Химерне моноклональне антитіло, що розпізнає гангліозиди, які включають n-гліколільовану сіалову кислоту, лінія клітин, яка його продукує, та фармацевтичні композиції, що його містять

1. Химерне моноклональне антитіло, одержане із мишачого моноклонального антитіла MAb P3, що розпізнає гангліозиди, які включають Nгліколільовану сіалову кислоту, яке продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під № 94113026, причому гіперваріабельні домени важкого та легкого ланцюгів згаданого антитіла мають такі послідовності: важкий ланцюг: CDR1: RYSVH CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS CDR3: SGVREGRAQAWFAY 2 (19) 1 3 75393 4 яка містить будь-яке з моноклональних антитіл за засобу, придатного для лікування злоякісних пухпп. 1-3. лин молочної залози та меланом, їхніх метастазів 7. Застосування моноклонального антитіла за та рецидивів. будь-яким із пп. 1-3 для виготовлення лікарського Цей винахід має відношення до біотехнології, зокрема, до нових рекомбінантних антитіл, які одержують шляхом генної інженерії, зокрема, до химерних та гуманізованих антитіл, які одержують із мишачого моноклонального антитіла Р3 (MAb P3) та його антиідіотипового мишачого моноклонального антитіла 1Е10 (MAbai 1E10). Зокрема, цей винахід має відношення до антитіл, які зв'язуються з гангліозидами, що включають N-гліколільовану сіалову кислоту, але не з ацетильованими формами гангліозидів, а також не з нейтральними гліколіпідами. Гангліозиди, що включають N-гліколільовану сіалову кислоту, є антигенами, які широко експресуються раковими пухлинами молочної залози та меланомами. З іншого боку, протипухлинний ефект MAbai IE 10 демонстрували також на експериментальних моделях. Цей винахід має також відношення до фармацевтичних композицій, що включають рекомбінантні антитіла, опис яких наводили раніше, придатних для діагностування та лікування раку, зокрема, раку молочної залози та меланом. Гангліозиди є глікосфінголіпідами, що включають сіалову кислоту і входять до складу плазматичної мембрани клітин хребетних [Стултс (Stults) та інші (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179:167-214]. У літературі повідомлялось, що деякі з цих молекул є антигенами, асоційованими з пухлинами або пухлинними маркерами [Хакоморі (Hakomori) та інші (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3:646-653]. З цього приводу застосування антигангліозидних антитіл описують, як придатне у діагностиці та терапії раку [Хафтон (Hougton) та інші (1985): Mouse monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82:1242-1246; Жанг (Zhang) та інші (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. l. Focus on gangliosides, Int. J. Cancer, 73:42-49]. Сіаловими кислотами, що частіше експресуються тваринами, є N-ацетилнейрамінова (NeuAc) та N-гліколілнейрамінова (NeuGc) кислоти [Корфілд (Corfield) та інші (1982): Occurrence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10:5-50]. NeuGc не експресується нормальними людськими та курячими тканинами взагалі, однак вона є широко розповсюдженою серед інших хребетних [Ліден (Leeden) та Ю (Yu) (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. У: Biological Role of Sialic Acid. Роземберг A. (Rosemberg А.) та Шенгтранд Кл. (Shengtrund СІ.) (Редактори) Plenum Press, New York, 1-48; Каваі (Kawai) та інші (1991): Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatographymass spectromentry, Cancer Research, 51:12421246]. Існують, однак, повідомлення, які показують, що анти-NeuGc антитіла розпізнають деякі людські пухлини та лінії пухлинних клітин [Хігаші (Higashi) та інші (1988): Detection of gangliosides as N-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79:952956; Фукуі (Fukui) та інші (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated HanganutziuDeicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154]. Підвищені рівні GM3 (NeuGc) гангліозидів були виявлені у ракових пухлинах людської молочної залози [Маркіна (Marquina) та інші (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 1996; 56: 5165-5171]. Такий результат робить привабливим застосування цієї молекули як мішені для ί лікування раку. Моноклональне антитіло (МАb) Р3 продукується лінією клітин, депонованою у ЕСАСС (Європейська колекція культивованих клітин тварин) під №94113026 [європейський патент ЕР 0657471 В1]. Це мишаче моноклональне антитіло з ізотипом IgM, яке одержали шляхом злиття мишачих спленоцитів мишей лінії BALB/c, імунізованих ліпосомами, що включають GM3 (NeuGc) та правцевий анатоксин, із клітинами лінії P3-X63-Ag8.653, які представляють собою лінію клітин мишачої мієломи. Це МАb Р3 активно реагує з гангліозидами, що містять N-гліколільовану сіалову кислоту, і не реагують ні з ацетильованими формами гангліозидів, ні з нейтральними гліколіпідами. Дані імуноцитохімічних та імуногістохімічних досліджень, проведених із лініями клітин та тканинами злоякісних та неопластичних пухлин, продемонстрували, що МАb Р3 розпізнає рак молочної залози [Васкес (Vazquez) та інші (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14:551-556] та меланому. МАb Р3 індукує антиідіотипову імунну відповідь (Аb2) у мишей лінії BALB/c (сингенна модель) навіть без ад'юванту та білка-носія [Васкес (Vazquez) та інші (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17:527534]. Роль електронегативних груп, сіалової кислоти (для гангліозидів) та SO3- (для сульфатидів), у розпізнавальних властивостях цього антитіла була встановлена шляхом імунохімічного аналізу [Морено (Moreno) та інші (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N 5 75393 6 glyclylneuraminic acid-containing gangliosides, антигенної розпізнавальної специфічності [МорріGlycobiology, 8:695-705]. сон (Morrison) та Уі (Оі) (1989): Genetically Антиідіотипове МАb 1Е10 (MAbai 1E10) підтипу engineered antibody molecules, Adv. Immunol., LgG1 одержали від мишей лінії BALB/c, імунізова44:65-92]. них МАb Р3, сполученим із KLH (гемоціанін лімфи Нещодавно було розроблено декілька спосоравлика) [патент США №6,063,379, лінія клітини, бів гуманізації мишачих або щурячих антитіл і, депонована у ЕСАСС під №97112901]. MAbai 1E10 таким чином, послаблення ксеногенної імунної розпізнає конкретно МАb Р3 і не зв'язує інші IgM відповіді проти чужорідних білків, у разі їх введенантигангліозидні антитіла. Більше того, MAbai ня людям. Одним із перших варіантів підходу до 1E10 пригнічує специфічне зв'язування МАb Р3 з послаблення антигенних властивостей були химеGM3 (NeuGc) і з лінією клітин MDA-MB-435, яку рні антитіла, у яких варіабельні домени мишачого одержали з ракової пухлини протоки молочної білка вставляють до константних доменів людсьзалози (позитивна на зв'язування MAb Р3). MAbai ких молекул, що демонструють таку саме специ1Е10 індукує активну імунну відповідь (антитіла фічність, але послаблену імуногенність, порівняно Аb3) у разі імунізації мишей сингенних або алогенз їх мишачими двійниками, причому химерні антиних моделей; ці антитіла Аb3 не демонструють тієї тіла зберігають людські ефекторні функції [Моррісаме специфічності, що МАb Р3, навіть у тому разі, сон (Morrison) та інші (1984): Chimeric human коли вони несуть набори ідіотипових детермінант, antibody molecules: Mouse antigenbinding domains подібні до тих, що переносяться антитілом Аb1 with human constant region domains, PNAS USA, [Васкес (Vazquez) та інші (1998): Syngeneic anti81:6851-6855]. Навіть у тому разі, коли химерні idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGcантитіла мають таку саме специфічність, що і миcontaining ganglioside monoclonal antibody, шачі двійники, на варіабельні ділянки гризунів часHybridoma, 17:527-534]. MAbai 1E10 індукує сильто спостерігається імунна відповідь. ний протипухлинний ефект як у сингенних, так і у З метою додаткового послаблення імуногеналогенних мишей. Ріст лінії клітин F3ll карциноми ності химерних антитіл, до людських остовних дімолочної залози був значно уповільнений повторлянок трансплантували лише гіперваріабельні ною дозою MAbai 1E10, сполученого з KLH, у ділянки моноклонального антитіла гризунів і ця ад'юванті Фрейнда у разі імунізації мишей лінії гібридна варіабельна ділянка експресувалась раBALB/c. Крім того, після імунізації зменшилась зом із людськими константними ділянками [Джонc кількість спонтанних легеневих метастаз. Інтраве(Jones) та інші (1986): Replacing the нозне введення MAbai 1E10 мишам лінії C57BL/6 complementary-determining regions in a human через 10-14 днів після інтравенозного введення antibody with those from a mouse, Nature 321:522останнім клітин меланоми В16, викликало різке 524: Верхейєн (Verhoeyen) та інші (1988): зменшення кількості легеневих метастаз, порівняReshaping human antibodies: grafting an но з мишами, які одержували сторонній IgG. Ці antilysozyme activity, Science 239, 1534-1536]. Цей результати дозволяють зробити припущення про варіант підходу, однак, має декілька недоліків: те, що відбувається запуск більш ніж одного мехаголовний з них полягає у тому, що одержане антинізму протипухлинного ефекту [Васкес (Vazquez) тіло втрачає афінність, порівняно з мишачим двійта інші (2000): Antitumor properties of an antiником, унаслідок чого деякі залишки основних діidiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolylлянок необхідно відновлювати відповідниками у containing gangliosides, Oncol. Rep., 7:751-756, мишачому імуноглобуліні [Річман (Rietchmann) та 2000]. інші (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Незважаючи на те, що технологія моноклонаNature, 332: 323-327; Куін (Queen) та інші (1989): A льних антитіл розробляється впродовж останніх humanized antibody that binds to the interleukin 2 15 років [Келер (Koehler) та Мілстайн (Milstein) receptor, PNAS USA, 86:10029-10033; Темпест (1975): Continuous cultures of fused cells secreting (Tempest) та інші (1991): Reshaping a human antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495monoclonal antibody to inhibit human respiratory 497], а також на те, що моноклональні антитіла все syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9:266ще залишаються дуже корисними у діагностиці та 272]. На додаток до цього, у антитіл із транспландослідженнях, вони не продемонстрували своєї тованими гіперваріабельними ділянками часто терапевтичної ефективності на людях. Це обумовспостерігається стійка імуногенність. люється, головним чином, їх нетривалим часом Матео (Mateo) та співробітники [патент США напівжиття у крові, тим, що мишачі ефекторні фун№5712120] навели опис І способу послаблення кції виявились непридатними для людської імунної імуногенності мишачих антитіл. За цим способом системи, а також людською імунною відповіддю, модифікації обмежуються варіабельними доменащо полягає у продукуванні антимишачих антитіл. ми і, конкретно, мишачими остовними ділянками Окрім того, генно-інженерна технологія ревохимерних антитіл. Більше того, заміни здійснюлюціонізувала потенціал придатності моноклонаються лише на тих частинах остовних ділянок, які льних антитіл, оскільки завдяки маніпулюванню мають амфіпатичні послідовності, і, таким чином, є імуноглобуліновими генами можна одержати мопотенційними антигенними детермінантами, що дифіковані антитіла послабленої антигенності, а розпізнаються Т-клітинами. Згаданий спосіб вклютакож поліпшити їх ефекторні функції для лікуванчає розважливу заміну декількох амінокислотних ня або діагностування певних патологій. Головна залишків, розміщених у потенційно імуногенних мета способів послаблення імуногенності імуногантигенних детермінантах, відповідними залишкалобулінів полягає у зменшені різниць між мишачим ми найгомологічнішої людської послідовності; поантитілом та людським імуноглобуліном, без зміни дібній заміні не підлягають амінокислоти, які, голо 7 75393 8 вним чином, несуть відповідальність за канонічні Положення 11: Met на Leu структури, а також залишки, що знаходяться у Положення 13: Thr на Ala безпосередній близькості до гіперваріабельних За іншим аспектом, цей винахід має відноділянок або у зоні Верн'є. шення до химерного антитіла, яке одержують із Одержане антитіло зберігає свою антигенмишачого моноклонального антитіла 1Е10, що зв'язувальну специфічність і є менш імуногенним, продукується лінією клітин гібридоми, депоновааніж його мишачий або химерний попередник [Маною у ЕСАСС під №97112901, і яке є антиідіотипотео (Mateo) та інші (2000): Removal of T cell вим антитілом, що розпізнає МАb Р3. MAbai 1E10 epitopes from genetically engineered antibodies: відрізняється такими послідовностями гіперваріаProduction of modified immunoglobulins with reduced бельних ділянок (CDR) важкого та легкого ланцюimmunogenicity, Hybridoma 19:463-71]; ці властивогів: сті підвищують їх терапевтичну придатність. За Важкий Ланцюг: цим способом необхідно здійснювати лише нечисCDR1: SYDIN ленні мутації та вдаватись, звичайно, до меншого CDR2: WIFPGDCSTKYNEKFKG обсягу генетичних маніпуляцій. CDR3: EDYYDNSYYFDY Цей винахід має відношення до рекомбінантЛегкий ланцюг: них антитіл, одержаних засобами генної інженерії. CDR1: RASQDISNYLN Зокрема, цей винахід має відношення до химерноCDR2: YTSRLHSG го антитіла, що одержують із мишачого моноклоCDR3: QQGNTLPWT нального антитіла Р3, яке продукується лінією За варіантом, якому віддається перевага, посклітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під лідовності остовних ділянок важкого та легкого №94113026. МАb Р3 розпізнає антиген, що ексланцюга є такими: пресується клітинами пухлини молочної залози та Важкий ланцюг: меланомами. МАb Р3 відрізняється такими посліFR1: довностями гіперваріабельних ділянок (CDRs) QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT важкого та легкого ланцюгів: FR2: WVRQRPEQGLEWIG Важкий ланцюг: FR3: CDR1: RYSVH KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS FR4: WGQGTTLTV CDR3: SGVREGRAQAWFAY Легкий ланцюг: Легкий ланцюг: FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC CDR1: KASQDVSTAVA FR2: WYQQKPDGTVKLLIY CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTPWT FR3: За варіантом, якому віддається перевага, посVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC лідовності остовних ділянок важкого та легкого FR4: FGGGTKLESK ланцюга є такими: За варіантом, якому віддається перевага, хиВажкий ланцюг: мерне антитіло за цим винаходом включає консFR1: тантну ділянку важкого ланцюга людського IgG1 і QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS константну ділянку легкого ланцюга людського Сk. FR2: WVRQPPGKGLEWLG За іншим аспектом, цей винахід має відношення FR3: до гуманізованого антитіла, яке одержують з МАb RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR 1Е10, що продукується лінією клітин гібридоми, FR4: WGQGTLV депонованою у ЕСАСС під №97112901, що відрізЛегкий ланцюг: няється тим, що включає константну ділянку важFR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC кого ланцюга людського IgG1 та константну ділянFR2: WYQQKPGQSPKLLIY ку легкого ланцюга людського Сk і остовні ділянки FR3: важкого та легкого ланцюга включають будь-яку з GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC наведених далі точкових мутацій: FR4: FGGGTKL Легкий ланцюг: За варіантом, якому віддається перевага, хиПоложення 7: Thr на Ser мерне антитіло за цим винаходом включає консПоложення 8: Thr на Pro тантну ділянку важкого ланцюга людського IgG1 і Положення 15: Leu на Val константну ділянку легкого ланцюга людського Сk. Важкий ланцюг: За іншим аспектом, цей винахід має відношення Положення 5: Gin на Val до гуманізованого антитіла, яке одержують із МАb Положення 40: Arg на Ala Р3, що продукується лінією клітин гібридоми, деПоложення 42: Glu на Gly понованою у ЕСАСС під №94113026, що відрізняПоложення 87 (83 за нумерацією Кабата ється тим, що включає константну ділянку важкого (Kabat)): Thr на Arg ланцюга людського IgG11 та константну ділянку За іншим аспектом, цей винахід має віднолегкого ланцюга людського Сk і остовні ділянки шення до ліній клітин, що експресують химерні та легкого ланцюга включають будь-яку з наведених гуманізовані антитіла, опис яких наведено; на додалі точкових мутацій: даток до цього, винахід має відношення до фарЛегкий ланцюг: мацевтичних композицій, що містять антитіла, Положення 8: His на Pro опис яких наведено. Положення 9: Lys на Ser За варіантом, якому віддається перевага, цей Положення 10: Phe на Ser винахід має відношення до фармацевтичних ком 9 75393 10 позицій для лікування пухлин молочної залози, 152: 89-104]. легень, шлунково-кишкової системи, сечовоГени VH вирізували з вектора ТА шляхом фестатевої системи, меланом, сарком та пухлин нейрментативного розщеплення за допомогою EcoRV роектодермічного походження, їхніх метастаз та та Nhel і клонували до вектора експресії (РАН рецидивів, що містять антитіла, опис яких наведе4604), що включав варіабельну ділянку людського но, та відповідний наповнювач. IgG1 і ген стійкості до гістидинолу. Одержані генЗа іншим варіантом втілення цього винаходу но-інженерні конструкції були позначені як P3VHфармацевтичні композиції можуть застосовуваPAH4604 та 1E10VH-PAH4604. тись для локалізації та діагнозу in vivo пухлин моГени VK вирізували з вектора ТА шляхом фелочної залози, легень, шлунково-кишкової систерментативного розщеплення за допомогою EcoRV ми, сечово-статевої системи, меланом, сарком та та Sall і клонували до вектора експресії (PAG4622). пухлин нейроектодермічного походження, їхніх Цей вектор включав ген стійкості до мікофенолометастаз та рецидивів, і включати антитіла, опис вої кислоти та людську константну каппа-ділянку. яких наведено. Одержані генно-інженерні конструкції були познаСинтез кДНК та ампліфікація засобами полічені як P3VK-PAG4622 та 1E10VK-PAG4622. меразної ланцюгової реакції (PCR) варіабельної Експресія химерних антитіл, одержаних із МАb ділянки МАb Р3 та MAbai 1E10 Р3 та MAbai 1E10 Цитоплазматичну РНК екстрагували із приблиКлітини NS-0 піддавали електропорації 10мкг зно 106 клітин гібридоми Р3 (мишаче IgM Mab, що P3VK-PAG4622 або 1E10VK-PAG4622K; клони, що розпізнає GM3 N-гліколільований гангліозид) або експресували людські легкі каппа-ланцюги, транс1Е10 (антиідіотипове анти-Р3 антитіло). РНК екстфікували 10мкг P3VH-PAH4604 або 1E10VHрагували за допомогою реактиву TRIZOL (фірма PAH4604. GIBCO BRL, Grand Island, Нью-Йорк) за інструкціДНК лінеаризували шляхом розщеплення феями виробника. рментом Pvul, осаджували етанолом та розчиняли Реакцію синтезу кДНК здійснювали шляхом у 50мкл забуференого фосфатом фізіологічного змішування 5мкг РНК, 25пмоль Vh (комплементаррозчину. Приблизно 107 клітин збирали шляхом ного до константної ділянки мишачого IgM для центрифугування і ресуспендували у 0,5мл забуVHP3 та константної ділянки мишачого IgG1 для ференого фосфатом фізіологічного розчину разом VH 1E10) або Vk (комплементарного до константіз розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. ної мишачої каппа-ділянки для обох антитіл), Після 10хв. на льоду клітини піддавались імпульсу 2,5мМ розчину дезоксинуклеозид-5'-трифосфату електричного току (200В, 960мкФ) і залишались на (dNTP), 50мМ розчину трис-НСІ (pH 7,5), 75мМ льоду додатково впродовж 10хв. Після цього клірозчину КСl, 10мМ розчину дитіотреїтолу (DTT), тини розподіляли до 96-лункового планшета з мо8мМ розчину MgCl2 та 15 одиниць інгібітору РНКадифікованим за способом Дульбекко живильним зи у 50мкл реакційної суміші. Суміш нагрівали при середовищем Ігла F12 плюс 10% фетальної телятемпературі 70°С впродовж 10хв. і повільно охочої сироватки. Через два або чотири дні додавали лоджували до температури 37°С. Після цього доселективне середовище (модифіковане за спосодавали 100 одиниць РНК-залежної ДНКбом Дульбекко живильне середовище Ігла F12 з полімерази, і інкубування продовжували при теммікофеноловою кислотою (0,45мкг/мл) або гістипературі 42°С впродовж 1год. динолом (10мМ розчин), відповідно). ТрансфіковаВаріабельні ділянки VK та VH кДНК ампліфікуні клони спостерігались неозброєним оком через вали засобами полімеразної ланцюгової реакції. 14 днів. Стисло, 5мкл кДНК VH або VK змішували з Присутність людського антитіла у живильному 25пмоль специфічного праймера, 2,5мМ розчином середовищі лунок, що містили трансфіковані клоdNTP, 5мкл складових буфера 10Х Taqни, визначали шляхом твердофазного імуноферполімерази та 1 одиницею цього ферменту. Зразки ментного аналізу (ELISA). Лунки титраційного мікпіддавали 25 термічним циклам при температурі ропланшета сенсибілізували козячим 94°С, 30с.; 50°С, 30с.; 72°С, 1хв. і, нарешті, інкубуантилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, ванню впродовж 5хв. при температурі 72°С. що продукують людський каппа-ланцюг) або антиКлонування та секвенування ампліфікованої людськими IgG (специфічними для гаммакДНК ланцюга) (для клонів, що продукують повне антиПродукти PCR VH та VK (Р3 та 1Е10, відповідтіло) антитілами. Після промивання PBS-T (забуно) клонували до вектора ТА (набір для клонуванферений фосфатом фізіологічний розчин, що ня Та Cloning kit, фірма Promega, США). Одержані включає 0,05% Твін-20) розбавлене культуральне клони секвенували дидезокси методом встановсередовище лунок, що містять трансфектанти, лення первинної структури ДНК із застосуванням додавали до кожної лунки титраційного мікроплаТ7 ДНК-полімерази (набір для секвенування Т7 ншета на 1год при температурі 37°С. Лунки проsequencing kit, фірма Pharmacia, Швеція). мивали PBS-T, додавали козячий антилюдський Конструювання химерних генів легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидаГени варіабельних ділянок важких та легких зою із хрону або козячий антилюдський IgG, кон'юланцюгів (VH та VK) вирізували з векторів ТА шлягований із лужною фосфатазою (специфічний для хом ферментативного розщеплення і клонували гамма-ланцюга), та інкубували при температурі до відповідних векторів експресії [Колома (Coloma) 37°С впродовж 1год. Лунки промивали PBS-T і та інші (1992): Novel vectors for the expression of додавали субстратний буфер, що містив оantibody molecules using variable regions generated фенілендіамін або р-нітрофенілфосфат, відповідby polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., но. Через півгодини визначали оптичну густину 11 75393 12 при 492нм або 405нм, відповідно. Слід звернути увагу на присутність пролінових Конструювання гуманізованих антитіл P3hu та залишків у спіральному амфіпатичному сегменті, а 1E10hu шляхом гуманізації антигенних детермітакож на те, що певні мишачі залишки не з'являнант Т-клітин. Прогнозування антигенних детерміються у тому саме положенні у найгомологічнішій нант Т-клітин людській послідовності, однак часто зустрічаються Послідовності варіабельних ділянок Р3 та у інших людських імуноглобулінах. Із цієї причини 1E10 аналізували за допомогою алгоритму АМРНІ не існує унікального набору мишачих амінокислот [Маргаліт (Margalit) та інші (1987): Prediction of до заміни у основних ділянках. Можна одержати immunodominant helper T cell antigenic sites from різні варіанти модифікованого антитіла з різною the primary sequence, J. immunol., 138:2213-2229]. кількістю замін. Мутації здійснювали шляхом переЗа його допомогою розшукують спіральні амфілакривання полімеразних ланцюгових реакцій. тичні сегменти з 7-11 амінокислотними залишками, Клонування та експресія гуманізованих антитіл які асоціюються з Т-імуногенністю. Спіральні гідP3hu та 1E10hu рофобні сегменти прогнозували також за допомоГенно-інженерні конструкції, що відповідали гою програми SOHHA [Елліот (Elliot) та інші (1987). P3hu та 1E10hu, клонували у векторах експресії за An hypothesis on the binding of an amphipatic, alpha способом, опис якого наведено для химерних анhelical sequence in li to the desotope of class II титіл. Одержані генно-інженерні конструкції були antigen, J. Immunol., 138: 2449-2952]. Обидва алгопозначені як P3VKhu-Pag4622 або 1E10Vkhuритми прогнозували, які сегменти з послідовносPAG4622 та P3VHhu-PAH4604 і 1E10VHhuтей варіабельних ділянок антитіл Р3 та 1E10 могPAH4604. Вони були трансфіковані до клітин NS-0 ли б бути презентовані Т-клітинам-помічникам у за методикою, опис якої було наведено перед тим контексті молекул II класу головного комплексу для химерних антитіл. гістосумісності. Очищення рекомбінантних антитіл Аналіз гомології з людськими імуноглобулінаРекомбінантні антитіла очищали засобами ми афінної хроматографії із застосуванням білка А Амінокислотні послідовності мишачих варіа(фірма Pharmacia, Upssala, Швеція). бельних ділянок порівнювали з імуноглобуліновиБіологічна активність ми послідовностями, включеними до бази даних Біологічну активність рекомбінантних антитіл GeneBank та EMBL (доступна у Інтернеті). Для перевіряли за специфічним зв'язуванням з антигекожного антитіла було визначено найгомологічніном, що визначали шляхом ELISA. шу послідовність людської варіабельної ділянки. Для рекомбінантного МАb Р3, титрувальні мікДля пошуку гомологічних послідовностей було ропланшети сенсибілізували розчином використано програмне забезпечення PC-TWO GM3(NeuGc) гангліозиду у метанолі. Після просуНІВЮ PROSIS 06-00 (Hitachi). шування впродовж 1год., неспецифічне зв'язуванАналіз на послаблення імуногенності ня блокували 1% розчином сироваткового альбуМетою способу є послаблення імуногенності міну великої рогатої худоби (BSA) у трис-НСІ та шляхом руйнування або гуманізації потенційних інкубували впродовж 1год. при температурі 37°С. імуногенних Т-антигенних детермінант із мінімальЛунки промивали забуференим фосфатом фізіоною кількістю мутацій. Згаданий спосіб включає логічним розчином та інкубували впродовж 1год. розважливу заміну декількох амінокислотних запри температурі 37°С з очищеним рекомбінантним лишків, що знаходяться у межах спіральних амфіМАb Р3. Лунки промивали трис-НСІ, додавали патичних сегментів. Амінокислоти, які несуть, гокозяче антилюдське антитіло, кон'юговане з лужловним чином, відповідальність за канонічні ною фосфатазою та інкубували при температурі структури, а також залишки у безпосередній бли37°С впродовж 1год. І, нарешті, лунки промивали зькості до гіперваріабельних ділянок або у зоні та додавали субстратний буфер, що включав рВерн'є, повинні зберігатись. нітрофенілфосфат. Через півгодини визначали За цим способом порівнюють послідовності оптичну густину при 405нм або 492нм, відповідно. варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів Для рекомбінантного MAbai 1E10 ELISA здійсмишачого імуноглобуліну з найгомологічнішими нювали подібним же чином, за виключенням того, людськими послідовностями з ідентифікуваням що лунки сенсибілізували МАb Р3 і промивали залишків, якими різняться мишача та людська поPBS-0,05% Твін-20. слідовності, лише у амфіпатичних сегментів, що Приклади знаходяться у межах остовних ділянок [Кабат У наведених далі прикладах усі використані (Kabat) (1991), Sequences of proteins of ферменти, а також реактиви і матеріали були одеimmunological interest, п'яте видання, Національржані з комерційних джерел, якщо не вказано інний Інститут Здоров'я (США)]. Раніше визначені ше. залишки замінювали залишками, присутніми у Приклад 1. Одержання химерного МАb Р3 найгомологічнішій людській послідовності. Заміни Синтез кДНК відбувався шляхом реакції з рездійснювали методами прямого мутагенезу. вертазою, із започаткування з РНК гібридоми, що Залишки, залучені до тривимірної структури продукує МАb Р3, як описувалось раніше. Показамісця зв'язування, мутаціям не піддавали; це могна послідовність специфічних праймерів, що були ло негативно вплинути на розпізнавання антигену. використані у цій реакції: Додаткову інформацію відносно впливу замін у Для VН: третинній структурі можна одержати шляхом мо5' лекулярного моделювання місця зв'язування антиAGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CC гену. AGTGGATAGAC 3' 13 75393 14 Для VK: су електричного току (200В, 960мкФ) і залишались 5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG на льоду додатково впродовж 10хв. Після цього 3' клітини розподіляли до 96-лункового планшета з кДНК VHP3 та кДНК VKP3 ампліфікували за модифікованим за способом Дульбекко живильдопомогою полімеразної ланцюгової реакції із заним середовищем Ігла F12 плюс 10% фетальної стосуванням Taq-полімерази та специфічних телячої сироватки. Через два або чотири дні допраймерів. Сайтами рестрикції, що включались до давали селективне середовище (модифіковане за праймерів, були ECORV/NHEI для VH та способом Дульбекко живильне середовище Ігла ECORV/SALI для VK. Були використані такі прайF12 із мікофеноловою кислотою (0,45мкг/мл) або мерні послідовності: гістидинолом (10мМ розчин), відповідно). ТрансфіДля VН: ковані клони спостерігались неозброєним оком Праймер 1 (сигнальний пептид): через 14 днів. 5' Присутність людського антитіла у живильному GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG середовищі лунок, що містили трансфіковані кло)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3' ни, визначали шляхом твердофазного імуноферПраймер 2 (СН1): ментного аналізу (ELISA). Лунки титраційного мік5' ропланшета сенсибілізували козячим GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT 3' антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, Для VК: що продукують людський каппа-ланцюг) або антиПраймер 1 (сигнальний пептид): людськими IgG (специфічними для гамма5' ланцюга) (для клонів, що продукують повне антиGGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CT тіло) антитілами. Після промивання PBS-T (забуCAGGTCTTT(GA)T 3' ферений фосфатом фізіологічний розчин, що Праймер 2 (Ck): включає 0,05% Твін-20) розбавлене культуральне 5' середовище лунок, що містять трансфектанти, AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(G додавали до кожної лунки титраційного мікроплаT)GTCCC 3' ншета на 1год. при температурі 37°С. Лунки проПродукти полімеразної ланцюгової реакції мивали PBS-T, додавали козячий антилюдський клонували до вектора ТА (набір для клонування легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидаТА cloning kit, фірма Invitrogen). Дванадцять незазою із хрону або козячий антилюдський IgG, кон'юлежних клонів секвенували дидезокси методом гований із лужною фосфатазою (специфічний для встановлення первинної структури ДНК із застосугамма-ланцюга), та інкубували при кімнатній темванням Т7 ДНК-полімерази (фірма Pharmacia). пературі впродовж 1год. Лунки промивали PBS-T і Аналізом пошуку гомологій визначили найгомолододавали субстратний буфер, що включав огічнішу послідовність для VHP3 та VKP3. Послідофенілендіамін або p-нітрофенілфосфат, відповідвності VHP3 та VKP3 (Фіг.1 та Фіг.2) мають високу но. Через півгодини визначали оптичну густину гомологію з групами IB та V, відповідно, за класипри 492нм або 405нм, відповідно. фікацією Кабата. Приклад 2. Одержання різних варіантів їуманіПісля розщеплення рестриктазами ECORV та зованого антитіла Р3 NHEI для VHP3 та ECORV і SALI для VKP3, їх клоПослідовності мишачих VHP3 та VKP3 (Фіг.1 нували до векторів експресії, попередньо розщепта Фіг.2) порівнювали з людськими послідовностялених тими саме ферментами, РАН4604 та ми. На Фіг.3 та Фіг.4 показані найгомологічніші PAG4622 для VH та VK, відповідно. Ці вектори людські послідовності. На послідовностях варіаекспресії були подаровані Шері Моррісон (Sherie бельної ділянки мишачого Р3 відшукували спіраMorrison) (UCLA, Каліфорнія, США); вони є придальні амфіпатичні ділянки або потенційні Т-клітинні тними для експресії імуноглобулінів у клітинах антигенні детермінанти і за згаданим способом ссавців. Вектор РАН 4604 включав константну дівизначали розважливу стратегію заміни амінокислянку людського LgG1, а вектор PAG 4622 вклюлот із метою руйнування або гуманізації потенційчав людську Ck [Колома (Coloma) та інші (1992): них Т-клітинних антигенних детермінант у межах Novel vectors ibr the expression of antibody мишачих послідовностей. molecules using variable regions generated by Аналіз VHP3 виявив (Фіг.3) 2 амфіпатичні сегpolymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: менти, перший з яких охоплює CDR1, FR2 та деякі 89-104]. Одержані генно-інженерні конструкції були залишки CDR2, у той час як другий охоплює кінець позначені як P3VH-PAH4604 та P3VK-PAG4622. FR3 та CDR3. Головні різниці мишачої послідовноКлітини NS-0 трансфікували 10мкг P3VKсті, порівняно з найгомологічнішою людською посPAG4622, клон, що експресував легкий ланцюг, лідовністю, були знайдені у гіперваріабельних дітрансфікували 10мкг P3VH-PAH4604; у обох випалянках або залишках, залучених до тривимірної дках ДНК лінеаризували за допомогою Pvul, осаструктури сайту зв'язування. З цієї причини було джували етанолом та розчиняли у 50мкл забуфевирішено не замінювати жодної амінокислоти у реного фосфатом фізіологічного розчину перед мишачій VHP3. трансфекцією. Аналіз VKP3 також виявив 2 амфіпатичні сегПриблизно 107 клітин збирали шляхом менти (Фіг.4), перший з яких охоплює FR1, другий центрифугування і ресуспендували у 0,5мл забуохоплює CDR2 та деякі залишки FR3. Було виріференого фосфатом фізіологічного розчину разом шено замінити залишки у положеннях 8, 9, 10, 11 із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. та 13 залишками у тому саме положенні найгомоПісля 10хв. на льоду, клітини піддавались імпульлогічнішої людської послідовності. Амінокислоти 15 75393 16 His, Lys, Phe, Met та Thr були замінені на Pro, Ser, що були використані у цій реакції: Ser, Leu та Ala, відповідно. Заміну здійснили шляДля VH: хом перекривання полімеразних ланцюгових реак5' цій [Камманн (Kammann) та інші (1989): Rapid GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3' insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain Для VK: reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17:5404] із за5' стосуванням праймерів 1 та 2 і 3 та 4, послідовноGCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3' сті яких виглядають таким чином: кДНК VH1E10 та кДНК VK1E10 ампліфікували Праймер 1: за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із 5' застосуванням Taq-полімерази та специфічних ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGT праймерів AGGAGAC 3' Для VН: Праймер 2: Праймер 1 (сигнальний пептид): 5' 5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(G GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG T)GTCCC 3' )GT(CA)AT(CG)CTCTT 3' Праймер 3: Праймер 2 (СН1): 5' 5' GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGA GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3' CTGGGTCAT 3' Для VК: Праймер 4: Праймер 1 (сигнальний пептид): 5GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(T 5' A)CTCAGGTCTTT(GA)T3' GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCA Точкові мутації були перевірені секвенуванG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3' ням. Одержана генно-інженерна конструкція була Праймер 2 (Ск): позначена як P3Vkhu і клонована до вектора екс5' пресії PAG 4622. Одержали генно-інженерну консAGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(G трукцію P3VKhu-PAG4622. T)GTCCC 3' Для експресії гуманізованого антитіла Р3 кліПродукти полімеразної ланцюгової реакції тини NS-0 трансфікували P3VH-PAH4604 та клонували до вектора ТА (набір для клонування P3VKhu-PAG4622. ТА cloning kit, фірма Invitrogen). Дванадцять незаАнтитіло P3hu трансфікували за тією саме мележних клонів секвенували (Фіг.7 та Фіг.8) дидезотодикою електропорації та виявлення, опис якої кси методом встановлення первинної структури було наведено перед тим для химерних антитіл. ДНК із застосуванням Т7 ДНК-полімерази (фірма Приклад 3: Біолопчна активність химерного Pharmacia). Аналізом пошуку гомологій визначили МАb Р3 найгомологічнішу послідовність для VH1E10 та Біологічну активність химерного МАb Р3 переVK1E10. Послідовності VH1E10 та VK1E10 мають віряли за специфічним зв'язуванням з антигеном, високу гомологію з різними групами та групою V, що визначали шляхом ELISA. відповідно, за класифікацією Кабата. Для рекомбінантного МАb Р3, титрувальні мікПісля розщеплення рестриктазами ECORV та ропланшети сенсибілізували розчином NHEI для VH1E10 та Hindi і SALI для VK1E10, їх GM3(NeuGc) гангліозиду у метанолі. Після просуклонували до векторів експресії, попередньо розшування впродовж 1год. при температурі 37°С, щеплених придатними ферментами, РАН4604 та неспецифічне зв'язування блокували 1% розчином PAG4622 для VH та VK, відповідно. Ці вектори сироваткового альбуміну великої рогатої худоби експресії були подаровані Шері Моррісон (Sherie (BSA) у трис-НСІ буфері та інкубували впродовж Morrison) (UCLA, Каліфорнія, США); вони є прида1год. при температурі 37°С. Лунки промивали затними для експресії імуноглобулінів у клітинах буференим фосфатом фізіологічним розчином та ссавців. Вектор РАН 4604 включав константну діінкубували впродовж 1год. при температурі 37°С з лянку людського LgG1, а вектор PAG 4622 вклюочищеним рекомбінантним МАb Р3. Лунки промичав людську Сk [Колома (Coloma) та інші (1992): вали трис-НСІ, додавали козяче антилюдське анNovel vectors for the expression of antibody титіло, кон'юговане з лужною фосфатазою та інкуmolecules using variable regions generated by бували при температурі 37°С впродовж 1год. І, polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: нарешті, лунки промивали трис-НСІ і додавали 89-104]. Одержані генно-інженерні конструкції були субстратний буфер, що включав pпозначені як 1E10VH-PAH4604 та 1E10VKнітрофенілфосфат. Через півгодини визначали PAG4622. оптичну густину при 405нм. Клітини NS-0 трансфікували 10мкг 1E10VKХимерне МАb Т1 використовували як негативPAG4622, клон, що експресував легкий ланцюг, ний контроль. трансфікували 10мкг 1E10VH-PAH4604; у обох На Фіг.5 зображено специфічне зв'язування випадках ДНК лінеаризували за допомогою Pvul, химерного МАb Р3 з антигеном. осаджували етанолом та розчиняли у 50мкл забуПриклад 4. Одержання химерного МАb 1Е10 ференого фосфатом фізіологічного розчину перед Синтез кДНК відбувався шляхом реакції з ретрансфекцією. вертазою, із започаткування з РНК гібридоми, що Приблизно 107 клітин збирали шляхом продукує МАb 1Е10, як описувалось раніше. Далі центрифугування і ресуспендували у 0,5мл забупоказана послідовність специфічних праймерів, ференого фосфатом фізіологічного розчину разом 17 75393 18 із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. Праймерами для мутації у положенні 5 важкоПісля 10хв. на льоду, клітини піддавались імпульго ланцюга були праймери 1, 2, 3 та 4, послідовносу електричного току (200В, 960мкФ) і залишались сті яких виглядають таким чином: на льоду додатково впродовж 10хв. Після цього Праймер 1: клітини розподіляли до 96-лункового планшета з 5' CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3' модифікованим за способом Дульбекко живильПраймер 2: ним середовищем Ігла F12 плюс 10% фетальної 5' телячої сироватки. Через два або чотири дні доGGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3' давали селективне середовище (модифіковане за Праймер 3: способом Дульбекко живильне середовище Ігла 5' AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3' F12 із мікофеноловою кислотою (0,45мкг/мл) або Праймер 4: гістидинолом (10мМ розчин), відповідно). Трансфі5' ковані клони спостерігались неозброєним оком GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG через 14 днів. )GT(CA)AT(CG)CTCTT 3' Присутність людського антитіла у живильному Після секвенування точкової мутації у полосередовищі лунок, що містили трансфіковані кложенні 5, були здійснені мутації у положеннях 40 та ни, визначали шляхом твердофазного імунофер42. ментного аналізу (ELISA). Лунки титраційного мікПраймер для мутацій у положеннях 40 та 42 ропланшета сенсибілізували козячим важкого ланцюга: антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, Праймер 1: що продукують людський каппа-ланцюг) або анти5' людськими IgG (специфічними для гаммаTGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGA ланцюга) (для клонів, що продукують повне антиG 3' тіло) антитілами. Після промивання PBS-T (забуПраймер 2: ферений фосфатом фізіологічний розчин, що 5' включає 0,05% Твін-20) розбавлене культуральне GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3' середовище лунок, що містять трансфектанти, Праймер 3: додавали до кожної лунки титраційного мікропла5' ншета на 1год. при температурі 37°С. Лунки проCTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA мивали PBS-T, додавали козячий антилюдський 3' легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидаПраймер 4: зоюіз хрону або козячий антилюдський IgG, кон'ю5' гований з лужною фосфатазою (специфічний для GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG гамма-ланцюга), та інкубували при кімнатній тем)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3' пературі впродовж 1год. Лунки промивали PBS-T, і Після секвенування точкової мутації у полододавали субстратний буфер, що містив оженнях 40 та 42, була здійснена мутація у полофенілендіамін або p-нітрофенілфосфат, відповідженні 87 (83 за нумерацією Кабата). но. Через півгодини визначали оптичну густину Праймер для мутації у положенні 87 (83 за нупри 492нм або 405нм, відповідно. мерацією Кабата) важкого ланцюга: Приклад 5. Одержання різних варіантів гуманіПраймер 1: зованого антитіла 1E10 5' CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3' Послідовності мишачих VH1E10 та VK1E10 Праймер 2: (Фіг.6 та Фіг.7) порівнювали з людськими послідов5' ностями. На Фіг.8 та Фіг.9 показані найгомологічGGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3' ніші людські послідовності. На послідовностях ваПраймер 3: ріабельної ділянки мишачого 1E10 відшукували 5' AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3' спіральні амфіпатичні ділянки або потенційні ТПраймер 4: клітинні антигенні детермінанти, і за згаданим спо5' собом визначали розважливу стратегію заміни GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG амінокислот із метою руйнування або гуманізації (TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3' потенційних Т-клітинних антигенних детермінант у Інші заміни не робили, оскільки залишки були межах мишачих послідовностей. залучені до тривимірної структури сайту зв'язуАналіз VH1E10 виявив (Фіг.8) 3 амфіпатичні вання. сегменти, перший з яких охоплює FR1, другий Точкові мутації були перевірені секвенуванохоплює FR2, третій охоплює FR3. Було вирішено ням. Одержана генно-інженерна конструкція була замінити залишки у положеннях 5, 40, 42 та 87 (83 позначена як 1E10VHhu і клонована до вектора за нумерацією Кабата) залишками у тому саме експресії РАН4604. Одержали генно-інженерну положенні найгомологічнішої людської послідовконструкцію 1E10VH-PAH4604. ності. Амінокислоти Gln, Arg, Glu та Thr були заміАналіз VK1E10 також виявив 3 амфіпатичні сенені на Val, Ala, Gly та Arg, відповідно. гменти (Фіг.9), перший з яких охоплює FR1, другий Заміну здійснили шляхом перекривання поліохоплює CDR1, третій охоплює FR3. Було вирішемеразних ланцюгових реакцій [Камманн но замінити залишки у положеннях 7, 8 та 15 за(Kammann) та інші (1989): Rapid insertional лишками у тому саме положенні найгомологічнішої mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction людської послідовності. Амінокислоти Thr, Thr та (PCR), Nucleic Acids Res., 17:5404] із застосуванLeu були замінені на Ser, Pro та Val, відповідно. ням різних наборів праймерів. Заміну здійснили шляхом перекривання полімера 19 75393 20 зних ланцюгових реакцій [Камманн (Kammann) та послідовності варіабельної ділянки важкого ланінші (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by цюга антитіла Р3. Нумерація амінокислот відповіpolymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., дає класифікації Кабата [Кабат (Kabat) та інші 17:5404] із застосуванням праймерів 1, 2, 3 та 4, (1991). Sequences of proteins of immunological послідовності яких виглядають таким чином: interest, п'яте видання, Національний Інститут Праймери для мутації у положеннях 7, 8 та 15 Здоров'я (США)]. Гіперваріабельні ділянки позналегкого ланцюга: чені штрих-пунктирними лініями. Праймер 1: Фіг.2: Визначені нуклеотидні та амінокислотні 5' послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюCAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCT га антитіла Р3. Нумерація амінокислот відповідає CTGTGGGAGACAGAGTC 3' класифікації Кабата [Кабат (Kabat) та інші (1991). Праймер 2: Sequences of proteins of immunological interest, п'я5' те видання, Національний Інститут Здоров'я AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(G (США)]. Гіперваріабельні ділянки позначені штрихT)GTCCC 3' пунктирними лініями. Праймер 3: Фіг.3: Порівняльний аналіз VHP3 із найгомоло5' гічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGA сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки AGGAGACTGTGTCATCTG 3' позначені жирним шрифтом. Праймер 4: Фіг.4: Порівняльний аналіз VKP3 із найгомоло5' гічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCA сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки G(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3' позначені жирним шрифтом. Точкові мутації були перевірені секвенуванФіг.5: Специфічне зв'язування химерного МАb ням. Одержана генно-інженерна конструкція була Р3 з GM3(NeuGc). Шляхом ELISA випробували позначена як 1E10Vkhu і клонована до вектора різні концентрації МАb Р3 та МАb Т1 (негативний експресії PAG 4622. Одержали генно-інженерну контроль). Титраційні мікропланшети сенсибілізуконструкцію lEMVKhu-PAG4622. вали розчином GM3(NeuGc) та GM3(NeuAc) (негаДля експресії гуманізованого антитіла 1Е10, тивний контроль) гангліозиду у метанолі і визнаклітини NS-0 трансфікували 1E10VHhu-PAH4604 чали специфічне зв'язування. та 1E10VKhu-PAG4622. Фіг.6: Визначені нуклеотидні та амінокислотні Антитіло 1E10hu трансфікували за тією саме послідовності варіабельної ділянки важкого ланметодикою електропорації та виявлення, опис якої цюга антитіла 1Е10. Нумерація амінокислот відпобуло наведено перед тим для химерних антитіл. відає класифікації Кабата [Кабат (Kabat) та інші Приклад 6: Біологічна активність химерного (1991). Sequences of proteins of immunological MAb 1E10 interest, п'яте видання, Національний Інститут Біологічну активність химерного MAb 1E10 пеЗдоров'я (США)]. Гіперваріабельні ділянки познаревіряли за специфічним зв'язуванням з антигечені штрих-пунктирними лініями. ном, що визначали шляхом ELISA. Фіг.7: Визначені нуклеотидні та амінокислотні Для рекомбінантного MAb 1E10, титрувальні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюмікропланшети сенсибілізували MAb Р3. Після га антитіла 1E10. Нумерація амінокислот відповіпромивання PBS-T (забуферений фосфатом фізідає класифікації Кабата [Кабат (Kabat) та інші ологічний розчин, що включає 0,05% Твін-20), не(1991). Sequences of proteins of immunological специфічне зв'язування блокували 1% розчином interest, п'яте видання, Національний Інститут сироваткового альбуміну великої рогатої худоби Здоров'я (США)]. Гіперваріабельні ділянки позна(BSA) у PBS-T та інкубували впродовж 1год. при чені штрих-пунктирними лініями. температурі 37°С. Лунки промивали, та інкубували Фіг.8: Порівняльний аналіз VH1E10 із найговпродовж 1год. при температурі 37°С з очищеним мологічнішою людською послідовністю. Амфіпатирекомбінантним MAb 1E10. Лунки пррмивали PBSчні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки T, додавали козяче антилюдське антитіло, кон'юпозначені жирним шрифтом. говане з лужною фосфатазою та інкубували при Фіг.9: Порівняльний аналіз VK1E10 із найгомотемпературі 37°С впродовж 1год. І, нарешті, лунки логічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні промивали PBS-T і додавали субстратний буфер, сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки що містив p-нітрофенілфосфат. Через півгодини позначені жирним шрифтом. визначали оптичну густину при 405нм. Фіг.10: Специфічне зв'язування мишачого МАb Химерне MAb C5 використовували як негативР3 з химерним МАb 1Е10. Шляхом ELISA випробуний контроль. вали різні концентрації МАb 1Е10 та МАb С5 (негаНа Фіг.10 показано специфічне зв'язування тивний контроль). Титраційні мікропланшети сенхимерного MAb 1Е10 з MAb Р3. сибілізували МАb Р3 та МАb A3 (негативний Фіг.1: Визначені нуклеотидні та амінокислотні контроль) і визначали специфічне зв'язування. 21 75393 22 23 75393 24 25 75393 26 27 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 75393 Підписне 28 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601