Композиція та спосіб для діагностики і лікування пухлини

Реферат: Винахід належить до виділеного антитіла або його функціонального фрагмента, яке специфічно зв'язується з ТАТ211, кон'югату, що містить зазначене антитіло, композиції для застосування у діагностиці та лікуванні пухлин у ссавців. UA 109423 C2 (12) UA 109423 C2 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Дана заявка є непопередньою заявкою, поданою відповідно до 37 C.F.R. § 1.53(b)(1), і по ній заявляється пріоритет відповідно до 35 U.S.C. § 119(е) попередньої заявки США № 61/265262, поданої 30 листопада 2009 р., і попередньої заявки США № 61/384467, поданої 20 вересня 2010 р., зміст яких приведений в даному описі як посилання в повному об'ємі. ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний винахід стосується композицій, які можуть використовуватися для діагностики і лікування пухлини у ссавців, і способів застосування цих композицій для тих же цілей. ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Злоякісні пухлини (ракові захворювання) є другою ведучою причиною смерті в Сполучених Штатах, після захворювань серця (Boring et al., CA Cancel J. Clin. 43:7 (1993)). Рак характеризується збільшенням кількості патологічних або неопластичних клітин, що є похідними нормальної тканини, які проліферують з утворенням пухлинної маси, інвазією сусідніх тканин цими неопластичними пухлинними клітинами, і продукцією злоякісних клітин, які поступово поширюються через кров або лімфатичну систему до регіональних лімфатичних вузлів і до віддалених ділянок за допомогою процесу, що називається метастазуванням. При раковому стані, клітина проліферує в умовах, при яких нормальні клітини не змогли б рости. Рак існує в широкій різноманітності форм, які відрізняються різними ступенями інвазивності і агресивності. У спробах виявити ефективні клітинні мішені для діагностики і терапії раку, дослідники знаходять шляхи для ідентифікації трансмембранних або інших зв'язаних з мембраною поліпептидів, які специфічно експресуються на поверхні одного або більше конкретних типів ракових клітин в порівнянні з однією або більше нормальних неракових клітин. Часто, такі мембранно-зв'язані поліпептиди більш широко експресуються на поверхні ракових клітин в порівнянні з поверхнею неракових клітин. Ідентифікація таких пухлино-зв'язаних антигенних поліпептидів клітинної поверхні забезпечує здатність специфічно мітити ракові клітини для руйнування за допомогою терапій, основаних на антитілах. У цьому відношенні, зазначається, що терапія на основі антитіл виявилася дуже ефективною при лікуванні деяких видів раків. Наприклад, HERCEPTIN® і RITUXAN® (обидва від Genentech Inc., South San Francisco, California) являють собою антитіла, які успішно використовувалися для лікування раку молочної залози неХоджкінської лімфоми, відповідно. Більш конкретно, HERCEPTIN® являє собою рекомбінантні ДНК-похідні гуманізовані моноклональні антитіла, які селективно зв'язуються з позаклітинним доменом прото-онкогена рецептора 2 фактор росту епідермісу (HER2) людини. Надекспресія білка HER2 спостерігається у 25-30 % з первинних раків молочної залози. RITUXAN® являє собою генно-інженерні химерні моноклональні антитіла миші/людини, направлені проти антигена CD20, виявленого на поверхні нормальних і малігнізованих В лімфоцитів. Обидва види цих антитіл рекомбінантно продукуються в клітинах CHO. Незважаючи на вказані вище досягнення в терапії раку молочної залози, існує величезна потреба в додаткових діагностичних і терапевтичних засобах, здатних до виявлення присутності пухлини у ссавця і до ефективного інгібування зростання неопластичних клітин, відповідно. Відповідно, метою даного винаходу є ідентифікація клітинних мембранно-зв'язаних поліпептидів, які більш поширено експресуються у одного або більше типів ракових клітин в порівнянні з нормальними клітинами або у інших відмінних ракових клітин і застосування цих поліпептидів, і кодуючих їх нуклеїнових кислот, для отримання композицій речовин, застосовних в терапевтичному лікуванні і діагностичному виявленні раку у ссавців. КОРОТКИЙ ЗМІСТ СУТІ ВИНАХОДУ У даному описі заявники уперше описують ідентифікацію клітинних поліпептидів (і кодуючих їх нуклеїнових кислот або їх фрагментів), які експресуються в більшій мірі на поверхні одного або більше типів ракових клітин в порівнянні з поверхнею одного або більше типів нормальних неракових клітин. Ці поліпептиди в даному описі називаються пухлино-зв'язаними антигенними поліпептидами-мішенями ("поліпептидами TAT") і, передбачається, що вони можуть служити як ефективні мішені для лікування і діагностики раку ссавців. Відповідно, в одному з варіантів здійснення даного винаходу, винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує пухлино-зв'язаний антиген поліпептид-мішень або його фрагмент ("поліпептид TAT"). У деяких аспектах, виділена молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 % ідентична послідовності нуклеїнової кислоти, альтернативно щонайменше приблизно на 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентична послідовності нуклеїнової кислоти, по відношенню до (a) молекули ДНК, що кодує непроцесований поліпептид ТАТ, що має амінокислотну послідовність, як описано в даній 1 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заявці, амінокислотну послідовність поліпептиду ТАТ без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, позаклітинний домен трансмембранного поліпептиду ТАТ, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, або будь-який інший конкретно визначений фрагмент амінокислотної послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, або (b) комплемент молекули ДНК (a). У інших аспектах, виділена молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 % ідентична послідовності нуклеїнової кислоти, альтернативно щонайменше приблизно на 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентична послідовності нуклеїнової кислоти по відношенню до (a) молекули ДНК, що містить кодуючу послідовність кДНК непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, кодуючу послідовність поліпептиду ТАТ без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, кодуючу послідовність позаклітинного домену трансмембранного поліпептиду ТАТ, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, або кодуючу послідовність будь-якого іншого конкретно визначеного фрагмента амінокислотної послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, або (b) комплемент молекули ДНК (a). У ще одному з аспектів винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ТАТ, який має або делецію трансмембранного домену, або інактивацію трансмембранного домену, або є комплементарною такій кодуючій нуклеотидній послідовності, де трансмембранні домен(и) таких поліпептидів описані в даній заявці. Отже, розглядаються розчинні позаклітинні домени описаних в даній заявці поліпептидів ТАТ. У інших аспектах даний винахід стосується виділених молекул нуклеїнових кислот, які гібридизуються з (a) нуклеотидною послідовністю, яка кодує поліпептид ТАТ, що має непроцесовану амінокислотну послідовність, як описано в даній заявці, амінокислотну послідовність поліпептиду ТАТ без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, позаклітинний домен трансмембранного поліпептиду ТАТ, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, або будь-який інший конкретно визначений фрагмент амінокислотної послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, або (b) комплемент нуклеотидної послідовності (a). У цьому відношенні в одному з варіантів здійснення даний винахід стосується послідовності, яка кодує фрагменти непроцесованого поліпептиду ТАТ, або його комплементу, як описано в даній заявці, що може знайти застосування як, наприклад, зонди гібридизації, що використовуються як, наприклад, діагностичні зонди, праймери ПЛР, антисмислові олігонуклеотидні зонди, або для кодування фрагментів непроцесованого поліпептиду ТАТ, які можуть необов'язково кодувати поліпептид, що містить ділянку зв'язування для антитіла проти поліпептиду ТАТ. Такі фрагменти нуклеїнової кислоти мають звичайно щонайменше приблизно 5 нуклеотидів по довжині, альтернативно щонайменше приблизно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 або 1000 нуклеотидів по довжині, де в даному контексті термін "приблизно" означає довжину нуклеотидної послідовності, що указується плюс або мінус 10 % від цієї вказаної довжини. Крім того, такі фрагменти нуклеїнової кислоти звичайно складаються з послідовних нуклеотидів, похідних від послідовності, яка кодує непроцесований поліпептидТАТ або його комплемент. Зазначають, що нові фрагменти нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид ТАТ або його комплемент, можуть бути визначені рутинним чином за допомогою вирівнювання нуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид ТАТ з іншими відомими нуклеотидними послідовностями з використанням будь-якої з ряду добре відомих програм вирівнювання послідовностей і визначення того, які фрагмент(и) нуклеотидної послідовності, що кодують поліпептид ТАТ, або його комплемент, є новими. Всі з таких фрагментів нуклеотидних послідовностей, які кодують поліпептид ТАТ, або їх комплемент, розглядаються в цьому документі. Також розглядаються фрагменти поліпептиду ТАТ, що кодуються цими нуклеотидними фрагментами молекули, переважно, такі фрагменти поліпептиду ТАТ, які містять ділянку зв'язування для антитіла проти ТАТ. У ще одному варіанті здійснення винахід стосується виділених поліпептидів ТАТ, які кодуються будь-якою з послідовностей виділеної нуклеїнової кислоти, ідентифікованих в даній заявці вище. 2 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У певному аспекті винахід стосується виділеного поліпептиду ТАТ, що містить амінокислотну послідовність, яка щонайменше приблизно на 80 % ідентична амінокислотній послідовності, альтернативно щонайменше приблизно 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентична амінокислотній послідовності, по відношенню до поліпептиду ТАТ, що має непроцесовану амінокислотну послідовність, як описано в даній заявці, амінокислотній послідовності поліпептиду ТАТ без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, позаклітинному домену трансмембранного поліпептидного ТАТ білка, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, амінокислотній послідовності, що кодується будь-якою з послідовностей нуклеїнової кислоти, описаної в даній заявці, або будь-якого іншого конкретно визначеного фрагмента амінокислотної послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці. У іншому додатковому аспекті, винахід стосується виділеного поліпептиду ТАТ, що містить амінокислотну послідовність, яка кодується нуклеотидною послідовністю, яка гібридизується з комплементом молекули ДНК, що кодує (a) поліпептид ТАТ, що має непроцесовану амінокислотну послідовність, як описано в даній заявці, (b) амінокислотну послідовність поліпептиду ТАТ без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, (с) позаклітинний домен трансмембранного поліпептидного ТАТ білка, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, (d) амінокислотну послідовність, що кодується будь-якою з послідовностей нуклеїнової кислоти, розкритих в даній заявці, або (е) будь-який інший конкретно визначений фрагмент амінокислотної послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці. У конкретному аспекті винахід стосується виділеного поліпептиду ТАТ без N-кінцевої сигнальної послідовності і/або без ініціюючого метіоніну, і який кодується нуклеотидною послідовністю, яка кодує таку амінокислотну послідовність, як описано в даній заявці вище. Способи для їх отримання також описані в даній заявці, де способи включають культивування клітини-хазяя, що містить вектор, який містить відповідну кодуючу молекулу нуклеїнової кислоти при умовах, відповідних для експресії поліпептиду ТАТ і виділення поліпептиду ТАТ з клітинної культури. У іншому аспекті винахід стосується виділеного поліпептиду ТАТ, який має або делецію трансмембранного домену, або інактивацію трансмембранного домену. Способи для їх отримання також описані в даній заявці, де ці способи включають культивування клітини-хазяя, що містить вектор, який містить відповідну кодуючу молекулу нуклеїнової кислоти при умовах, відповідних для експресії поліпептиду ТАТ і виділення поліпептиду ТАТ з клітинної культури. У інших варіантах здійснення даного винаходу винахід стосується векторів, які містять ДНК, які кодують будь-які з описаних в даній заявці поліпептидів. Також винахід стосується клітинхазяїв, що містять будь-який такий вектор. За допомогою прикладу, клітини-хазяї можуть являти собою CHO клітини, Е. coli клітини або дріжджові клітини. Додатково наданий спосіб отримання будь-яких описаних в даній заявці поліпептидів, який включає культивування клітин-хазяїв при умовах, відповідних для експресії бажаного поліпептиду і виділення бажаного поліпептиду з клітинної культури. У інших варіантах здійснення винахід стосується виділених химерних поліпептидів, які містять будь-який з описаних поліпептидів ТАТ, рекомбінованих з гетерологічним (не-ТАТ) поліпептидом. Приклади таких химерних молекул містять будь-який з описаних в даній заявці поліпептидів ТАТ, рекомбінованих з гетерологічним поліпептидом, таким як, наприклад, послідовність епітопної мітки або Fc-область імуноглобуліну. У ще одному варіанті здійснення винахід стосується антитіла, яке зв'язується, переважно, конкретно, з будь-яким з вказаних вище або описаних нижче поліпептидів. Необов'язково, антитіло являє собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, химерне антитіло, гуманізоване антитіло, антитіло з єдиним ланцюгом або антитіло, яке конкурентно інгібує зв'язування антитіла проти поліпептиду ТАТ з його відповідним антигенним епітопом. Антитіла за даним винаходом можуть необов'язково бути кон'юговані з агентом, який інгібує ріст, або цитотоксичним агентом, таким як токсин, що включає, наприклад, майтансиноїд або каліхеаміцин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолітичний фермент або т. п. Антитіла за даним винаходом можуть необов'язково продукуватися в CHO клітинах або бактерійних клітинах і, переважно, інгібують ріст або проліферацію або індукують смерть клітини, з якою вони зв'язуються. Для діагностичних цілей, антитіла за даним винаходом можуть бути помічені для виявлення, приєднані до твердого носія, або т. п. У інших варіантах здійснення даного винаходу винахід стосується векторів, які містять ДНК, які кодують будь-яке з описаних в даній заявці антитіл. Також винахід стосується клітин-хазяїв, 3 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що містять будь-який такий вектор. Як приклад, клітини-хазяї можуть являти собою CHO клітини, клітини Е. coli або дріжджові клітини. Додатково, винахід стосується способу отримання будь-якого з описаних в даній заявці антитіл, який включає культивування клітин-хазяїв при умовах, відповідних для експресії бажаного антитіла і виділення бажаного антитіла з клітинної культури. У іншому додатковому варіанті здійснення винахід стосується композиції, що містить поліпептид ТАТ, як описано в даній заявці, химерний поліпептид ТАТ, як описано в даній заявці, або антитіло проти ТАТ, як описано в даній заявці, в комбінації з носієм. Необов'язково, носій являє собою фармацевтично прийнятний носій. У ще одному іншому варіанті здійснення винахід стосується виробу, що містить контейнер і композицію речовин, що міститься всередині контейнера, де композиція речовин може містити поліпептид ТАТ, як описано в даній заявці, химерний поліпептид ТАТ, як описано в даній заявці, або антитіло проти ТАТ, як описано в даній заявці. Виріб може додатково необов'язково містити етикетку, прикріплену до контейнера, або листок-вкладиш, включений в контейнер, який стосується застосування композиції речовин для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення пухлини. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується застосування поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, химерного поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, або антитіла проти поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, для отримання лікарського засобу, що використовується для лікування стану, який є сприйнятливим до поліпептиду ТАТ, химерного поліпептиду ТАТ, або антитіла проти поліпептиду ТАТ. Інші варіанти здійснення даного винаходу стосуються будь-якого виділеного антитіла, що містить одну або більше з послідовностей CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 або CDR-H3, розкритих в даній заявці, або будь-яке антитіло, яке зв'язується з тим же самим епітопом як будь-яке таке антитіло. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу інгібування росту клітини, яка експресує поліпептид ТАТ, де спосіб передбачає приведення в контакт клітини з антитілом, яке зв'язується з поліпептидом ТАТ, і, де зв'язування антитіла з поліпептидом ТАТ викликає інгібування росту клітини, яка експресує поліпептид ТАТ. У переважних варіантах здійснення клітина являє собою ракову клітину, і зв'язування антитіла з поліпептидом ТАТ викликає смерть клітини, яка експресує поліпептид ТАТ. Необов'язково, антитіло являє собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло з єдиним ланцюгом. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково бути кон'юговані з агентом, який інгібує ріст, або цитотоксичним агентом, таким як токсин, що включає, наприклад, майтансиноїд або каліхеаміцин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолітичний фермент, або т. п. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково продукуватися в CHO клітинах або бактерійних клітинах. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу терапевтичного лікування ссавця, що має ракову пухлину, що містить клітини, які експресують поліпептид ТАТ, де спосіб включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості антитіла, яке зв'язується з поліпептидом ТАТ, за допомогою чого приводячи в результаті до ефективного терапевтичного лікування пухлини. Необов'язково, антитіло являє собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло з єдиним ланцюгом. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково бути кон'юговані з агентом, який інгібує ріст, або цитотоксичним агентом, таким як токсин, що включає, наприклад, майтансиноїд або каліхеаміцин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолітичний фермент, або т. п. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково продукуватися в CHO клітинах або бактерійних клітинах. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується способу визначення присутності поліпептиду ТАТ в зразку, що підозрюється на вміст поліпептиду ТАТ, де спосіб включає вплив зразка на антитіло, яке зв'язується з поліпептидом ТАТ, і визначення зв'язування антитіла з поліпептидом ТАТ в зразку, де присутність такого зв'язування вказує на присутність поліпептиду ТАТ в зразку. Необов'язково, зразок може містити клітини (які можуть бути раковими клітинами), в яких передбачають експресію поліпептиду ТАТ. Антитіло, що використовується в способі, може необов'язково бути міченим для виявлення, приєднане до твердого носія, або т. п. Додатковий варіант здійснення даного винаходу стосується способу діагностики присутності пухлини у ссавця, де спосіб включає виявлення рівня експресії гена, що кодує поліпептид ТАТ (a) в тестованому зразку клітин тканини, отриманих від вказаного ссавця, і (b) в контрольному зразку відомих нормальних неракових клітин такого ж тканинного походження або типу, де більш високий рівень експресії поліпептиду ТАТ в тестованому зразку, в порівнянні з 4 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контрольним зразком, вказує на присутність пухлини у ссавця, від якого був отриманий тестований зразок. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу діагностики присутності пухлини у ссавця, де спосіб передбачає (a) приведення в контакт тестованого зразка, що містить тканинні клітини, отримані від ссавця, з антитілом, яке зв'язується з поліпептидом ТАТ і (b) виявлення утворення комплексу між антитілом і поліпептидом ТАТ в тестованому зразку, де утворення комплексу вказує на присутність пухлини у ссавця. Необов'язково, використовуване антитіло є міченим для виявлення, приєднане до твердого носія, або т. п., і/або тестований зразок клітин тканини отримують від індивідуума, що підозрюється, як такий, що має ракову пухлину. У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується способу лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення, пов'язаного зі зміненою, переважно, збільшеною, експресією або активністю поліпептиду ТАТ, спосіб, що включає введення суб'єкту, потребуючому такого лікування, ефективної кількості антагоніста поліпептиду ТАТ. Переважно, клітинне проліферативне порушення є раком, а антагоніст поліпептиду ТАТ являє собою антитіло проти ТАТ поліпептиду або антисмисловий олігонуклеотид. Ефективне лікування або профілактика клітинного проліферативного порушення може бути результатом безпосереднього знищення або інгібування росту клітин, які експресують поліпептид ТАТ або за допомогою антагонізації клітинного росту, потенціюючого активність поліпептиду ТАТ. У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується способу зв'язування антитіла з клітиною, яка експресує поліпептид ТАТ, де спосіб передбачає приведення в контакт клітини, яка експресує поліпептид ТАТ з вказаним антитілом при умовах, які є відповідними для зв'язування антитіла з вказаним поліпептидом ТАТ і забезпечення зв'язування між ними. У переважних варіантах здійснення, антитіло мітять молекулою або сполукою, які використовуються для якісного і/або кількісного визначення розташування і/або кількості зв'язування антитіла з клітиною. Інші варіанти здійснення даного винаходу стосуються застосування поліпептиду ТАТ, нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид ТАТ, або вектора або клітини-хазяя, що містить цю нуклеїнову кислоту, або антитіла проти поліпептиду ТАТ при отриманні лікарського засобу, застосовного для (i) терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку або пухлини, або (ii) терапевтичного лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується способу інгібування росту ракової клітини, де ріст вказаної ракової клітини є щонайменше частково залежним від потенціюючих ріст ефекту(ів) поліпептиду ТАТ (де поліпептид ТАТ може експресуватися або самою раковою клітиною, або клітиною, яка продукує поліпептид(и), які мають потенціюючий ріст ефект на ракові клітини), де спосіб включає приведення в контакт поліпептиду ТАТ з антитілом, яке зв'язується з поліпептидом ТАТ, за допомогою чого антагонізуючи рістпотенціюючу активність поліпептиду ТАТ і, в свою чергу, інгібуючи ріст ракової клітини. Переважно, ріст ракової клітини раку повністю інгібується. Навіть більш переважно, зв'язування антитіла з поліпептидом ТАТ індукує смерть ракової клітини. Необов'язково, антитіло являє собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло з єдиним ланцюгом. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково бути кон'юговані з агентом, який інгібує ріст, або цитотоксичним агентом, таким як токсин, що включає, наприклад, майтансиноїд або каліхеаміцин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолітичний фермент, або т. п. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково продукуватися в CHO клітинах або бактерійних клітинах. У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується способу терапевтичного лікування пухлини у ссавця, де ріст вказаної пухлини є щонайменше частково залежним від ріст-потенціюючих ефекту(ів) поліпептиду ТАТ, де спосіб включає введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості антитіла, який зв'язується з поліпептидом ТАТ, за допомогою чого антагонізуючи ріст-потенціюючу активність вказаного поліпептиду ТАТ і приводячи в результаті до ефективного терапевтичного лікування пухлини. Необов'язково, антитіло являє собою моноклональне антитіло, фрагмент антитіла, химерне антитіло, гуманізоване антитіло або антитіло з єдиним ланцюгом. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково бути кон'юговані з агентом, який інгібує ріст, або цитотоксичним агентом, таким як токсин, що включає, наприклад, майтансиноїд або каліхеаміцин, антибіотик, радіоактивний ізотоп, нуклеолітичний фермент, або т. п. Антитіла, що використовуються в способах даного винаходу, можуть необов'язково продукуватися в CHO клітинах або бактерійних клітинах. 5 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У ще додаткових варіантах здійснення винахід стосується наступного набору потенційних пунктів формули винаходу для даної або майбутньої заявок: 1. Виділена нуклеїнова кислота, що має нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на 80 % ідентична послідовності нуклеїнової кислоти по відношенню до (a) молекули ДНК, яка кодує амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) молекулі ДНК, що кодує амінокислотну послідовність, показаній як SEQ ID NO:2, в якій відсутній його зв'язаний сигнальний пептид, (с) молекулі ДНК, що кодує позаклітинний домен поліпептиду, показаній як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) молекулі ДНК, що кодує позаклітинний домен поліпептиду, показаній як SEQ ID NO:2, в якій відсутній його зв'язаний сигнальний пептид, (е) нуклеотидної послідовності, показана як SEQ ID NO:1, (f) непроцесованій кодуючій послідовності нуклеотидної послідовності, показаній як SEQ ID NO:1, або (g) комплементу (a), (b), (с), (d), (е) або (f). 2. Виділена нуклеїнова кислота, що має (a) нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) нуклеотидну послідовність, яка кодує амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, в якій відсутній його зв'язаний сигнальний пептид, (с) нуклеотидну послідовність, яка кодує позаклітинний домен поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) нуклеотидну послідовність, яка кодує позаклітинний домен поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, в якому відсутній його зв'язаний сигнальний пептид, (е) нуклеотидну послідовність, показану як SEQ ID NO:1, (f) непроцесовану кодуючу область нуклеотидної послідовності, показану як SEQ ID NO:1, або (g) комплемент (a), (b), (с), (d), (е) або (f). 3. Виділена нуклеїнова кислота, яка гібридизується з (a) нуклеїновою кислотою, яка кодує амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) нуклеїновою кислотою, яка кодує амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) нуклеїновою кислотою, яка кодує позаклітинний домен поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) нуклеїновою кислотою, яка кодує позаклітинний домен поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, (f) непроцесованою кодуючою областю нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, або (g) комплементом (a), (b), (с), (d), (е) або (f). 4. Нуклеїнова кислота за п. 3, де гібридизація відбувається при суворих умовах. 5. Нуклеїнова кислота за п. 3, яка містить щонайменше приблизно 5 нуклеотидів по довжині. 6. Експресійний вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п. 1, 2 або 3. 7. Експресійний вектор за п. 6, де вказана нуклеїнова кислота є функціонально зв'язаною з контрольними послідовностями, розпізнаваними клітиною-хазяєм, трансформованою вектором. 8. Клітина-хазяїн, яка містить експресійний вектор за п. 7. 9. Клітина-хазяїн за п. 8, яка являє собою CHO клітину, клітину Е. coli або дріжджову клітину. 10. Спосіб продукування поліпептиду, що включає культивування клітини-хазяя за п. 8 при умовах, відповідних для експресії вказаного поліпептиду і виділення вказаного поліпептиду з клітинної культури. 11. Виділений поліпептид, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності по відношенню до (a) поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, (b) поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, в якому відсутній його зв'язаний сигнальний пептид, (с) позаклітинного домену поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинного домену поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, в якому відсутній його зв'язаний сигнальний пептид, (е) поліпептиду, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептиду, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 12. Виділений поліпептид, що має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 13. Химерний поліпептид, що містить поліпептид за п. 11 або 12, рекомбінований з гетерологічним поліпептидом. 6 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 14. Химерний поліпептид за п. 13, де вказаний гетерологічний поліпептид являє собою послідовність епітопної мітки або Fc-область імуноглобуліну. 15. Виділене антитіло, яке зв'язується з поліпептидом, що має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % ідентична амінокислотній послідовності по відношенню до (a) поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, (b) поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинного домену поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинного домену поліпептиду, показаному як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептиду, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептиду, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаної як SEQ ID NO:1. 16. Виділене антитіло, яке зв'язується з поліпептидом, що має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 17. Антитіло за п. 15 або 16, яке являє собою моноклональне антитіло. 18. Антитіло за п. 15 або 16, яке являє собою фрагмент антитіла. 19. Антитіло за п. 15 або 16, яке являє собою химерне або гуманізоване антитіло. 20. Антитіло за п. 15 або 16, яке є кон'югованим з агентом, який інгібує ріст. 21. Антитіло за п. 15 або 16, яке є кон'югованим з цитотоксичним агентом. 22. Антитіло за п. 21, де цитотоксичний агент вибирають з групи, яка складається з токсинів, антибіотиків, радіоактивних ізотопів і нуклеолітичних ферментів. 23. Антитіло за п. 21, де цитотоксичний агент являє собою токсин. 24. Антитіло за п. 23, де токсин вибирають з групи, яка складається з майтансиноїду і каліхеаміцин. 25. Антитіло за п. 23, де токсин являє собою майтансиноїд. 26. Антитіло за п. 15 або 16, яке продукується в бактеріях. 27. Антитіло за п. 15 або 16, яке продукується в CHO клітинах. 28. Антитіло за п. 15 або 16, яке індукує смерть клітини, з якою воно зв'язується. 29. Антитіло за п. 15 або 16, яке мітять для виявлення. 30. Виділена нуклеїнова кислота, що має нуклеотидну послідовність, яка кодує антитіло за п. 15 або 16. 31. Експресійний вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п. 30, функціонально зв'язану з контрольними послідовностями розпізнаваними клітинами-хазяями, трансформованими вектором. 32. Клітина-хазяїн, яка містить експресійний вектор за п. 31. 33. Клітина-хазяїн за п. 32, яка являє собою СНО клітину, клітину Е. coli або дріжджову клітину. 34. Спосіб продукування антитіла, що включає культивування клітини-хазяя за п. 32 при умовах, відповідних для експресії вказаного антитіла і виділення вказаного антитіла з клітинної культури. 35. Композиція речовин, яка містить (a) поліпептид за п. 11, (b) поліпептид за п. 12, (с) химерний поліпептид за п. 13, (d) антитіло за п. 15 або (е) антитіло за п. 16 в комбінації з носієм. 36. Композиція речовин за п. 35, де вказаний носій являє собою фармацевтично прийнятний носій. 37. Виріб, що містить (a) контейнер; і (b) композицію речовин за п. 35, що міститься всередині вказаного контейнера. 38. Виріб за п. 37, що додатково містить етикетку, прикріплену до вказаного контейнера, або листок-вкладиш, включений з вказаним контейнером, що стосується застосування вказаної композиції речовин для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 39. Спосіб інгібування росту клітини, яка експресує білок, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (a) поліпептидом, показаним, як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його 7 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, вказаний спосіб, що включає приведення в контакт вказаної клітини з антитілом, яке зв'язується з вказаним білком, зв'язування вказаного антитіла з вказаним білком таким чином, викликаючи інгібування росту вказаної клітини. 40. Спосіб за п. 39, де вказане антитіло являє собою моноклональне антитіло. 41. Спосіб за п. 39, де вказане антитіло являє собою фрагмент антитіла. 42. Спосіб за п. 39, де вказане антитіло являє собою химерне або гуманізоване антитіло. 43. Спосіб за п. 39, де вказане антитіло є кон'югованим з агентом, який інгібує ріст. 44. Спосіб за п. 39, де вказане антитіло є кон'югованим з цитотоксичним агентом. 45. Спосіб за п. 44, де вказаний цитотоксичний агент вибирають з групи, яка складається з токсинів, антибіотиків, радіоактивних ізотопів і нуклеолітичних ферментів. 46. Спосіб за п. 44, де цитотоксичний агент являє собою токсин. 47. Спосіб за п. 46, де токсин вибирають з групи, яка складається з майтансиноїду і каліхеаміцину. 48. Спосіб за п. 46, де токсин являє собою майтансиноїд. 49. Спосіб за п. 39, де вказане антитіло продукується в бактеріях 50. Спосіб за п. 39, де вказане антитіло продукується в СНО клітинах. 51. Спосіб за п. 39, де вказана клітина являє собою ракову клітину. 52. Спосіб за п. 51, де вказана ракова клітина додатково піддається променевій терапії або впливу хіміотерапевтичного агента. 53. Спосіб за п. 51, де вказану ракову клітину вибирають з групи, яка складається з клітини раку молочної залози, клітини колоректального раку, клітини раку легень, клітини раку яєчника, клітини раку центральної нервової системи, клітини раку печінки, клітини раку сечового міхура, клітини раку підшлункової залози, клітини раку шийки матки, клітини меланоми і лейкемічної клітини. 54. Спосіб за п. 51, де вказаний білок в більшій мірі експресується вказаними раковими клітинами в порівнянні з нормальною клітиною такого ж тканинного походження. 55. Спосіб за п. 39, який викликає смерть вказаної клітини. 56. Спосіб за п. 39, де вказаний білок має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 57. Спосіб терапевтичного лікування ссавця, що має ракову пухлину, яка містить клітини, які експресують білок, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (a) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаного як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1; або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, вказаний спосіб, що включає введення вказаному ссавцеві терапевтично ефективної кількості антитіла, який зв'язується з вказаним білком, за допомогою чого ефективно виліковуючи вказаний ссавця. 58. Спосіб за п. 57, де вказане антитіло являє собою моноклональне антитіло. 59. Спосіб за п. 57, де вказане антитіло являє собою фрагмент антитіла. 60. Спосіб за п. 57, де вказане антитіло являє собою химерне або гуманізоване антитіло. 61. Спосіб за п. 57, де вказане антитіло є кон'югованим з агентом, який інгібує ріст. 62. Спосіб за п. 57, де вказане антитіло є кон'югованим з цитотоксичним агентом. 63. Спосіб за п. 62, де вказаний цитотоксичний агент вибирають з групи, яка складається з токсинів, антибіотиків, радіоактивних ізотопів і нуклеолітичних ферментів. 64. Спосіб за п. 62, де цитотоксичний агент являє собою токсин. 65. Спосіб за п. 64, де токсин вибирають з групи, яка складається з майтансиноїду і каліхеаміцину. 8 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 66. Спосіб за п. 64, де токсин являє собою майтансиноїд. 67. Спосіб за п. 57, де вказане антитіло продукується в бактеріях. 68. Спосіб за п. 57, де вказане антитіло продукується в СНО клітинах. 69. Спосіб за п. 57, де вказана пухлина додатково піддається променевої терапії або впливу хіміотерапевтичного агента. 70. Спосіб за п. 57, де вказана пухлину являє собою пухлину молочної залози, колоректальну пухлину, пухлину легені, пухлину яєчника, пухлину центральної нервової системи, пухлину печінки, пухлину сечового міхура, пухлину підшлункової залози або пухлину шийки матки. 71. Спосіб за п. 57, де вказаний білок в більшій мірі експресується раковими клітинами вказаної пухлини в порівнянні з нормальною клітиною такого ж тканинного походження. 72. Спосіб за п. 57, де вказаний білок має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 73. Спосіб визначення присутності білка в зразку, що підозрюється на вміст вказаного білка, де вказаний білок щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (a) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, вказаний спосіб, що включає піддавання вказаного зразка впливу антитіла, який зв'язується з вказаним білком, і визначення зв'язування вказаного антитіла з вказаним білком у вказаному зразку, де зв'язування антитіла з вказаним білком вказує на присутність вказаного білка у вказаному зразку. 74. Спосіб за п. 73, де вказаний зразок містить клітину, що підозрюється на експресію вказаного білка. 75. Спосіб за п. 74, де вказана клітина являє собою ракову клітину. 76. Спосіб за п. 73, де вказане антитіло є міченим для виявлення. 77. Спосіб за п. 73, де вказаний білок має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 78. Спосіб діагностики присутності пухлини у ссавця, де вказаний спосіб включає визначення рівня експресії гена, що кодує білок, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (а) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, в тестованому зразку клітин тканини, отриманих від вказаного ссавця і в контрольному зразку відомих нормальних клітин такого ж тканинного походження, де більш високий рівень експресії вказаного білка в тестованому зразку, в порівнянні з контрольним зразком, вказує на присутність пухлини у ссавця, з якого був отриманий тестований зразок. 79. Спосіб за п. 78, де стадія визначення рівня експресії гена, що кодує вказаний білок, включає використання олігонуклеотиду при гібридизації in situ або аналізі методом РВ-ПЛР. 9 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 80. Спосіб за п. 78, де стадія визначення рівня експресії гена, що кодує вказаний білок, включає використання антитіла при імуногістохімії або аналізі методом вестерн-блотингу. 81. Спосіб за п. 78, де вказаний білок має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 82. Спосіб діагностики присутності пухлини у ссавця, де вказаний спосіб включає приведення в контакт тестованого зразка клітин тканини, отриманих від вказаного ссавця з антитілом, яке зв'язується з білком, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (а) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, і виявлення утворення комплексу між вказаним антитілом і вказаним білком в тестованому зразку, де утворення комплексу вказує на присутність пухлини у вказаного ссавця. 83. Спосіб за п. 82, де вказане антитіло є міченим для виявлення. 84. Спосіб за п. 82, де вказаний тестований зразок клітин тканини отримують від індивідуума, що підозрюється на наявність ракової пухлини. 85. Спосіб за п. 82, де вказаний білок має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 86. Спосіб лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення, пов'язаного із збільшеною експресією або активністю білка, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (а) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, вказаний спосіб, що включає введення суб'єкту, потребуючому такого лікування ефективної кількості антагоніста вказаного білка, за допомогою чого ефективно виліковуючи або запобігаючи вказаному клітинному проліферативному порушенню. 87. Спосіб за п. 86, де вказане клітинне проліферативне порушення являє собою рак. 88. Спосіб за п. 86, де вказаний антагоніст являє собою антитіло проти поліпептиду ТАТ або антисмисловий олігонуклеотид. 89. Спосіб зв'язування антитіла з клітиною, яка експресує білок, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (а) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, де вказаний спосіб включає приведення в контакт вказаної клітини з антитілом, яке зв'язується з вказаним білком і 10 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечує наявність зв'язування антитіла з вказаним білком, таким чином, зв'язуючи вказане антитіло з вказаною клітиною. 90. Спосіб за п. 89, де вказане антитіло являє собою моноклональне антитіло. 91. Спосіб за п. 89, де вказане антитіло являє собою фрагмент антитіла. 92. Спосіб за п. 89, де вказане антитіло являє собою химерне або гуманізоване антитіло. 93. Спосіб за п. 89, де вказане антитіло є кон'югованим з агентом, який інгібує ріст. 94. Спосіб за п. 89, де вказане антитіло є кон'югованим з цитотоксичним агентом. 95. Спосіб за п. 94, де вказаний цитотоксичний агент вибирають з групи, яка складається з токсинів, антибіотиків, радіоактивних ізотопів і нуклеолітичних ферментів. 96. Спосіб за п. 94, де цитотоксичний агент являє собою токсин. 97. Спосіб за п. 96, де токсин вибирають з групи, яка складається з майтансиноїду і каліхеаміцину. 98. Спосіб за п. 96, де токсин являє собою майтансиноїд. 99. Спосіб за п. 89, де вказане антитіло продукується в бактеріях. 100. Спосіб за п. 89, де вказане антитіло продукується в СНО клітинах. 101. Спосіб за п. 89, де вказана клітина являє собою ракову клітину. 102. Спосіб за п. 101, де вказана ракова клітина додатково піддається променевій терапії або впливу хіміотерапевтичного агента. 103. Спосіб за п. 101, де вказану ракову клітину вибирають з групи, яка складається з клітини раку молочної залози, клітини колоректального раку, клітини раку легень, клітини раку яєчника, клітини раку центральної нервової системи, клітини раку печінки, клітини раку сечового міхура, клітини раку підшлункової залози, клітини раку шийки матки, клітини меланоми і лейкемічної клітини. 104. Спосіб за п. 103, де вказаний білок в більшій мірі експресується вказаною раковою клітиною в порівнянні з нормальною клітиною такого ж тканинного походження. 105. Спосіб за п. 89, який викликає смертьвказаної клітини. 106. Застосування нуклеїнової кислоти, за будь-яким з пп. 1-5 або 30 при отриманні лікарського засобу для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 107. Застосування нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-5 або 30 при отриманні лікарського засобу для лікування пухлини. 108. Застосування нуклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-5 або 30 при отриманні лікарського засобу для лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. 109. Застосування експресійного вектора за будь-яким з пп. 6, 7 або 31 при отриманні лікарського засобу для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 110. Застосування експресійного вектора за будь-яким з пп. 6, 7 або 31 при отриманні лікарського засобу для лікування пухлини. 111. Застосування експресійного вектора за будь-яким з пп. 6, 7 або 31 при отриманні лікарського засобу для лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. 112. Застосування клітини-хазяя за будь-яким з пп. 8, 9, 32 або 33 при отриманні лікарського засобу для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 113. Застосування клітини-хазяя за будь-яким з пп. 8, 9, 32 або 33 при отриманні лікарського засобу для лікування пухлини. 114. Застосування клітини-хазяя за будь-яким з пп. 8, 9, 32 або 33 при отриманні лікарського засобу для лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. 115. Застосування поліпептиду за будь-яким з пп. 11-14 при отриманні лікарського засобу для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 116. Застосування поліпептиду за будь-яким з пп. 11-14 при отриманні лікарського засобу для лікування пухлини. 117. Застосування поліпептиду за будь-яким з пп. 11-14 при отриманні лікарського засобу для лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. 118. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 15-29 при отриманні лікарського засобу для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 119. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 15-29 при отриманні лікарського засобу для лікування пухлини. 120. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 15-29 при отриманні лікарського засобу для лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. 121. Застосування композиції речовин за будь-яким з пп. 35 або 36 при отриманні лікарського засобу для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 122. Застосування композиції речовин за будь-яким з пп. 35 або 36 при отриманні лікарського засобу для лікування пухлини. 11 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 123. Застосування композиції речовин за будь-яким з пп. 35 або 36 при отриманні лікарського засобу для лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. 124. Застосування виробу за будь-яким з пп. 37 або 38 при отриманні лікарського засобу для терапевтичного лікування або діагностичного виявлення раку. 125. Застосування виробу за будь-яким з пп. 37 або 38 при отриманні лікарського засобу для лікування пухлини. 126. Застосування виробу за будь-яким з пп. 37 або 38 при отриманні лікарського засобу для лікування або профілактики клітинного проліферативного порушення. 127. Спосіб інгібування росту клітини, де ріст вказаної клітини є щонайменше частково залежним від ріст-потенціюючого ефекту білка, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (а) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, де вказаний спосіб включає приведення в контакт вказаного білка з антитілом, яке зв'язується з вказаним білком, за допомогою чого інгібуючи ріст вказаної клітини. 128. Спосіб за п. 127, де вказана клітина являє собою ракову клітину. 129. Спосіб за п. 127, де вказаний білок експресується вказаною клітиною. 130. Спосіб за п. 127, де зв'язування вказаного антитіла з вказаним білком антагонізує клітинну ріст-потенціюючу активність вказаного білка. 131. Спосіб за п. 127, де зв'язування вказаного антитіла з вказаним білком індукує смерть вказаної клітини. 132. Спосіб за п. 127, де вказане антитіло являє собою моноклональне антитіло. 133. Спосіб за п. 127, де вказане антитіло являє собою фрагмент антитіла. 134. Спосіб за п. 127, де вказане антитіло являє собою химерне або гуманізоване антитіло. 135. Спосіб за п. 127, де вказане антитіло є кон'югованим з агентом, який інгібує ріст. 136. Спосіб за п. 127, де вказане антитіло є кон'югованим з цитотоксичним агентом. 137. Спосіб за п. 136, де вказаний цитотоксичний агент вибирають з групи, яка складається з токсинів, антибіотиків, радіоактивних ізотопів і нуклеолітичних ферментів. 138. Спосіб за п. 136, де цитотоксичний агент являє собою токсин. 139. Спосіб за п. 138, де токсин вибирають з групи, яка складається з майтансиноїду і каліхеаміцину. 140. Спосіб за п. 138, де токсин являє собою майтансиноїд. 141. Спосіб за п. 127, де вказане антитіло продукується в бактеріях. 142. Спосіб за п. 127, де вказане антитіло продукується в СНО клітинах. 143. Спосіб за п. 127, де вказаний білок має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 144. Спосіб терапевтичного лікування пухлини у ссавця, де ріст вказаної пухлини є щонайменше частково залежним від ріст-потенціюючого ефекту білка, який щонайменше на 80 % ідентичний амінокислотній послідовності з (а) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, (b) поліпептидом, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (с) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, з його зв'язаним сигнальним пептидом, (d) позаклітинним доменом поліпептиду, показаним як SEQ ID NO:2, без його зв'язаного сигнального пептиду, (е) поліпептидом, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) поліпептидом, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1, вказаний спосіб, що включає приведення в контакт вказаного білка з антитілом, яке зв'язується з вказаним білком, за допомогою чого ефективно виліковуючи вказану пухлину. 145. Спосіб за п. 144, де вказаний білок експресується клітинами вказаної пухлини. 12 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 146. Спосіб за п. 144, де зв'язування вказаного антитіла з вказаним білком антагонізує клітинну ріст-потенціюючу активність вказаного білка. 147. Спосіб за п. 144, де вказане антитіло являє собою моноклональне антитіло. 148. Спосіб за п. 144, де вказане антитіло являє собою фрагмент антитіла. 149. Спосіб за п. 144, де вказане антитіло являє собою химерне або гуманізоване антитіло. 150. Спосіб за п. 144, де вказане антитіло є кон'югованим з агентом, який інгібує ріст. 151. Спосіб за п. 144, де вказане антитіло є кон'югованим з цитотоксичним агентом. 152. Спосіб за п. 151, де вказаний цитотоксичний агент вибирають з групи, яка складається з токсинів, антибіотиків, радіоактивних ізотопів і нуклеолітичних ферментів. 153. Спосіб за п. 151, де цитотоксичний агент являє собою токсин. 154. Спосіб за п. 153, де токсин вибирають з групи, яка складається з майтансиноїду і каліхеаміцину. 155. Спосіб за п. 153, де токсин являє собою майтансиноїд. 156. Спосіб за п. 144, де вказане антитіло продукується в бактеріях. 157. Спосіб за п. 144, де вказане антитіло продукується в СНО клітинах. 158. Спосіб за п. 144, де вказаний білок має (a) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, (b) амінокислотну послідовність, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (с) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, з послідовністю його зв'язаного сигнального пептиду, (d) амінокислотну послідовність позаклітинного домену поліпептиду, показану як SEQ ID NO:2, без послідовності його зв'язаного сигнального пептиду, (е) амінокислотну послідовність, що кодується нуклеотидною послідовністю, показаною як SEQ ID NO:1, або (f) амінокислотну послідовність, що кодується кодуючою областю непроцесованої нуклеотидної послідовності, показаною як SEQ ID NO:1. 159. Виділене антитіло, яке зв'язується з таким же епітопом, зв'язаним з антитілом за будьяким з пп. 15-29. 160. Антитіло за п. 159, яке являє собою моноклональне антитіло. 161. Антитіло за п. 159, яке являє собою фрагмент антитіла. 162. Антитіло за п. 159, яке являє собою химерне або гуманізоване антитіло. 163. Антитіло за п. 159, яке є кон'югованим з агентом, який інгібує ріст. 164. Антитіло за п. 159, яке є кон'югованим з цитотоксичним агентом. 165. Антитіло за п. 164, де цитотоксичний агент вибирають з групи, яка складається з токсинів, антибіотиків, радіоактивних ізотопів і нуклеолітичних ферментів. 166. Антитіло за п. 164, де цитотоксичний агент являє собою токсин. 167. Антитіло за п. 166, де токсин вибирають з групи, яка складається з майтансиноїду і каліхеаміцину. 168. Антитіло за п. 166, де токсин являє собою майтансиноїд. 169. Антитіло за п. 159, яке продукується в бактеріях. 170. Антитіло за п. 159, яке продукується в CHO клітинах. 171. Антитіло за п. 159, яке індукує смерть клітини, з якою воно зв'язується. 172. Антитіло за п. 159, яке мітять для виявлення. 173. Антитіло за п. 159, яке містить щонайменше одну з областей визначення комплементарності будь-якого антитіла за пп. 15-29. 174. Клітина гібридоми, яка продукує моноклональне антитіло, яке зв'язується з поліпептидом ТАТ. 175. Спосіб ідентифікації антитіла, яке зв'язується з епітопом, зв'язаним з будь-яким антитілом за пп. 15-29, вказаний спосіб, що включає визначення здатності тестованого антитіла блокувати зв'язування будь-якого антитіла за пп. 15-29, де здатність вказаного тестованого антитіла блокувати зв'язування вказаного будь-якого антитіла за пп. 15-29 з поліпептидом ТАТ на щонайменше 40 % і при однакових концентраціях антитіла вказує на те, що вказане тестоване антитіло має здатність до зв'язування з епітопом, зв'язаним з вказаним будь-яким антитілом за пп. 15-29. Ще додаткові варіанти здійснення даного винаходу будуть очевидними для кваліфікованого фахівця в даній галузі при прочитанні даного опису. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фігура 1 показує нуклеотидну послідовність (SEQ ID NO:1) кДНК TAT211, де SEQ ID NO:1 є клоном, позначеним в даній заявці як "ДНК219894". Фігура 2 показує амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:2), що є похідною кодуючої послідовності SEQ ID NO:1, показаної на Фігурі 1. 13 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігури 3A-C показують вирівнювання в лінійний ланцюг амінокислотних послідовностей варіабельних легких ланцюгів для наступних: консенсусна послідовність підгрупи I людини (huKI; SEQ ID NO:3) з легким ланцюгом, мишаче 10H1 антитіло проти ТАТ211 (mu10H1-L; SEQ ID NO:4), прищеплене "гуманізоване" антитіло 10H1 проти ТАТ211 (10H1-графт; SEQ ID NO:5), і різноманітні інші "гуманізовані" антитіла проти ТАТ211 (SEQ ID NO:6-11). Фігури 4A-C показують вирівнювання в лінійний ланцюг амінокислотних послідовностей варіабельних важких ланцюгів для наступних: консенсусна послідовність підгрупи III людини з важким ланцюгом (hum III; SEQ ID NO:12), мишаче антитіло 10H1 проти ТАТ211 (mu10H1-H; SEQ ID NO:13), прищеплене "гуманізоване" антитіло 10H1 проти ТАТ211 (10H1-графт; SEQ ID NO:14), і різноманітні інші "гуманізовані" антитіла проти ТАТ211 (SEQ ID NO: 15-20). Фігура 5 показує різноманітні CDR-L1 послідовності (SEQ ID NO:21-34) вибраних 10Н1похідних антитіл зі зрілою афінністю. Фігура 6 показує різноманітні CDR-L2 послідовності (SEQ ID NO:35-38) вибраних 10Н1похідних антитіл зі зрілою афінністю. Фігура 7 показує різноманітні CDR-L3 послідовності (SEQ ID NO:39-41) вибраних 10Н1похідних антитіл зі зрілою афінністю. Фігура 8 показує різноманітні CDR-H1 послідовності (SEQ ID NO:42-45) вибраних 10Н1похідних антитіл зі зрілою афінністю. Фігура 9 показує різноманітні CDR-H2 послідовності (SEQ ID NO:46-60) вибраних 10Н1похідних антитіл зі зрілою афінністю. Фігура 10 показує різноманітні CDR-H3 послідовності (SEQ ID NO:61-65) вибраних 10Н1похідних антитіл зі зрілою афінністю. Фігура 11 показує зразкові акцепторні консенсусні каркасні послідовності людини для застосування при практичній реалізації даного винаходу з наступними ідентифікаторами послідовностей: VH підгрупи I консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:66), VH підгрупи I консенсусна каркасна людини мінус розширені гіперваріабельні області (SEQ ID NO:67-69), VH підгрупи II консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:70), VH підгрупи II консенсусна каркасна людини мінус розширені гіперваріабельні області (SEQ ID NO:71-73), VH підгрупи III консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата "L-варіант" (SEQ ID NO:74), і VH підгрупи III консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата "F-варіант" (SEQ ID NO:75). Фігура 12 показує зразкові акцепторні консенсусні каркасні послідовності людини для застосування при практичній реалізації даного винаходу з наступними ідентифікаторами послідовностей: VL каппа підгрупи I консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:76), VL каппа підгрупи II консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:77), VL каппа підгрупи III консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO:78), і VL каппа підгрупи IV консенсусна каркасна людини мінус CDR Кабата (SEQ ID NO: 79). Фігура 13 показує амінокислотну послідовність важкого ланцюга антитіла 10H1.1.4 В (SEQ ID NO:80). Фігура 14 показує амінокислотну послідовність легкого ланцюга антитіла 10H1.1.4 В (SEQ ID NO:81). Фігура 15 показує знищення in vitro клітин OVCAR-3 клітини (які ендогенно експресують поліпептид ТАТ211 на клітинній поверхні) за допомогою обробки наступними ADC vc-MMAE кон'югованими антитілами, 10H1.11 (♦), 10H1.11.1 ( ), 10H1.11.2 В (▲), 10H1.11.4 В (●), 10H1.11.6 В (X), 10H1-графт (о), проти-людські gD (|), проти-аглютиніну пилка (□). Фігура 16 показує знищення in vitro 293 клітин (які не експресують поліпептид ТАТ211 на клітинній поверхні) за допомогою обробки наступними ADC vc-MMAE кон'югованими антитілами, 10H1.11.4 В (●), або проти-людськими gD (|). Фігура 17 показує знищення in vitro 293/TAT211 клітин (які були створені методом генної інженерії для експресії поліпептиду ТАТ 211 на клітинній поверхні) за допомогою обробки наступними ADC vc-MMAE кон'югованими антитілами, 10H1.11.4 В (●), або проти-людськими gD (|). Фігура 18 показує знищення in vivo пухлин OVCAR-3 в експерименті з жировим шаром мишачої молочної залози з наступними ADC vc-MMAE кон'югованими антитілами, тільки середовищем (□), 10H1.11 (♦), 10H1.11.1 ( ), 10H1.11.2 В (▲), 10H1.11.4 В (●), 10H1.11.6 В (+), і 10H1-графт (о). Фігура 19 показує знищення in vivo пухлин OVCAR-3 в експерименті з жировим шаром мишачої молочної залози з наступними ADC vc-MMAE кон'югованими антитілами, тільки середовищем (X), 10H1.11.4 В при 3 мг/кг ( ), 10H1.11.4 В при 1 мг/кг (●), або неспецифічним проти-gp120 контрольним антитілом, яке не зв'язується з TAT211 (▲). ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ 14 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 I. Визначення Терміни "поліпептид ТАТ" і "TAT", як використовують в даній заявці, і, коли відразу супроводжуються числовим позначенням, стосуються різноманітних поліпептидів, де повне позначення (тобто, TAT/номер) стосується конкретних поліпептидних послідовностей, як описано в даній заявці. Терміни "TAT/номер поліпептиду" і "TAT/номер" де термін "номер" наданий як дійсне числове позначення, як використовують в даній заявці, охоплює нативні послідовності поліпептидів, поліпептидні варіанти і фрагменти нативних послідовностей поліпептидів і поліпептидні варіанти (які далі визначаються в даній заявці). Поліпептиди ТАТ, описані в даній заявці, можуть бути виділені з різноманітних джерел, таких як з тканинних типів людини або з ще одного іншого джерела, або отримані за допомогою рекомбінантних або синтетичних способів. Термін "поліпептид ТАТ" стосується кожного індивідуального TAT/номер поліпептиду, розкритого в даній заявці. Всі розкриття в даному описі, які стосуються "поліпептиду ТАТ" стосуються кожного з поліпептидів індивідуально, а також спільно. Наприклад, описи їх отримання, очищення, отримання похідних, утворення антитіл до них або проти, утворення ТАТ-зв'язувальних олігопептидів до них або проти, утворення ТАТзв'язувальних органічних молекул до них або проти, їх введення, композицій, що містить їх, лікування захворювання з їх використанням, і т. д., стосуються кожного поліпептиду винаходу індивідуально. Термін "поліпептид ТАТ" також включає варіанти TAT/номер поліпептидів, розкритих в даній заявці. У одному варіанті здійснення, поліпептидна послідовність TAT211 показана як SEQ ID NO:2. "Поліпептид ТАТ з нативною послідовністю" включає поліпептид, що має таку ж амінокислотну послідовність, як і відповідний поліпептид ТАТ, отриманий в природі. Такі поліпептиди ТАТ з нативною послідовністю можуть бути виділені з природних джерел або можуть бути продуковані за допомогою рекомбінантних або синтетичних засобів. Термін "поліпептид ТАТ з нативною послідовністю" конкретно охоплює процесовані або секретовані форми конкретного поліпептиду ТАТ, які зустрічаються в природі (наприклад, послідовності позаклітинного домену), варіантні форми, що зустрічаються в природі (наприклад, альтернативно сплайсовані форми) і алельні варіанти поліпептиду, що зустрічаються в природі. У певних варіантах здійснення винаходу, поліпептиди ТАТ з нативною послідовністю, описані в даній заявці, являють собою зрілі або непроцесовані (з повною довжиною) поліпептиди з нативною послідовністю, що містять амінокислотні послідовності з повною довжиною, показані на відповідних фігурах. Стартові і стоп-кодони (якщо вказані) показані жирним шрифтом і підкреслені на фігурах. Залишки нуклеїнової кислоти, вказані як "N" або "X" на відповідних фігурах, є будь-яким залишком нуклеїнової кислоти. Однак, в той час як показано, що поліпептиди ТАТ, розкриті на відповідних фігурах, починаються із залишків метіоніну, позначених в даній заявці як амінокислотне положення 1 на фігурах, є зрозумілим і можливим, що інші залишки метіоніну, розташовані або вгору у напрямку або вниз у напрямку від амінокислотного положення 1 на фігурах, можуть використовуватися як вихідний амінокислотний залишок для поліпептидів ТАТ. "Позаклітинний домен" поліпептиду ТАТ або "ECD" стосується форми поліпептиду ТАТ, яка по суті не містить трансмембранних і цитоплазматичних доменів. Звичайно, ECD поліпептиду ТАТ буде складати менше ніж 1 % від таких трансмембранних і/або цитоплазматичних доменів і переважно, буде складати менше ніж 0,5 % від таких доменів. Буде зрозумілим, що будь-які трансмембранні домени, ідентифіковані для поліпептидів ТАТ даного винаходу, ідентифіковані відповідно до критеріїв, що традиційно використовуються в даній галузі для ідентифікації цього типу гідрофобного домену. Точні межі трансмембранного домену можуть змінюватися, але найбільш ймовірно на не більше ніж приблизно 5 амінокислот по обох кінцях домену, як спочатку ідентифіковано в даній заявці. Необов'язково, отже, позаклітинний домен поліпептиду ТАТ може містити від приблизно 5 або менше амінокислот по обох сторонах межі трансмембранного домену/позаклітинного домену, як ідентифіковано в Прикладах або описі, і такі поліпептиди, з зв'язаним сигнальним пептидом або без нього, і нуклеїнова кислота, що кодує їх, передбачена даним винаходом. Приблизно розташування "сигнальних пептидів" різноманітних поліпептидів ТАТ, розкритих в даній заявці, може бути показане в даному описі і/або на відповідних фігурах. Відмічають, однак, що С-кінцева межа сигнального пептиду може змінюватися, але, найбільш ймовірно, не більше ніж на приблизно 5 амінокислот по обох сторонах С-кінцевої межі сигнального пептиду, як спочатку ідентифіковано в даній заявці, де С-кінцева межа сигнального пептиду може бути ідентифікований відповідно до критеріїв, що традиційно використовуються в даній галузі для ідентифікації цього типу елемента амінокислотної послідовності (наприклад, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) і von Heinje et al, Nucl. Acids. Res. 14:4683-4690 (1986)). Крім того, також 15 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визнають, що, в деяких випадках, розщеплення сигнальної послідовності з секретованого поліпептиду не є повністю однорідним, приводячи в результаті до більше ніж одного секретованого виду. Ці зрілі поліпептиди, де сигнальний пептид розщеплюється в межах не більше ніж приблизно 5 амінокислот по обох сторонах С-кінцевої межі сигнального пептиду, як ідентифіковано в даній заявці, і полінуклеотиди, що кодують їх, передбачені даним винаходом. "Варіант поліпептиду ТАТ" означає поліпептид ТАТ, переважно, активний поліпептид ТАТ, як визначено в даній заявці, що має щонайменше приблизно 80 % ідентичність амінокислотної послідовності з послідовністю поліпептиду ТАТ з непроцесованою нативною послідовністю, як описано в даній заявці, з послідовністю поліпептиду ТАТ без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, позаклітинним доменом поліпептиду ТАТ, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, або будь-яким іншим фрагментом послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці (такі як кодовані нуклеїновою кислотою, яка представляє тільки частину повної кодуючої послідовності для поліпептиду ТАТ непроцесований). Такі варіанти поліпептидів ТАТ включають, наприклад, поліпептиди ТАТ, де додані або видалені (піддані делеції) один або більше амінокислотних залишків, по N- або Скінцю нативної амінокислотної послідовності непроцесований. Звичайно, варіант поліпептиду ТАТ буде мати щонайменше приблизно 80 % ідентичність амінокислотної послідовності, альтернативно щонайменше приблизно 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %), 98 % або 99 % ідентичність амінокислотної послідовності, з нативною послідовністю непроцесованої послідовності поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці, з послідовністю поліпептиду ТАТ без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, позаклітинним доменом поліпептиду ТАТ, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, або будь-яким іншим конкретно визначеним фрагментом послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці. Звичайно, варіантні поліпептиди ТАТ складають щонайменше приблизно 10 амінокислот по довжині, альтернативно щонайменше приблизно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 амінокислот по довжині або більше. Необов'язково, варіантні поліпептиди ТАТ будуть мати не більше ніж одну консервативну заміну амінокислоти в порівнянні з послідовністю поліпептиду ТАТ, альтернативно не більше ніж 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 консервативних замін амінокислот, в порівнянні з нативною послідовністю поліпептиду ТАТ. "Процент (%) ідентичності амінокислотної послідовності" по відношенню до послідовностей поліпептиду ТАТ, ідентифікованого в даній заявці, визначають як процентний вміст амінокислотних залишків в кандидатній послідовності, які є ідентичними амінокислотним залишкам в конкретній послідовності поліпептиду ТАТ, після вирівнювання послідовностей і введення пропусків, якщо необхідно, для досягнення максимального процента ідентичності послідовності, і без урахування будь-яких консервативних замін як частини ідентичності послідовності. Вирівнювання в лінію з метою визначення процента ідентичності амінокислотної послідовності може досягатися різноманітними шляхами, які знаходяться в межах об'єму кваліфікації в даній галузі, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програмне забезпечення BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Кваліфіковані фахівці в даній галузі можуть визначити відповідні параметри для вимірювання вирівнювання в лінію, включаючі будь-які алгоритми, необхідні для досягнення максимального вирівнювання в лінію протягом непроцесованих порівнюваних послідовностей. Для цілей даного винаходу в даній заявці, однак, значення % ідентичності амінокислотної послідовності генерують, використовуючи комп'ютерну програму порівняння послідовностей ALIGN-2, де повний вихідний текст для програми ALIGN-2 наданий в патенті США № 7160985, який включений в дану заявку за допомогою посилання. Комп'ютерна програма порівняння послідовностей ALIGN-2 має авторські права від Genentech, Inc. і її повний вихідний текст був поданий разом з документацією користувача в Бюро реєстрації авторських прав США, Вашингтон, D.C., 20559, де він зареєстрований під реєстраційним номером TXU510087. Програма ALIGN-2 є загальнодоступною від Genentech, Inc., Південний СанФранциско, Каліфорнія, або може бути складена по повному вихідному тексту. Програма ALIGN2 повинна бути складена для застосування з операційною системою UNIX, переважно, цифровою UNIX V4.0D. Всі параметри порівняння послідовностей встановлені програмою ALIGN-2 і не змінюються. У ситуаціях, де ALIGN-2 використовують для порівнянь амінокислотних послідовностей, % ідентичності амінокислотної послідовності даної амінокислотної послідовності А по відношенню, з або проти даної амінокислотної послідовності В (яка може бути альтернативно 16 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перефразована як дана амінокислотна послідовність А, яка має або містить певний % ідентичності амінокислотної послідовності по відношенню, з або проти даної амінокислотної послідовності В) розраховують таким чином: 100-кратна фракція X/Y, де X є числом амінокислотних залишків, що оцінюються як ідентичні збіги за допомогою програми вирівнювання в лінію послідовностей ALIGN-2 в цьому програмному вирівнюванні в лінію А і В, і, де Y є повним числом амінокислотних залишків в B. Слід враховувати, що там, де довжина амінокислотної послідовності А не дорівнює довжині амінокислотної послідовності В, % ідентичності амінокислотної послідовності А з В не буде дорівнювати % ідентичності амінокислотної послідовності В з А. "Полінуклеотид TAT варіанту" або "послідовність нуклеїнової кислоти TAT варіанту" означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид ТАТ, переважно, активний поліпептид ТАТ, як визначено в даній заявці, і, який має щонайменше приблизно 80 % ідентичність послідовності нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеотидної кислоти, що кодує послідовність непроцесованого поліпептиду ТАТ з нативною послідовністю, як описано в даній заявці, послідовність непроцесованого поліпептиду ТАТ з нативною послідовністю без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, позаклітинний домен поліпептиду ТАТ, з сигнальним пептидом або без нього, як описано в даній заявці, або будь-який інший фрагмент послідовності непроцесованого поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці (такі як кодовані нуклеїновою кислотою, яка представляє тільки частину повної кодуючої послідовності для непроцесованого поліпептиду ТАТ). Звичайно, полінуклеотид TAT варіанту буде мати щонайменше приблизно 80 % ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти, альтернативно щонайменше приблизно 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти зпослідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує послідовність непроцесованого поліпептиду ТАТ з нативною послідовністю, як описано в даній заявці, послідовність непроцесованого поліпептиду ТАТ з нативною послідовністю без сигнального пептиду, як описано в даній заявці, позаклітинний домен поліпептиду ТАТ, з сигнальною послідовністю або без неї, як описано в даній заявці, або будьякий інший фрагмент непроцесованої послідовності поліпептиду ТАТ, як описано в даній заявці. Варіанти не охоплюють нативну нуклеотидну послідовність. Звичайно, полінуклеотиди TAT варіантів складають щонайменше приблизно 5 нуклеотидів по довжині, альтернативно щонайменше приблизно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990 або 1000 нуклеотидів по довжині, де в даному контексті термін "приблизно" означає довжину нуклеотидної послідовності, що порівнюється плюс або мінус 10 % від цієї порівнюваної довжини. "Процент (%) ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти" по відношенню до ТАТкодуючих послідовностей нуклеїнової кислоти, ідентифікованих в даній заявці, визначають як процентний вміст нуклеотидів в кандидатній послідовності, які є ідентичними нуклеотидам в послідовності ТАТ-нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, після вирівнювання послідовностей і введення пропусків, якщо необхідно, для досягнення максимального процента ідентичності послідовності. Вирівнювання в лінію з метою визначення процента ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти може досягатися різноманітними шляхами, які знаходяться в межах об'єму кваліфікації в даній галузі, наприклад, з використанням загальнодоступного комп'ютерного програмного забезпечення, такого як програмне забезпечення BLAST, BLAST-2, ALIGN або Megalign (DNASTAR). Для цілей даного винаходу в даній заявці, однак, значення % ідентичності амінокислотної послідовності генерують, використовуючи комп'ютерну програму порівняння послідовностей ALIGN-2, де повний вихідний текст для програми ALIGN-2 наданий в патенті США № 7160985, який включений в дану заявку за допомогою посилання. Комп'ютерна програма порівняння послідовностей ALIGN-2 має авторські права від Genentech, Inc. і її повний вихідний текст був поданий разом з документацією користувача в Бюро реєстрації авторських прав США, Вашингтон, D.C., 20559, де він зареєстрований під реєстраційним номером TXU510087. Програма ALIGN-2 є загальнодоступною від Genentech, Inc., Південний СанФранциско, Каліфорнія, або може бути складена по повному вихідному тексту. Програма ALIGN2 повинна бути складена для застосування з операційною системою UNIX, переважно, 17 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цифровою UNIX V4.0D. Всі параметри порівняння послідовностей встановлені програмою ALIGN-2 і не змінюються. У ситуаціях, де ALIGN-2 використовують для порівнянь послідовності нуклеїнової кислоти, % ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти даної послідовності нуклеїнової кислоти С по відношенню до, з або проти даної послідовності нуклеїнової кислоти D (яка альтернативно може бути перефразована як дана послідовність нуклеїнової кислоти С, яка має або містить певний % ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти по відношенню до, з або проти даної послідовності нуклеїнової кислоти D) розраховують таким чином: 100-кратна фракція W/Z, де W є числом нуклеотидів, що оцінюються як ідентичні збіги за допомогою програми вирівнювання в лінію послідовностей ALIGN-2 в цьому програмному вирівнюванні в лінію С і D, і, де Z є загальним числом нуклеотидів в D. Слід враховувати, що там, де довжина послідовності нуклеїнової кислоти С не дорівнює довжині послідовності нуклеїнової кислоти D, % ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти С з D не буде дорівнювати % ідентичності послідовності нуклеїнової кислоти D з С. У інших варіантах здійснення, полінуклеотиди TAT варіанту являють собою молекули нуклеїнової кислоти, які кодують поліпептид ТАТ і які є здатними до гібридизації, переважно, при умовах суворої гібридизації і промивання, з нуклеотидними послідовностями, що кодують непроцесований поліпептид ТАТ, як описано в даній заявці. Поліпептиди TAT варіанту можуть бути поліпептидами, які кодуються полінуклеотидом TAT варіанту. Термін "непроцесована кодуюча область", коли використовується по відношенню до нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид ТАТ, стосується послідовності нуклеотидів, яка кодує непроцесований поліпептид ТАТ винаходу (який часто показують між стартовими і стопкодонами, включаючи їх, на відповідних фігурах). Термін "непроцесована кодуюча область", коли використовується по відношенню до нуклеїнової кислоти, депонованої в ATCC, стосується поліпептид ТАТ-кодуючої частини кДНК, яку вводять у вектор, депонований разом з ATCC (який часто показують між стартовими і стоп-кодонами, включаючи їх, на відповідних фігурах). "Виділений", коли використовують для опису різноманітних поліпептидів ТАТ, розкритих в даній заявці, означає поліпептид, який був ідентифікований і виділений і/або витягнутий з компонента його природного оточення. Забруднюючі компоненти його природного оточення являють собою речовини, які звичайно надають впливи при діагностичних або терапевтичних застосуваннях поліпептиду, і можуть включати ферменти, гормони, і інші білкові або небілкові розчинні речовини. У переважних варіантах здійснення, поліпептид буде очищений (1) до ступеня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою застосування секвенатора з обертовою склянкою, або (2) до гомогенності за допомогою SDS-PAGE при невідновних або відновних умовах, використовуючи Кумассі синій або, переважно, срібний барвник. Виділений поліпептид включає поліпептид in situ в рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного оточення поліпептиду ТАТ не буде присутнім. Звичайно, однак, виділений поліпептид буде отриманий за допомогою щонайменше однієї стадії очищення. "Виділена" поліпептид ТАТ-кодуюча нуклеїнова кислота або інша поліпептид-кодуюча нуклеїнова кислота являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яку ідентифікують і відділяють від щонайменше однієї контамінантної молекули нуклеїнової кислоти, з якою вона звичайно зв'язана в природному джерелі поліпептид-кодуючої нуклеїнової кислоти. Виділена поліпептидкодуюча молекула нуклеїнової кислоти відрізняється за формою або характеристиками, з якими її виявляють в природі. Виділені поліпептид-кодуючі молекули нуклеїнової кислоти, отже, відрізняються від конкрентної поліпептид-кодуючої молекули нуклеїнової кислоти, як вона існує в природних клітинах. Однак, виділена поліпептид-кодуюча молекула нуклеїнової кислоти включає поліпептид-кодуючу молекулу нуклеїнової кислоти, що міститься в клітинах, яка звичайно експресує поліпептид, де, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти знаходиться в хромосомному розташуванні, відмінному від розташування в природних клітинах. Термін "контрольні послідовності" стосується послідовностей ДНК, необхідних для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності в конкретному організмі-хазяя. Контрольні послідовності, які є придатними для прокаріотів, наприклад, включають промотор, необов'язково операторну послідовність, і ділянку зв'язування рибосоми. Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, сигнали поліаденілювання і енхансери. Нуклеїнова кислота є "функціонально зв'язаною", коли її вміщують в функціональну взаємодію з ще однією іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК для препослідовності або секреторного лідера функціонально зв'язують з ДНК для поліпептиду, якщо він експресується як білок-попередник, який бере участь в секреції поліпептиду; промотор 18 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 або енхансер є функціонально зв'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він надає вплив на транскрипцію послідовності; або ділянка зв'язування рибосоми є функціонально зв'язаною з кодуючою послідовністю, якщо вона розташована таким чином, щоб полегшити трансляцію. Загалом, "функціонально зв'язані" означає, що послідовності ДНК будучи зв'язаними є перекривними, і, у разі секреторного лідера, перекривними і в фазі зчитування. Однак, енхансери не повинні бути перекривними. Зв'язування завершується лігуванням по зручних рестрикційних сайтах. Якщо такі сайти не існують, застосовують синтетичні олігонуклеотидні адаптори або лінкери відповідно до загальноприйнятої практики. "Суворість" реакцій гібридизацій легко визначається рядовим фахівцем в даній галузі, і, як правило, є емпіричним розрахунком, залежним від довжини зонда, температури промивання і концентрацій солі. Загалом, більш довгі зонди вимагають більш високих температур для потрібної ренатурації, в той час як більш короткі зонди потребують більш низьких температур. Гібридизація загалом залежить від здатності денатурованої ДНК до повторної ренатурації, коли комплементарні нитки присутні в оточенні нижче їх температури плавлення. Чим вищий ступінь бажаної гомології між зондом і гібридизованою послідовністю, тим вища відносна температура, яка може застосовуватися. У результаті, виходить, що більш високі відносні температури будуть мати тенденцію зробити умови реакції більш суворими, в той час як більш низькі температури менш суворими. Для додаткових подробиць і пояснення суворості реакцій гібридизації, див. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). "Суворі умови" або "умови високої суворості", як визначено в даній заявці, можуть бути ідентифіковані як такі умови, при яких: (1) використовують низьку іонну силу і високу температуру для промивання, наприклад 0,015 M хлорид натрію/0,0015 M цитрат натрію/0,1 % додецилсульфат натрію при 50 °C; (2) використовують у час гібридизації денатуруючий агент, такий як формамід, наприклад, 50 % (об./об.) формамід з 0,1 % альбумін бичачої сироватки/0,1 % Фіколл/0,1 % полівінілпіролідон/буфер 50 мМ фосфат натрію при pH 6,5 з 750 мМ хлоридом натрію, 75 мМ цитрат натрію при 42 °C; або (3) використовують гібридизацію протягом ночі в розчині, в якому використовують 50 % формамід, 5× SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрію), 50 мМ фосфат натрію (pH 6,8), 0,1 % пірофосфат натрію, 5× розчин Денхардта, озвучену ультразвуком ДНК сперми лосося (50 мкг/мл), 0,1 % SDS, і 10 % декстрансульфату при 42 °C, з 10 хвилинним промиванням при 42 °C в 0,2× SSC (хлорид натрію/цитрат натрію) з подальшим 10 хвилинним промиванням в суворих умовах, що складається з 0,1× SSC, що містить ЕДТА при 55 °C. "Помірно суворі умови" можуть бути ідентифіковані, як описано у Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, і включають застосування промивального розчину і умов гібридизації (наприклад, температури, іонної сили і % SDS) менш суворих, ніж умови, описані вище. Приклад помірно суворих умов являє собою інкубацію протягом ночі при 37 °C в розчині, що містить: 20 % формамід, 5× SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ цитрат тринатрію), 50 мМ фосфат натрію (pH 7,6), 5× розчин Денхардта, 10 % декстрансульфат, і 20 мг/мл денатурованої деформованої ДНК сперми лосося, з подальшим промиванням фільтрів в 1× SSC при приблизно 37-50 °C. Кваліфікований фахівець в даній галузі зможе зрозуміти, як регулювати температуру, іонну силу, і т. д. за потреби для акомодації чинників, таких як довжина зонда і т.п. Термін "маркований епітопом", коли використовують в даній заявці, стосується химерного поліпептиду, що містить поліпептид ТАТ або антитіло проти ТАТ, рекомбіноване з "маркерним поліпептидом". Маркерний поліпептид має достатньо залишків, щоб надати епітоп, проти якого може бути отримане антитіло, все ще досить короткий, щоб не надавати впливу на активність поліпептиду, з яким він злитий. Маркерний поліпептид, переважно, також є цілком унікальним, таким чином, що антитіло по суті не реагує перехресно з іншими епітопами. Прийнятні маркерні поліпептиди, як правило, мають щонайменше шість амінокислотних залишків і звичайно між приблизно 8 і 50 амінокислотними залишками (переважно, між приблизно 10 і 20 амінокислотними залишками). "Активний" або "активність" для цілей даного винаходу стосується форми(формам) поліпептиду ТАТ, який зберігає біологічну і/або імунологічну активність нативного або який зустрічається в природі TAT, де "біологічна" активність стосується біологічної функції (або інгібіторної або стимуляторної), що викликається нативним або яким зустрічається в природі TAT, відмінній від здатності індукувати продукування антитіл проти антигенного епітопа, який має нативний або що зустрічається в природі TAT, а "імунологічна" активність стосується здатності індукувати продукування антитіла проти антигенного епітопа, який має нативний або що зустрічається в природі TAT. 19 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "антагоніст" застосовують в найширшому значенні, і включає будь-яку молекулу, яка частково або повністю блокує, інгібує або нейтралізує біологічну активність нативного поліпептиду ТАТ, розкритого в даній заявці. Аналогічним чином, термін "агоніст" застосовують в найширшому значенні, і включає будь-яку молекулу, яка імітує біологічну активність нативного поліпептиду ТАТ, розкритого в даній заявці. Відповідні молекули агоніста або антагоніста конкретно включають агоністичне або антагоністичне антитіла або фрагменти антитіл, фрагменти або амінокислотну послідовність варіантів нативних поліпептидів ТАТ, пептиди, антисмислові олігонуклеотиди, малі органічні молекули, і т.д. Способи ідентифікації агоністів або антагоністів поліпептиду ТАТ можуть включати приведення в контакт поліпептиду ТАТ з кандидатною молекулою агоніста або антагоніста і вимірювання зміни, що виявляється, однієї або більше біологічних активностей, що звичайно асоціюються з поліпептидом ТАТ. "Вилікування" або "лікування", або "пом'якшення" стосується як терапевтичного лікування, так і профілактичних або запобіжних засобів, де мета полягає в запобіганні або сповільненні (зниженні) цільового патологічного стану або порушення. Потребуючі лікування включають тих, які вже мають порушення, а також що мають схильність до захворювання або тих, у яких порушення повинно відвертатися. Суб'єкта або ссавця вважають успішно "вилікуваними" від поліпептид ТАТ-експресуючого раку, після отримання терапевтичної кількості антитіла проти ТАТ, ТАТ-зв'язувального олігопептиду або ТАТ-зв'язувальної органічної молекули відповідно до способів даного винаходу, пацієнт показує спостережуване і/або вимірюване зниження або відсутність одного або декількох з наступних: зниження кількості ракових клітин або відсутності ракових клітин; зниження розміру пухлини; інгібування (тобто, сповільнення в деякій мірі і, переважно, зупинки) інфільтрації ракових клітин до периферичних органів, що включає поширення раку в м'які тканини і кістки; інгібування (тобто, сповільнення в деякій мірі і, переважно, зупинки) пухлинних метастазів; інгібування, в деякій мірі, пухлинного росту; і/або пом'якшення в деякій мірі, одного або більше з симптомів, пов'язаних з конкретним раком; знижену захворюваність і смертність, і поліпшення якості життєвих показників. У тій мірі, в якій антитіло проти ТАТ або ТАТ-зв'язувальний олігопептид можуть запобігати росту і/або знищувати існуючі ракові клітини, вони можуть бути цитостатичними і/або цитотоксичними. Зниження цих ознак або симптомів можуть також відчуватися пацієнтом. Вказані вище параметри для оцінки успішного лікування і поліпшення стану захворювання є легко вимірюваними за допомогою звичайних методик, відомих терапевту. Для лікування раку, ефективність може бути виміряна, наприклад, за допомогою оцінки часу до розвитку захворювання (TTP) і/або визначення ступеня відгуку (RR). Метастази можуть визначатися за допомогою стадійних тестів і сканування кісткових тканин, і тестів на рівень кальцію і інших ферментів для визначення поширення в кісткову тканину. КТ-сканування можуть також проводитися для пошуку поширення в ділянці таза і лімфатичних вузлів. Рентгенівські дослідження грудної клітки і вимірювання рівнів ферментів печінки відомими способами застосовують для пошуку метастазів в легенях і печінці, відповідно. Інші традиційні методи для моніторингу захворювання включають трансректальну ультразвукову ехографію (TRUS) і трансректальну голкову біопсію (TRNB). "Постійне" введення стосується введення агента(агентів) в безперервному режимі на противагу гострому режиму, таким чином, щоб підтримувати первинний терапевтичний ефект (активність) протягом тривалого періоду часу. "Дробне" введення являє собою лікування, яке не проводиться без переривання, але в більшій мірі є циклічним за природою. "Ссавець" для цілей лікування, полегшення симптомів або діагностики раку стосується будьякої тварини, що класифікується як ссавець, включаючи людей, домашніх і сільськогосподарських тварин, і тварин в зоопарках, спортивних або домашніх тварин, таких як собаки, кішки, велика рогата худоба, коні, вівці, свині, кози, кролики і т. д. Переважно, ссавець є людиною. Введення "в комбінації з" одним або більше додатковими терапевтичними агентами включає одночасне (супутнє) і послідовне введення в будь-якому порядку. "Носії", як використовують в даній заявці, включають фармацевтично прийнятні носії, ексципієнти або стабілізатори, які є нетоксичними для клітини або ссавця, що піддається їх впливу при використовуваних дозуваннях і концентраціях. Часто фізіологічно прийнятний носій являє собою водний рН-забуферений розчин. Приклади фізіологічно прийнятних носіїв включають буфери, такі як фосфат, цитрат і інші органічні кислоти; антиоксиданти, що включають аскорбінову кислоту; низькомолекулярний (менше ніж приблизно 10 залишків) поліпептид; білки, такі як альбумін сироватки, желатин або імуноглобуліни; гідрофільні полімери, такі як полівінілпіролідон; амінокислоти, такі як гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін або лізин; моносахариди, дисахариди і інші вуглеводи, що включають глюкозу, манозу або 20 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 декстрини; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; спиртоцукри, такі як манітол або сорбітол; солетворні протиіони, такі як натрій; і/або неіоногенні поверхнево-активні речовини, такі як TWEEN®, поліетиленгліколь (PEG) і PLURONICS®. "Тверда фаза" або "твердий носій" означає неводну матрицю, до якої антитіло, ТАТзв'язувальний олігопептид або ТАТ-зв'язувальна органічна молекула даного винаходу можуть прилипати або приєднуватися. Приклади твердих фаз, що охоплюються в даній заявці, включають фази, утворені частково або повністю зі скла (наприклад, скло з контрольованим розміром пор), полісахариди (наприклад, агарозу), поліакриламіди, полістирол, полівініловий спирт і силікони. У певних варіантах здійснення, залежно від контексту, тверда фаза може містити ямку аналітичної плашки; в інших являє собою колонку для очищення (наприклад, колонку для афінної хроматографії). Цей термін також включає переривисту тверду фазу з дискретних частинок, таку як ті, що описані в патенті США № 4275149. "Ліпосома" являє собою невелику везикулу, складену з різноманітних типів ліпідів, фосфоліпідів і/або поверхнево-активної речовини, яка є застосовною для доставки лікарського засобу (такого як поліпептид ТАТ, антитіло до нього або ТАТ-зв'язувального олігопептид) ссавцеві. Компоненти ліпосоми звичайно розташовані в двошаровому утворенні, яке схоже з розташуванням ліпідів біологічних мембран. У даній заявці визначено, що "мала" молекула або "мала" органічна молекула мають молекулярну масу нижче приблизно 500 Дальтон. "Ефективна кількість" поліпептиду, антитіла, ТАТ-зв'язувального олігопептиду, ТАТзв'язувальної органічної молекули або її агоніста або антагоніста, як описано в даній заявці, являє собою кількість, достатню для здійснення конкретно встановленої мети. "Ефективна кількість" може бути визначена емпірично і традиційним чином, по відношенню до встановленої мети. Термін "терапевтично ефективна кількість" стосується кількості антитіла, поліпептиду, ТАТзв'язувального олігопептиду, ТАТ-зв'язувальної органічної молекули або іншого лікарського засобу, ефективного, щоб "лікувати" захворювання або порушення у суб'єкта або ссавця. У разі раку, терапевтично ефективна кількість лікарського засобу може знижувати кількість ракових клітин; зменшувати розмір пухлини; інгібувати (тобто сповільнювати до деякої міри і, переважно, зупиняти) інфільтрацію ракових клітин до периферичних органів; інгібувати (тобто сповільнювати до деякої міри і, переважно, зупиняти метастази пухлини; інгібувати, до деякої міри ріст пухлини; і/або полегшувати до деякої міри один або більше з симптомів, пов'язаних з раком. Див. визначення, дане в даній заявці "вилікування". У тому ступені, в якому лікарський засіб може запобігати росту і/або знищувати існуючі ракові клітини, він може бути цитостатичним і/або цитотоксичним. "Інгібуюча ріст кількість" антитіла проти ТАТ, поліпептиду ТАТ, ТАТ-зв'язувального олігопептиду або ТАТ-зв'язувальної органічної молекули являє собою кількість, здатну до інгібування росту клітини, особливо, пухлинної, наприклад, ракової клітини, або in vitro або in vivo. "Інгібуюча ріст кількість" антитіла проти ТАТ, поліпептиду ТАТ, ТАТ-зв'язувального олігопептиду або ТАТ-зв'язувальної органічної молекули з метою інгібування росту неопластичної клітини може бути визначена емпірично і традиційним чином. "Цитотоксична кількість" антитіла проти ТАТ, поліпептиду ТАТ, ТАТ-зв'язувального олігопептиду або ТАТ-зв'язувальної органічної молекули являє собою кількість, здатну викликати деструкцію клітини, особливо пухлинної, наприклад, ракової клітини, або in vitro або in vivo. "Цитотоксична кількість" антитіла проти ТАТ, поліпептиду ТАТ, ТАТ-зв'язувального олігопептиду або ТАТ-зв'язувальної органічної молекули з метою інгібування росту неопластичної клітини може бути визначена емпірично і традиційним чином. Термін "антитіло" застосовують в найширшому значенні, і він конкретно охоплює, наприклад, одиничні проти ТАТ моноклональні антитіла (включаючі агоністичні, антагоністичні, і нейтралізуючі антитіла), композиції антитіла проти ТАТ з поліепітопною специфічністю, поліклональні антитіла, одноланцюжкові антитіла проти ТАТ, і фрагменти антитіл проти ТАТ (див. нижче), оскільки вони виявляють бажану біологічну або імунологічну активність. Термін "імуноглобулін" (Ig) застосовують в даній заявці взаємозамінно з антитілом. "Виділене антитіло" являє собою антитіло, яке було ідентифіковане і відділене і/або витягнуте з компонента його природного оточення. Забруднюючі компонентийого природного оточення являють собою речовини, які звичайно впливають при діагностичних або терапевтичних застосуваннях антитіла, і можуть включати ферменти, гормони і інші білкові або небілкові розчинні речовини. У переважних варіантах здійснення, антитіло буде очищене (1) до більше ніж 95 % маси антитіла, як визначають по методу Лоурі, і найбільш переважно, більше ніж 99 % маси, (2) до ступеня, достатнього для отримання щонайменше 15 залишків N-кінцевої 21 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або внутрішньої амінокислотної послідовності за допомогою застосування секвенатора з обертовою склянкою, або (3) до гомогенності за допомогою SDS-PAGE при невідновних або відновних умовах, використовуючи Кумассі синій або, переважно, срібний барвник. Виділене антитіло включає антитіло in situ в рекомбінантних клітинах, оскільки щонайменше один компонент природного оточення антитіла не буде присутнім. Звичайно, однак, виділене антитіло буде отримане за допомогою щонайменше однієї стадії очищення. Базова одиниця 4-ланцюжкового антитіла являє собою гетеротетрамерний глікопротеїн, складений з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (Н) ланцюгів (IgM антитіло складається з 5 базових гетеротетрамерних одиниць поряд з додатковим поліпептидом, що називається J ланцюг, і, отже, містить 10 антиген-зв'язувальних ділянок, в той час як секретовані IgA антитіла можуть полімеризуватися з утворенням полівалентних агрегатів, що містять 2-5 базових 4-ланцюжкових одиниць, нарівні з J ланцюгом). У випадку IgG, 4ланцюжкова одиниця становить, як правило, приблизно 150000 Дальтон. Кожний L ланцюг зв'язаний з Н ланцюгом за допомогою одного ковалентного дисульфідного зв'язку, в той час як двоа Н ланцюги зв'язані один з одним за допомогою одного або більше дисульфідних зв'язків залежно від ізотипу Н ланцюга. Кожен Н і L ланцюг також має внутрішньоланцюжкові дисульфідні містки з регулярними інтервалами. Кожний Н ланцюг має N-кінець, варіабельний домен (VH) з подальшими трьома константними доменами (CH) для кожного з α і γ ланцюгів і чотирма CH доменами для μ і ε ізотипів. Кожний L ланцюг має N-кінець, варіабельний домен (VL) з подальшим константним доменом (CL) по її іншому кінцю. VL вирівняний з VH, і CL вирівняний з першим константним доменом важкого ланцюга (CH1). Вважають, що конкретні амінокислотні залишки утворять межа розділу фаз між варіабельними доменами з легким ланцюгом і з важким ланцюгом. Утворення пари VH і VL разом утворить одиничну антигензв'язувальну ділянку. По структурі і властивостям різних класів антитіл, див., наприклад, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel Р. Stites, Abba I. Terr and Triсtram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Норwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6. L ланцюг від будь-якого вигляду хребетних може бути віднесена до одного з двох чітко помітних типів, які називаються каппа і лямбда, на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів. Залежно від амінокислотної послідовності їх константних доменів з важким ланцюгом (CH), імуноглобуліни можуть бути віднесені до різних класів або ізотипів. Існують п'ять класів імуноглобулінів: IgA, IgD, IgE, IgG і IgM, що мають важкі ланцюги, позначені α, δ, ε, γ і μ, відповідно. γ і α класи додатково розділені на підкласи на основі відносно мінорних відмінностей в CH послідовності і функції, наприклад, люди експресують наступні підкласи: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 і IgA2. Термін "варіабельний" стосується того факту, що деякі сегменти варіабельних доменів відрізняються по послідовності між антитілами. V домен опосередковує зв'язування антигена і визначає специфічність конкретного антитіла для його конкретного антигена. Однак, варіабельність не однорідно розподілена протягом 110-амінокислотної протяжності варіабельних доменів. Замість цього, V області складаються з відносно інваріантних ділянок, які називаються каркасними областями (FR) з 15-30 амінокислот, розділених більш короткими областями крайньої варіабельності, які називаються "гіперваріабельними областями", які мають кожна 9-12 амінокислот по довжині. Варіабельні домени нативних важких і легких ланцюгів кожний містить чотири FR, що в основному приймають β-листову конфігурацію, з'єднаних за допомогою трьох гіперваріабельних областей, які утворюють петлі, які з'єднують, і в деяких випадках утворюють частину, структури β-листа. Гіперваріабельні області в кожному ланцюгу утримуються разом в тісній близькості за допомогою FR і, разом з гіперваріабельними областями від іншого ланцюга, сприяють утворенню антиген-зв'язувальної ділянки антитіла (див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени не є включеними безпосередньо в зв'язування антитіла з антигеном, але виявляють різноманітні ефекторні функції, такі як участь антитіла в залежній від антитіла клітинній цитотоксичності (ADCC). Термін "моноклональне антитіло" як використовують в даній заявці, стосується антитіла, отриманого від популяції по суті гомогенних антитіл, тобто, індивідуальні антитіла, що містяться в популяції, є ідентичними за винятком можливих мутацій, що зустрічаються в природі, які можуть бути присутніми в мінорних кількостях. Моноклональні антитіла є високоспецифічними, будучи направленими проти одиничної антигенної ділянки. Крім того, на противагу препаратам поліклональних антитіл, які включають різні антитіла, направлені проти різних детермінантів (епітопів), кожне моноклональне антитіло направлене проти одиничного детермінанта на антигені. У доповнення до їх специфічності, моноклональні антитіла є переважними в тому, що вони можуть бути синтезовані незабрудненими іншими антитілами. Під визначенням 22 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "моноклональний" не мається на увазі, як вимагаюче продукування антитіла за допомогою будьякого конкретного способу. Наприклад, моноклональні антитіла, застосовні в даному винаході, можуть бути отримані за допомогою гібридомної методології, уперше описаної Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), або можуть бути отримані з використанням методів з рекомбінантної ДНК в бактерійних, еукаріотичних тварин або рослинних клітинах (див., наприклад, патент США № 4816567). "Моноклональні антитіла" можуть також бути виділені з бібліотек фагових антитіл, з використанням методів, описаних, наприклад, у Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991) і Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991). Моноклональні антитіла в даній заявці включають "химерні" антитіла, в яких частина важкого і/або легкого ланцюга є ідентичною з або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, які походять від конкретних видів або належать конкретному класу або підкласу антитіла, в той час як частина ланцюга(ланцюгів), що залишилася, є ідентичною з або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, які походять від ще одного іншого виду або що належать до ще одного іншого класу або підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, оскільки вони виявляють бажану біологічну активність (див. патент США № 4816567; і Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Химерні антитіла, що представляють інтерес, в даній заявці включають "приматизовані" антитіла, що містять варіабельний домен антиген-зв'язувальних послідовностей, які походять від нелюдського примату (наприклад, мавпи Старого Світу, примату і т. д.), і константну область послідовностей людини. "Інтактне" антитіло являє собою антитіло, яке містить антиген-зв'язувальну ділянку, а також CL і щонайменше константні домени важкого ланцюга, CH1, CH2 і CH3. Константні домени можуть являти собою константні домени нативної послідовності (наприклад, константні домени нативної послідовності людини) або їх варіант амінокислотної послідовності. Переважно, інтактне антитіло має одну або більше ефекторних функцій. "Фрагменти антитіла" містять частину інтактного антитіла, переважно, антиген-зв'язувальну або варіабельну область інтактного антитіла. Приклади фрагментів антитіла включають Fab, Fab', F(ab')2, і Fv фрагменти; діатіла; лінійні антитіла (див. патент США № 5641870, Приклад 2; Zapata et al, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); молекули антитіл з єдиним ланцюгом; і мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Розщеплення антитіл папаїном продукує два ідентичні антиген-зв'язувальні фрагменти, які називаються "Fab'фрагменти, і залишковий "Fc" фрагмент, позначення, що відображає здатність легко кристалізуватися. Fab фрагмент складається з повного L ланцюга нарівні з доменом варіабельної області Н ланцюга (VH), і перший константний домен одного важкого ланцюга (CH1). Кожний Fab фрагмент є моновалентним по відношенню до зв'язування антигена, тобто, він має одиничну антиген-зв'язувальну ділянку. Обробка антитіла пепсином дає на виході одиничний великий F(ab')2 фрагмент, який приблизно відповідає двом дисульфідно зв'язаним Fab фрагментам, що мають дивалентну антиген-зв'язувальну активність, і все ще здатним до зшивання з антигеном. Fab' фрагменти відрізняються від Fab фрагментів тим, що мають додаткові декілька залишків по карбоксикінцю домену CH1, що включає один або більше цистеїнів шарнірної області антитіла. Fab'-SH являє собою позначення, подане в даній заявці для Fab', в якому цистеїнові залишок(залишки) константних доменів несуть вільнутіольну групу. F(ab')2 фрагменти антитіл спочатку були отримані як пари Fab' фрагментів, які мають шарнірні цистеїни між ними. Відомі також інші хімічні сполучення фрагментів антитіл. Fc фрагмент містить карбоксикінцеві частини обох Н ланцюгів, що втримуються разом за допомогою дисульфідів. Ефекторні функції антитіл визначаються послідовностями в Fc-області, яка також являє собою частину, розпізнавану Fc рецепторами (FcR), виявленими на деяких типах клітин. "Fv" являє собою мінімальний фрагмент антитіла, який містить повну антигенрозпізнавальну і -зв'язувальну ділянку. Цей фрагмент складається з димера одного з важким ланцюгом і одного з легким ланцюгом доменів варіабельної області в щільній, нековалентной асоціації. Від вигинів цих двох доменів відбувається утворення шести гіперваріабельних петель (3 петлі від кожної з Н і L ланцюгів), що сприяє зв'язуванню антигена амінокислотними залишками і додає специфічності зв'язуванню антигена з антитілом. Однак, навіть одиничний варіабельний домен (або половина Fv, що містить тільки три CDR, специфічні для антигена) має здатність до розпізнавання і зв'язування антигена, хоч при більш низькій спорідненості, ніж для повної ділянки зв'язування. "Одинично-ланцюжковий Fv", що також скорочується як "sFv" або "scFv", являє собою фрагменти антитіл, які містять VH і VL домени антитіл, з'єднані в одиничний поліпептидний ланцюг. Переважно, sFv поліпептид додатково містить поліпептидний лінкер між VH і VL 23 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 доменами, який дозволяє sFv утворювати бажані структури для зв'язування антигена. Огляд по sFv, див. Pluckthun in Pharmacology Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, нижче. Термін "діатіла" стосується невеликих фрагментів антитіл, отриманих за допомогою збирання sFv фрагментів (див. попередній параграф) з короткими лінкерами (приблизно 5-10 залишків) між VH і VL доменами, таким чином, що досягається міжланцюжкове, але не внутрішньоланцюжкове спарювання V доменів, що приводить в результаті до бівалентного фрагмента, тобто, фрагмента, що має дві антиген-зв'язувальні ділянки. Біспецифічні діатіла являють собою гетеродимери двох "перехресних" sFv фрагментів, в яких VH і VL домени двох антитіл присутні на різних поліпептидних ланцюгах. Діатіла описані більш повно в, наприклад, EP 404097; WO 93/11161; і Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). "Гуманізовані" форми нелюдських антитіл (наприклад, гризунів) являють собою химерні антитіла, які містять мінімальну послідовність, яка походить від нелюдського антитіла. Переважно, гуманізовані антитіла являють собою імуноглобуліни людини (реципієнтне антитіло), в яких залишки з гіперваріабельної області реципієнта замінені на залишки з гіперваріабельної області нелюдських видів (донорне антитіло), таких як миші, щури, кролики або примати, що не є людиною, що мають специфічність, спорідненість і здатність бажаного антитіла. У деяких випадках, залишки каркасної області (FR) імуноглобуліну людини замінені на відповідні нелюдські залишки. Крім того, гуманізовані антитіла можуть містити залишки, які не виявляються в реципієнтному антитілі або в донорному антитілі. Ці модифікації проробляють, щоб додатково поліпшити ефективність дії антитіла. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити по суті всі зі щонайменше одного, і звичайно двох, варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі з гіперваріабельних петель відповідають петлям нелюдського імуноглобуліну, і всі або по суті всі з FR являють собою FR послідовності імуноглобуліну людини. Гуманізоване антитіло необов'язково також буде містити щонайменше частину константної області імуноглобуліну (Fc), звичайно з імуноглобуліну людини. Додаткові подробиці, див. Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); і Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). "Видозалежне антитіло", наприклад, антитіло ссавця проти IgE людини, являє собою антитіло, яке має більш високу спорідненість до зв'язування для антигена від першого виду ссавця, ніж воно має для гомолога цього антигена від другого виду ссавця. Звичайно, видозалежне антитіло "зв'язується специфічно" з антигеном людини (тобто, має значення -7 спорідненості до зв'язування (Kd), яке дорівнює не більше ніж приблизно 1×10 M, переважно, -8 -9 не більше ніж приблизно 1×10 , і, найбільш переважно, не більше ніж приблизно 1×10 M), але має спорідненість зв'язування для гомолога антигена від другого нелюдського виду ссавця, яке щонайменше приблизно в 50 разів, або щонайменше приблизно в 500 разів, або щонайменше приблизно в 1000 разів, слабше, ніж його спорідненість зв'язування для антигена людини. Видозалежне антитіло може являти собою будь-який з різноманітних типів антитіл, як визначено вище, але, переважно, є гуманізованим антитілом або антитілом людини. Термін "нумерація залишків варіабельного домену по Кабату" або "нумерація амінокислотного положення по Кабату", і їх варіації, стосується системи нумерації, що використовується для варіабельних доменів з важким ланцюгом або варіабельних доменів з легким ланцюгом з компіляції антитіл в Kabat et al., Sequences Proteins Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes Health, Bethesda, MD. (1991). З використанням цієї системи нумерації, дійсна лінійна амінокислотна послідовність може містити меншу кількість або додаткові амінокислоти, відповідні укороченню, або введенню в, FR або CDR варіабельного домену. Наприклад, варіабельний домен з важким ланцюгом може включати одиничну амінокислотну вставку (залишок 52a відповідно до Кабат) після залишку 52 з H2 і введені залишки (наприклад, залишки 82a, 82b і 82c, і т. д., відповідно до Кабат) після залишку з важким ланцюгом FR 82. Нумерація залишків по Кабат може бути визначена для даного антитіла за допомогою вирівнювання в лінію в областях гомології послідовності антитіла зі "стандартною" пронумерованою по Кабат послідовності. Фраза "по суті схожі" або "по суті такі ж", як використовують в даній заявці, означає досить високий ступінь схожості між двома числовими значеннями (звичайно, одним, пов'язаним з антитілом винаходу, і іншим, пов'язаним з референтним/для порівняння антитілом) таким чином, що кваліфікований фахівець в даній галузі буде вважати відмінність між двома значеннями маленьким або що не має біологічної і/або статистичної значущості в межах контексту біологічної характеристики, виміряної по вказаних значеннях (наприклад, значеннях Kd). Відмінність між вказаними двома значеннями, переважно, складає менше ніж приблизно 50 %, переважно, менше ніж приблизно 40 %, переважно, менше ніж приблизно 30 %, 24 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно, менше ніж приблизно 20 %, переважно, менше ніж приблизно 10 % як функція значення для референтного/для порівняння антитіла. "Спорідненість зв'язування", загалом, стосується міцності загальної суми нековалентних взаємодій між одиничною ділянкою зв'язування молекули (наприклад, антитіла) і його партнером зв'язування (наприклад, антигеном). Якщо не указано інакше, як використовують в даній заявці, "спорідненість зв'язування" стосується характеристичної спорідненості зв'язування, яка відображає 1:1 взаємодію між елементами пари зв'язування (наприклад, антитіла і антигена). Спорідненість молекули X до її партнера Y може, загалом, представлено за допомогою константи дисоціації (Kd). Спорідненість може бути виміряна за допомогою загальноприйнятих способів, відомих в даній галузі, що включають способи, описані в даній заявці. Низькоафінні антитіла, як правило, зв'язують антиген повільно і мають тенденцію легко дисоціювати, в той час як високоафінні антитіла, як правило, зв'язують антиген швидше і мають тенденцію залишатися зв'язаними довше. Різноманітні способи вимірювання спорідненості зв'язування відомі в даній галузі, будь-які з яких можуть застосовуватися для цілей даного винаходу. Конкретні ілюстративні варіанти здійснення описані далі. У одному варіанті здійснення, "Kd" або "значення Kd" відповідно до даного винаходу вимірюють за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно-міченого антигена (RIA), здійснюваного з Fab версією антитіла, що представляє інтерес, і його антигена, як описано за допомогою подальшого аналізу, який вимірює спорідненість зв'язування розчину Fab до 125 антигену за допомогою урівноваження Fab з мінімальною концентрацією ( I)-міченого антигена в присутності титрувального ряду неміченого антигена, потім захоплення зв'язаного антигена з планшетом, покритим антитілами проти-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Для встановлення умов для аналізу, титраційні мікропланшети (Dynex) покривають протягом ночі 5 мкг/мл захоплюючого антитіла проти-Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонаті натрію (pH 9,6), і далі блокують 2 % (мас./об.) альбуміном бичачої сироватки в PBS протягом двох-п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 °C). У неадсорбуючому планшеті (Nunc #269620), 100 пM 125 або 26 пM [ I]-антиген змішують з серійним розведенням Fab, що представляє інтерес (наприклад, відповідно до оцінки антитіла проти-VEGF, Fab-12, в Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab, що представляє інтерес, далі інкубують протягом ночі; однак, інкубація може продовжуватися протягом більш тривалого періоду (наприклад, 65 годин) для гарантії, що рівновага досягнута. Потім, суміші переносять в планшет для захоплення для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Розчин потім видаляють, і планшет видаляють вісім разів з 0,1 % Твін-20 в PBS. Коли планшети висушують, додають 150 мкл/ямку сцинтилятору (МікроScint-20; Packard), і планшети підраховують на гамма-лічильнику Topcount (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Fab, які дають менше ніж або дорівнюють 20 % від максимального зв'язування вибирають для застосування в аналізах з конкурентним зв'язуванням. Відповідно до ще одного іншого варіанту здійснення Kd або значення Kd вимірюють за допомогою використання аналізів поверхневого плазмонного резонансу, застосовуючи BIAcore™-2000 або BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25 °C з чипами з іммобілізованим антигеном CM5 при ~10 одиницях відгуку (RU). Коротко, біосенсорні чипи (CM5, BIAcore Inc.) з карбоксиметилованим декстраном активують гідрохлоридом N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)-карбодііміду (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ ацетатом натрію, pH 4,8, в 5 мкг/мл (~0,2 мкM) перед ін'єкційним введенням при швидкості потоку, яка дорівнює 5 мкл/хвилина для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (RU) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигена, 1M етаноламін ін'єктують в блок-непрореагувавші групи. Для вимірювань кінетики, двократне серійне розведення Fab (0,78 нM до 500 нM) ін'єкційно вводить в PBS з 0,05 % Твін 20 (PBST) при 25 °C при швидкості потоку, яка дорівнює приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (kon) і швидкості дисоціації (koff) розраховують, використовуючи просту модель зв'язування один-до-одного Ленгмюра (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної апроксимації сенсограми асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) розраховують як відношення koff/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al, (1999) J. Mol Biol 293:8656 -1 -1 881. Якщо швидкість асоціації перевищує 10 M S за результатами аналізу поверхневого плазмонного резонансу, згаданого вище, потім швидкість асоціації може бути визначена за допомогою використання методу гасіння флуоресценції, який вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, смуга пропускання = 16 нм) при 25 °C 20 нМ антитіла проти-антигена (Fab форма) в PBS, pH 7,2, в присутності збільшуваної концентрації антигена, як вимірюють спектрометром, таким як спектрофотометр, обладнаний зупинкою потоку (Aviv Instruments) або SLM-Aminco спектрофотометр 8000-серії (Thermo Spectronic) з перемішуваною кюветою. 25 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Швидкість асоціації" або "ступінь асоціації" або "асоціаційна швидкість" або "kon" відповідно до даного винаходу може також визначатися за допомогою того ж методу поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, з використанням BIAcore™-2000 або BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 25 °C з чипами з іммобілізованим антигеном CM5 при ~10 одиницях відповіді (RU). Коротко, біосенсорні чипи (CM5, BIAcore Inc.) з карбоксиметилованим декстраном активують гідрохлоридом N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)-карбодііміду (EDC) і Nгідроксисукцинімідом (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ ацетатом натрію, pH 4,8, в 5 мкг/мл (~0,2 мкM) перед ін'єкційним введенням при швидкості потоку, яка дорівнює 5 мкл/хвилина для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (RU) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигена, 1M етаноламін ін'єктують в блок-непрореагувавші групи. Для вимірювань кінетики, двократне серійне розведення Fab (0,78 нM до 500 нM) ін'єкційно вводить в PBS з 0,05 % Твін 20 (PBST) при 25 °C при швидкості потоку, яка дорівнює приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (kon) і швидкості дисоціації (koff) розраховують, використовуючи просту модель зв'язування один-до-одного Ленгмюра (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної апроксимації сенсограми асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) розраховують як відношення koff/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al, (1999) J. 6 -1 -1 Mol Biol 293:865-881. Якщо швидкість асоціації перевищує 10 M S за результатами аналізу поверхневого плазмонного резонансу, згаданого вище, потім швидкість асоціації може бути визначена за допомогою використання методу гасіння флуоресценції, який вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, смуга пропускання = 16 нм) при 25 °C 20 нМ антитіла проти-антигена (Fab форма) в PBS, pH 7,2, в присутності збільшуваної концентрації антигена, як вимірюють спектрометром, таким як спектрофотометр, обладнаний зупинкою потоку (Aviv Instruments) або SLM-Aminco спектрофотометр 8000-серії (Thermo Spectronic) з перемішуваною кюветою. "Kd" або "значення Kd" відповідно до даноговинаходу в одному варіанті здійснення вимірюють за допомогою аналізу зв'язування радіоактивно-міченого антигена (RIA), здійснюваного з Fab версією антитіла, що представляє інтерес, і його антигена, як описано за допомогою подальшого аналізу, який вимірює спорідненість зв'язування розчину Fab до антигену за допомогою 125 урівноваження Fab з мінімальною концентрацією ( I)-міченого антигена в присутності титрувального ряду неміченого антигена, потім захоплення зв'язаного антигена з планшетом, покритим антитілами проти-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Для встановлення умов для аналізу, титраційні мікропланшети (Dynex) покривають протягом ночі 5 мкг/мл захоплюючого антитіла проти-Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбонаті натрію (pH 9,6), і далі блокують 2 % (мас./об.) альбуміном бичачої сироватки в PBS протягом двох-п'яти годин при кімнатній температурі (приблизно 23 °C). У неадсорбуючому планшеті (Nunc #269620), 100 пM 125 або 26 пM [ I]-антиген змішують з серійним розведенням Fab, що представляє інтерес (наприклад, відповідно до оцінки антитіла проти-VEGF, Fab-12, в Presta et al., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab, що представляє інтерес, далі інкубують протягом ночі; однак, інкубація може продовжуватися протягом більш тривалого періоду (наприклад, 65 годин) для гарантії, що рівновага досягнута. Потім, суміші переносять в планшет для захоплення для інкубації при кімнатній температурі (наприклад, протягом однієї години). Розчин потім видаляють, і планшет промивають вісім разів з 0,1 % Твін-20 в PBS. Коли планшети висушують, додають 150 мкл/ямку сцинтилятора (МікроScint-20; Packard), і планшети підраховують на гамма-лічильнику Topcount (Packard) протягом десяти хвилин. Концентрації кожного Fab, які дають менше ніж або дорівнюють 20 % від максимального зв'язування, вибирають для застосування в аналізах з конкурентним зв'язуванням. Відповідно до ще одного іншого варіанту здійснення Kd або значення Kd вимірюють за допомогою використання аналізів поверхневого плазмонного резонансу, застосовуючи BIAcore™-2000 або BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25 °C з чипами з іммобілізованим антигеном CM5 при ~10 одиницях відгуку (RU). Коротко, біосенсорні чипи (CM5, BIAcore Inc.) з карбоксиметилованим декстраном активують гідрохлоридом N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)-карбодііміду (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ ацетатом натрію, pH 4,8, в 5мкг/мл (~0,2 мкM) перед ін'єкційним введенням при швидкості потоку, яка дорівнює 5 мкл/хвилина для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (RU) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигена, 1M етаноламін ін'єктують в блок-непрореагувавші групи. Для вимірювань кінетики, двократне серійне розведення Fab (0,78 нM до 500 нM) ін'єкційно вводить в PBS з 0,05 % Твін 20 (PBST) при 25 °C при швидкості потоку, яка дорівнює приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (kon) і швидкості дисоціації (koff) розраховують, використовуючи просту модель зв'язування один-до-одного Ленгмюра (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної апроксимації сенсограми асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) 26 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розраховують як відношення koff/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al, (1999) J. Mol Biol 293:865881. Якщо швидкість асоціації перевищує 106 M-1 S-1 за результатами аналізу поверхневого плазмонного резонансу, згаданого вище, потім швидкість асоціації може бути визначена за допомогою використання методу гасіння флуоресценції, який вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, 16 нм смуга пропускання) при 25 °C 20 нМ антитіла проти-антигена (Fab форма) в PBS, pH 7,2, в присутності збільшуваної концентрації антигена, як вимірюють спектрометром, таким як спектрофотометр, обладнаний зупинкою потоку (Aviv Instruments) або SLM-Aminco спектрофотометр 8000-серії (Thermo Spectronic) з перемішуваною кюветою. У одному варіанті здійснення, "швидкість асоціації" або "ступінь асоціації" або "ассоціаційна швидкість" або "kon" відповідно до даного винаходу може також визначатися за допомогою того ж методу поверхневого плазмонного резонансу, описаного вище, з використанням BIAcore™2000 або BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) 25 °C з чипами з іммобілізованим антигеном CM5 при ~10 одиницях відповіді (RU). Коротко, біосенсорні чипи (CM5, BIAcore Inc.) з карбоксиметилованим декстраном активують гідрохлоридом N-етил-N'-(3-диметиламінопропіл)карбодііміду (EDC) і N-гідроксисукцинімідом (NHS) відповідно до інструкцій постачальника. Антиген розбавляють 10 мМ ацетатом натрію, pH 4,8, в 5 мкг/мл (~0,2 мкM) перед ін'єкційним введенням при швидкості потоку, яка дорівнює 5 мкл/хвилина для досягнення приблизно 10 одиниць відповіді (RU) зв'язаного білка. Після ін'єкції антигена, 1M етаноламін ін'єктують в блокнепрореагувавші групи. Для вимірювань кінетики, двократне серійне розведення Fab (0,78 нM до 500 нM) ін'єкційно вводить в PBS з 0,05 % Твін 20 (PBST) при 25 °C при швидкості потоку, яка дорівнює приблизно 25 мкл/хв. Швидкості асоціації (kon) і швидкості дисоціації (koff) розраховують, використовуючи просту модель зв'язування один-до-одного Ленгмюра (BIAcore Evaluation Software version 3.2) за допомогою одночасної апроксимації сенсограми асоціації і дисоціації. Рівноважну константу дисоціації (Kd) розраховують як відношення koff/kon. Див., наприклад, Chen, Y., et al, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Якщо швидкість асоціації перевищує 106 M-1 S-1 за результатами аналізу поверхневого плазмонного резонансу, згаданого вище, потім швидкість асоціації може бути визначена за допомогою використання методу гасіння флуоресценції, який вимірює збільшення або зменшення інтенсивності емісії флуоресценції (збудження = 295 нм; емісія = 340 нм, смуга пропускання = 16 нм) при 25 °C 20 нМ антитіла проти-антигена (Fab форма) в PBS, pH 7,2, в присутності збільшуваної концентрації антигена, як вимірюють спектрометром, таким як спектрофотометр, обладнаний зупинкою потоку (Aviv Instruments) або SLM-Aminco спектрофотометр 8000-серії (Thermo Spectronic) з перемішуваною кюветою. Фраза "значно знижені" або "значно відмінні", як використовують в даній заявці, означає досить високий ступінь відмінності між двома числовими значеннями (як правило, одного, пов'язаного з антитілом винаходу і іншого, пов'язаного з референтним/для порівняння антитілом), таким чином, що кваліфікований фахівець в даній галузі буде розглядати відмінність між двома значеннями, як що має статистичну значущість в межах контексту біологічної характеристики, виміряної по вказаних значеннях (наприклад, значення Kd, відгук HAMA). Відмінність між вказаними двома значеннями є, переважно, вищою ніж приблизно 10 %, переважно, вищою ніж приблизно 20 %, переважно, вищою ніж приблизно 30 %, переважно, вищою ніж приблизно 40 %, переважно, вищою ніж приблизно 50 % як функція значення для референтного/для порівняння антитіла. "Антиген" являє собою попередньо визначений антиген, з яким антитіло може селективно зв'язуватися. Цільовий антиген може являти собою поліпептид, вуглевод, нуклеїнову кислоту, ліпід, гаптен або іншу сполуку, що зустрічається в природі, або синтетичну сполуку. Переважно, цільовий антиген є поліпептидом. "Акцепторний каркас людини" для цілей в даній заявці являє собою каркас, що містить амінокислотну послідовність каркаса VL або VH, який походить від каркаса імуноглобуліну людини або від консенсусного каркаса людини. Акцепторний каркас людини, "який походить від" каркаса імуноглобуліну людини, або консенсусний каркас людини можуть містити однакову їх амінокислотну послідовність або можуть містити попередньо існуючі зміни амінокислотної послідовності. Там, де присутні попередньо існуючі амінокислотні зміни, переважно, не більше ніж 5 і, переважно, 4 або менше, або 3 або менше, попередньо існуючі амінокислотні зміни присутні. Там, де попередньо існуючі амінокислотні зміни присутні в VH, переважно, ці зміни присутні тільки по трьох, двох або одному з положень 71H, 73H і 78H; наприклад, амінокислотні залишки по цих положеннях можуть бути 71A, 73T і/або 78A. У одному варіанті здійснення, VL акцепторний каркас людини є ідентичним по послідовності з каркасною послідовністю VL імуноглобуліну людини або консенсусною каркасною послідовністю людини. 27 UA 109423 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіла даного винаходу можуть мати здатність до конкуренції за зв'язування з одним і тим же епітопом, зв'язаним з другим антитілом. Вважають, що моноклональні антитіла ділять "один і той же епітоп", якщо кожне блокує зв'язування іншого на 40 % або вище при такій же концентрації антитіла в стандартному аналізі in vitro конкурентного зв'язування антитіл. "Консенсусний каркас людини" являє собою каркас, який представляє собой амінокислотний залишок, що найчастіше зустрічається, при виборі VL або VH каркасних послідовностей імуноглобуліну людини. Загалом, вибір VL або VH послідовностей імуноглобуліну людини походить з підгрупи послідовностей варіабельного домену. Загалом, підгрупи послідовностей є підгрупами, як приведено у Kabat et al. У одному варіанті здійснення, для VL, підгрупа є підгрупою каппа I, як у Kabat et al. У одному варіанті здійснення, для VH, підгрупа є підгрупою III як у Kabat et al. "Консенсусний каркас VH підгрупи III" містить консенсусну послідовність, отриману з амінокислотних послідовностей у варіабельній важкій підгрупі III по Kabat et al. "Консенсусний каркас VL підгрупи I" містить консенсусну послідовність, отриману з амінокислотних послідовностей у варіабельній легкій каппа підгрупі I по Kabat et al. "Немодифікований каркас людини" представляє каркас людини, який має таку ж амінокислотну послідовність, як і акцепторний каркас людини, наприклад, без від людських до нелюдських амінокислотних замін в акцепторному каркасі людини. "Змінена гіперваріабельна область" для цілей даного винаходу являє собою гіперваріабельну область, що містить одну або більше (наприклад, від однієї до приблизно 16) амінокислотних замін в них. "Немодифікована гіперваріабельна область" для цілей даного винаходу являє собою гіперваріабельну область, що має таку ж амінокислотну послідовність, як і нелюдське антитіло, з якого вона була отримана, тобто область, в якій відсутні одна або більше амінокислотних замін. Термін "гіперваріабельна область", "HVR", "HV" або "CDR", коли використовують в даній заявці, стосується областей варіабельного домену антитіла, які є гіперваріабельними по послідовності і/або утворюють структурно визначені петлі. Загалом, антитіла містять шість гіперваріабельних областей; три в VH (H1, H2, H3), і три в VL (L1, L2, L3). Ряд розмежування гіперваріабельних областей знаходяться в застосуванні і охоплені в даній заявці. Області визначення комплементарності по Кабат (CDR) основані на варіабельності послідовності і використовуються найчастіше (Kabat et al., Sequences Proteins Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia дає замість цього посилання на розташування структурних петель (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). "Контактні" гіперваріабельні області основані на аналізі доступних комплексних кристалічних структур. Залишки від кожної з цих гіперваріабельних областей відмічені нижче. Якщо не визначено інакше, буде використана нумерація по Кабат. Розташування гіперваріабельної області, як правило, є наступним: амінокислоти 24-34 (HVR-L1), амінокислоти 49-56 (HVR-L2), амінокислоти 89-97 (HVR-L3), амінокислоти 26-35A (HVR-H1), амінокислоти 4965 (HVR-H2) і амінокислот 93-102 (HVR-H3). Гіперваріабельні області можуть також містити "розширені гіперваріабельні області" таким чином: амінокислоти 24-36 (L1), і амінокислоти 46-56 (L2) в VL. Залишки варіабельного домену нумеруються відповідно до Kabat et al, вище для кожного з цих визначень. "Каркасні" або "FR" залишки являють собою такі залишки варіабельного домену, відмінні від залишків гіперваріабельної області, як в даній заявці визначено. "Антитіло людини" являє собою антитіло, яке має амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності антитіла, продукованій людиною, і/або була отримана з використанням будь-якого з методів для отримання антитіл людини, як описано в даній заявці. Це визначення антитіла людини конкретно виключає гуманізоване антитіло, що містить нелюдські антигензв'язувальні залишки. Антитіло "зрілої афінності" являє собою антитіло з однією або більше змінами в одній або більше їх CDR, які приводять до поліпшення спорідненості антитіла до антигену, в порівнянні з батьківським антитілом, яке не має цих змін. Переважні антитіла зрілої афінності будуть мати наномолярні або навіть пікомолярні значення спорідненості до цільового антигену. Антитіла зрілої афінності отримують за допомогою методик, відомих в даній галузі. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описує зрілу афінність за допомогою перетасовування VH і VL доменів. Статистичний мутагенез CDR і/або каркасних залишків описаний в: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); і Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). 28