фірма Pharmacia, Upssala, Швеція). Біологічна активність Біологічну активність рекомбінантних антитіл перевіряли за специфічним зв'язуванням з антигеном, що визначали шляхом ELISA. Для рекомбінантного МАb Р3, титрувальні мікропланшети сенсибілізували розчином GM3(NeuGc) гангліозиду у метанолі. Після просушування впродовж 1 год, неспецифічне зв'язування блокували 1% розчином сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (BSA) у трис-НСІ та інкубували впродовж 1 год при температурі 37°С. Лунки промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином та інкубували впродовж 1 год при температурі 37°С з очищеним рекомбінантним МАb Р3. Лунки промивали трис-НСІ, додавали козяче антилюдське антитіло, кон'юговане з лужною фосфатазою та інкубували при температурі 37°С впродовж 1 год. І, нарешті, лунки промивали та додавали субстратний буфер, що включав pнітрофенілфосфат. Через півгодини визначали оптичну густину при 405 нм або 492 нм, відповідно. Для рекомбінантного MAbai 1E10 ELISA здійснювали подібним же чином, за виключенням того, що лунки сенсибілізували МАb Р3 і промивали PBS-0,05% Твін-20. 13 Приклади У наведених далі прикладах усі використані ферменти, а також реактиви і матеріали були одержані з комерційних джерел, якщо не вказано інше. Приклад 1. Одержання химерного МАb Р3 Синтез кДНК відбувався шляхом реакції з ревертазою, із започаткування з РНК гібридоми, що продукує МАb Р3, як описувалось раніше. Показана послідовність специфічних праймерів, що були використані у цій реакції: для VH 5' AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG) (AG)CCAGTGGATAGAC 3' Для VК: 5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3’ кДНК VHP3 та кДНК VKP3 ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням Taq-полімерази та специфічних праймерів. Сайтами рестрикції, що включались до праймерів, були ECORV/NHEI для VH та ECORV/SALI для VK. Були використані такі праймерні послідовності: Для VH Праймер 1 (сигнальний пептид): 5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG) AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3’ Праймер 2 (СН1): 5’ GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGA GT 3’ Для VК: Праймер 1 (сигнальний пептид): 5’ GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT) (TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3’ Праймер 2 (Ck): 5’ AGCGTCGACTrACGTTT(TG)ATTTCCA(GA) CTT(GT)GTCCC 3’ Продукти полімеразної ланцюгової реакції клонували до вектора ТА (набір для клонування ТА cloning kit, фірма Invitrogen). Дванадцять незалежних клонів секвенували дидезокси методом встановлення первинної структури ДНК із застосуванням Т7 ДНК-полімерази (фірма Pharmacia). Аналізом пошуку гомологій визначили найгомологічнішу послідовність для VHP3 та VKP3. Послідовності VHP3 та VKP3 (Фіг.1 та Фіг.2) мають високу гомологію з групами IB та V, відповідно, за класифікацією Кабата. Після розщеплення рестриктазами ECORV та NHEI для VHP3 та ECORV і SALI для VKP3, їх клонували до векторів експресії, попередньо розщеплених тими саме ферментами, РАН4604 та PAG4622 для VH та VK, відповідно. Ці вектори експресії були подаровані Шері Моррісон (Sherie Morrison) (UCLA, Каліфорнія, США); вони є придатними для експресії імуноглобулінів у клітинах ссавців. Вектор РАН 4604 включав константну ділянку людського IgG1, а вектор PAG 4622 включав людську Ck (Колома (Coloma) та інші (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як P3VH-PAH4604 та P3VK-PAG4622. 86768 14 Клітини NS-0 трансфікували 10 мкг P3VKPAG4622, клон, що експресував легкий ланцюг, трансфікували 10 мкг P3VH-PAH4604; у обох випадках ДНК лінеаризували за допомогою Pvul, осаджували етанолом та розчиняли у 50 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину перед трансфекцією. Приблизно 107 клітин збирали шляхом центрифугування і ресуспендували у 0,5 мл забуференого фосфатом фізіологічного розчину разом із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. Після 10 хв на льоду, клітини піддавались імпульсу електричного току (200 В, 960 мкФ) і залишались на льоду додатково впродовж 10 хв. Після цього клітини розподіляли до 96-лункового планшета з модифікованим за способом Дульбекко живильним середовищем Ігла F12 плюс 10% фетальної телячої сироватки. Через два або чотири дні додавали селективне середовище (модифіковане за способом Дульбекко живильне середовище Ігла F12 із мікофеноловою кислотою (0,45 мкг/мл) або гістидинолом (10 мМ розчин), відповідно). Трансфіковані клони спостерігались неозброєним оком через 14 днів. Присутність людського антитіла у живильному середовищі лунок, що містили трансфіковані клони, визначали шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Лунки титраційного мікропланшета сенсибілізували козячим антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, що продукують людський каппа-ланцюг) або антилюдськими IgG (специфічними для гаммаланцюга) (для клонів, що продукують повне антитіло) антитілами. Після промивання PBS-T (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,05% Твін-20) розбавлене культуральне середовище лунок, що містять трансфектанти, додавали до кожної лунки титраційного мікропланшета на 1 год при температурі 37°С. Лунки промивали PBS-T, додавали козячий антилюдський легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидазою із хрону або козячий антилюдський IgG, кон'югований із лужною фосфатазою (специфічний для гамма-ланцюга), та інкубували при кімнатній температурі впродовж 1 год. Лунки промивали PBS-T і додавали субстратний буфер, що включав офенілендіамін або р-нітрофенілфосфат, відповідно. Через півгодини визначали оптичну густину при 492 нм або 405 нм, відповідно. Приклад 2. Одержання різних варіантів гуманізованого антитіла Р3 Послідовності мишачих VHP3 та VKP3 (Фіг.1 та Фіг.2) порівнювали з людськими послідовностями. На Фіг.3 та Фіг.4 показані найгомологічніші людські послідовності. На послідовностях варіабельної ділянки мишачого Р3 відшукували спіральні амфіпатичні ділянки або потенційні Т-клітинні антигенні детермінанти і за згаданим способом визначали розважливу стратегію заміни амінокислот із метою руйнування або гуманізації потенційних Т-клітинних антигенних детермінант у межах мишачих послідовностей. Аналіз VHP3 виявив (Фіг.3) 2 амфіпатичні сегменти, перший з яких охоплює CDR1, FR2 та деякі залишки CDR2, у той час як другий охоплює кінець 15 FR3 та CDR3. Головні різниці мишачої послідовності, порівняно з найгомологічнішою людською послідовністю, були знайдеш у гіперваріабельних ділянках або залишках, залучених до тривимірної структури сайту зв'язування. З цієї причини було вирішено не замінювати жодної амінокислоти у мишачій VHP3. Аналіз VKP3 також виявив 2 амфілатичні сегменти (Фіг.4), перший з яких охоплює FR1, другий охоплює CDR2 та деякі залишки FR3. Було вирішено замінити залишки у положеннях 8, 9, 10, 11 та 13 залишками у тому саме положенні найгомологічнішої людської послідовності. Амінокислоти His, Lys, Phe, Met та Thr були замінені на Pro, Ser, Ser, Leu та Ala, відповідно. Заміну здійснили шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій (Камманн (Kammaim) та інші (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17:5404) із застосуванням праймерів 1 та 2 і 3 та 4, послідовності яких виглядають таким чином: Праймер 1: 5' ATGACCCAGTCTCCTTCTТCTCTTTCCGCG TCAGTAGGAGAC 3’ Праймер 2: 5’ AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATТTCCA(GA) CTT(GT)GTCCC 3’ Праймер 3: 5’ GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAG GAGACTGGGTCAT 3’ Праймер 4: 5’ GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT) (TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3’ Точкові мутації були перевірені секвенуванням. Одержана генно-інженерна конструкція була позначена як P3Vkhu і клонована до вектора експресії PAG 4622. Одержали генно-інженерну конструкцію P3VKhu-PAG4622. Для експресії гуманізованого антитіла Р3 клітини NS-0 трансфікували P3VH-PAH4604 та P3VKhu-PAG4622. Антитіло P3hu трансфікували за тією саме методикою електропорації та виявлення, опис якої було наведено перед тим для химерних антитіл. Приклад 3: Біологічна активність химерного МАb Р3 Біологічну активність химерного МАb Р3 перевіряли за специфічним зв'язуванням з антигеном, що визначали шляхом ELISA. Для рекомбінантного МАb Р3, титрувальні мікропланшети сенсибілізували розчином GM3(NeuGc) гангліозиду у метанолі. Після просушування впродовж 1 год при температурі 37°С, неспецифічне зв'язування блокували 1% розчином сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (BSA) у трис-НСІ буфері та інкубували впродовж 1 год при температурі 37°С. Лунки промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином та інкубували впродовж 1 год при температурі 37°С з очищеним рекомбінантним МАb Р3. Лунки промивали трис-НСІ, додавали козяче антилюдське антитіло, кон'юговане з лужною фосфатазою та інкубували при температурі 37°С впродовж 1 год. І, нарешті, лунки промивали трис-НСІ і додавали субстратний буфер, що включав р 86768 16 нітрофенілфосфат. Через півгодини визначали оптичну густину при 405 нм. Химерне МАb Т1 використовували як негативний контроль. На Фіг.5 зображено специфічне зв'язування химерного МАb Р3 з антигеном. Приклад 4. Одержання химерного МАb 1Е10 Синтез кДНК відбувався шляхом реакції з ревертазою, із започаткування з РНК гібридоми, що продукує МАb 1Е10, як описувалось раніше. Далі показана послідовність специфічних праймерів, що були використані у цій реакції: Для VH: 5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAG TGGT 3' Для VK: 5’ GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGA TGGA 3’ кДНК VH1E10 та кДНК VK1E10 ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням Taq-полімерази та специфічних праймерів Для VН: Праймер 1 (сигнальний пептид): 5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG) AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3’ Праймер 2 (СН1): 5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGA GTGGT 3’ ДляУК Праймер 1 (сигнальний пептид): 5’ GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT) GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3’ Праймер 2 (Ск): 5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA) CTT(GT)GTCCC 3' Продукта полімеразної ланцюгової реакції клонували до вектора ТА (набір для клонування ТА cloning kit, фірма Invitrogen). Дванадцять незалежних клонів секвенували (Фіг.7 та Фіг.8) дидезокси методом встановлення первинної структури ДНК із застосуванням Т7 ДНК-полімерази (фірма Pharmacia). Аналізом пошуку гомологія визначили найгомологічнішу послідовність для VH1E10 та VK1E10. Послідовності VH1E10 та VK1E10 мають високу гомологію з різними групами та групою V, відповідно, за класифікацією Кабата. Після розщеплення рестриктазами ECORV та NHEI для VH1E10 та HinII і SALI для VK1E10, їх клонували до векторів експресії, попередньо розщеплених придатними ферментами, РАН4604 та PAG4622 для VH та VK, відповідно. Ці вектори експресії були подаровані Шері Моррісон (Sherie Morrison) (UCLA, Каліфорнія, США); вони є придатними для експресії імуноглобулінів у клітинах ссавців. Вектор РАН. 4604 включав константну ділянку людського IgG1, а вектор PAG 4622 включав людську Ск (Колома (Coloma) та інші (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як 1E10VH-PAH4604 та 1E10VKPAG4622. 17 Клітини NS-0 трансфікували 10 мкг 1E10VKPAG4622, клон, що експресував легкий ланцюг, трансфікували 10 мкг 1E10VH-PAH4604; у обох випадках ДНК лінеаризували за допомогою Pvul, осаджували етанолом та розчиняли у 50 мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину перед трансфекцією. Приблизно 107 клітин збирали шляхом центрифугування і ресуспендували у 0,5 мл забуференого фосфатом фізіологічного розчину разом із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. Після 10 хв на льоду, клітини піддавались імпульсу електричного току (200 В, 960 мкФ) і залишались на льоду додатково впродовж 10 хв. Після цього клітини розподіляли до 96-лункового планшета з модифікованим за способом Дульбекко живильним середовищем Ігла F12 плюс 10% фетальної телячої сироватки. Через два або чотири дні додавали селективне середовище (модифіковане за способом Дульбекко живильне середовище Ігла F12 із мікофеноловою кислотою (0,45 мкг/мл) або гістидинолом (10 мМ розчин), відповідно). Трансфіковані клони спостерігались неозброєним оком через 14 днів. Присутність людського антитіла у живильному середовищі лунок, що містили трансфіковані клони, визначали шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Лунки титраційного мікропланшета сенсибілізували козячим антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, що продукують людський каппа-ланцюг) або антилюдськими IgG (специфічними для гаммаланцюга) (для клонів, що продукують повне антитіло) антитілами. Після промивання PBS-T (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,05% Твін-20) розбавлене культуральне середовище лунок, що містять трансфектанти, додавали до кожної лунки титраційного мікропланшета на 1 год при температурі 37°С. Лунки промивали PBS-T, додавали козячий антилюдський легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидазою із хрону або козячий антилюдський IgG, кон'югований з лужною фосфатазою (специфічний для гамма-ланцюга), та інкубували при кімнатній температурі впродовж 1 год. Лунки промивали PBS-T, і додавали субстратний буфер, що містив офенілендіамін або р-нітрофенілфосфат, відповідно. Через півгодини визначали оптичну густину при 492 нм або 405 нм, відповідно. Приклад 5. Одержання різних варіантів гуманізованого антитіла 1Е10 Послідовності мишачих VH1E10 та VK1E10 (Фіг.6 та Фіг.7) порівнювали з людськими послідовностями. На Фіг.8 та Фіг.9 показані найгомологічніші людські послідовності. На послідовностях варіабельної ділянки мишачого 1Е10 відшукували спіральні амфіпатичні ділянки або потенційні Тклітинні антигенні детермінанти, і за згаданим способом визначали розважливу стратегію заміни амінокислот із метою руйнування або іуманізації потенційних Т-клітинних антигенних детермінант у межах мишачих послідовностей. Аналіз VH1E10 виявив (Фіг.8) 3 амфіпатичні сегменти, перший з яких охоплює FR1, другий охоплює FR2, третій охоплює FR3. Було вирішено 86768 18 замінити залишки у положеннях 5, 40, 42 та 87 (83 за нумерацією Кабата) залишками у тому саме положенні найгомологічнішої людської послідовності. Амінокислоти Gln, Arg, Glu та Thr були замінені на Val, Ala, Gly та Arg, відповідно. Заміну здійснили шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій (Камманн (Kammann) та інші (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17:5404) із застосуванням різних наборів праймерів. Праймерами для мутації у положенні 5 важкого ланцюга були праймери 1, 2, 3 та 4, послідовності яких виглядають таким чином: Праймер 1: 5’ CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3’ Праймер 2: 5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAG TGGT 3’ Праймер 3: 5’ AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3’ Праймер 4: 5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG) AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3’ Після секвенування точкової мутації у положенні 5, були здійснені мутації у положеннях 40 та 42. Праймер для мутацій у положеннях 40 та 42 важкого ланцюга: Праймер 1: 5' TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGG ACTTGAG 3’ Праймер 2: 5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGT GGT 3’ Праймер 3: 5' CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCA CCCA 3’ Праймер 4: 5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG) AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3' Після секвенування точкової мутації у положеннях 40 та 42, була здійснена мутація у положенні 87 (83 за нумерацією Кабата). Праймер для мутації у положенні 87 (83 за нумерацією Кабата) важкого ланцюга: Праймер 1: 5’ CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3’ Праймер 2: 5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAG TGGT 3' Праймер 3: 5' AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3’ Праймер 4: 5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG) AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3’ Інші заміни не робили, оскільки залишки були залучені до тривимірної структури сайту зв'язування. Точкові мутації були перевірені секвенуванням. Одержана генно-інженерна конструкція була позначена як 1E10VHhu і клонована до вектора експресії РАН4604. Одержали генно-інженерну конструкцію 1E10VH-PAH4604. 19 Аналіз VK1E10 також виявив 3 амфіпатичні сегменти (Фіг.9), перший з яких охоплює FR1, другий охоплює CDR1, третій охоплює FR3. Було вирішено замінити залишки у положеннях 7, 8 та 15 залишками у тому саме положенні найгомологічнішої людської послідовності. Амінокислоти Thr, Thr та Leu були замінені на Ser, Pro та Val, відповідно. Заміну здійснили шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій (Камманн (Kammann) та інші (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17:5404) із застосуванням праймерів 1, 2, 3 та 4, послідовності яких виглядають таким чином: Праймери для мутації у положеннях 7, 8 та 15 легкого ланцюга: Праймер 1: 5' CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCT GCCTCTGTGGGAGACAGAGTC 3' Праймер 2: 5' AGCGTCGACTTACGTТT(TG)ATTTCCA(GA) CTT(GT)GTCCC 3’ Праймер 3: 5’ GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGG AGGAAGGAGACTGTGTCATCTG 3’ Праймер 4: 5’ GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT) GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3' Точкові мутації були перевірені секвенуванням. Одержана генно-інженерна конструкція була позначена як 1E10Vkhu і клонована до вектора експресії PAG 4622. Одержали генно-інженерну конструкцію 1E10VKhu-PAG4622. Для експресії гуманізованого антитіла 1Е10, клітини NS-0 трансфікували 1E10VHhu-PAH4604 та 1E10VKhu-PAG4622. Антитіло 1E10hu трансфікували за тією саме методикою електропорації та виявлення, опис якої було наведено перед тим для химерних антитіл. Приклад 6: Біологічна активність химерного MAb 1E10 Біологічну активність химерного MAb 1E10 перевіряли за специфічним зв'язуванням з антигеном, що визначали шляхом ELISA. Для рекомбінантного MAb 1E10, титрувальні мікропланшети сенсибілізували MAb Р3. Після промивання PBS-T (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,05% Твін-20), неспецифічне зв'язування блокували 1% розчином сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (BSA) у PBS-T та інкубували впродовж 1 год при температурі 37°С. Лунки промивали, та інкубували впродовж 1 год при температурі 37°С з очищеним рекомбінантним MAb 1E10. Лунки промивали PBST, додавали козяче антилюдське антитіло, кон'юговане з лужною фосфатазою та інкубували при температурі 37°С впродовж 1 год. 1, нарешті, лунки промивали PBS-T і додавали субстратний буфер, що містив р-нітрофенілфосфат. Через півгодини визначали оптичну густину при 405 нм. Химерне MAb C5 використовували як негативний контроль. На Фіг.10 показано специфічне зв'язування химерного MAb 1E10 з MAb Р3. 86768 20 Короткий опис фігур:Фіг.1: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла Р3. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата (Кабат (Kabat) та інші (1991). Sequences of proteins of immunological interest, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки позначені штрих-пунктирними лініями. Фіг.2: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла Р3. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата (Кабат (Kabat) та інші (1991). Sequences of proteins of immunological interest, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки позначені штрихпунктирними лініями. Фіг.3: Порівняльний аналіз VHP3 із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом. Фіг.4: Порівняльний аналіз VKP3 із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом. Фіг.5: Специфічне зв'язування химерного MAb P3 з GM3(NeuGc). Шляхом ELISA випробували різні концентрації МАb Р3 та МАb Т1 (негативний контроль). Титраційні мікропланшети сенсибілізували розчином GM3(NeuGc) та GM3(NeuAc) (негативний контроль) гангліозиду у метанолі і визначали специфічне зв'язування. Фіг.6: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла 1Е10. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата (Кабат (Kabat) та інші (1991). Sequences of proteins of immunological interest, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки позначені штрих-пунктирними лініями. Фіг.7: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла 1Е10. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата (Кабат (Kabat) та інші (1991). Sequences of proteins of irnmunological interest, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки позначені штрих-пунктирними лініями. Фіг.8: Порівняльний аналіз VH1E10 із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом. Фіг.9: Порівняльний аналіз VK1E10 із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом. Фіг.10: Специфічне зв'язування мишачого МАb Р3 з химерним МАb 1Е10. Шляхом ELISA випробували різні концентрації МАb 1Е10 та MAb C5 (негативний контроль). Титраційні мікропланшети сенсибілізували МАb Р3 та МАb A3 (негативний контроль) і визначали специфічне зв'язування. 21 86768 22 23 86768 24 25 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 86768 Підписне 26 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601