Варіантний ген axmi-r1 дельта-ендотоксину та способи його застосування

Реферат: Винахід належить до молекули нуклеїнової кислоти з пестицидною активністю, що кодує варіант послідовності Сrу3, який містить заміни в положеннях 316, 482 та 483, а також до використання його у конструкціях ДНК або експресійних касетах для трансформації та експресії у рослинах і бактеріях. UA 108197 C2 (12) UA 108197 C2 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ, ДО ЯКОЇ ВІДНОСИТЬСЯ ВИНАХІД Даний винахід відноситься до галузі молекулярної біології. Забезпечуються нові гени, що кодують пестицидні білки. Ці білки та послідовності нуклеїнової кислоти, що кодують їх, є корисними в одержанні пестицидних композицій та в одержанні трансгенних, стійких до пестицидів рослин. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Bacillus thuringiensis (Bt) являє собою Грам-позитивну спороутворювальну грунтову бактерію, яка характеризується своєю здатністю виробляти кристалічні включення, що є специфічно токсичними для певних рядів та видів комах, проте нешкідливими для рослин та інших нецільових організмів. З цієї причини композиції, що включають штами Bacillus thuringiensis або їх інсектопестицидні білки, можуть використовуватися як прийнятні для навколишнього середовища інсектициди для контролю сільськогосподарських комах-шкідників або як вектори комах для різноманітних захворювань людини та тварин. Кристалічні (Cry) білки (дельта-ендотоксини) з Bacillus thuringiensis мають потужну інсектицидну активність особливо проти личинок лускокрилих, двокрилих та жуків. Ці білки також демонструють активність проти рядів шкідників Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga та Acari, а також інших рядів безхребетних, таких, як Nemathelminthes, Platyhelminthes та Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. У Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) Ці білки були спочатку класифіковано від CryI дo CryV, у першу чергу, на основі їх інсектицидної активності. Основні класи являли собою специфічні для Lepidoptera (I), специфічні для Lepidoptera та Diptera (II), специфічні для Coleoptera (III), специфічні для Diptera (IV) та специфічні для нематод (V) та (VI). Ці білки були додатково класифіковані у підродини; більш споріднені білки у межах кожної родини позначалися великими літерами Cry1A, Cry1B, Cry1C, тощо. Ще більш споріднені білки у межах кожного розділення одержали назви, такі, як Cry1C1, Cry1C2, тощо. Нова номенклатура була нещодавно описана для генів Cry, пераважно базуючись на гомології амінокислотної послідовності, замість цільової специфічності комах (Crickmore та ін. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813). У новій класифікації кожний токсин позначається унікальною назвою, введеною первинним розрядом (арабська цифра), вторинним розрядом (велика літера), третинним розрядом (літера нижнього регістру), та четвертинний розрядом (друга арабська цифра). У новій класифікації римські цифри замінені арабськими цифрами у первинному розряді. Білки з ідентичністю послідовності менше 45% мають різні первинні рядки, а критерії для вторинного та третинного рядків являють собою 78% та 95%, відповідно. Кристалічний білок не демонструє інсектицидної активності до тих пір, поки він не перетравиться та не розчиниться у середньому кишечнику комах. Перетравлений протоксин гідролізується протеазами у травному тракті комахи до активної токсичної молекули. (Höfte та Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53: 242-255). Цей токсин зв’язується з рецепторами апікальної щіткової облямівки у середньому кишечнику цільової личинки та вбудовується в апікальну мембрану, створюючи іонний канал або пори, що призводить до смерті личинки. Дельта-ендотоксини в загальному випадку мають п’ять консервативних послідовностей доменів, та три консервативні структурні домени (див., наприклад, de Maagd та ін. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Перший консервативний структурний домен складається з семи альфаспіралей та є втягненим у вбудовування у мембрану та утворення пор. Домен II складається з трьох бета-шарів, що перебувають у Greek key конфігурації, а домен III складається з двох антипаралельних бета шарів у конформації “рулет із джемом” (de Maagd та ін., 2001, supra). Домени II та III є втягнутими у впізнання рецепторами і зв’язування та, таким чином, вважаються детермінантами специфічності токсину. Cry3 тип дельта ендотоксинів було вперше ідентифіковано на початку 1980-их. Cry3Aa1 дельта ендотоксин (що також був раніше відомий як cryC та cryIIIA) було раніше ізольовано із штамів Bacillus thuringiensis var san diego (Herrnstadt та ін. (1987) Gene. 57: 37-46), Bacillus thuringiensis tenebrionis (Hofte та ін. (1987) Nucleic acids Res. 15: 7183; McPherson та ін. (1988) Bio/Technology 6: 61-66; Sekar та ін. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7036-7040) та EG2158 (Donovan та ін. (1988) Mol Gen Genet. 214(3): 365-72). Cry3Aa часто спостерігається як основний компонент ромбоподібного кристалу у деяких нативних штамів Bacillus та виробляється як 72 кДа білок, що послідовно піддається процесингу з утворенням 66 кДa токсину за допомогою протеолітичного процесингу при використанні протеаз, асоційованих із споруляцією. Цей 66 кДа білок був відомий як такий, що спричинює активність стосовно колорадського картопляного жука. З причини винищення, яке можуть спричинити комахи, та поліпшення контролю за комахами-шкідниками, існує постійна потреба у розробці нових форм пестицидних токсинів. 1 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 КОРОТКИЙ ВИКЛАД СУТІ ВИНАХОДУ Забезпечуються композиції та способи для надання пестицидної активності бактеріям, рослинам, рослинним клітинам, тканинам та насінню. Композиції включають молекули нуклеїнових кислот, що кодують послідовності для пестицидних та інсектицидних поліпептидів, вектори , що включають такі молекули нуклеїнових кислот, та хазяйські клітини, які включають ці вектори. Композиції також включають пестицидні поліпептидні послідовності та антитіла до таких поліпептидів. Нулкотидні послідовності можуть використовуватися у ДНК конструкціях або експресійних касетах для трансформації та експресії в організмах, включаючи мікроорганізми та рослини. Нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть бути штучними послідовностями, які є сконструйованими для експресії в організмі, включаючи, але без обмеження, мікроорганізм або рослину. Композиції також включають трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, тканини та насіння. Зокрема, забезпечуються ізольовані молекули нуклеїнової кислоти, що кодують пестицидний білок. Крім того, винаходом охоплюються амінокислотні послідовності, що відповідають пестицидному білку. Зокрема, даний винахід забезпечує ізольовану молекулу нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує варіант CRY3. Також винаходом охоплюються нуклеотидні послідовності, які є комплементарними до нуклеотидної послідовності згідно з винаходом, або такі, які гібридизуються з послідовністю згідно з винаходом. Забезпечуються способи одержання поліпептидів згідно з винаходом та використання цих поліпептидів для контролю або знищення лускокрилих, твердокрилих, нематодних або двокрилих шкідників. Способи та набори для визначення нуклеїнових кислот та поліпептидів згідно з винаходом у зразку також включаються. Композиції та способи згідно з винаходом є корисними для одержання організмів з покращеною резистентністю або толерантністю до пестицидів. Такі організми та композиції, які включають ці організми, є бажаними для сільськогосподарських цілей. Такі композиції згідно з винаходом є також корисними для одержання змінених або поліпшених білків, що мають пестицидну активність, або для визначення присутності пестицидних білків або нуклеїнових кислот у продуктах або організмах. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1 показує анотовану AXMI-R1 послідовність (SEQ ID NO:2). Підкреслені ділянки представляють ділянки петлі (L1, L2 та L3). Вертикальні смуги представляють границі між доменом I (DI), доменом II (DII) та доменом III (DIII). Стрілки показують деякі з ділянок, заплановані для одержання варіантів. Фігура 2 показує вирівнювання Axmi164 (SEQ ID NO:13), Axmi161 (SEQ ID NO:44), Axmi152 (SEQ ID NO:45), Axmi151 (SEQ ID NO:26), Axmi146 (SEQ ID NO:27), Axmi141 (SEQ ID NO:28), Axmi129 (SEQ ID NO:29), Axmi128 (SEQ ID NO:30), Axmi127 (SEQ ID NO:31), Axmi120 (SEQ ID NO:32), Axmi116 (SEQ ID NO:33), Axmi114 (SEQ ID NO:34), Axmi101 (SEQ ID NO:35), Axmi091 (SEQ ID NO:36), Axmi087 (SEQ ID NO:37), Axmi037 (SEQ ID NO:38), Axmi029 (SEQ ID NO:39), Axmi028 (SEQ ID NO:40), Cry8Bb1 (SEQ ID NO:41), Cry8Bc1 (SEQ ID NO:42), Cry7Aa (SEQ ID NO:43), AxmiR1 PermutP3c7 (evo21) (SEQ ID NO:13) та Axmi-R1 (SEQ ID NO:2). ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС Даний винахід відноситься до композицій та способів для регуляції резистентності або толерантності до шкідників в організмах, зокрема, у рослинах або рослинних клітинах. Під “резистентністю” розуміють, що шкідник (наприклад, комаха) знищується при споживанні або при іншому контакті з поліпептидом згідно з винаходом. Під “толерантністю” розуміють порушення або зниження руху, харчування, розмноження або інших функцій шкідника. Способи втягують трансформацію організмів за допомогою нуклеотидних послідовностей, що кодують пестицидний білок згідно з винаходом. Зокрема, нуклеотидні послідовності згідно з винаходом є корисними для одержання рослин та мікроорганізмів, що мають пестицидну активність. Таким чином, забезпечуються трансформовані бактерії, рослини, рослинні клітини, рослинні тканини та насіння. В даній заявці забезпечуються композиції, які включають послідовності нуклеїнових кислот, що кодують варіант Cry3 амінокислотних послідовностей, де варіант має пестицидну активність, зокрема, пестицидну активність проти твердокрилих шкідників. Під “варіантом Cry3” амінокислотної послідовності розуміють Cry3 послідовність, відмінну від існуючої в природі Cry3 амінокислотної послідовності, де амінокислотна послідовність має одну або більше амінокислотних замін, що відповідають замінам, представленим у Taблиці 16. Для списку Cry3 послідовностей див. Crickmore та ін. (1998), Мікроbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813, а для регулярних поновлень див. Crickmore та ін. (2003) “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature,” на 2 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index. У деяких втіленнях існуючі у природі послідовності або Cry3 послідовності “дикого типу” являють собою Axmi-R1 нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, яка кодує амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:2. AXMI-R1 послідовність відповідає cry3Aa послідовності, описаній під GENBANK® номером доступу P0A379. Проте буде зрозумілим, що заміни, описані у Таблиці 16, можуть бути зроблені у відповідних положеннях будь-якого Cry3 білка, такого, як будь-який з Cry3A, Cry3B або Cry3C білків. “Відповідні положення” можуть бути визначені щляхом вирівнювання цільової послідовності з SEQ ID NO:2. Див., наприклад, вирівнювання, показане на Фігурі 2. Кристалічна структура cry3Aa білка була визначена раніше (Li та ін., 1991, Nature 353: 815821). Ця кристалічна структура встановлена у різних ділянках петлі та показує сайти протеолітичного процесингу відносно трьохвимірної структури білка. Ця структура передбачає, що токсин розміщується у трьох доменах у відповідності із структурами інших послідовностей дельта-ендотоксинів (типово зазначаються як Домени I, II та III). Кожний домен токсину має ділянки петлі, які визначають на основі кристалічної структури. Перед та після публікації цієї кристалічної структури було зроблено численні спроби описати широкі прості правила, пов’язані зі структурою та функціями токсичності Bt ендотоксинів, та, зокрема ендотоксинів cry3-типу та роллю протеолізу у цій активності. Наприклад, Van Rie та ін., 1997 (U.S. Patent 5,659,123) запропонував ідентифікацію амінокислот, що приводять до поліпшеної токсичності шляхом здійснення модифікацій Домену II у ділянках, які розглядаються як “петлі” за допомогою ідентифікації положень, які негативно впливають на токсичність, після цього здійснюють випадкову заміну амінокислот у певних положеннях у межах цих петель. Подібно до цього, випадкова інсерція аланіну у залишки петлі II, виконана Wu та Dean (J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640), зменшує функцію білка. Випадковий мутагенез залишків петлі I, проведений Wu та ін. (Febs Letters, 2000, 473: 227-232), у багатьох випадках приводив до одержання знижених функцій білка, а у двох випадках повідомлялося про одержання білків з підвищеною токсичністю та зі зміненими властивостями зв’язування. Для cry3Bb токсину (English та ін., патент США №6,023,013, перевиданий як RE39,580) повідомлялося, що деякі заміни у цьому токсині приводять до одержання поліпшеної активності щодо личинок жуків, які паразитують на злакових рослинах, проте у більшості випадків ці заміни виникали у залишках, відмінних від тих, які були запропоновані Van Rie або були вивчені Wu та Dean. Крім того, модифікації у цих ділянках cry3A токсину, що у нормі розщеплюються подібними до трипсину або хімотрипсину протеазами, були зроблені як спроби поліпшити cry3A активність стосовно твердокрилих та, зокрема, західного кукурудзяного жука. Chen та ін. (патент США № 7,030,295) повідомили про те, що інсерція синтетичного тетрапептиду AAPF (SEQ ID NO: 20), описаного як “сайт розщеплення катепсину G” (або як сайт розщеплення “хімотрипсину/ катепсину G”; Walters та ін., 2008, Applied та Environ. Micro. 74: 367-374), у специфічних положеннях білка може приводити до одержання поліпшеної cry3A активності. Розщеплення трипсином cry3A є добре відомим з рівня техніки та було продемонстроване як таке, що у природі відбувається приблизно у ділянці R158-N159 у нативному cry3A пептиді (Carroll та ін. 1989 Biochem J. 261: 99-105). Крім того, хімотрипсин є також відомим для розщеплення у цій ділянці у положенні His161-Ser162 зв’язку (Carroll та ін. 1997 J Invert. Biol. 70: 41-49). Walters та ін. (2008) показали розщеплення модифікованого Cry3A (“mCry3A,” який містить сайт впізнання протеазою хімотрипсином/катепсином G) за допомогою хімотрипсину у цьому нативному положенні у вказаній ділянці (сполучення His161-Ser162). Не було повідомлень стосовно мутагенезу існуючих в природі амінокислотних послідовностей у цій ділянці Cry 3A, що приводить до одержання поліпшеної пестицидної активності по відношенню до твердокрилих шкідників. Таким чином, даний винахід забезпечує варіант Cry3 послідовності, що має поліпшену пестицидну активність у порівнянні з відповідним варіантом послідовності дикого типу. У різних втіленнях варіант Cry3 пестицидних послідовностей має поліпшену пестицидну активність у порівнянні із пестицидною активністю AXMI-R1. Під “поліпшеною активністю” розуміють підвищення смертності, зменшення харчування або затримку росту цільового шкідника. Поліпшення активності складає принаймні приблизно 5%, принаймні приблизно 10%, принаймні приблизно 20%, принаймні приблизно 30%%, принаймні приблизно 40%, принаймні приблизно 50%, принаймні приблизно 60%, принаймні приблизно 70%, принаймні приблизно 80%, принаймні приблизно 90%, принаймні приблизно 100%, принаймні приблизно 1,5-кратне, принаймні приблизно 2-кратне, принаймні приблизно 3-кратне, принаймні приблизно 4-кратне або більше підвищення активності у порівнянні з активністю послідовності дикого типу, наприклад, AXMI-R1. У деяких втіленнях цільовий шкідник являє собою твердокрилого 3 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шкідника. У деяких втіленнях пестицидні послідовності, які охоплюються даною заявкою, включають варінати axmi-R1 послідовності, представлені у SEQ ID NO:1. Під “варіантами axmi-R1” розуміють нуклеотидну або амінокислотну послідовність, що відповідає AXMI-R1, де одна або більше мутацій були введені у межах певних ділянок (тобто, “ділянки(ок) цільової мутації”) AXMI-R1 послідовності. Якщо не вказано інше, то амінокислотні ділянки за межами ділянки(ділянок) цільової мутації є ідентичними AXMI-R1 послідовності. Ідентичні ділянки являють собою або ідентичні амінокислотні послідовності, або нуклеотидну послідовність, що кодує ідентичну амінокислотну послідовність. При цьому є зрозумілим, що нуклеотидні послідовності можуть відрізнятися від нуклеотидних послідовностей дикого типу, які все ще кодують амінокислотну послідовність дикого типу, завдяки виродженості генетичного коду. В інших втіленнях ділянка цільової мутації Cry3 відповідає запропонованій ділянці процесингу та утворення пор, що описані у Li та ін. (1991, Nature 353: 815-821, що є введеним у дану заявку як посилання у своїй цілісності, зокрема, стосовно структурних описів cry3Aa білка). У різних втіленнях ділянка цільової мутації відповідає амінокислотним положенням від 480 дo 490, та положенням від 510 дo 530 послідовності SEQ ID NO:2. У деяких втіленнях варіант Cry3 послідовності містить одну або більше мутацій, описаних у Таблиці 16, включаючи будь-яку комбінацію мутацій, приведених у Таблиці 16, аж до та включаючи мутацію у кожному положенні, описаному у Таблиці 16. У деяких втіленнях варіант Cry3 послідовності згідно з винаходом має одну або більше замін, вибраних з амінокислотних положень, що відповідають положеннням 158, 482, 483 та 519 послідовності SEQ ID NO:2. В іншому втіленні варіант Cry3 послідовності не має наступних замін: P154H, V155H, R315W, R315D, R315M, R315L, G316K, G316N, G316V або G316A. Ще в одному втіленні варіант Cry3 послідовності згідно з винаходом не містить жодної комбінації мутацій, приведених у Таблиці 2 патенту США № 6,023,013. В іншому втіленні варіант Cry3 послідовності є вибраним з групи, що складається з послідовностей SEQ ID NO: 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19 та 21-43. Ще в одному втіленні варіант Cry3 послідовностей, які охоплюються даною заявкою, складається з однієї або більше мутацій у ділянці процесингу та утворення пор та однієї або більше мутацій у ділянці зв’язування рецептора. Ці варіанти, які охоплюються даною заявкою, мають поліпшену пестицидну активність у порівнянні з пестицидною активністю Cry3 дикого типу. У деяких втіленнях поліпшена пестицидна активність є такою проти твердокрилих шкідників, наприклад, личинок жуків, що пошкоджують корені. Варіант Cry3 послідовності згідно з винаходом може бути додатково модифікований для введення однієї або більше Cry3 мутацій, описаних в області техніки. Наприклад, варіант AXMIR1 послідовності, який охоплюється даною заявкою, може включати одну або більше замін, приведених у Таблиці 16, додатково до однієї або більше мутацій, описаних у патентах США № 5,659,123 та № 6,023,013; Wu та Dean (J.Mol. Biol., 1996, 255: 628-640); або Wu та ін. (Febs Letters, 2000, 473: 227-232), або будь-яку їх комбінацію. Крім того, варіант AXMI-R1 послідовності може включати інсерцію одного або більше сайтів розщеплення катепсину Gs, як описано вище (наприклад, у або поблизу нативного сайту розщеплення хімотрипсином або трипсином). Ще в одному іншому втіленні згідно з винаходом мутації, описані у Таблиці, 16, можуть вводитися у відповідні положення будь-якої амінокислотної послідовності, що має гомологію з AXMI-R1, для введення або підвищення токсичності стосовно шкідника, що представляє інтерес, зокрема, твердокрилого шкідника, такого, як личинка, що пошкоджує корені рослин. Див., наприклад, амінокислотні послідовності, вирівняні з AXMI-R1 на Фігурі 2, або гомологічні амінокислотні послідовності, представлені, наприклад, у GENBANK® з номером доступу P0A379.1, AAA22336.1, AAA22542.1, AAS79487.1, AAU29411.1, AAW82872.1, AAA73184.1, CAA51996.1, 1DLC_A, Q45744.1, Q06117.1, AAA74198.1, P17969.1. Гомологічна амінокислотна послідовність може бути вирівняна при використанні однієї з програм вирівнювання, описаних в даній заявці для ідентифікації відповідного положення для мутації. Альтернативно, кристалічна структура або інше трьохвимірне представлення гомологічної амінокислотної послідовності може накладатися на кристалічну структуру Cry3A (описану у Li та ін. 1991, Nature 353: 815-821), а відповідні положення при цьому порівнюються. Кристалічна структура Cry3B білка є описаною у патенті США № 6,023,013. Ці послідовності знаходять своє застосування для конструювання експресійних векторів для подальшої трансформації в організми, що представляють інтерес, як зонди для ізоляції інших гомологічних (або частково гомологічних) генів та для одержання змінених пестицидних білків за допомогою способів, відомих у галузі техніки, таких, як перестановка доменів або 4 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перестановка ДНК. Ці білки знаходять своє застосування для контролю або знищення популяцій лускокрилих, твердокрилих, двокрилих та нематодних шкідників та для одержання композицій з пестицидною активністю. Під “пестицидним токсином” або “пестицидним білком” розуміють токсин, що має токсичну активність проти одного або більше шкідників, включаючи, але без обмеження, членів рядів Lepidoptera, Diptera та Coleoptera, або типу Nematoda, або білок, що має гомологію з таким білком. Пестицидні білки були ізольовані з організмів, включаючи, наприклад, Bacillus sp., Clostridium bifermentans та Paenibacillus popilliae. Пестицидні білки включають амінокислотні послідовності, дедуковані з нуклеотидних послідовностей повної довжини, розкритих в даній заявці, та амінокислотні послідовності, які є більш короткими, ніж послідовності повної довжини або завдяки використанню альтернативного розміщеного стартового сайту, або завдяки процесингу, що приводить до одержання більш короткого білка, який має пестицидну активність. Процесинг може відбуватися в організмі, в якому експресується цей білок, або у шкіднику після споживання цього білка. Ізольовані молекули нуклеїнової кислоти, а також їх варіанти та фрагменти Один аспект згідно з винаходом відноситься до ізольованих або рекомбінантних молекул нуклеїнових кислот, що включають нуклеотидні послідовності, які кодують пестицидні білки та поліпептиди або їх біологічно активні частини, а також молекул нуклеїнових кислот, які є достатніми для застосування як гібридизаційних зондів для ідентифікації молекул нуклеїнової кислоти, що кодують білки з ділянками гомології послідовності. Як використовується в даній заявці, термін “молекула нуклеїнової кислоти” є призначеним для включення молекул ДНК (наприклад, рекомбінантної ДНК, кДНК або геномної ДНК) та молекул РНК (наприклад, іРНК) та аналогів ДНК або РНК, що одержані при використанні нуклеотидних aналогів. Молекула нуклеїнової кислоти може бути одноланцюговою або дволанцюговою, проте переважно являє собою дволанцюгову молекулу ДНК. "Ізольована” або “рекомбінантна” послідовність нуклеїнової кислоти (або ДНК) використовується в даній заявці для позначення послідовності нуклеїнової кислоти (або ДНК), що вже не перебуває у своєму природному навколишньому середовищі, наприклад, in vitro або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній хазяйській клітині. У деяких втіленнях ізольована або рекомбінантна нуклеїнова кислота є вільною від послідовностей (переважно послідовностей, що кодують білок), які звичайно фланкують нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, розміщених на 5′ та 3′ кінцях нуклеїнової кислоти) у геномній ДНК організму, з якого нуклеїнова кислота виділена. Для цілей згідно з винаходом термін “ізольований”, коли використовується для позначення молекули нуклеїнової кислоти, виключає ізольовані хромосоми. Наприклад, у різних втіленнях молекула нуклеїнової кислоти, що кодує ізольований дельта-ендотоксин, може містити менше, ніж приблизно 5 кб, 4 кб, 3 кб, 2 кб, 1 кб, 0,5 кб або 0,1 кб нуклеотидної послідовності, що звичайно фланкує молекулу нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітини, з якої походить ця нуклеїнова кислота. У різних втіленнях білок дельтаендотоксину, який є суттєво вільним від клітинного матеріалу, включає препарати білка, які містять менше, ніж приблизно 30%, 20%, 10%, або 5% (за сухою речовиною) білка, відмінного від білка дельта-ендотоксину (що також згадується в даній заявці як “забруднюючий білок”). Нуклеотидні послідовності, що кодують білки згідно з даним винаходом, включають нуклеотидні послідовності, які кодують варіанти Cry3, а також їх фрагменти та комплементи. Під “комплементом” розуміють нуклеотидну послідовність, що є достатньо комплементарною до даної нуклеотидної послідовності, так, що вона гібридизуються з даною нуклеотидною послідовністю, утворюючи, таким чином, стабільний дуплекс. Молекули нуклеїнової кислоти, що являють собою фрагменти цих нуклеотидних послідовностей, які кодують пестицидні білки, також охоплюються даним винаходом. Під “фрагментом” розуміють частину нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок. Фрагмент нуклеотидної послідовності може кодувати біологічно активну частину пестицидного білка, або він може являти собою фрагмент, який може використовуватися як гібридизаційний зонд або ПЛР праймер при здійсненні способів, розкритих вище. Молекули нуклеїнової кислоти, які являють собою фрагменти нуклеотидної послідовності, яка кодує пестицидний білок, включають принаймні приблизно 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1350, 1400 послідовних нуклеотидів, або аж до числа нуклеотидів, що є присутніми у нуклеотидній послідовності повної довжини, яка кодує пестицидний білок, розкритий в даній заявці, в залежності від передбачуваного застосування. Під “послідовними” нуклеотидами розуміють нуклеотидні залишки, що безпосередньо контактують один з одним. Фрагменти нуклеотидних послідовностей згідно з даним винаходом будуть кодувати білкові фрагменти, що зберігають біологічну активність пестицидного білка та, таким чином, зберігають пестицидну 5 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активність. Під виразом “зберігає активність” розуміють, що фрагмент буде мати принаймні приблизно 30%, принаймні приблизно 50%, принаймні приблизно 70%, 80%, 90%, 95% або більше пестицидної активності референтного пестицидного білка (тобто, пестицидного варіанту Cry3 послідовності, розкритої в даній заявці). В одному втіленні пестицидна активність являє собою активність, направлену проти твердокрилих. Способи для вимірювання пестицидної активності є добре відомими в галузі техніки. Див., наприклад, Czapla та Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews та ін. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone та ін. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293; та патент США № 5,743,477, які усі введені в дану заявку як посилання у своїй цілісності. Фрагмент нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, який кодує біологічно активну частину білка згідно з винаходом, буде кодувати принаймні приблизно 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 послідовних амінокислот, або аж до загальної кількості амінокислот, які є присутніми у пестицидному білку повної довжини згідно з винаходом. У деяких втіленнях фрагмент являє собою протеолітично розщеплений фрагмент. Наприклад, протеолітично розщеплений фрагмент може мати N-термінальне вкорочення принаймні приблизно 100 амінокислот, приблизно 120, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150, або приблизно 160 амінокислот у порівнянні з SEQ ID NO:2. У різних втіленнях протеолітично розщеплений фрагмент може відповідати нативному сайту розщеплення трипсином або хімотрипсином, що відповідає амінокислотним положенням 158-159 або положенням 160-161 послідовності SEQ ID NO:2, відповідно, або може відповідати будь-яким штучно вбудованим сайтам розщеплення, таким, як сайт розщеплення катепсином G, описаний у Walters та ін., 2008, Applied and Environ. Micro. 74: 367-374. Бажані пестицидні білки згідно з даним винаходом кодуються нуклеотидною послідовністю, яка є у достатній мірі ідентичною варіанту Cry3 послідовностей, які охоплюються даною заявкою. Під “у достатній мірі ідентичною” розуміють амінокислотну або нуклеотидну послідовність, що має принаймні приблизно 60% або 65% ідентичності послідовності, приблизно 70% або 75% ідентичності послідовності, приблизно 80% або 85% ідентичності послідовності, приблизно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичності послідовності у порівнянні з референтною послідовністю (наприклад, нативною або варіантною Cry3 послідовністю, включаючи нативну або варіантну Cry3A, Cry3B, або Cry3C послідовність, або послідовність, вибрану з SEQ ID NO:2, 6, 8, 10, 13, 15, 17, 19 та 21-43, або нуклеотидну послідовність, що кодує будь-яку з цих нативних або варіантних Cry3 білкових послідовностей) при використанні однієї з програм вирівнювання, описаних в даній заявці, та при використанні стандартних параметрів. Будь-який спеціаліст в даній галузі техніки визнає, що ці значення можуть прийнятним чином доводитися для визначення відповідної ідентичності білків, що кодуються двома нуклеотидними послідовностями, беручи до уваги виродженість кодонів, амінокислотну подібність, місце знаходження рамки зчитування та подібні характеристики. Для визначення проценту ідентичності двох амінокислотних послідовностей або двох нуклеїновокислотних послідовностей послідовності вирівнюють для цілей оптимального порівняння. Процент ідентичності між двома послідовностями є функцією кількості iдентичних положень, які є спільними для послідовностей (тобто, процент ідентичності = кількості ідентичних положень/загальна кількість положень (наприклад, положень, які перекриваються) x 100). В одному втіленні дві послідовності мають однакову довжину. В іншому втіленні процент ідентичності підраховується по всій довжині референтної послідовності (тобто, варіанта Cry3 послідовності, що охоплюється даною заявкою). Процент ідентичності між двома послідовностями може визначатися при використанні методик, подібних до тих, що є описаними нижче з або за відсутності допустимих пробілів. У підрахованому проценті ідентичності типово підраховуються точні співпадання. Визначення проценту ідентичності між двома послідовностями може бути проведене при використанні математичного алгоритму. Необмежувальний приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння двох послідовностей, являє собою алгоритм Karlin та Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, модифікований Karlin та Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. Такий алгоритм є введеним у програми BLASTN та BLASTX Altschul та ін. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403. BLAST нуклеотидні пошуки можуть бути проведені при використанні програми BLASTN, показник = 100, довжина слова = 12, для одержання нуклеотидних послідовностей, гомологічних до подібних до пестициду молекул нуклеїнової кислоти згідно з винаходом. BLAST пошуки на білок можуть бути проведені при використанні програми BLASTX, показник = 50, довжина слова = 3, для одержання амінокислотних послідовностей, гомологічних до молекули пестицидного білка згідно з винаходом. Для 6 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 одержання вирівнювання з пробілами з метою порівняння може використовуватися Gapped BLAST (BLAST 2.0), так, як описано у Altschul та ін. (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3389. Альтернативно, PSI-Blast може використовуватися для здійснення багатократного пошуку, що визначає віддалені взаємозв’язки між молекулами. Див. Altschul та ін. (1997) нижче. При використанні програм BLAST, Gapped BLAST та PSI-Blast можуть використовуватися параметри по умовчанню відповідних програм (наприклад, BLASTX та BLASTN). Вирівнювання можна також здійснювати за допомогою ручного управління шляхом перевірки. Інший необмежувальний приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, являє собою ClustalW алгоритм (Higgins та ін. (1994) Nucleic Acid Res. 22: 4673-4680). ClustalW порівнює послідовності та вирівнює цілі амінокислотні послідовності або ДНК послідовності та, таким чином, може забезпечувати дані стосовно консервативності послідовності цільної амінокислотної послідовності. ClustalW aлгоритм використовується у декількох комерційно доступних пакетах програм ДНК/амінокислотного аналізу, таких, як ALIGNX модуль Vector NTI комплекту програми (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Після вирівнювання амінокислотних послідовностей за допомогою ClustalW можна оцінити процент ідентичності амінокислотних послідовностей. Необмежувальний приклад програмного продукту, корисного для аналізу ClustalW вирівнювань, являє собою GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) дозволяє проводити оцінку амінокислотної (або ДНК) подібності та ідентичності між декількома білками. Інший необмежувальний приклад математичного алгоритму, що використовується для порівняння послідовностей, являє собою алгоритм Myers та Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Такий алгоритм вводиться у програму ALIGN (версія 2.0), яка є частиною пакету програм GCG Wisconsin Genetics, Версія 10 (є доступною від Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., San Diego, CA, USA). При використанні ALIGN програми для порівняння амінокислотних послідовностей можуть використовуватися PAM120 таблиці значущості залишку, штраф за довжину пробілу 12 та штраф за пробіл 4. Якщо не вказане інше, то GAP Версія 10, яка використовує алгоритм Needleman та Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3): 443-453, буде використовуватися для визначення ідентичності або подібності послідовностей при використанні наступних параметрів: % ідентичності та % подібності для нуклеотидної послідовності при використанні значення пробілу 50 та значення довжини слова 3, а також nwsgapДНК.cmp матриці для підрахунку; % ідентичності або % подібності для амінокислотної послідовності при використанні значення пробілу 8 та значення довжини слова 2, а також BLOSUM62 програми для підрахунку. Можуть також використовуватися еквівалентні програми. Під “еквівалентною програмою” розуміють будь-яку програму порівняння послідовностей, що для двох послідовностей, які піддають порівнянню, забезпечує одержання вирівнювання, яка має ідентичні пари залишків та однаковий процент ідентичності послідовності, одержаний при порівнянні із відповідним вирівнюванням, одержаним за допомогою GAP Версія 10. Даний винахід також охоплює варіант молекули нуклеїнової кислоти. “Варіанти” для нуклеотидних послідовностей, що кодують варіанти пестициду Cry3 білка, включають ті послідовності, які кодують варіанти пестицидних білків, розкритих в даній заявці, але який відрізняється консервативно завдяки виродженості генетичного коду, а також ті, що є достатньо ідентичними, як обговорюється вище. Варіант нуклеотидних послідовностей також включає синтетично одержані нуклеотидні послідовності, що були отримані, наприклад, при використанні сайт-направленого мутагенезу, але такі, які все ще кодують пестицидні білки, розкриті у даному винаході, як обговорюється нижче. Варіанти білків, що охоплюються даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони все ще мають біологічну активність референтного білка (тобто, варіанти Cry3 послідовностей, які охоплюються даною заявкою), тобто, пестицидну активність. Під виразом “зберігає активність” розуміють, що варіант буде мати принаймні приблизно 30%, принаймні приблизно 50%, принаймні приблизно 70% або принаймні приблизно 80% пестицидної активності референтного білка. У деяких втіленнях варіанти пестицидних білків, описаних в даній заявці, демонструють поліпшену активність у порівнянні з AXMI-R1 білком, представленим у SEQ ID NO:2. Способи для вимірювання пестицидної активності є добре відомими у галузі техніки. Див., наприклад, Czapla та Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews та ін. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone та ін. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293; та патент США № 5,743,477, які усі введені в дану заявку як посилання у своїй цілісності. Кваліфікований спеціаліст зможе також оцінити, що зміни можуть вводитися шляхом мутації нуклеотидних послідовностей згідно з винаходом, що приводить, таким чином, до змін амінокислотної послідовності кодованих пестицидних білків, без зміни біологічної активності цих білків. Таким чином, варіант ізольованих молекул нуклеїнової кислоти може бути створений шляхом введення однієї або більше нуклеотидних замін, доповнень або делецій у відповідну 7 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеотидну послідовність, розкриту в даній заявці, так що одна або більше амінокислотних замін, доповнень або делецій юудуть введені у цільову(і) ділянку(и) мутації кодованого білка. Мутації можуть вводитися за допомогою стандартних методик, таких, як сайт-направлений мутагенез та опосередкований ПЛР мутагенез. Такі варіанти нуклеотидних послідовностей також охоплюються даним винаходом. Наприклад, консервативні амінокислотні заміни можуть бути зроблені в одному або більше передбачених несуттєвих амінокислотних залишках. “Несуттєвий” амінокислотний залишок являє собою залишок, що може бути змінений у референтній послідовності пестицидного білка без суттєвої зміни біологічної активності, у той час, як “суттєвий” амінокислотний залишок є необхідним для біологічної активності. “Консервативна амінокислотна заміна” є такою, в якій амінокислотний залишок замінюється за допомогою амінокислотного залишка, що має подібний бічний ланцюг. Родини амінокислотних залишків, що мають подібні бічні ланцюги, є визначеними у галузі техніки. Такі родини включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Дельта-ендотоксини в загальному випадку мають п’ять консервативних доменних послідовностей та три консервативні структурні домени (див., наприклад, de Maagd та ін. (2001) Trends Genetics 17: 193-199). Перший консервативний домен складається із семи альфаспіралей та є втягненим у вбудовування у мембрани та в утворення пор. Домен II складається з трьох бета шарів, що розташовані у Greek key конфігурації, а домен III складається з двох антипаралельних бета шарів, що утворюють конфігурацію “рулет із джемом” (de Maagd та ін., 2001, вище). Домени II та III є втягненими у впізнання рецепторів та зв’язування та, таким чином, вважаються детермінантами специфічності токсину. Амінокислотні заміни можуть бути зроблені у неконсервативних ділянках, що зберігають свою функцію. В загальному випадку такі заміни не можуть бути зроблені для консервативних амінокислотних залишків або для амінокислотних залишків, що знаходяться у межах консервативного мотиву, де такі залишки є суттєвими для активності білка. Приклади залишків, які є консервативними та які можуть бути суттєвими для білкової активності, включають, наприклад, залишки, які є ідентичними між усіма білками, що містяться у вирівнюванні подібних або споріднених токсинів з послідовностями згідно з винаходом (наприклад, залишки, які є ідентичними у вирівнюванні гомологічних білків). Приклади залишків, що є консервативними, проте таких, які можуть дозволяти проводити консервативні амінокислотні заміни та все ще зберігають активність, включають, наприклад, залишки, які мають тільки консервативні заміни між усіма білками, що містяться у вирівнюванні подібних або споріднених токсинів з послідовностями згідно з винаходом (наприклад, залишки, які мають тільки консервативні заміни між усіма білками, що містяться у вирівнюванні гомологічних білків). Проте спеціалістові в даній галузі техніки буде зрозумілим, що функціональні варіанти можуть мати мінорні консервативні або неконсервативні зміни у консервативних залишках. Альтернативно, варіанти нуклеотидних послідовностей можуть бути одержані шляхом введення мутацій випадковим чином в усі або у частину цільові(их) ділянки(ділянок) мутацій, так, що шляхом пермутаційного або насичуючого мутагенезу, а одержані мутанти можуть потім піддаватися скринінгу на їх здатність надавати пестицидну активність для ідентифікації мутантів, що зберігають активність або демонструють поліпшену активність. Після мутагенезу білок, що кодується, може бути рекомбінантно експресований, а активність білка може бути визначена при використанні стандартних методик аналізу. При використанні способів, таких, як ПЛР, гібридизація та подібних до них, відповідні послідовностей можуть бути ідентифіковані, такі послідовності мають суттєву ідентичність з послідовностями згідно з винаходом. Див., наприклад, Sambrook та Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) та Innis, та ін. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY). В аналізі гібридизації уся або частина нуклеотидної послідовності пестициду можуть використовуватися для скринінгу кДНК або геномних бібліотек. Способи конструювання таких кДНК та геномних бібліотек взагалі є відомими в області техніки та є розкритими у Sambrook та Russell, 2001, вище. Так звані гібридизаційні зонди можуть являти собою фрагменти геномної ДНК, фрагменти кДНК, фрагменти РН, або інші олігонуклеотиди та можуть піддаватися міченню 32 при використанні здатної до визначення групи, такої, як P, або будь-якого іншого здатного до 8 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначення маркера, такого, як інші радіоізотопи, флуоресцентні сполуки, фермент або кофактор ферменту. Зонди для гібридизації можуть бути одержані шляхом мічення синтетичних олігонуклеотидів на основі відомої нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок, розкритий в даній заявці. Можуть додатково використовуватися вироджені праймери, сконструйовані на основі консервативних нуклеотидних або амінокислотних залишків або кодованої амінокислотної послідовності. Зонд типово включає ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується при жорстких умовах принаймні приблизно з 12, принаймні приблизно з 25, принаймні приблизно з 50, 75, 100, 125, 150, 175 або 200 сусідніми нуклеотидами нуклеотидної послідовності, що кодує пестицидний білок згідно з винаходом, її фрагментом або варіантом. Способи одержання зондів для гібридизації в загальному випадку є відомими у галузі техніки та є розкритими у Sambrook та Russell, 2001, вище, що є введеним у дану заявку як посилання у своїй цілісності. Наприклад, повна послідовність пестицидного білка, розкрита в даній заявці, або одна або більше її частин можуть використовуватися як зонд, здатний специфічно гібридизуватися з послідовностями, подібними до пестицидного білка та інформаційними РНК. Для проведення специфічної гібридизації при різноманітних умовах такі зонди включають послідовності, які є унікальними та містять принаймні приблизно 10 нуклеотидів у довжину або принаймні приблизно 20 нуклеотидів у довжину. Такі зонди можуть використовуватися для ампліфікації відповідних послідовностей пестициду з вибраного організму за допомогою ПЛР. Ця методика може використовуватися для ізоляції додаткових кодуючих послідовностей з бажаного організму або як діагностичний аналіз для визначення присутності кодуючих послідовностей в організмі. Методики гібридизації включають гібридизаційний скринінг висаджених на чашку Петрі бібліотек ДНК (або бляшки, або колонії; див., наприклад, Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-е вид., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Гібридиазція таких послідовностей може бути проведена при жорстких умовах. Під “жорсткими умовами” або “умовами жорсткої гібридизації” розуміють умови, при яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю у здатній до визначення більшій мірі, ніж з іншими послідовностями (наприклад, принаймні у два рази краще у порівнянні із фоном). Жорсткі умови є залежними від послідовності та будуть відрізнятися за різних обставин. Шляхом контролю жорсткості гібридизації та/або умов промивання можуть бути ідентифіковані цільові послідовності, які є на 100% комплементарними зонду (гомологічне зондування). Альтернативно, умови жорсткості можуть піддаватися доводці для того, щоб дозволити деяку невідповідність у послідовностях так. що будуть визначатися більш низькі ступені подібності (гетерологічне зондування). В загальному випадку зонд має довжину менше, ніж приблизно 1000 нуклеотидні у довжину, переважно менше 500 нуклеотидів у довжину. Типово, жорсткі умови будуть такими, в яких концентрація солі є меншою, ніж приблизно 1,5 M іонів Na, типово приблизно від 0,01 дo 1,0 M концентрації іонів Na (або інших солей) при значенні рН від 7,0 дo 8,3, а температура складає принаймні приблизно 30 °C для коротких зондів (наприклад, від 10 дo 50 нуклеотидів) та принаймні приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, таких, що містять більше, ніж 50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть також бути досягнуті шляхом додання дестабілізувальних агентів, таких, як формамід. Приклади умов низької жорсткості включають гібридизацію за допомогою буферного розчину, що містить від 30 дo 35% формаміду, 1 M NaCl, 1% SDS (додецидсульфат натрію) при 37 °C, та при промиванні у 1X - 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M цитрату тринатрію) при температурі від 50 дo 55 °C. Приклади умов помірної жорсткості включають гібридизацію у 40 - 45% формаміді, 1,0 M NaCl, 1% SDS при 37 °C, та промивання у 0,5X - 1X SSC при 55 - 60 °C. Приклади умов високої жорсткості включають гібридизацію у 50% формаміді, 1 M NaCl, 1% SDS при 37 °C, та промивання у 0,1X SSC при темпратурі 60 - 65 °C. Необов’язково, буфери для промивання можуть включати приблизно від 0,1% до приблизно 1% SDS. Тривалість гібридизації у загальному випадку складає менше приблизно 24 годин, звичайно, приблизно від 4 дo приблизно 12 годин. Специфічність типово є функцією промивань після гібридизації, критичні фактори являють собою іонну силу та температуру заключного розчину для промивання. Для ДНК-ДНК гібридів Tm може піддаватися апроксимації при використанні рівняння Meinkoth та Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% форм.) - 500/л; де M являє собою молярність моновалентних катіонів, %GC являє собою процент гуанозинових та цитозинових нуклеотидів у ДНК, % форм. є процентним вмістом формаміду у гібридизаційному розчині, а L є довжиною гібриду у парах основ. T m являє собою температуру (при визначеній іонній силі та pH), при якій 50% комплементарної цільової послідовності гібридизується з точно 9 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 співпадаючим зондом. Tm знижується на приблизно 1 °C для кожного 1% неспівпадання; таким чином, Tm, гібридизація та/або умови промивання можуть доводитися для гібридизації з послідовністю бажаної ідентичності. Наприклад, якщо проводять пошук послідовностей з >90% ідентичністю, то Tm може бути знижена на 10 °C. В загальному випадку, жорсткі умови вибирають таким чином, щоб вони були приблизно на 5 °C нижче, ніж температурна точка плавлення (Tm) для специфічної послідовності та її комплементу при визначеній іонній силі та pH. Проте дуже жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію та/або промивання при температурі на 1, 2, 3 або 4 °C нижче, ніж точка плавлення (Tm); помірно жорсткі умови можуть використовувати гібридизацію та/або промивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 °C нижче, ніж точка плавлення (Tm); умови низької жорсткостіможуть використовувати гібридизацію та/або промивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 °C нижче, ніж точка плавлення (T m). При використанні рівняння гібридизація та композиції для промивання, а також бажаної T m, спеціалістові в даній галузі техніки буде зрозумілим, що варіації стосовно жорсткості гібридизації та/або розчинів для промивання є по суті описаними. Якщо бажана ступінь неспівпадання приводить до одержання T m, що є меншою, ніж 45 °C (водний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), є бажаним підвищити концентрацію SSC так, що буде використовуватися більш висока температура. Детальні інструкції щодо гібридизації нуклеїнових кислот можуть бути знайдені у Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, частина I, розділ 2 (Elsevier, New York); та Ausubel та ін., ред. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Розділ 2 (Greene Publishing and WileyInterscience, New York). Див. Sambrook та ін. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-е вид., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Ізольовані білки та їх варіанти та фрагменти Пестицидні білки також охоплюються даним винаходом. Під “пестицидним білком” розуміють послідовності пестицидного варіанту Cry3, які охоплюються даною заявкою. Забезпечуються фрагменти, біологічно активні частини та їх варіанти. Усі вони вони можуть використовуватися для здійснення способів згідно з даним винаходом. "Ізольований білок" або “рекомбінантна білок” використовується для позначення білка, що більше не перебуває у своєму природному навколишньому середовищі, наприклад, in vitro або у рекомбінантній бактеріальній або рослинній хазяйській клітині. “Фрагменти” або “біологічно активні частини” включають поліпептидні фрагменти варіантів Cry3 послідовності, які охоплюються даною заявкою, та які демонструють пестицидну активність. Біологічно активна частина пестицидного білка може являти собою поліпептид тобто, наприклад, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 або більше амінокислот у довжину. Такі біологічно активні частини одержують за допомогою рекомбінантних методик та оцінюються на пестицидну активність. Способи вимірювання пестицидної активності є добре відомими у галузі техніки. Див., наприклад, Czapla та Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews та ін. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone та ін. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293; та патент США № 5,743,477, які усі введені в дану заявку як посилання у своїй цілісності. Як використовується в даній заявці, фрагмент включає принаймні 8 послідовних амінокислот референтного білка. Даний винахід охоплює інші фрагменти, проте будь-який такий фрагмент у білку, який є більшим, ніж приблизно 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 або більше амінокислот. Під “варіантом” розуміють білки або поліпептиди, що мають амінокислотні послідовність, які є принаймні приблизно на 60%, 65%, приблизно на 70%, 75%, приблизно на 80%, 85%, приблизно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% або 99% ідентичними амінокислотній послідовності SEQ ID NO:2. Варіанти також включають поліпептиди, які кодуються молекулою нуклеїнової кислоти, що гібридизується з молекулою нуклеїнової кислоти, яка кодує послідовності варіанту Cry3, що охоплюється даною заявкою, або їх комплемент, при жорстких умовах. Варіанти включають поліпептиди, що відрізняють по амінокислотній послідовності завдяки мутагенезу. Варіанти білків, що охоплюються даним винаходом, є біологічно активними, тобто вони продовжують володіти бажаною біологічною активністю варіантного Cry3 білка, тобто зберігають пестицидну активність. У деяких втіленнях ці варіанти мають поліпшену активність у порівнянні з референтним білком (наприклад, у порівнні з SEQ ID NO:2, або у порівнянні із специфічним варіантом Cry3 білка). Способи для вимірювання пестицидної активності є добре відомими в галузі техніки. Див., наприклад, Czapla та Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews та ін. (1988) Biochem. J. 252: 199-206; Marrone та ін. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293; та патент США № 5,743,477, які усі введені в дану заявку як посилання у своїй цілісності. Бактеріальні гени, такі як axmi гени згідно з даним винаходом, досить часто мають множинні 10 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 метіонінові кодони ініціації, що знаходяться поблизу стартового кодону відкритої рамки зчитування. Часто ініціація трансляції при одному або більше з цих стартових кодонів буде приводити до одержання функціонального білка. Ці стартові кодони можуть включати ATG кодони. Проте бактерії, такі, як Bacillus sp., також впізнають кодон GTG як стартовий кодон, та білки, які ініціюють трансляцію при GTG кодонах, містять метіонін як першу амінокислоту. В рідких випадках трансляція у бактеріальних системах може ініціюватися при TTG кодоні, хоча у цьому випадку TTG кодує метіонін. Крім того, часто за відсутності експериментів не визначається, які з цих кодонів природно використовуються у бактеріях. Таким чином, є зрозумілим, що застосування одного з альтернативних метіонінових кодонів може також приводити до одержання пестицидних білків. Ці пестицидні білки також охоплюються даним винаходом та можуть використовуватися у способах згідно з даним винаходом. При цьому буде зрозумілим, що при експресії у рослинах буде необхідним змінювати альтернативний стартовий кодон на ATG для власної трансляції. Антитіла до поліпептидів згідно з даним винаходом або до їх варіантів або фрагментів також охоплюються даним винаходом. Способи одержання антитіл є добре відомиим у галузі техніки (див., наприклад, Harlow та Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; gатент США № 4,196,265). Змінені або поліпшені варіанти Вважається, що ДНК послідовності пестицидного білка можуть бути додатково змінені за допомогою різних способів, та ці зміни можуть приводити до одержання ДНК послідовностей, що кодують білки з амінокислотними послідовностями, відмінними від тих, що є характерними для пестицидного білка згідно з даним винаходом. Цей білок може бути зміненим різними шляхами, включаючи амінокислотні заміни, делеції, вкорочення та інсерції однієї або більше амінокислот варіантів Cry3 послідовності, які охоплюються даною заявкою, включаючи аж до приблизно 2, приблизно 3, приблизно 4, приблизно 5, приблизно 6, приблизно 7, приблизно 8, приблизно 9, приблизно 10, приблизно 15, приблизно 20, приблизно 25, приблизно 30, приблизно 35, приблизно 40, приблизно 45, приблизно 50, приблизно 55, приблизно 60, приблизно 65, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 85, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 105, приблизно 110, приблизно 115, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 135, приблизно 140, приблизно 145, приблизно 150, приблизно 155 або більше амінокислотних замін, делецій або інсерцій в одній або більше цільовій(их) ділянці(ділянок) мутацій. Способи для таких маніпуляцій є у загальному випадку відомими у галузі техніки. Наприклад, варіанти амінокислотних послідовностей пестицидного білка можуть бути одержані шляхом мутацій у ДНК. Це може бути також здійснене за допомогою однієї або декількох форм мутагенезу та/або направленої еволюції. У деяких аспектах зміни, які кодуються в амінокислотній послідовності, не будуть суттєво впливати на функцію білка. Такий варіант буде мати бажану (або поліпшену) пестицидну активність. Проте є зрозумілим, що здатність пестицидного білка до забезпечення пестицидної активності може бути поліпшена шляхом застосування таких методик до композицій згідно з даним винаходом. Наприклад, одна надає можливість експресувати пестицидний білок у хазяйських клітинах, що демонструють високі швидкості помилкового включення основ при реплікації ДНК, така як XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Після розмноження таких штамів можна ізолювати ДНК (шляхом одержання плазмідної ДНК або шляхом ампліфікації за допомогою ПЛР та клонування одержаного ПЛР фрагменту у вектор), культивувати мутації пестицидних білків у немутагенному штамі та ідентифікувати мутовані гени на пестицидну активність, наприклад, шляхом здійснення аналізу для тестування на пестицидну активність. В загальному випадку білок змішують та використовують у вегетативних аналізах. Див., наприклад Marrone та ін. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293. Такі аналізи можуть включати контакт рослини з одним або більше шкідниками та визначення здатності рослини виживати та/або викликати загибель шкідників. Приклади мутацій, що приводять до одержання підвищеної токсичності, можуть бути знайдені у Schnepf та ін. (1998) Micrоbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 775-806. Альтернативно, зміни можуть бути внесені у білкову послідовність багатьох білків на аміноабо карбокситермінальному кінці за відсутності суттєвого впливу на активність. Такі можуть включати інсерції, делеції або зміни, які вводяться за допомогою сучасних молекулярних способів, таких, як ПЛР, включаючи ПЛР ампліфікацію, такі способи змінюють або подовжують послідовність, що кодує білок, шляхом включення амінокислот, які кодують послідовності в олігонуклеотидах, які використовуються для ПЛР ампліфікації. Альтернативно, приєднані білкові послідовності можуть включати цільні послідовності, що кодують білок, такі, як ті, що звичайно використовуються для одержання злитих білків. Такі злиті білки часто використовуються для (1) підвищення експресії білка, що представляє інтерес, (2) введення зв’язувального домену, 11 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментативної активності або епітопу для сприяння або очистці білка, або визначенню білка, або іншим експериментальним застосуванням, відомим у галузі техніки, (3) цільової секреції або трансляції білка у субклітинних органеллах, таких, як периплазматичний простір Грамнегативних бактерій, або ендоплазматичний ретикулум еукаріотичних клітин, при цьому останній часто приводить до глікозилювання білка. Варіанти нуклеотидних та амінокислотних послідовностей згідно з даним винаходом також охоплюють послідовності, що одержані в результаті здійснення мутегенних та рекомбіногенних процедур, таких, як перестановка ДНК. За допомогою такої процедури одна або більше різних ділянок, що кодують пестицидний білок, можуть використовуватися для створення нових пестицидних білків, що мають бажані властивості. Таким чином одержують бібліотеки рекомбінантних полінуклеотидів з популяції споріднених послідовностей полінуклеотидів, що включають ділянки послідовності, які мають суттєву ідентичність послідовності та можуть бути гомологічно рекомбіновані in vitro або in vivo. Наприклад, при використанні такого підходу мотиви послідовності, що кодують домен, який представляє інтерес, можуть переставлятися між пестицидним геном згідно з винаходом та іншими відомими пестицидними генами для одержання нових кодуючих генів для білка з поліпшеною властивістю, що представляє інтерес, такою, як підвищену інсектицидна активність. Стратегії для таких перестановок ДНК є відомими у галузі техніки. Див., наприклад, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri та ін. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore та ін. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang та ін. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri та ін. (1998) Nature 391: 288-291; та патенти США №№ 5,605,793 та 5,837,458. Заміна або перестановка доменів являє собою інший механізм для одержання змінених пестицидних білків. Домени замінюються між пестицидними білками, що приводить до одержання гібридних або химерних токсинів з поліпшеною пестицидною активністю або цільовим спектром. Способи для одержання рекомбінантних білків та аналізу на пестицидну активність є добре відомими у галузі техніки (див., наприклад, Naimov та ін. (2001) Appl. Environ. Micrоbiol. 67: 5328-5330; de Maagd та ін. (1996) Appl. Environ. Micrоbiol. 62: 1537-1543; Ge та ін. (1991) J. Biol. Chem. 266: 17954-17958; Schnepf та ін. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20923-20930; Rang та ін. 91999) Appl. Environ. Micrоbiol. 65: 2918-2925). Вектори Пестицидна послідовність згідно з винаходом може забезпечуватися в експресійній касеті для експресії у рослині, що представляє інтерес. Під “рослинною експресійною касетою” розуміють конструкцію ДНК, що є здатною приводити до експресії білка з відкритої рамки зчитування у рослинній клітині. Типово така містить промотор та кодуючу послідовність. Часто такі конструкції будуть також містити 3′ нетрансльовану ділянку. Такі конструкції можуть містити “сигнальну послідовність” або “лідерну послідовність” для поліпшення ко-трансляційного або пост-трансляційного транспорту пептиду до певних внутрішньоклітинних структур, таких, як хлоропласт (або інша пластида), ендоплазматичний ретикулум або апарат Гольджі. Під “сигнальною послідовністю” розуміють послідовність, що є відомою або передбачуваною як така, що приводить до ко-трансляційного або пост-трансляційного пептидного транспорту через клітинну мембрану. У еукаріот такий типово втягує секрецію в апарат Гольджі з незначним глікозилюванням. Iнсектицидні токсини бактерій часто синтезуються як протоксини, які протеолітично активуються у травному тракті цільового шкідника (Chang (1987) Methods Enzymol. 153: 507-516). У деяких втіленнях згідно з даним винаходом сигнальна послідовність розміщується у нативній послідовності або може походити від послідовності згідно з винаходом. Під “лідерною послідовністю” розуміють будь-яку послідовність, яка при трансляції приводить до одержання амінокислотної послідовності, достатньої для запуску ко-трансляційного транспорту пептидного ланцюга до субклітинної органели. Таким чином, такий транспорт включає лідерну послідовність, що націлює транспорт та/або глікозилювання за допомогою проходження через ендоплазматичний ретикулум, проходження до вакуолей, пластид, включаючи хлоропласти, мітохондрії та подібні до них. Під “рослинним вектором трансформації” розуміють молекулу ДНК, що є необхідною для ефективної трансформації рослинної клітини. Така молекула може складатися з однієї або більше рослинних експресійних касет, та може бути організована у більше, ніж одну “векторну” молекулу ДНК. Наприклад, бінарні вектори являють собою рослинні вектори трансформації, що використовують два непослідовні ДНК вектори для кодування усіх необхідних цис- та трансдіючих функцій для трансформації рослинних клітин (Hellens та Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). “Вектор” відноситься до конструкції нуклеїнової кислоти, що є призначеною для переносу між різними хазяйськими клітинами. “Експресійний вектор” відноситься до вектора, що має здатність до вбудовування, інтеграції та експресії гетерологічних 12 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей ДНК або фрагментів у чужорідні клітини. Касета буде включати 5′ та 3′ регуляторні послідовності, оперативно зв’язані з послідовністю згідно з винаходом. Під “оперативно зв’язаною” розуміють функціональний зв’язок між промотором та другою послідовністю, де промоторна послідовність ініціює та опосередковує транскрипцію ДНК послідовності, що відповідає другій послідовності. В загальному випадку "оперативно зв’язаний" означає, що послідовності нуклеїнової кислоти, які є зв’язаними, є сусідніми та, якщо є необхідність зв’язати дві ділянки, що кодують білок, вони є суміжними та знаходяться у тій самій рамці зчитування. Касета може, крім того, містити принаймні один додатковий ген, який є котрансформованим в організм. Альтернативно, додатковий(і) ген(и) може(уть) забезпечуватися у множинних експресійних касетах. “Промотор” відноситься до послідовності нуклеїнової кислоти, що функціонує для направлення транскрипції розміщеної нижче кодуючої послідовності. Промотор разом з іншими послідовностями нуклеїнових кислот, що регулюють транскрипцію та трансляцію (також називаються“контрольними послідовностями”), є необхідним для експресії ДНК послідовності, що представляє інтерес. Така експресійна касета забезпечується з множиною рестрикційних сайтів для вбудовування пестицидної послідовності під транскрипційною регуляцією регуляторної ділянки. Експресійна касета буде включати у 5′-3′ напрямку транскрипції, ділянку ініціації транскрипції та транляції (тобто, промотор), ДНК послідовність згідно з винаходом та ділянку термінації транскрипції та трансляції (тобто, ділянку термінації), функціональну у рослинах. Промотор може бути нативним або аналогічним, або чужорідним або гетерологічним, по відношенню до хазяйської рослини та/або до ДНК послідовності згідно з винаходом. Крім того, промотор може являти собою природну послідовність або, альтернативно, синтетичну послідовність. Коли промотор є “нативним” або “гомологічним” по відношенню до хазяйської рослини, є зрозумілим, що промотор виявляють у нативній рослині, в яку було вбудовано промотор. Коли промотор є “чужорідним” або “гетерологічним” по відношенню до ДНК послідовності згідно з винаходом, є зрозумілим, що промотор не є нативним промотором або таким, що існує в природі для оперативно зв’язаної ДНК послідовності згідно з винаходом. Ділянка термінації може бути нативною по відношенню до ділянки ініціації транскрипції, може бути нативною по відношенню до оперативно зв’язаної ДНК послідовності, що представляє інтерес, може бути нативною по відношенню до хазяйської рослини, або може походити з іншого джерела (тобто, є чужорідною або гетерологічною щодо промотора, ДНК послідовності, яка представляє інтерес, хазяйської рослини, або будь-якою їх комбінацією). Прийнятні ділянки термінації є доступними з Ti-плазміди A. tumefaciens, такі, як ділянки термінації октопінсинтази та нопалінсинтази. Див. також Guerineau та ін. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon та ін. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen та ін. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe та ін. (1990) Gene 91: 151-158; Ballas та ін. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 7891-7903; та Joshi та ін. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639. Якщо це є прийнятним, то ген(и) може(можуть) бути оптимізований(і) для підвищення експресії у трансформованій хазяйській клітині. Tобто, ці гени можуть бути синтезовані при використанні бажаних для хазяйської клітини кодонів для сприяння експресії, або можуть бути синтезовані при використанні кодонів при бажаній для хазяїна частоті використання кодонів. В загальному випадку вміст GC гена буде підвищуватися. Див., наприклад, Campbell та Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11, для обговорення бажаного для хазяїна використання кодонів. Способи синтезу бажаних для рослини генів є доступними у галузі техніки. Див., наприклад, патенти США №№ 5,380,831 та 5,436,391, та Murray та ін. (1989) Nucleic Acid Res. 17: 477-498, що введені в дану заявку як посилання. В одному втіленні пестицидний білок є націленим на хлоропласт для експресії. Таким чином, коли пестицидний білок не є вбудованим у хлоропласт, то експресійна касета буде, крім того, містити нуклеїнову кислоту, що кодує транзитний пептид для направлення пестицидного білка до хлоропластів. Такі транзитні пептиди є добре відомими у галузі техніки. Див., наприклад, Von Heijne та ін. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark та ін. (1989) J. Biol. Chem. 264: 1754417550; Della-Cioppa та ін. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer та ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; та Shah та ін. (1986) Science 233: 478-481. Пестицидний ген, націлений на хлоропласт, може бути оптимізований для експресії у хлоропласті для підрахунку відмінностей у частоті використання кодонів між рослинним ядром та цією органелою. Таким чином, нуклеїнова кислота, що представляє інтерес, може бути синтезована при використанні бажаних для хлоропласту кодонів. Див., наприклад, патент США № 5,380,831, введений у дану заявку як посилання. Трансформація рослин 13 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Способи згідно з винаходом втягують вбудовування нуклеотидної конструкції у рослину. Під “вбудовуванням” розуміють представлення рослині нуклеотидної конструкції таким чином, що конструкція набуває доступу до внутрішнього середовища клітини рослини. Способи згідно з винаходом не вимагають, щоб використовувався певний спосіб введення нуклеотидної конструкції у рослину, а тільки те, що нуклеотидна конструкція одержує доступ до внутрішнього середовища принаймні однієї клітини рослини. Способи для введення нуклеотидних конструкцй у рослину є відомими у галузі техніки, включаючи, але без обмеження, прийнятні способи трансформації, способи тимчасової трансформації та опосередковані вірусами способи. Під “рослиною” розуміють цільні рослини, рослинні органи (наприклад, листя, стебла, корені тощо), насіння, рослинні клітини, матеріал для розмноження, зародки та їх потомство. Рослинні клітини можуть бути диференційованими та недиференційованими (наприклад, калуси, суспензія клітин у культурі, протопласти, клітини листків, клітини коренів, клітини флоеми, пилок). “Tрансгенні рослини” або “трансформовані рослини” або “стабільно трансформовані” рослини або клітини, або тканини відносяться у рослину, яка має вбудовані або інтегровані у рослинну клітину послідовності нуклеїнових кислот або ДНК фрагменти. Ці послідовності нуклеїнових кислот включають такі, що є екзогенними або не є присутніми у нетрансформованій рослинній клітині, а також такі, що можуть бути ендогенними або присутніми у нетрансформованій рослинній клітині. “Гетерологічні” в загальному випадку відносяться до послідовностей нуклеїнової кислоти, що не є ендогенними по відношенню до клітини або частини нативного геному, в якому вони є присутніми та були додані до клітини шляхом інфекції, трансфекції, мікроін’єкції, електропорації, мікропроекції та подібних до них. Трансгенні рослини згідно з винаходом експресують одну або більше варіантних Cry3 послідовностей, розкритих в даній заявці. У різних втіленнях трансгенна рослина додатково включає один або більше додаткових генів для резистентності до комах, наприклад, один або більше додаткових генів для контролю твердокрилих шкідників (наприклад, Cry1, такі, як члени родин Cry1A, Cry1B, Cry1C, Cry1D, Cry1E, та Cry1F; Cry2, такі, як члени родин Cry2A; Cry9, такі, як члени родин Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E та Cry9F; Cry34/35; VIP, такі, як VIP3; або будь-які модифіковані Cry3A або Cry3B послідовності, відомі у галузі техніки як такі, що мають токсичність проти твердокрилих шкідників. При цьому спеціалістові у галузі техніки буде зрозумілим, що трансгенна рослина може включати будь-який ген, який надає агрономічну характеристику, що представляє інтерес. Трансформація рослинних клітин може бути здійснена за допомогою декількох методик, відомих у галузі техніки. Пестицидний ген згідно з винаходом може бути модифікований для одержання або поліпшення експресії у рослинних клітинах. Типово, конструкція, що експресує такий білок, буде містити промотор для направлення транскрипції гена, а також 3′ нетрансльовану ділянку для того, щоб дозволити проводити термінацію транскрипції та поліаденілування. Організація такої конструкції є добре відомою з рівня техніки. У деяких випадках може бути корисним сконструювати ген, такий, що одержаний пептид є секретованим, або іншим чином націленим у рослинній клітині. Наприклад, такий ген може бути сконструйований для того, щоб містити сигнальний пептид для сприяння переносу пептиду до ендоплазматичного ретикулуму. Може бути також бажаним сконструювати рослинну експресійну касету, яка містить інтрон, так, що процесинг іРНК інтрону буде необхідним для експресії. Типово, така “рослинна експресійна касета” буде вбудовуватися у “рослинний вектор трансформації”. Такий рослинний вектор трансформації може включати один або більше ДНК векторів, необхідних для досягнення трансформації рослини. Наприклад, є загальною практикою в області техніки використовувати рослинні вектори для трансформації, що складаються з одного або більше послідовних ДНК сегментів. Ці вектори часто називаються в області техніки “бінарними векторами”. Бінарні вектори, а також вектори з хелперними плазмідами найбільш часто використовуються для опосередкованої Agrobacterium трансформації, де розмір та складність ДНК сегментів, які є необхідними для досягнення ефективної трансформації, є надзвичайно великим, при цьому є бажаним розділяти функції по окремих молекулах ДНК. Бінарні вектори типово містять плазмідний вектор, що включає цисдіючі послідовності, які є необхідними для переносу T-ДНК (такі, як ліва границя та права границя), селективний маркер, який є сконструйованим для того, щоб бути здатним до експресії у рослинній клітині, та “ген, що представляє інтерес” (ген, сконструйований для того, щоб бути здатним до експресії у рослинній клітині, для якої є бажаним розмноження трансгенної рослини). Також присутніми у цьому плазмідному векторі є послідовності, які необхідні для бактеріальної реплікації. Цис-діючі послідовності розміщуються таким чином, щоб дозволити 14 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проводити ефективний перенос у рослинні клітини та експресію у них. Наприклад, селективний маркерний ген та пестицидний ген розміщуються між лівою та правою границею. Часто другий плазмідний вектор містить транс-діючі фактори, які опосередковують перенос T-ДНК з Agrobacterium у рослинні клітини. Така плазміда часто містить функції вірулентності (Vir гени), що дозволяють здійснювати інфекцію рослинних клітин за допомогою Agrobacterium, та переносити ДНК шляхом відщеплення граничної послідовності та vir опосередкованого переносу ДНК, як це є зрозумілим у рівні техніки (Hellens та Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). Декілька типів штамів Agrobacterium (наприклад LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, тощо) можуть використовуватися для трансформації рослин. Другий плазмідний вектор не є необхідним для трансформації рослини іншими способами, такими, як мікровведення, мікроінєкція, електропорація, перенос, опосередкований поліетиленгліколем, тощо. В загальному випадку способи трансформації рослин втягують перенос гетерологічної ДНК у цільові рослинні клітини (наприклад, незрілі або зрілі зародки, суспензійні культури, недиференційовані калуси, протопласти, тощо.), після чого здійснюють застосування максимального порогового рівня прийнятної селекції (у залежності від селективного маркерного гена) для відновлення трансформованих рослинних клітин з групи трансформованої клітинної маси. Експлантати типово переносять на нову порцію того самого середовища та культивують звичайним чином. Потім трансформовані клітини диференціюються у паростки після переносу на регенераційне середовище з доданням максимального порогового рівня oселективного агента. Паростки потім переносять на середовище для вкорінення з метою одержання вкорінених паростків або сходів. Tрансгенні сходи потім вирощують до зрілої рослини та одержують фертильне насіння (наприклад, Hiei та ін. (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida та ін. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750). Експлантати типово переносять на нову порцію того самого середовища та культивують звичайним чином. Загальний опис методик та способів для одержання трансгенних рослин можна знайти у Ayres та Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13: 219-239 та Bommineni та Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Трансформований матеріал містить багато клітин; як трансформовані, так і нетрансформовані клітини є присутніми у будь-якій частині цільового калусу або тканини, або групі клітин, що піддається обробці. Здатність знищувати нетрансформовані клітини та дозволяти трансформованим клітинам розмножуватися приводить до одержання трансформованих рослинних культур. Часто здатність до видалення нетрансформованих клітин являє собою обмеження здатності до швидкого відновлення трансформованих рослинних клітин та успішного одержання трансгенних рослин. Прописи трансформації, а також прописи для введення нуклеотидних послідовностей у рослини можуть варіювати в залежності від типу рослини або рослинної клітини, тобто, однодольні або дводольні, що є мішенню для трансформації. Одержання трансгенних рослин може бути проведене за допомогою одного з декількох способів, включаючи, але без обмеження, мікроiн’єнцію, електропорацію, безпосередній генний перенос, введення гетерологічної ДНК за допомогою Agrobacterium у рослинні клітини (опосередкована Agrobacterium трансформація), бомбардування рослинних клітин при використанні чужорідної гетерологічної ДНК, прикріпленої до частинок, балістичного прискорення частинок, аерозольної променевої трансформації (опублікована заявка США № 20010026941; патент США № 4,945,050; публікація міжнародної заявки WO 91/00915; опублікована заявка США № 2002015066), Lec1 трансформації та інших різноманітних безчастинкових прямих/опосередкованих способів для переносу ДНК. Способи для трансформації хлоропластів є відомими у галузі техніки. Див., наприклад, Svab та ін. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab та Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab та Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. Спосіб базується на використанні генної гармати для доставки ДНК, що містить селективний маркер, та націлювання ДНК на пластидний геном за допомогою гомологічної рекомбінації. Крім того, пластидна трансформація може супроводжуватися трансактивацією мовчазного пластидного трансгену шляхом переважної для тканини експресії ядерної та направленої на пластиди РНК полімерази. Така система є описаною McBride та ін. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305. Після інтеграції чужорідної гетерологічної ДНК у рослинні клітини можна застосовувати максимальний пороговий рівень прийнятної селекції у середовищі для знищення нетрансформованих клітин, відокремлення та проліферації путативно трансформованих клітин, що вижили при цій селективній обробці, шляхом регулярного переносу на свіже середовище. Шляхом постійного пасивування та стимуляції за допомогою прийнятної селекції можна ідентифікувати та розмножити клітини, що є трансформованими за допомогою плазмідного 15 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вектора. Молекулярні та біохімічні способи можна потім використовувати для підтвердження присутності інтегрованого гетерологічного гена, що представляє інтерес, у геном трансгенної рослини. Клітини, які були трансформовані, можуть вирощуватися у рослинах у відповідності із традиційними методами. Див., наприклад, McCormick та ін. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Ці рослини можна потім вирощувати та схрещувати або з таким самим трансформованим штамом, або з відмінними штамами, а одержаний гібрид буде мати конститутивну експресію бажаної ідентифікованої фенотипічної характеристики. Два або більше поколінь можуть вирощуватися для забезпечення того, що експресія бажаної фенотипічної характеристики стабільно підтримується та успадковується, потім насіння збирають для підтвердження досягнення експресії бажаної фенотипічної характеристики. Таким чином, даний винахід забезпечує трансформоване насіння (також називається як “трансгенне насіння”), що має нуклеотидну конструкцію згідно з винаходом, наприклад, експресійну касету згідно з винаходом, стабільно введену у їх геном. Оцінка рослинної трансформації Після інтеграції чужорідної гетерологічної ДНК у рослинні клітини трансформацію або інтеграцію гетерологічного гена у рослинному геномі підтверджують різними способами, такими, як аналіз нуклеїнових кислот, білків та метаболітів, асоційованих з інтегрованим геном. ПЛР аналіз являє собою швидкий спосіб для скринінгу трансформованих клітин, тканин або паростків на присутність вбудованого гена на більш ранній стадії перед висаджуванням у ґрунту(Sambrook та Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). ПЛР здійснюють при використанні oлігонуклеотидних праймерів, специфічних для гена, що представляє інтерес, або вихідного вектора на основі Agrobacterium, тощо. Рослинна трансформація може бути підтверджена за допомогою Саузерн-блотінгу геномної ДНК (Sambrook та Russell, 2001, вище). Типово, загальну ДНК піддають екстракції з трансформанту, перетравлюють при використанні прийнятних рестрикційних ферментів, фракціонують в агарозному гелі та переносять на нітроцелюлозну або нейлонову мембрану. Мембрану або “блот” потім піддають зондуванню при використанні, наприклад, радіоактивно 32 міченого P цільового фрагменту ДНК для підтвердження інтеграції введеного гена у рослинний геном у відповідності із стандартними методиками (Sambrook та Russell, 2001, вище). У Нозерн-блотінгу РНК ізолюють зі специфічної тканини трансформанта, піддають фракціонуванню в агарозному гелі з формальдегідом та переносять блоти на нейлоновий фільтр згідно зі стандартними процедурами, що звичайно використовуються у галузі техніки (Sambrook та Russell, 2001, вище). Експресію РНК, що кодується пестицидним геном, потім аналізують шляхом гібридизації фільтра з радіоактивним зондом, що походить від пестицидного гена, за допомогою способів, відомих у галузі техніки (Sambrook та Russell, 2001, вище). Вестерн-блотінг, біохімічні аналізи та подібні до них можуть здійснюватися на трансгенних рослинах для підтвердження присутності білка, що кодується пестицидним геном, за допомогою стандартних процедур (Sambrook та Russell, 2001, вище) при використанні антитіла, що зв’язується з одним або більше епітопами, які є присутніми у пестицидному білку. Пестицидна активність у рослинах В іншому аспекті згідно з винаходом можна одержати трансгенні рослини, які експресують пестицидний білок, що має пестицидну активність. Способи, описані вище як приклади, можуть використовуватися для одержання трансгенних рослин, але спосіб, за допомогою якого одержують рослинні клітини, не є критичним для даного винаходу. Відомі способи або такі, що, описані в області техніки, такі, як опосередкована Agrobacterium трансформація, біобалістична трансформація та способи, які не опосередковані частинками, можуть використовуватися на розсуд експериментатора. Рослини, що експресують пестицидний білок, можуть бути ізольовані за допомогою відомих способів, описаних у галузі техніки, наприклад, шляхом трансформації калусів, селекції трансформованих калусів та регенерації фертильних рослин з таких трансгенних калусів. У цьому процесі можна використовувати будь-який ген як селективний маркер поки його експресія у рослинних клітинах забезпечує здатність ідентифікації та селекції на трансформовані клітини. Ряд маркерів було розроблено для застосування у рослинних клітинах, такі, як резистентність до хлорамфеніколу, аміноглікозиду G418, гігроміцин, або подібних до них. Інші гени, які кодують продукт і є втягненими у хлоропластний метаболізм, можуть також використовуватися як селективні маркери. Наприклад, гени, що забезпечують резистентність до рослинних гербіцидів, таких, як гліфосат, бромоксиніл або iмідазолінон, можуть також знайти своє застосування. Такі гени були описані (Stalker та ін. (1985) J. Biol. Chem. 263: 6310-6314 16 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (нітрілазний ген резистентності до бромоксинілу); та Sathasivan та ін. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 2188 (ген AHAS резистентністі до імідазолінону). Крім того, гени, розкриті в даній заявці, є корисними як маркери для оцінки трансформації бактеріальних або рослинних клітин. Способи для визначення присутності трансгена у рослині, органах рослини (наприклад, листях, стаблах, коренях, тощо), насінні, рослинній клітині, матеріалі для розмноження, зародках або у їх потомстві є добре відомими у галузі техніки. В одному втіленні присутність трансгена визначають шляхом аналізу на пестицидну активність. Фертильні рослини, що експерсують пестицидний білок, можуть піддаватися аналізу на пестицидну активність, а рослини, які демонструють оптимальну активність, відбирають для подальшого розведення. У галузі техніки є доступними способи для аналізу на активність стосовно шкідника. В загальному випадку білок змішують та використовують в аналізах харчування. Див., наприклад Marrone та ін. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293. Даний винахід може використовуватися для трансформації будь-яких видів рослин, включаючи, але без обмеження, однодольні та дводольні. Приклади рослин, що представляють інтерес, включають, але без обмеження, кукурудзу (маїс), сорго, пшеницю, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь та олійний рапс, Brassica sp., люцерну, жито, овес, сафлор, арахіс, солодку картоплю, маніоку, каву, кокос, ананас, цитрусові, какао, чай, банани, авокадо, фігове дерево, гуайяву, манго, маслини, папайю, анакард, макадамію, мигдальне дерево, овес, овочі, декоративні рослини та хвойні дерева. Овочі включають, але без обмеження, томати, салат-латук, зелену квасолю, лімську квасолю, горох та членів родини Curcumis, таких, як огірки, канталупа та мускусна диня. Декоративні рослини включають, але без обмеження, азалію, гортензію, гібіскус, троянди, тюльпани, жовті нарциси, петунії, , petunias, гвоздики, пуансетію та хризантеми. Бажано, коли рослини згідно з даним винаходом являють собою сільськогосподарські культури (наприклад, кукурудзу, сорго, пшеницю, соняшник, томати, хрестоцвіті, перці, картоплю, бавовник, рис, сою, цукровий буряк, цукрову тростину, тютюн, ячмінь, олійний рапс, тощо). Використання у контролі шкідників Загальні способи для використання штамів, що включають нуклеотидні послідовність згідно з даним винаходом або їх варіант, у контролі шкідників або у конструюванні інших організмів, таких, як пестицидні агенти, є відомими у галузі техніки. Див., наприклад патент США № 5,039,523 та EP 0480762A2. Штами Bacillus, що містять нуклеотидну послідовність згідно з даним винаходом або її варіант, або мікроорганізми, що були генетично змінені для того, щоб містити пестицидний ген та білок, можуть можуть використовуватися для захисту сільськогогосподарських культур та продуктів від шкідників. В одному аспекті згідно з винаходом цілі, тобто, нелізовані клітини організму, що виробляє токсин (пестицид), обробляють за допомогою реагентів, пролонгують активність токсину, що виробляється клітиною, коли клітину застосовують до навколишнього середовища цільового(их) шкідника(ів). Альтернативно, пестицид одержують шляхом введення пестицидного гену у клітинного хазяїна. Експресія пестицидного гена приводить, безпосередньо або опосередковано, до внутрішньоклітинної продукції та підтриманню пестициду. В одному аспекті даного винаходу ці клітини потім піддають обробці за умов, які подовжують активність токсину, що виробляється клітиною, коли клітину застосовують до навколишнього середовища цільового(их) шкідника(ів). Одержаний продукт зберігає токсичність токсину. Ці природно інкапсульовані пестициди можуть потім бути рецептовані у відповідності з традиційними методиками для застосування до навколишнього середовища, що оточує цільового шкідника, наприклад, ґрунт, вода та листова маса рослини. Див., наприклад EPA 0192319 та посилання, які наводяться там Альтернативно, можна рецептувати клітини, що експресують ген згідно з винаходом, так, що це дозволить застосовувати одержаний матеріал як пестицид. Активні інгредієнти згідно з даним винаходом звичайно застосовують у формі композиції, та вони можуть застосовувати до площі культури або рослини, яку піддають обробці, одночасно або послідовно з іншими компонентами. Ці сполуки можуть являти собою добрива, агенти для знищення бур’янів, кріопротектори, поверхнево-активні сполуки, детергенти, пестицидне мило, латентні олї, полімери та/або композиції носія для вивільнення у часі або здатні до біорозкладання композиції носія, що дозволяють здійснювати довготривале внесення дози на цільову площу після однократного застосування композиції. Вони можуть також являти собою селективні гербіциди, хімічні інсектициди, вірициди, мікробіциди, амебоциди, пестициди, фунгіциди, бактеріоциди, нематоциди, молюскоциди або суміші декількох цих препаратів, якщо це є бажаним, разом з агрономічно прийнятними носіями, поверхнево-активними агентами або 17 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 aд’ювантами, які сприяють застосуванню, що традиційно використовуються у галузі створення рецептур. Прийнятні носії та ад’юванти можуть бути твердими або рідкими та відповідають речовинам, які звичайно використовуються у технології створення рецептур, наприклад, природні або перетворені мінеральні речовини, розчинники, диспергувальні агенти, змочувальні агенти, реагенти, що підвищують клейкість, зв’язувальні агенти або добрива. Таким чином, композиції можуть бути одержані у формі їстівних “приманок” або сформовані у вигляді “пастки” для шкідника, для того, що дозволити здійснювати згодовування та споживання цільовим шкідником пестицидної композиції. Способи застосування активного інгредієнту згідно з даним винаходом або агрохімічної композиції згідно з даним винаходом, що містить принаймні один з пестицидних білків, що продукуються бактеріальними штамами згідно з даним винаходом, включають застосування для обробки листя, покриття насіння та застосування до ґрунту. Кількість застосувань та частота застосування залежать від інтенсивності зараження відповідним шкідником. Композиція може бути рецептована як порошок, пил, кульки, гранули, розпилюваний розчин, емульсія, колоїд, розчин, або подібні до них, та може бути одержана за допомогою таких способів, як висушування, ліофілізація, гомогенізація, екстракція, фільтрування, центрифугування, седиментація або концентрація культури клітин, які включають поліпептид. У таких композиціях, що містять принаймні один такий пестицидний поліпептид, такий поліпептид може бути представлений у концентрації від приблизно 1% до приблизно 99% за вагою. Лускокрилі, двокрилі або твердокрилі шкідники можуть бути знищені або зменшені у кількості на даній площі за допомогою способів згідно з винаходом, або способи згідно з винаходом можуть профілактично застосовуватися до площі навколишнього середовища для запобігання зараження чутливим шкідником. Переважно шкідник з’їдає або контактує з пестицидно ефективною кількістю поліпептиду. Під “пестицидно ефективною кількістю” розуміють кількість пестициду, що є здатною до спричинення смерті принаймні одного шкідника, або до значного зниження кількості шкідника, його харчування або нормального фізіологічного розвитку. Ця кількість може варіювати у залежності від таких факторів, як, наприклад, специфічні цільові шкідники, що піддаються контролю, специфічне навколишнє середовище, розміщення, рослина, культура або агрономічний сайт, який піддають обробці, умови навколишнього середовища та спосіб, норма, концентрація, стабільність та кількість застосувань пестицидно ефективної композиції поліпептиду. Композиції можуть також варіювати у залежності від кліматичних умов, урахування впливу на навколишнє середовище та/або частоти застосування, та/або тяжкості зараження шкідником. Описані пестицидні композиції можуть бути рецептовані як бактеріальна клітина, кристалічна та/або спорова суспензія або ізольований білковий компонент з бажаним агрономічним носієм. Композиції можуть бути рецептовані перед введенням у вигляді прийнятних форм, таких, як ліофілізовані, висушені, висушені заморожуванням або у водному або прийнятному розріджувачі, такому, як фізіологічний розчин або інший буфер. Рецептовані композиції можуть бути у формі порошкового або гранулярного матеріалу або суспензії у маслі (рослинному або мінеральному), або у вигляді водних, масляно-водних емульсій, або у вигляді змочуваного порошку, або у комбінації з іншим матеріалом носія, прийнятним для сільськогосподарського застосування. Прийнятні агрономічні носії можуть бути твердими або рідкими та є добре відомими у галузі техніки. Термін “агрономічно прийнятний носій” охоплює усі ад’юванти, інертні компоненти, диспергувальні агенти, поверхнево-активні речовини, агенти, що сприяють прилипанню, зв’язувальні агенти, тощо, що звичайно використовуються у технології пестицидних комбінацій; такі агенти є добре відомими спеціалісту у галузі пестицидних композицій. Композиції можуть змішуватися з одним або більше твердих або рідких ад’ювантів та приготовлені за допомогою різних засобів, наприклад, шляхом гомогенного змішування, змішування та/або подрібнення пестицидної композиції з прийнятними ад’ювантами при використанні традиційних методик для створення композицій. Прийнятні композиції та способи застосування є описаними у патенті США № 6,468,523, що є введеним у дану заявку як посилання. “Шкідник” включає, проте без обмеження такими, комах, гриби, бактерії, нематод, кліщів, іксодових кліщів та подібних до них. Комахи шкідники включають комах, вибраних з порядків Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, тощо, зокрема, Coleoptera, Lepidoptera та Diptera. Порядок Coleoptera включає підпорядки Adephaga та Polyphaga. Підпорядок Adephaga включає суперродини Caraboidea та Gyrinoidea, у той час як підпорядок Polyphaga включає суперродини Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, 18 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea та Curculionoidea. Суперродина Caraboidea включає родини Cicindelidae, Carabidae та Dytiscidae. Суперродина Gyrinoidea включає родину Gyrinidae. Суперродина Hydrophiloidea включає родину Hydrophilidae. Суперродина Staphylinoidea включає родини Silphidae та Staphylinidae. Суперродина Cantharoidea включає родини Cantharidae та Lampyridae. Суперродина Cleroidea включає родини Cleridae та Dermestidae. Суперродина Elateroidea включає родини Elateridae та Buprestidae. Суперродина Cucujoidea включає родину Coccinellidae. Суперродина Meloidea включає родину Meloidae. Суперродина Tenebrionoidea включає родину Tenebrionidae. Суперродина Scarabaeoidea включає родини Passalidae та Scarabaeidae. Суперродина Cerambycoidea включає родину Cerambycidae. Суперродина Chrysomeloidea включає родину Chrysomelidae. Суперродина Curculionoidea включає родини Curculionidae та Scolytidae. Порядок Diptera включає підпорядки Nematocera, Brachycera та Cyclorrhapha. Підпорядок Nematocera включає родини Tipulidae, Psychodidae, Culicidae, Ceratopogonidae, Chironomidae, Simuliidae, Bibionidae та Cecidomyiidae. Підпорядок Brachycera включає родини Stratiomyidae, Tabanidae, Therevidae, Asilidae, Mydidae, Bombyliidae та Dolichopodidae. Підпорядок Cyclorrhapha включає розділи Aschiza та Aschiza. Розділ Aschiza включає родини Phoridae, Syrphidae та Conopidae. Розділ Aschiza включає підрозділи Acalyptratae та Calyptratae. Підрозділ Acalyptratae включає родини Otitidae, Tephritidae, Agromyzidae та Drosophilidae. Підрозділ Calyptratae включає родини Hippoboscidae, Oestridae, Tachinidae, Anthomyiidae, Muscidae, Calliphoridae та Sarcophagidae. Порядок Lepidoptera включає родини Papilionidae, Pieridae, Lycaenidae, Nymphalidae, Danaidae, Satyridae, Hesperiidae, Sphingidae, Saturniidae, Geometridae, Arctiidae, Noctuidae, Lymantriidae, Sesiidae та Tineidae. Комахи шкідники згідно з винаходом для багатьох культур включають: Кукурудза: Ostrinia nubilalis, европейський кукурудзяний метелик; Agrotis ipsilon, совка-іпсілон; Helicoverpa zea, гусінь совки бавовникової американської; Spodoptera frugiperda, совка трав’яна; Diatraea grandiosella, вогнівка кукурудзяна південно-західна; Elasmopalpus lignosellus, малий свердлик стебла кукурудзи; Diatraea saccharalis, свердлик цукрової тростини; Diabrotica virgifera, західний кукурудзяний жук; Diabrotica longicornis barberi, північний кукурудзяний жук; Diabrotica undecimpunctata howardi, південний кукурудзяний жук; Melanotus spp., личинка жука-ковалика; Cyclocephala borealis, личинка північного майського хруща (личинка хруща); Cyclocephala immaculata, личинка південного майського хруща (личинка хруща); Popillia japonica, хрущик японський; Chaetocnema pulicaria, кукурудзяний жук-блошка; Sphenophorus maidis, довгоносик кукурудзяний; Rhopalosiphum maidis, блошиця кукурудзяна; Anuraphis maidiradicis, блошиця в’язово-злакова; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшенична північноамериканська; Melanoplus femurrubrum, червононога кобилка; Melanoplus sanguinipes, кобилка мексиканська; Hylemya platura, личинка мухи росткової; Agromyza parvicornis, мінер, що викликає плямистість кукурудзи; Anaphothrips obscrurus, трипси злакові; Solenopsis milesta, мураха-крадій хатній; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Сорго: Chilo partellus, сорговий свердлик; Spodoptera frugiperda, совка трав’яна; Helicoverpa zea, гусінь совки бавовникової американської; Elasmopalpus lignosellus, малий стебловий свердлик; Feltia subterranea, гусінь озимого метелика-совки; Phyllophaga crinita, майський хрущ; Eleodes, Conoderus, та Aeolus spp., дротяники; Oulema melanopus, п’явиця червоногруда; Chaetocnema pulicaria, жук-блошка; Sphenophorus maidis, довгоносик кукурудзяний; Rhopalosiphum maidis; попелиця кукурудзяна; Sipha flava, жовта попелиця цукрової тростини; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшенична північноамериканська; Contarinia sorghicola, галиця соргова; Tetranychus cinnabarinus, червоний павутинний кліщ; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Пшениця: Pseudaletia unipunctata, совка лугова; Spodoptera frugiperda, совка трав’яна; Elasmopalpus lignosellus, малий стебловий свердлик; Agrotis orthogonia, личинка західної озимої совки; Elasmopalpus lignosellus, малий свердлик стебла кукурудзи; Oulema melanopus, п’явиця червоногруда; Hypera punctata, слоник листовий бобовий; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-крапкова Говарда; російська пшенична попелиця; Schizaphis graminum, попелиця злакова звичайна; Macrosiphum avenae, попелиця злакова; Melanoplus femurrubrum, червононога кобилка; Melanoplus differentialis, кобилка відмітна; Melanoplus sanguinipes, кобилка мексиканська; Mayetiola destructor, Гессенська муха; Sitodiplosis mosellana, галиця злакова оранжева; Meromyza americana, личинка американської меромізи; Hylemya coarctata, муха озима; Frankliniella fusca, тютюнові трипси; Cephus cinctus, пилильщик хлібний; Aceria tulipae, кліщ, що пошкоджує цибулини тюльпанів; Соняшник: Suleima helianthana, соняшникова брунькова листовійка; Homoeosoma electellum, вогнівка соняшникова; Zygogramma 19 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 exclamationis, совка соняшникова оклична; Bothyrus gibbosus, жук морквяний; Neolasioptera murtfeldtiana, галиця насіння соняшника; Бавовник: Heliothis virescens, совка бавовникова; Helicoverpa zea, совка бавовникова; Spodoptera exigua, мала совка; Pectinophora gossypiella, рожевий черв коробочокковий бавовника; Anthonomus grandis, довгоносик бавовниковий; Aphis gossypii, попелиця баштанна; Pseudatomoscelis seriatus, бавовниковий слепняк; Trialeurodes abutilonea, літаюча білокрилка; Lygus lineolaris, клоп польовий; Melanoplus femurrubrum, червононога кобилка; Melanoplus differentialis, кобилка відмітна; Thrips tabaci, трипс тютюновий; Franklinkiella fusca, тютюнові трипси; Tetranychus cinnabarinus, червоний павутинний кліщ; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Рис: Diatraea saccharalis, свердлик цукрової тростини; Spodoptera frugiperda, совка трав’яна; Helicoverpa zea, гусінь совки бавовникової американської; Colaspis brunnea, виноградний коласпис; Lissorhoptrus oryzophilus, рисовий водяний довгоносик; Sitophilus oryzae, довгоносик рисовий; Nephotettix nigropictus, рисова цикадка; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшенична північноамериканська; Acrosternum hilare, щитник; Соя: Pseudoplusia comorisens, п’ядун соєвих бобів; Anticarsia gemmatalis, гусениця бархатних бобів; Plathypena scabra, зелений шкідник конюшини; Ostrinia nubilalis, метелик кукурудзяний; Agrotis ipsilon, совка іпсілон; Spodoptera exigua, совка мала; Heliothis virescens, совка бавовникова; Helicoverpa zea, совка бавовникова; Epilachna varivestis, мексиканська зернівка бобова; Myzus persicae, попелиця оранжерейна; Empoasca fabae, цикадка картополяна; Acrosternum hilare, щитник; Melanoplus femurrubrum, червононога кобилка; Melanoplus differentialis, кобилка відмітна; Hylemya platura, див.dcorn maggot; Sericothrips variabilis, соєві трипси; Thrips tabaci, тютюнові трипси; Tetranychus turkestani, кліщик павутинний атлантичний; Tetranychus urticae, звичайний павутинний кліщ; Ячмінь: Ostrinia nubilalis, метелик кукурудзяний; Agrotis ipsilon, совка іпсілон; Schizaphis graminum, попелиця злакова звичайна; Blissus leucopterus leucopterus, клоп-черепашка пшенична північноамериканська; Acrosternum hilare, щитник; Euschistus servus, коричневий щитник; Delia platura, муха росткова; Mayetiola destructor, гессенська муха; Petrobia latens, коричневий пшеничний кліщик; Олійний рапс: Brevicoryne brassicae, попелиця капустяна; Phyllotreta cruciferae, земляні блошки; Mamestra configurata, совка мереживна; Plutella xylostella, міль капустяна; Delia ssp., личинки, що пошкоджують корені. Нематоди включають паразитичних нематод, таких, як ті, що утворюють кореневі нарости, цисти, та нематод, що спричинюють пошкодження, включаючи Heterodera spp., Meloidogyne spp., та Globodera spp.; зокрема, членів цистових нематод, включаючи, але без обмеження, Heterodera glycines (соєву нематоду); Heterodera schachtii (бурякову нематоду); Heterodera avenae (злакову нематоду); та Globodera rostochiensis та Globodera pailida (картопляну нематоду). Нематоди, що спричинюють пошкодження, включають Pratylenchus spp. Рослини можуть також оброблятися за допомогою однієї або більше хімічних композицій, включаючи один або більше гербіцидів, інсектицидів або фунгіцидів. Приклади хімічних композицій включають: гербіциди для фруктів та овочів: атразин, бромацил, діурон, гліфосат, лінурон, метридузин, сімазин, трифлуралін, флуазифоп, глюфозинат, галосульфурон гован, паракват, пропізамід, сутоксидим, бутафенацил, галосульфурон, індазифлам; інсектициди для фруктів та овочів: алдикарб, Bacillus thuriengiensis, карбарил, карбофуран, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, діазинон, малатіон, абамектин, цифлутрин/бета-цифлутрин, есфенвалерат, лямбда-цигалотрин, ацеквіноцил, біфеназат, метоксифенозид, новалурон, хромафенозид, тіаклоприд, дінотефуран, флуакрипірин, толфенпірад, клотіанідин, спіродиклофен, гамма-цигалотрин,спіромесіфен, спіносад, рінаксипір, ціазипір, спінотерам, трифлумурон, спіротетрамат, імідаклоприд, флубендіамід, тіодікарб, метафлумізон, сульфоксафлор, цифлуметофен, цианопірафен, імідаклоприд, клотіанідин,тіаметоксам, спіноторам, тіодікарб, флонікамід, метіокарб, емамектин бензоат, індоксакарб, фортіазат, фенаміфос, кадузафос, пірипроксифен, фенбутатін-oксид, гекстіазокс, метоміл, 4-[[(6хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он; фунгіциди для фруктів та овочів: карбендазим, хлороталоніл, EBDC, сірка, тіофанат-метил, азоксистробін, цимоксаніл, флуазинам, фосетил, іпродіон, крезоксим-метил, металаксил/мефеноксам, трифлоксистробін, етабоксам, іпровалікарб, трифлоксистробін, фенгексамід, опоксоназол фумарат, циазофомід, фенамідон, зоксамід, пікоксистробін, піраклостробін, цифлуфенамід, боскалід; гербіциди для злакових: ізопротурон, бромоксиніл, іоксиніл, фенокси, хлорсульфурон, клодинафоп, диклофоп, дифлюфенікан, феноксипроп, флорасулам, флуроксипір, метсульфурон, триасульфурон, флукарбазон, йодосульфурон, пропоксикарбазон, піколінафен, мезосульфурон, бефлубутамід, піноксаден, амідосульфурон, тифенсульфурон, трибенурон, флупірсульфурон, сульфосульфурон, пірасульфотол, піроксосулам, флуфенацет, тралкоксидим, піроксасульфон; фунгіциди для злакових: карбендазим, хлороталоніл, азоксистробін, ципроконазол, ципродиніл, 20 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фенпропіморф, епоксиконазол, крезоксим-метил, квіноксифен, тебуконазол, трифлоксистробін, симеконазол, пікоксистробін, піраклостробін, димоксистробін, протіоконазол, флуоксастробін; інсектициди для злакових: диметоат, лямбда-цигалотрин, дельтаметрин, альфа-циперметрин, ß-цифлутрин, біфентрин, імідаклоприд, клотіанідин,тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, дінетофуран, хлорпірифос, метамідофос, оксидиметон-метил, піримікарб, метіокарб; гербіциди для кукурудзи: атразин, алахлор, бромоксиніл, ацетохлор, дикамба, клопіралід, (S-) діметенамід, глюфозинат, гліфосат, ізоксафлутол, (S-) метолахлор, мезотріон, нікосульфурон, прімісульфурон, римсульфурон, сулкотріон, форамсульфурон, топрамезон, темботріон, сафлуфенацил, тієнкарбазон, флубенацет, піроксасульфон; інсектициди для кукурудзи: карбофуран, хлорпірифос, біфентрин, фіпроніл, імідаклоприд, лямбда-цигалотрин, тефлутрин, тербуфос, тіаметоксам, клотіанідин, спіромесіфен, флубендіамід, трифлумурон, ринаксипір, дельтаметрин, тіодикарб, ß-цифлутрин, циперметрин, біфентрин, луфенурон, трифлумурон, тефлутрин, тебупіримфос, етипрол, циазипір, тіаклоприд, ацетаміприд, дінетофуран, авермектин, метіокарб, спіродиклофен, спірометромат; фунгіциди для кукурудзи: фенітропан, тирам, протіоконазол, тебуконазол, трифлоксистробін; гербіциди для рису: бутахлор, пропаніл, азимсульфурон, бенсульфурон, цигалофоп, даімурон, фентразамід, імазосульфурон, мефенацет, оксазикломефон, піразосульфурон, пірибутикарб, квінклорпак, тіобенкарб, інданофан, флуфенацет, фентразамід, галосульфурон, оксацикломефон, бензодициелон, пірафталід, пеноксулам, біспірибак, оксадіаргіл, етоксисульфурон, претілахлор, мезотріон, тефурилтріон, оксадіазон, феноксапроп, піримсульфан; інсектициди для рису: діазинон, фенітротіон, фенобукарб, монокротофос, бенфуракарб, бупрофезин, дінотефуран, фіпроніл, імідаклоприд, ізопрокарб, тіаклоприд, хромафенозид, тіаклоприд, дінотефуран, клотіанідин, етіпрол, флубендіамід, ринаксипір, дельтаметрин, ацетаміприд, тіаметоксам, ціазипір, спіносад, спіноторам, емамектин бензоат, циперметрин, хлорпірифос, картап, метамідофос, етофенпрокс, тріазофос, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-діфторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, карбофуран, бенфуракарб; фунгіциди для рису: тіофанат-метил, азоксистробін, карпропамід, едіфенфос, феримзон, іпробенфос, ізопротіолан, пенцикурон, пробеназол, піроквілонтрициклзол, трифлоксистробін, диклоцимет, феноксаніл, симеконазол, тіадиніл; гербіциди для бавовника: діурон, флуометурон, MSMA, оксифлуорфен, прометрин, трифлуралін, карфентразон, клетодим, флуазифоп бутил, гліфосат, норфлуразон, пендіметалін, піритіобак натрія, трифлоксисульфурон, тепралоксидим, глюфозинат, флуміоксазим, тіадіазурон; інсектициди для бавовника: ацефат, алдікарб, хлорпірифос, циперметрин, дельтаметрин, малатіон, монокротофос, абамектин, ацетаміприд, емамектин бензоат, імідаклоприд, індоксакарб, лямбда-цигалотрин, спіносад, тіодикарб, гамма-цигалотрин, спіромесіфен, піридаліл, флонікамід, флубендіамід, трифлумурон, ринакиспір, бета-цифлутрин, спіротетрамат, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, дінетофуран, флубендіамід, циазапір, спіносад, спіноторам, гамма цигалотрин, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2діфторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, тіокарб, авермектин, флонікамід, піридаліл, спіромесіфен, сульфоксафлор, профенофомс, триазофос, ендосульфан; фунгіциди для бавовника: етрідіазол, металаксил, квінотозен; гербіциди для сої: алахлор, бентазон, трифлуралін, хлоримурон-етил, хлорнсулам-метил, феноксапроп, фомесафен, флуазифоп, гліфосат, імазамікс, імазаквін, імазетапір, (S-) метолахлор, метридузин, пендиметалін, тепралоксидим, глюфозинат; інсектициди для сої: лямбда-цигалотрин, метоміл, паратіон, тіокарб, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, дінетофуран, флубендіамід, ринаксипір, циазапір, спіносад, спіноторам, емамектин бензоат, фіпроніл, етипрол, дельтаметрин, ß-цифлутрин, гамма та лямбда-цигалотрин, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-діфторетил)аміно]фуран-2(5H)он, спіротетрамат, спінодиклофен, трифлумурон, флонікамід, тіокарб, бета-цифлутрин; фунгіциди для сої: азоксистробін, ципроконазол, епоксиконазол, флутриафол, піраклостробін, тебуконазол, трифлоксистробін, протіоконазол, тетраконазол; гербіциди для цукрових буряків: хлоридазон, десмедифам, етфумезат, фенмедіфам, триаллат, клопіралід, флуазифоп, ленацил, метамітрон, квінмерак, циклоксидим, трифлусульфурон, тепралоксидим, хізалофоп; інсектициди для цукрового буряка: імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, тіаклоприд, ацетаміприд, дінетофуран, дельтаметрин, ß-цифлутрин, гамма/лямбда цигалотрин, 4-[[(6хлорпіридин-3-іл)метил](2,2-діфторетил)аміно]фуран-2(5H)-он, тефлутрин, ринакиспір, циаксипір, фіпроніл, карбофуран; гербіциди для Canola: клопіралід, диклофоп, флуазифоп, глюфозинат, гліфосат, метазахлор, трифлуралін, етаметсульфурон, квінмерак, хізалофоп, клетодим, тепралоксидим; фунгіциди для Canola: азоксистробін, карбендазим, флудіоксаніл, іпродіон, прохлораз, вінклозолін; інсектициди для Canola: карбофуран, органофосфати, піретроїди, тіаклоприд, дельтаметрин, імідаклоприд, клотіанідин, тіаметоксам, ацетаміприд, дінетофуран, ß-цифлутрин, гамма та лямбда цигалотрин, тау-флувалеріат, етипрол, спіносад, 21 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 спіноторам, флубендіамід, ринаксипір, циазапір, 4-[[(6-хлорпіридин-3-іл)метил](2,2діфторетил)аміно]фуран-2(5H)-он. Способи підвищення врожаю рослин Забезпечуються способи підвищення врожаю рослин. Способи включають введення в рослину або рослинну клітину полінуклеотиду, що включає пестицидну послідовність, розкриту в даній заявці. Як визначено в даній заявці, “врожай” рослини відноситься до якості та/або кількості біомаси, що продукується рослинами. Під “біомасою” розуміють будь-який здатний до вимірювання рослинний продукт. Підвищення біомаси продукції являє собою будь-яке поліпшення стосовно врожаю вимірюваного рослинного продукту. Підвищення врожаю рослин має декілька комерційних застосувань. Наприклад, підвищення листової біомаси рослин може підвищувати врожай листових овочів для споживання людиною. Крім того, підвищення листової біомаси може використовуватися для збільшення фармацевтичних або промислових продуктів, які одержують з рослин. Підвищення врожаю може включати статистично значуще підвищення, включаючи, але без обмеження, принаймні 1% підвищення, принаймні 3% підвищення, принаймні 5% підвищення, принаймні 10% підвищення, принаймні 20% підвищення, принаймні 30%, принаймні 50%, принаймні 70%, принаймні 100% або більше підвищення врожаю у порівнянні з рослиною, яка не експресує пестицидної послідовності. Наступні приклади пропонуються для ілюстрації, але не для обмеження даного винаходу. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА Приклад 1. Експресійна конструкція. pAX 5510 являє собою експресійний вектор, що базується на pRSF1b1 векторній системі (Invitrogen), яка містить відкриту рамку зчитування SEQ ID NO:1 (позначається в даній заявці як axmi-R1, що кодує послідовність, описану під депозитним номером GENBANK®. POA379), розміщену нижче промотора T7, так, що індукція транскрипції T7 промотора (наприклад, у BL21: DE3 штамах) приводить до акумуляції cry-R1 білка (SEQ ID NO:2, що відповідає послідовності, описаній під депозитний номером GENBANK® POA379), з розміщеною на N-кінці His міткою, у клітинах E. coli. Приклад 2. Біоаналізи стосовно західного кукурудзяного жука (WCRW) та південного кукурудзяного жука (SCRW) Яйця західного та південного кукурудзяного жука (Diabrotica virgifera та Diabrotica undecimpunctata, відповідно) (Crop Characteristics, MN) промитвали та інкубували при 25 ºC майже до вилуплення. Рідкий синтетичний корм готували так, як описано вище (патент США № 7,351,881, що є введеним у дану заявку як посилання), поміщали у 1 мл аліквоти та охолоджували у планшетах для культури тканин на 24 комірки (Corning 3527) протягом 1 години. Після затвердіння 40 мкл зразка поміщали у кожну комірку та розподіляли у кормі. Після абсорбції зразка 7,5 мкл яєць: 0,15% агарової суспензії (приблизно 25 яєць кукурудзяного жука на комірку) наносили на бічну частину кожної комірки та залишали для висихання. Після висихання планшети накривали за допомогою BREATHE-EASY® газопроникної плівки (Research Products International) та поміщали у темну ростову камеру (25 ºC, 90% відносна вологість (ВВ)). Через 24 години знімали кожну плівку та видаляли яйця, в яких було відсутнім вилуплення, знову покривали газонепроникними плівками та повертали у темну ростову камеру (25 ºC, 90% відносної вологості) ще на чотири дні. Через загальний період часу п’ять днів комах у комірках зі зразком порівнювали з контролями для цих планшетів та оцінювали на припинення росту та смертність (див. Таблицю 1 для системи підрахунку). 45 Таблиця 1 Система підрахунку, що використовується в біоаналізах стосовно WCRW та SCRW Показник 0 1 2 3 4 5 Визначення Активність відсутня Слабка неоднорідна затримка росту Неоднорідна затримка росту Однорідна затримка росту Однорідна затримка росту із смертністю (виражена як проценти) Однорідна затримка росту зі 100% смертністю Приклад 3. Стратегія мутагенезу та створення першої мутагенізованої бібліотеки Проводили перше одержання бібліотеки точкової мутації (PM бібліотека 1, PM1), націленої на 4 ділянки послідовності SEQ ID NO:2, що включає двадцять вісім (28) положень. При 22 UA 108197 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 використанні pAX5510 як зонда деякі індивідуальні положення піддавали рандомізації при використанні QUIKCHANGE® набору для сайт-направленого мутагенезу та визначали ДНК послідовності великої кількості варіантів. За допомогою аналізу ДНК послідовності об’єднували бажані варіанти, у той час, як небажані клони (такі, як клони дикого типу, подвійні мутанти та мутанти зсуву рамки) видаляли. Ідентифікували двісті дев’яносто чотири (294) унікальні варіанти з PM для подальшого аналізу. Первинний скринінг. Поєднану бібліотеку варіантів, а також pAX5510 трансформували у BL21*DE3 клітини та висаджували на середовище LB+ канаміцин (100 мкг/мл). Свіжі колонії поміщали у 8,5 мл рідкого середовища LB + канаміцин (100 мкг/мл) та вирощували у 24 блоках глибоких комірок при 37C та 250 об./хв. до досягнення O 600 нм 0,3-0,4. Додавали IPTG до одержання заключної концентрації 0,5 мM, та культури інкубували протягом додаткових 18 годин при температурі 20C. Визначали OD600 нм та збирали клітини шляхом центрифугування (10 хвилин при 4500 об./хв., 4 градуси C). Клітинні осади ресуспендували у 50 мM розчині карбонату натрію pH 10,5, 1 мM DTT при оптичній густині 10 OD 600/мл. Клітини руйнували при розбиванні кульками, та одержували розчинні екстракти після центрифугування при 4000 об./хв. протягом 15 хвилин при температурі 4C. Екстракти піддавали аналізу на активність проти WCRW та SCRW у 4-кратній повторності на кожний варіант. Через 5 днів показники токсичності для кукурудзяного жука визначали за допомогою усереднення показників з 4 повторностей. Варіанти (загальна кількість 436) піддавали скринінгу у первинному аналізі, забезпечуючи таким чином 1,5x покриття бібліотеки. Повторні аналізи та розмноження. Сорок три варіанти, які мають бал ≥3 у первиному скринінгу, піддавали повторному аналізу при використанні таких самих умов експерименту, що й у випадку первинного скринінгу. Бали, одержані в результаті первинного скринінгу та повторного аналізу, що включали бали, одержані від повторюваних ізолятів завдяки додатковій виборці, усереднювали, та віддавали перевагу 20 варіантам завдяки більш широкому розмноженню. Для розмноження 5 свіжо трансформованих колоній переносили у 135 мл середовища LB + канаміцин (100 мкг/мл) та вирощували у колбах для струшування на 1 літр при 37C та 250 об./хв. до досягнення OD 600 нм 0,3-0,4. Додавали IPTG до одержання заключної концентрації 0,5 мM, та культури інкубували протягом додаткових 18 годин при 20C. Визначали OD 600 нм та збирали клітини шляхом центрифугування (10 хвилин при 5000 об./хв., 4 градуси С). Клітинні осади ресуспендували у 50 мM карбонату натрію pH 10,5, 1 мM DTT при щільності 10 OD 600/мл. Клітини руйнували за допомогою розбивання кульками та одержували розчинні екстракти після центрифугування при 4000 об./хв. протягом15 хвилин при 4 C. AXMI-R1 варіанти у цих екстрактах піддавали кількісній оцінці на SDS-ПАГЕ, який забарвлювали за Кумассі, шляхом порівняння серійних розведень екстракту з BSA стандартом відомої концентрації. Концентрації досліджуваних AXMI-R1 варіантів були близькими та коливалися від 0,13 до 0,22 мкг/мкл. Для кількісного аналізу серійні розведення екстрактів, що містять AXMI-R1 варіант, одержували у контрольному екстракті з використанням BL21*DE3 клітин, трансформованих за допомогою pRSF1b. Інтервал розведень складав від 40 до 1,25 мкл екстракту, що містить AXMIR1 варіанти. Таким чином, концентрацію AXMI-R1 варіантів титрували, у той час, як кількість білків BL21#DE3 залишалася постійною. Сорок реплікантів на варіант та розведення оцінювали на WCRW. Визначали середній бал для кожного розведення, а також визначали EC50. AXMI-R1 варіанти розподіляли у відповідності із середнім балом біоаналізу (n=40) при використанні 40 мкл екстракту (Таблиця 2). Для порівняння, одержували 6 біологічних реплікантів AXMI-R1 дикого типу (д.т.), при цьому забезпечуються дані та середнє квадратичне відхилення. Варіанти D4F11, H9, G5, H4, D5D8 та D4A2 продемонстрували значно поліпшену активність проти WCRW. Нуклеотидна послідовність, що кодує D5D8, є представленою у SEQ ID NO:5, а амінокислотна послідовність є представленою у SEQ ID NO:6. 23 UA 108197 C2 Таблиця 2 Варіанти з поліпшеною активністюпроти WCRW Положення амінокислоти по відношенню до SEQ ID NO:2 154 160 160 160 316 316 5 10 15 Ідентифікаційний номер варіанту білка D4F11 H9 G5 H4 D5D8 D4A2 Зміна амінокислоти P154A P160I P160A P160F G316T G316Q Таким чином, не бажаючи зв’язуватися з будь-якою теорією або механізмом, можна сказати, що поліпшена активність проти WCRW можуе бути зв’язана з мутацією у трьох положеннях AXMI-R1 (Таблиця 2) .Положення 154 та 160 AXMI-R1 знаходяться у передбаченій ділянці процесингу та утворення пор, у той час як положення 316 знаходиться у передбачуваній ділянці зв’язування з рецептором (Li та ін., 1991, Nature 353: 815-821). Приклад 4. Комбінаційні варіанти: Одержували варіанти, що поєднують сприятливі мутації у положенні 316 із сприятливими мутаціями у положеннях 154 та 160 для ідентифікації комбінацій мутацій, що забезпечують кумулятивне поліпшення процесингу та впізнання рецептора. Таблиця 3 приводить результати такого аналізу; дані аналізу свідчать про те, що комбінаційні мутанти P160I; G316T (H9 + D5D8) та P160F; G316T (H4 + D5D8) забезпечують кумулятивне поліпшення стосовно активності. Нуклеотидна послідовність, яка кодує H9 + D5D8, є представленою у SEQ ID NO:7, а амінокислотна послідовність є представленою у SEQ ID NO:8. Амінокислотна послідовність для H4+D5D8 є представленою у SEQ ID NO:26. Таблиця 3a Активність комбінованих варіантів проти SCRW Бал 0 AXMI-R1 H4 H9 G5 D4F11 D5D8 D4A2 H9+D5D8 H4+D5D8 G5+D5D8 D4F11 + D5D8 H9+ D4A2 H4+ D4A2 G5+ D4A2 D4F11+ D4A2 Вектор 1 2 3 4 5 Середнє значення 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 6 12 16 13 18 13 16 2 3 14 18 10 17 8 18 0 0 8 4 7 2 7 4 15 17 6 2 9 3 12 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,2 2,4 2,2 2,35 2.1 2,35 2,2 3,05 2,85 2,3 2,1 2,4 2,15 2,6 2,1 0 24 Середнє квадратичне відхилення 0,62 0,5 0,41 0,49 0,31 0,49 0,41 0,51 0,37 0,47 0,31 0,6 0,37 0,5 0,31 0 UA 108197 C2 Таблиця 3b Активність комбінованих варіантів проти WCRW Бал 0 AXMI-R1 H4 H9 G5 D4F11 D5D8 D4A2 H9+D5D8 H4+D5D8 G5+D5D8 D4F11 + D5D8 H9+ D4A2 H4+ D4A2 G5+ D4A2 D4F11+ D4A2 Вектор 5 10 1 2 3 4 5 Середнє значення 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 32 16 18 0 37 33 40 35 40 40 40 40 39 40 34 40 7 24 21 0 0 7 0 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.93 2,18 2,00 2,13 2,00 2,00 2,00 2,00 2,03 2,00 1,85 2,00 1,18 1,60 1,54 0,0 Середнє квадратичне відхилення 0,27 0,38 0,00 0,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,16 0,00 0,36 0,00 0,39 0,50 0,51 0,00 Приклад 5. Бібліотека 2 точкових мутантів: залишки, що фланкують положення 316 Враховуючи поліпшену пестицидну активність, одержану у PM бібліотеці 1 (PM1) з мутацій у положенні 316, другу бібліотеку точкової мутації (PM бібліотека 2, PM2) отримували для положень 313, 314, 315, 317 та 318 у відповідності із послідовністю SEQ ID NO:2. Ця бібліотека мала підраховану різноманітність 61 варіант. Аналізували дев’яносто два (92) варіанти, та п’ять варіантів (R315F, R315M, R315W, Y317E, Y317N), що фланкують положення 316, продемонстрували деяке поліпшення у первинному скринінгу. Варіанти R315M та R315W розмножували та піддавали аналізу при концентраціях білка в інтервалі 125-250 мкг/мл. Ці дані свідчать про те, що зміна положення 315 може забезпечувати поліпшену активність проти CRW. Таблиця 4a Активність варіантів проти WCRW Частота повторюваності балу (0-5) WCRW pAX5510 Бал (AXMI-R1) 0 0 1 0 2 32 3 8 4 0 5 0 Середнє значення 2,20 Середнє квадратичне 0,41 відхилення L3F1 (R315M) 0 0 30 9 0 0 2,23 L3G2 (R315W) 0 0 31 9 0 0 2,23 pRSF1b (контроль) 20 0 0 0 0 0 0 0,43 0,42 0 25 UA 108197 C2 Таблиця 4b Активність варіантів проти SCRW Частота повторюваності балу (0-5) WCRW pAX5510 Бал (AXMI-R1) 0 0 1 0 2 14 3 6 4 0 5 0 Середнє значення 2,30 5 L3F1 (R315M) 0 0 2 15 3 0 3,05 L3G2 (R315W) 0 0 0 16 4 0 3,20 pRSF1b (контроль) 17 0 3 0 0 0 0,30 Приклад 6. Пермутаційна бібліотека 1. Одержували бібліотеку пермутаційного мутагенезу, націлену на положення 154, 155, 158 та 160. Цю бібліотеку одержували (бібліотека P1; P1) отримували при використанні способів олігонаправленого мутагенезу, як є відомим у галузі техніки, що приводило до одержання бібліотеки з теоретичним рівнем складності 768 варіантів. Різноманітність, введена у бібліотеку, є наступною: Таблиця 5 Положення, змінені у бібліотеці 2 Положення стосовно SEQ ID NO:2 154 155 158 160 Амінокислоти, що спостерігаються у варіанті P,A,E V,E,K R,V P,A,F,I Амінокислотні зміни у бібліотеці (P1) P,A,E,D,H,Q V,E,K,M R,V,G,L P,A,F,I,L,S,T,V 10 15 20 25 30 П’ятсот сімдесят три (573) клони піддавали аналізу у форматі 24 комірок (4 повторності на кожний), та 155 клонів було ідентифіковано для подальшого дослідження. Сімдесят три клони піддавали повторному аналізу, та на кінцевому етапі вісім клонів аналізували після розмноження (як описано в даній заявці). Приклад 7. Смертність стосовно WCRW та SCRW для варіантів Декілька варіантів з P1, що показали бажану активність, відбирали для експериментів по розмноженню так, як описано в даній заявці. Одержаний білок аналізували при концентраціях білка в інтервалі 125-250 мкг/мл. Декілька варіантів показали здатність знищувати WCRW та SCRW у цих аналізах, у той час як контрольний білок AXMI-R1 д.т. не продемонстрував смертності ні по відношенню до WCRW, ні до SCRW у цих аналізах. У першому наборі експериментів яйця CRW відкладали у комірки, додавали зразки та через 5 днів підраховували пошкодження від CRW та % смертності CRW (якщо це є прийнятним) (Таблиця 6). Середні показники та середнє значення смертності базувалися на 40 повторностях для WCRW та 20 повторностях для SCRW. Дані свідчать про те, що варіант PermutP3c6 та PermutP3c7 давали 8-9% смертності проти WCRW та 60-80% смертності проти SCRW, у той час як AXMI-R1 д.т. не продемонстрував смертності (Таблиця 7). Нуклеотидна послідовністьі, що кодує 3c7 варіант, є представленою у SEQ ID NO:12, а амінокислотна послідовність є представленою у SEQ ID NO:13. Аналіз білків за допомогою SDS–ПАГЕ показав, що рівні експресії AXMI-R1 д.т., 3c6 та 3c7 не відрізняються між собою та є майже ідентичними. 26 UA 108197 C2 Таблиця 6 Активність варіантів стосовно кукурудзяного жука Показник: західний кукурудзяний жук Середній показник (n=40) Векторний контроль AXMI-R1 3c6 3c7 0.00 2,50 3,03 3,03 Показник: південний кукурудзяний жук Середнє квадраСередній Середнє квадратичне відхилепоказник (n=20) тичне відхилення ння 0.00 0.25 0.44 0,51 2,65 0,49 0,62 4,70 0,57 0,62 4,10 0,85 Таблиця 7 Смертність, спричинена варіантами, по відношенню до кукурудзяного жука Смертність: західний кукурудзяний жук Смертність: південний кукурудзяний жук Середнє Процент квадратичне смертності (n=20) відхилення Процент смертності (n=40) Векторний контроль AXMI-R1 3c6 3c7 5 Середнє квадратичне відхилення 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8,75 7,75 0,00 18,72 17,02 0,00 86,50 59,00 0,00 29,07 38,78 У подальшому експерименті яйця CRW поміщали у комірки, додавали зразки та через 1 день яйця, з яких не вивелися личинки, видаляли. Цей метод дає більш синхронізовану популяцію рано виведений личинок CRW, які нападали на зразок протягом 1-2 днів застосування зразка. За цих умов варіант 3c7 досягав 44% смертності стосовно WCRW та 86% смертності стосовно SCRW (Таблиця 8). Таблиця 8 Смертність варіанту PermutP3c7 у модифікованому аналізі кукурудзяного жука Смертність: західний кукурудзяний жук Смертність: південний кукурудзяний жук Середнє Процент смертності квадратичне (n=20) відхилення Процент смертності (n=40) Векторний контроль 3c7 Середнє квадратичне відхилення 0,00 0,00 0,00 0,00 44,00 26,44 86,50 13,09 10 Третій варіант 3a11 (V155K; R158G; P160T), також індукував смертність проти WCRW у порівнянні із AXMI-R1 контролями. У цьому експерименті CRW яйця поміщали у комірки, додавали зразки та через 1 день яйця, з яких не вивелися личинки, видаляли. Спостерігали смертність 36% у кукурудзяних жуків, яких піддавали впливу 3a11 у цьому аналізі (Таблиця 9). 15 27 UA 108197 C2 Таблиця 9 Активність варіанту 3a11 проти кукурудзяного жука Західний кукурудзяний жук Середній показник (n=40) Середнє квадратичне відхилення 0,05 0,22 2,45 0,71 3,8 0,69 Векторний контроль AXMI-R1 3a11 Таблиця 10 Підсумовування амінокислотних змін певних варіантів Ід. номер білка 3c7 3c6 3a11 5 10 15 Амінокислотні зміни у порівнянні із SEQ ID NO:2 P154A; V155K; P160V P154Q; V155E; P160L V155K; R158G; P160T Приклад 8. Комбінаторний варіант. Одержували варіант, що поєднує 3c7 (P154A, V155K, P160V) та варіант D5D8 (G316T) з бібліотеки PM1, та піддавали його аналізу на активність проти CRW, було продемонстровано смертність стосовно WCRW та SCRW при концентраціях білка в інтервалі 125-250 мкг/мл. Нуклеотидна послідовність, що кодує 3c7 + D5D8 варіант, є представленою у SEQ ID NO:9, а амінокислотна послідовність є представленою у SEQ ID NO:10. Приклад 9. Бібліотека PM2 Одержували друге покоління бібліотеки точкової мутації (PM2) для поєднання змін у положеннях 482 та 483 зі змінами у положеннях 315 та 316. Ця бібліотека містить 756 варіантів. Збирали більше 1100 клонів та піддавали аналізу на активність. Варіант ‘1g8’ (G316E, Q482L, G483K) та ‘2b11’ (G316A, Q482L, G483K) виявляли як такий, що демонструє поліпшену активність проти кукурудзяного жука у порівнянні із AXMI-R1. Варіант 1g8 показав у більшості випадків найкращу активність у порівнянні із 3c7. Нуклеотидні послідовності, що кодують 1g8 варіант, є представленими у SEQ ID NO:14, а амінокислотна послідовність є представленою у SEQ ID NO:15. Таблиця 11 Процент комірок з 50% або більшою смертністю WCRW 0 56 100 6 AXMI-R1 (pAX5510) 3c7 1g8 Векторний контроль SCRW 0 13 50 0 20 25 Приклад 10. Бібліотека P3 Одержували бібліотеку (бібліотека P3) варіантів у положеннях, що відповідають положенням від 481 до 486 AXMI-R1 (позначаються в даній заявці як ‘Петля 3’). Індивідуальні клони аналізували для оцінки вкладу кожного залишку у пестицидну активність. Залишки 482 та 483 були виявлені як такі, які впливають на пестицидну активність, оскільки варіанти у цих залишках демонстрували поліпшену активність стосовно кукурудзяного жука (Таблиця 12). 28