Олігонуклеотид або його функціональний гомолог, композиція, яка містить його, і спосіб лікування в-клітинної пухлини

1. Спосіб лікування В-клітинної пухлини у суб'єкта-ссавця, що передбачає введення суб'єкту, якому потрібне лікування, терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції, що містить олігонуклеотид, який має послідовність SEQ ID NO:1. 2. Спосіб за п.1, що передбачає індукцію апоптозу В-клітинних пухлинних клітин. 3. Спосіб за п.1, що передбачає підвищення експресії CD40 на В-клітинних пухлинних клітинах. 4. Спосіб за п.1, де вказаний спосіб передбачає стимуляцію утворення IL-10 В-клітинними пухлинними клітинами. 5. Спосіб за п.1, де вказана В-клітинна пухлина є В-клітинним лейкозом, В-клітинної лімфомою або мієломою. 6. Спосіб за п.5, де вказаний В-клітинний лейкоз є В-клітинним хронічним лімфолейкозом або Вклітинним гострим лімфолейкозом. 7. Спосіб за п.5, де вказана В-клітинна лімфома є лімфомою з малих лімфоцитів. 8. Спосіб за п.1, де вказаний суб'єкт-ссавець є суб'єктом-людиною. 9. Спосіб за п.1, де вказану фармацевтичну композицію вводять ентерально, парентерально або місцево, або шляхом інгаляції. 2 (19) 1 3 91057 4 21. Композиція за п.17, де вказана променева терапія являє собою зовнішнє опромінення або ліку вання антитілами, міченими радіоактивним ізотопом. Даний винахід стосується олігонуклеотиду з послідовністю, показаною в SEQ ID NO:1, або його функціонального гомолога, композиції, яка його містить, і способу лікування В-клітинної пухлини з використанням олігонуклеотиду, основаного на індукції апоптозу В-клітинних пухлинних клітин, на підвищенні експресії CD40 на В-клітинних пухлинних клітинах і на стимуляції утворення Вклітинними пухлинними клітинами IL-10. Для лікування В-клітинної пухлини олігонуклеотид або його функціональний гомолог можуть використовуватися самостійно або в комбінації з хіміотерапевтичними засобами, імунотерапевтичними засобами і опроміненням. Згідно з системою класифікації ВОЗ (American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121), лімфоїдні злоякісні пухлини поділяють на три основних класи: В-клітинні пухлини, пухлини з Тлімфоцитів/природних кілерів (NK) і лімфому Ходжкіна. В-клітинні пухлини поділяють на дві групи: пухлина з попередників В-лімфоцитів і пухлина з периферичних В-лімфоцитів. Пухлина з попередників В-лімфоцитів включає гострий лімфобластний лейкоз з попередників В-лімфоцитів (Вклітинний гострий лімфобластний лейкоз, ВГЛЛ)/лімфобластну лімфому (LBL). Пухлина з периферичних В-лімфоцитів включає В-клітинний хронічний лімфолейкоз (В-ХЛЛ), лімфому з малих лімфоцитів, В-клітинний пролімфоцитарний лейкоз, лімфо-плазмоцитарну лімфому/імуноцитому, лімфому з клітин зони мантії, фолікулярну лімфому, шкіряну фолікулярну лімфому, естранодальну В-клітинну лімфому з клітин маргінальної зони типу MALT, нодальну В-клітинну лімфому з клітин маргінальної зони (+/- моноцитоподібні Влімфоцити), лімфому з клітин маргінальної зони селезінки (+/- ворсинчасті лімфоцити), волосатоклітинний лейкоз, плазмоцитому/плазмоклітинну мієлому, дифузну В-великоклітинну лімфому, медіастинальну (тимусну) В-великоклітинну лімфому, внутрішньосудинну В-великоклітинну лімфому, первинну лімфому серозних оболонок і лімфому Беркітта. В-клітинний хронічний лімфолейкоз (В-ХЛЛ) і В-клітинний гострий лімфобластний/лімфоцитарний лейкоз (В-ГЛЛ) представлений двома типами В-клітинного лейкозу. Клітини В-ХЛЛ експресують CD 19, CD5 і CD23 (Nicholas Chiorazzi, M.D., et al.N Engl J Med 2005; 352:80415). Клітини В-ГЛЛ експресують маркери CD 19+CD10+. Лімфома з малих лімфоцитів являє собою Вклітинну пухлину. Моноклональна популяція Вклітин в лімфомі з малих лімфоцитів експресує CD 19, CD5 і CD23 (Catherine Thieblemont, et al. Blood. 2004; 103:2727-2737). Залежно від діагностованої В-клітинної пухлини, в даний час доводиться вибирати між такими видами лікування як хіміотерапія, променева терапія і імунотерапія. CD40, експресований на клітинній поверхні нормальних В-лімфоцитів і дендритних клітин, відноситься до сімейства рецепторів фактора некрозу пухлини (TNFR). CD40L (CD 154), експресований на В-лімфоцитах, відноситься до сімейства фактора некрозу пухлини (Castle BE, et al. J Immunol 1993; 151: 1777-1788). Взаємодія CD40L і CD40 сприяє проліферації, диференціюванню і представленню антигенів В-лімфоцитів, дендритних клітин і моноцитів (Ranheim ЕА, et al. J Exp Med 1993; 177: 925-935; Yellin MJ, et al. J Immunol 1994; 153: 666-674; Banchereau J, et al. Anhu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M. von BergweltBaildonMS, etal. Blood 2002; 99: 3319-3325). CD40 також експресується на В-клітинних пухлинних клітинах. Показано, що посилення експресії CD40 сприяє апоптозу В-клітинних пухлинних клітин (Peter Chu, et al. PNAS, March 19, 2002, vol. 99, no: 6 3854-3859; Frank Dicker, et al. BLOOD, 15 April 2005 Volume 105, Number 8: 3193-3198). Експерименти, проведені і in vitro, і in vivo, показали, що стимуляція і підвищення експресії CD40 призводить до інгібування росту В-клітинних пухлинних клітин (Funakoshi et al., Blood 83: 27872794,1994; Murphy et al., Blood 86: 1946-1953, 1995; Eliopoulos, A. G., et al. 1996. Oncogene 13:2243; Hirano, A., et al. 1999. Blood 93:2999; Tong, A. W., M et al. 2001. Clin. Cancer Res. 7:691). Повідомлялося, що активація експресії CD40 на В-клітинних пухлинних клітинах підвищує антигенність В-клітинних пухлинних клітин і, отже, сприяє появі цитотоксичних В-лімфоцитів (CTL), направлених проти цих клітин. CTL можуть ефективно знищувати пухлинні В-клітини (Dilloo D, et al. Blood. 1997; 90:1927-1933; Kato К, et al. J Clin Invest. 1998; 101:1133-1141; Wierda WG, et al. Blood. 2000; 96:2917-2924; Takahashi S, et al. Hum Gene Ther. 2001; 12:659-670; Takahashi S, et al. Cancer Gene Ther. 2001; 8:378-387). В присутності CD40L B-клітини хронічного лімфолейкозу, що експресують CD40, можуть знищуватися цитотоксичними В-лімфоцитами, які несують CD4 (Frank Dicker, et al. Blood, 15 April 2005 Vol 105, Num 8: 3193-3198). Взаємодія D40L і CD40 на клітинах лімфоми Беркітта могла б сприяти презентації клітиною пухлинних антигенів специфічним CTL (Khanna, R. et al. 1997. J. Immunol. 159:5782). Експерименти in vivo і клінічні випробування також продемонстрували, що активація CD40 могла б підвищувати імуногенність клітин В-клітинного хронічного лімфолейкозу (В-ХЛЛ) і, отже, індукувати утворення CTL, специфічно направлених проти даних клітин (Kato, К., et al. 1998. J. Clin. Invest. 101:1133; Wierda, W. G., et al. 2000. Blood 96:2917). Разом взяті, ці дані вказують на те, що підвищення експресії CD40 на В-клітинних пухлинних клітинах може стимулювати протипухлинний імунітет, направлений проти В-клітинної пухлини. Про 5 типухлинний імунітет включає в себе наступне, але не обмежений перерахованим: 1. активацією апоптозу В-клітинних пухлинних клітин; 2. інгібуванням росту В-клітинних пухлинних клітин; 3. посиленням імуногенності В-клітинних пухлинних клітин і, тим самим, утворенням покоління CTL, специфічно направлених проти цих клітин. Інтерлейкін-10 (IL-10) є гомодимерним цитокіном, який синтезується визначеними В-клітинами, моноцитами, макрофагами і деякими пухлинними клітинами, які походять від В-клітин, В-клітин або NK-клітин (Kitabayashi et al., 1995; Masood et al, 1995; Sjoberg et al., 1996; Beatty et al, 1997; Boulland et al, 1998; Jones et al, 1999). Активність IL-10 опосередкована його специфічним рецептором, що знаходиться на поверхні клітини. Рецептор експресується на антигенрепрезентуючих клітинах, лімфоцитах, а також на клітинах Вклітинного хронічного лімфолейкозу (В-ХЛЛ). Виявлено, що додавання екзогенного IL-10 інгібує проліферацію клітин В-ХЛЛ, недавно виділених [з крові] хворих (Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol 89, No 11 (June 1), 1997: pp 41464152). Також повідомлялося, що IL-10 інгібує проліферацію клітин В-ХЛЛ і підвищує апоптоз клітин В-ХЛЛ (Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand, and Jacques Banchereau. Interleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179 January 1994 91-99). Імуностимулюючі протипухлинні властивості IL-10 обговорюються в огляді, автори якого передбачають, що гіперекспресія IL-10 в мікрооточенні пухлини може каталізувати відторгнення пухлини імунною системою (Simone Mocellin, Francesco M. Marincola and Howard A. Young. Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005;78:1043-1051). У даному винаході авторами запропонований олігонуклеотид і спосіб лікування В-клітинної пухлини за допомогою використання олігонуклеотиду згідно з винаходом. Олігонуклеотид викликає апоптоз В-клітинних пухлинних клітин, підвищує експресію CD40 на В-клітинних пухлинних клітинах і стимулює утворення В-клітинними пухлинних клітинами IL-10 - всі ці ефекти сприяють лікуванню Вклітинної пухлини. Перший варіант здійснення даного винаходу стосується олігонуклеотиду з послідовністю 5rTCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3' (сконструйованого як Оліго-2 або такого, що позначається SEQ ID NO:1) або його функціонального гомолога. Олігонуклеотид або його функціональний гомолог може мати модифікацію фосфатного кістяка, яка являє собою фосфортіоатну або фосфордитіоатну модифікацію, часткову або повну. Олігонуклеотид або його функціональний гомолог можуть мати хімічні модифікації або заміни на рідкі основи. Олігонуклеотид або його функціональний гомолог можуть бути функціональною частиною будь-якого іншого олігонуклеотиду або фрагмента ДНК, або 91057 6 можуть бути клоновані в плазміду, бактеріальний вектор, вірусний вектор або ДНК-вакцину, відповідно. Олігонуклеотид з послідовністю SEQ ID NO:1 може бути модифікований шляхом додавання однієї основи і більше (переважно 1-10 основ) до кожного кінця або шляхом зміни основ. Фахівцям в даній галузі вирішувати, чи використовувати олігонуклеотид з послідовністю SEQ ID NO:1 або його функціональний гомолог, або фрагмент ДНК, одноланцюговий або дволанцюговий, який містить одну і більше копій олігонуклеотиду з послідовністю (SEQ ID NO:1), щоб досягнути мети даного винаходу на основі суми знань, накопичених в даній галузі, і ідеї даного винаходу. Другий варіант здійснення даного винаходу стосується способу лікування В-клітинних пухлин у суб'єкта із застосуванням олігонуклеотиду або його функціонального гомолога згідно з винаходом або композицією, що містить вищезазначене. Суб'єктом є людина або тварина. В-клітинні пухлини включають в себе, але не обмежені В-клітинним лейкозом, В-клітинною лімфомою і мієломою. Третій варіант здійснення даного винаходу стосується способу лікування В-клітинної пухлини з використанням олігонуклеотиду або його функціонального гомолога згідно з винаходом або композицією, що містить вищезазначене, шляхом активації апоптозу В-клітинних пухлинних клітин. Четвертий варіант здійснення даного винаходу стосується способу лікування В-клітинної пухлини з використанням олігонуклеотиду або його функціонального гомолога згідно з винаходом або композицією, що містить вищезазначене, шляхом підвищення експресії CD40 на В-клітинних пухлинних клітинах. П'ятий варіант здійснення даного винаходу стосується способу лікування В-клітинної пухлини з використанням олігонуклеотиду або його функціонального гомолога згідно з винаходом або композицією, що містить вищезазначене, шляхом стимуляції утворення IL-10 В-клітинними пухлинними клітинами. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується композиції, що містить терапевтично ефективну кількість олігонуклеотиду або його функціонального гомолога згідно з винаходом в чистому вигляді або в складі або в поєднанні з фармацевтично прийнятними носіями. Композицію можна вводити за допомогою ентерального, парентерального і місцевого введення або шляхом інгаляції. Ще один варіант здійснення даного винаходу стосується способу лікування В-клітинних пухлин, що передбачає введення терапевтично ефективної кількості олігонуклеотиду або його функціонального гомолога згідно з винаходом або композицією, що містить вищезазначене, і щонайменше один засіб, направлений проти В-клітинних пухлин, включаючи хіміотерапевтичні засоби, імунотерапевтичні засоби і засоби, які використовуються в променевій терапії. Фіг.1. Апоптоз клітин В-ХЛЛ, викликаний Оліго2 (дозування) Клітини В-ХЛЛ культивували в середовищі, що містить 10% сироватки людини групи АВ, окремо 7 або разом з різною кількістю Оліго-2. На 7-й день клітини забарвлювали TMRE. Число життєздатних клітин В-ХЛЛ обчислювали як процентний вміст TMRE-позитивних клітин. Фіг.2. Вплив Оліго-2 на підвищення експресії CD40 на клітинах В-ХЛЛ Клітини В-ХЛЛ інкубували окремо або разом з Оліго-2 протягом 7 днів і потім забарвлювали антитілом FITC-CD40 для аналізу на експресію CD40, в якому використовували проточну цитометрію. На рівень експресії вказувала кількість MFI. Фіг.3. Вплив Оліго-2 на підвищення експресії CD40 на клітинах лімфоми з малих лімфоцитів Клітини лімфоми з малих лімфоцитів інкубували окремо або разом з Оліго-2. На 7-й день клітини забарвлювали антитілом FITC-CD40 для аналізу на експресію CD40, в якому використовували проточну цитометрію. На рівень експресії вказувала кількість MFI. Фіг.4. Апоптоз клітин В-ГЛЛ, викликаний Оліго-2 Клітини В-ГЛЛ інкубували окремо або разом з Оліго-2. На 3-й, 5-й і 7-й дні інкубації клітини забарвлювали TMRE, потім виконували проточну цитометрію. Кількість життєздатних клітин В-ГЛЛ обчислювали за процентним вмістом TMREпозитивних клітин. Фіг.5. Підвищення експресії CD40 на клітинах В-ГЛЛ, викликане Оліго-2 Клітини В-ГЛЛ культивували окремо або разом з 1 мкг/мл Оліго-2. На 3-й, 5-й і 7-й дні культивування клітини забарвлювали міченими FITC моноклональними антитілами до CD40 для визначення експресії CD40 методом проточної цитометрії. На рівень експресії вказувала кількість MFI. Фіг.6. Утворення інтерлейкіну-10 клітинами ВХЛЛ, індуковане Оліго-2 Клітини В-ХЛЛ культивували окремо або разом з Оліго-2 в середовищі, що не містить сироватки. Супернатанти збирали у вказаний момент, і визначали в них IL-10, використовуючи набір для ELISA. Фіг.7. Вплив Оліго-2 на проліферацію нормальних РВМС людини Нормальні РВМС людини культивували з Оліго-2, 2216 або 2006 протягом 36 годин, потім в них включали мічений [3Н] тимідин, щоб, відповідно, визначити проліферацію клітин. Аналізували 5 проб крові. Проліферацію клітин виражали у вигляді SI. Визначення У даному винаході наступні терміни повинні мати наведені нижче значення: «Олігонуклеотид» означає множину нуклеотидів (тобто молекул, що містять цукор (наприклад, дезоксирибозу), зв'язаний з фосфатною групою і з органічною основою, яка може зазнавати заміни). Існує чотири органічні основи: цитозин (С), тимін (Т), аденін (А) і гуанін (G). Олігонуклеотид може синтезуватися за допомогою автоматизованого синтезатора олігонуклеотидів, який є на ринку, або може бути отриманий з існуючих послідовностей нуклеїнової кислоти з використанням відомих методів. 91057 8 «Модифікація кістяка» олігонуклеотиду повинна означати, що в олігонуклеотиду є фосфатний кістяк, модифікований фосфортіоатом (тобто щонайменше один з атомів кисню фосфату заміщений сіркою), або інший модифікований кістяк. «Хімічна модифікація» олігонуклеотиду повинна означати модифікацію шляхом використання активних груп нуклеотиду або шляхом створення аналогів нуклеотиду. Модифікації можуть відбуватися або під час синтезу олігонуклеотиду, або після нього. Під час синтезу модифіковані основи (включаючи, без обмеження, аналоги тимідину) можуть включатися у внутрішні ділянки молекули або в 5'кінець. Після синтезу модифікацію можна виконати з використанням активних груп (за допомогою амінного модифікатора, за допомогою 3'- або 5'гідроксильних груп або за допомогою фосфатної групи). «В-клітинна пухлина» повинна означати захворювання, що виникають внаслідок патологічної проліферації клітин В-лімфоцитарної лінії. Вклітинні пухлини можна розділити на В-клітинний лейкоз, В-клітинну лімфому і мієлому (плазмоцитому/мієлому з плазматичних клітин). В-клітинний лейкоз включає в себе В-клітинний хронічний лімфолейкоз (В-ХЛЛ), гострий лімфобластний лейкоз з попередників В-клітин (В-клітинний гострий лімфолейкоз, В-ГЛЛ), В-клітинний пролімфоцитарний лейкоз і волосатоклітинний лейкоз. В-клітинна лімфома включає в себе лімфому з малих лімфоцитів, лімфо-плазмоцитарну лімфому/імуноцитому, лімфому з клітин зони мантії, фолікулярну лімфому, шкіряну фолікулярну лімфому, естранодальну В-клітинну лімфому з клітин маргінальної зони типу MALT, нодальну В-клітинну лімфому з клітин маргінальної зони (+/- моноцитоподібні Влімфоцити), лімфому з клітин маргінальної зони селезінки (+/- ворсинчасті лімфоцити), дифузну Ввеликоклітинну лімфому, медіастинальну (тимусну) В-великоклітинну лімфому, внутрішньосудинну В-великоклітинну лімфому, первинну лімфому серозних оболонок і лімфому Беркітта. «Суб'єкт» повинен означати ссавця, включаючи, без обмеження, людину, мавпу, собаку, кішку, коня, корову, свиню, козу, вівцю, мишу і щура. Олігонуклеотид згідно з винаходом можна вводити суб'єкту з Вклітинною пухлиною. «Засіб, направлений проти В-клітинної пухлини» повинен означати засіб, що використовується для лікування В-клітинної пухлини у суб'єкта. Засіб включає в себе олігонуклеотид згідно з винаходом, хіміотерапевтичні засоби, імунотерапевтичні засоби і засоби, що використовуються в променевій терапії. Олігонуклеотид згідно з винаходом можна вводити перед, одночасно або після введення одного і більше інших засобів, направлених проти Вклітинної пухлини, щоб досягнути синергізму в лікуванні В-клітинної пухлини. «Хіміотерапевтичні засоби» повинні означати хіміотерапевтичні засобу, якими лікують В-клітинну пухлину в комбінації з олігонуклеотидом згідно з винаходом. Олігонуклеотид згідно з винаходом можна використовувати в лікуванні В-клітинних пухлин з одним хіміотерапевтичним засобом і більше. Хіміотерапевтичні засоби включають в себе, 9 але не обмежені алкілу вальними засобами, такими як циклофосфамід або хлорамбуцил, алкалоїдами барвінку (наприклад, вінкристином і вінбластином), прокарбазином, метотрексатом, преднізоном, антрацикліном, L-аспарагіназою, аналогами пуринів (наприклад, флударабіну монофосфатом, 2-хлордезоксіаденозином і пентостатином), цитозином, арабінозидом, цисплатином, етопозидом та іфосфамідом. Олігонуклеотид згідно з винаходом також може використовуватися в хіміотерапії разом з однією і більше комбінацією хіміотерапевтичних засобів. Комбінації включають, але не обмежені CVP (циклофосфамід, вінкристин і преднізон), CHOP (CVP і доксорубіцин), С-МОРР (циклофосфамід, вінкристин, преднізон і прокарбазин), CAP-ВОР (CHOP плюс прокарбазин і блеоміцин), m-BACOD (CHOP плюс метотрексат, блеоміцин і лейковорин), ProMACE-МОРР (преднізон, метотрексат, доксорубіцин, циклофосфамід, етопозид і лейковорин плюс стандартний МОРР), ProMACE-CytaBOM (преднізон, доксорубіцин, циклофосфамід, етопозид, цитарабін, блеоміцин, вінкристин, метотрексат і лейковорин), МАСОР-В (метотрексат, доксорубіцин, циклофосфамід, вінкристин, фіксована доза преднізону, блеоміцин і лейковорин), IMVP-16 (іфосфамід, метотрексат і етопозид), МІМЕ (метил-gag, іфосфамід, метотрексат і етопозид), DHAP (дексаметазон, висока доза цитарабіну і цисплатин), ESHAP (етопозид, метилпреднізолон, висока доза цитарабіну, цисплатин), СЕРР(В) (циклофосфамід, етопозид, прокарбазин, преднізон і блеоміцин), CAMP (ломустин, мітоксантрон, цитарабін і преднізон), CHOP плюс блеоміцин, метотрексат, прокарбазин, мустарген, цитозин-арабінозид і етопозид. МОРР (мехлоретамін (мустарген), вінкристин (Онковін), прокарбазин і преднізон), ABVD (наприклад, адріаміцин, блеоміцин, вінбластин і дакарбазин), ChlVPP (хлорамбуцил, вінбластин, прокарбазин і преднізон), CABS (ломустин, доксорубіцин, блеоміцин і стрептозоцин), МОРР плюс ABVD, МОРР плюс ABV (доксорубіцин, блеоміцин і вінбластин) або BCVPP (кармустин, циклофосфамід, вінбластин, прокарбазин і преднізон) і CAP (циклофосфамід, доксорубіцин і преднізон). «Імунотерапевтичні засоби» повинні означати імунотерапевтичні засоби, якими лікують Вклітинну пухлину в комбінації з олігонуклеотидом згідно з винаходом. Олігонуклеотид згідно з винаходом можна використовувати в лікуванні Вклітинних пухлин разом з одним і більше імунотерапевтичними засобами. Імунотерапевтичні засоби включають в себе, але не обмежені антитілами до CD20. Антитіло до CD20 включає імуноглобуліни і його фрагменти, які здатні специфічно реагувати з білком CD20, що знаходиться на поверхні В-клітинних пухлинних клітин. Антитіла до CD20 можуть бути поліклональними і моноклональними антитілами, химерними антитілами, біспецифічними антитілами і гуманізованими антитілами. «CD20» є білком мебрани В-клітин (Tedder et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994)), його експресують і нормальні, і пухлинні В-клітини (John 3. Byrd, et al. J Clin Oncol 2001; 19: 2165-2170; Huhn D, et al. Blood 2001, 98:1326-1331). 91057 10 «Фармацевтично прийнятний носій» означає один і більше твердих або рідких наповнювачів, розріджувачів або інкапсулюючих речовин, які підходять для введення олігонуклеотиду згідно з винаходом суб'єкту. Носій може бути органічним, неорганічним, природним або синтетичним. Носій включає всі без виключення розчини, розріджувачі, розчинники, дисперсійні середовища, ліпосоми, емульсії, покриття, антибактеріальні і протигрибкові засоби, ізотонічні засоби і засоби, що уповільнюють всмоктування, і будь-який інший носій, придатний для введення олігонуклеотиду згідно з винаходом, і їх застосування відоме в даній галузі. «Терапевтично ефективна кількість» олігонуклеотиду згідно з винаходом повинна відноситися до дози, що використовується, щоб досягнути бажаного результату лікування В-клітинної пухлини у суб'єкта. Доза може бути визначена стандартними методами, відомими фахівцям в даній галузі, і може змінюватися, залежно від факторів, що включають, але не обмежених розміром або/і загальним станом здоров'я суб'єкта, або тяжкістю захворювання. Введення олігонуклеотиду згідно з винаходом може бути виконане у вигляді однократного або багаторазового лікувального впливу. Дози олігонуклеотиду згідно з винаходом для введення суб'єкту складають приблизно від 1мкг до 100мг на введення. Однак для лікування Вклітинної пухлини можна використовувати дози, які в 10-1000 разів перевищують описані вище дози. Режим введення може коректуватися фахівцями для забезпечення оптимального терапевтичного ефекту. «Шлях» введення олігонуклеотиду згідно з винаходом повинен означати ентеральне, парентеральне і місцеве введення або інгаляцію. Термін «ентеральне», який використовується в даному документі, включає в себе пероральне, шлункове, кишкове і ректальне введення. Термін «парентеральне» включає в себе внутрішньовенне, інтраперитонеальне, внутрішньом'язове, підшкірне, ректальне або вагінальне введення. Термін «місцеве» означає нанесення олігонуклеотиду зовні на епідерміс, введення в порожнину рота і у вухо, око і ніс. «Фармацевтична композиція» повинна означати композицію, що містить терапевтично ефективну кількість олігонуклеотиду згідно з винаходом в чистому вигляді або разом з фармацевтично прийнятним носієм. Композиція включає в себе, але не обмежена водними або сольовими розчинами, частинками, аерозолями, пілюлями, гранулами, порошками, таблетками, покритими оболонкою таблетками, (мікро)капсулами, супозиторіями, сиропами, емульсіями, суспензіями, кремами, краплями та іншими фармацевтичними композиціями, придатними для застосування, нарівні з рядом інших систем введення препаратів. Композиції підходять для ін'єкції, перорального, букального, ректального і вагінального введення, інгаляції і застосування у вигляді депо. У всіх випадках композиція повинна бути стерильною і стабільною в умовах виготовлення і зберігання, і захищена від мікробного забруднення. Композиція для ін'єкцій буде включати в себе водні розчини або дисперсію 11 і порошки для негайного виготовлення розчинів або дисперсії, придатної для ін'єкції. «Порошок» згідно з винаходом стосується композиції, яка містить тонко дисперговані тверді частинки, що містять олігонуклеотид згідно з винаходом. Перед застосуванням до складу порошку можуть бути введені інші фармацевтично прийнятні носії (наприклад, вода, PBS, фізіологічний розчин і інші фармацевтично прийнятні буфери). Розчини можуть бути отримані шляхом об'єднання олігонуклеотиду з одним і більше придатними розчинниками та іншими необхідними інгредієнтами. Дисперсія може бути отримана шляхом об'єднання олігонуклеотиду і розчинника, який містить дисперсійне середовище (наприклад, гліцерин, рідкі поліетиленгліколі і масла) і інші необхідні інгредієнти. Склад композиції для перорального прийому буде містити їстівні носії, щоб сформувати таблетки, пілюлі, драже, капсули, рідини, гелі, сиропи, наважки, суспензії і тому подібне. Композиція для букального введення буде являти собою таблетки або пастилки, отримані звичайним способом. Композиція для інгаляції буде являти собою аерозоль, що видавлюється з балончика, який знаходиться під тиском, або розпилювачі, або сухий порошок, і може бути вибрана фахівцем. З олігонуклеотиду також можуть бути отримані фармацевтичні прийнятні композиції для ректального або вагінального введення або для застосування як депо. Олігонуклеотид згідно з винаходом може використовуватися в композиції самостійно або в комбінації ще з одним або більше засобами, включаючи, але не обмежуючись хіміотерапевтичними засобами, імунотерапевтичними засобами і лігандом, що розпізнається специфічним рецептором або молекулою клітини-мішені. Олігонуклеотид згідно з винаходом в комбінації з іншим засобом може являти собою окремі композиції і використовуватися таким чином: (1) перед введенням олігонуклеотид змішують з другим засобом; (2) олігонуклеотид і другий засіб вводять суб'єкту в різний час; (3) олігонуклеотид і другий засіб вводять в різні частини організму суб'єкта. Крім того, композиція може містити плазміду, бактеріальні вектори, вірусні вектори і вакцини на основі нуклеїнової кислоти, яка несе послідовність олігонуклеотиду згідно з винаходом. Наступні приклади є ілюстративними і не повинні розглядатися як такі, що обмежують обсяг даного винаходу. При цьому передбачені різні варіації винаходу, запропоновані фахівцями, в рамках обсягу, що охоплюється даним винаходом. Приклад 1. Синтез олігонуклеотиду Олігонуклеотид з послідовністю 5'TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3' (сконструйований як Оліго-2, SEQ ID NО:1) був сконструйований і синтезований. Для аналізу функції Оліго-2 також синтезували два контрольних олігонуклеотиди: 2006 з послідовністю 5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NО:2) і 2216 з послідовністю 5'-gggggacgatcgtcgggggg-3' (SEQ iD NО:3). Три олігонуклеотиди синтезували в Sangon Biotech Company (Шанхай, Китай), перевірили на ендотоксин, використовуючи аналіз лізату амебоцита Linralus (Associates of Cape Cod, Inc); 91057 12 маніпуляції з ними проводили з використанням апірогенних реактивів. 2006 (J Immunol 2000: 164: 1617) - добре вивчений олігонуклеотид, який сильно активує нормальні В-клітини. 2216 (Eur J Immunol 2001; 31:2154) - інший добре вивчений олігонуклеотид, який спричиняє утворення великої кількості інтерферону типу І в плазмоцитоїдних дендритних клітинах. Способи синтезу олігонуклеотиду відомі фахівцям в даній галузі; зазвичай, крім іншого, використовують твердофазний синтез. Конкретно, твердий носій, що використовується в процесі синтезу, являє собою кульку зі скла з контрольованим розміром пор (CPG). У кульки є поверхня з порами і каналами, всередині яких відбувається приєднання захищеного нуклеотиду. Синтез олігонуклеотиду починається з нуклеотидів, розташованих з 3'кінця, і проходить через ряд циклів, які складаються з п'яти стадій, що повторюються доти, поки не буду приєднаний нуклеотид 5'-кінця. Цими стадіями є зняття захисту, активація, зв'язування, кепірування і стабілізація. Стадія 1. Зняття захисту Захисна група в захищеному нуклеозиді, прикріпленому до кульки з CPG (скло з розміром контрольованим розміром пор), видаляють трихлороцтовою кислотою (ТСА), залишаючи реакційноздату 5'-гідроксильну групу. Стадія 2. Активація На цій стадії тетразол вступає в реакцію з нуклеозидом, пов'язаним з фосфорамідатом, утворюючи проміжну сполуку тетразолілфосфорамідат. Стадія 3. Зв'язування Проміжна сполука тетразолілфосфорамідат реагує з гідроксильною групою реципієнта, і утворюється зв'язок 5' до 3'. Тетразол регенерується, і спосіб продовжується. Стадія 4. Кепірування У цій стадії використовують ацетилувальний реактив, що складається з оцтового ангідриду і Nметилімідазолу, щоб заблокувати реакційноздатну гідроксильну групу на найближчих до 5'-кінця олігонуклеотидах, щоб забезпечити проходження реакції зв'язування. Стадія 5. Стабілізація Як тільки стадія кепірування виконана, останньою стадією в циклі є стадія окислення, яка стабілізує фосфатний зв'язок між зростаючим ланцюгом олігонуклеотиду і останньою доданою основою. Цю стадію виконують в присутності йоду як м'якого окислювача в тетрагідрофурані (THF) і воді. Після цієї заключної стадії цикл повторюється для кожного нуклеотиду в послідовності. Після завершення синтезу одноланцюгову молекулу ДНК очищують такими способами як хроматографія на гідроксіапатиті, електрофорез в поліакриламідному гелі, ВЕРХ, С18 і ОРС. Приклад 2. Апоптоз клітин В-ХЛЛ людини, викликаний Оліго-2 1. Отримання клітин В-ХЛЛ людини Проби крові у тих хворих, які не отримували лікування (The First Hospital Університет Цзілінь, Китай), В-ХЛЛ (підтвердженого морфологічно) 13 91057 брали після отримання письмової інформованої згоди. Мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) виділяли центрифугуванням в градієнті щільності Ficoll-Paque (Pharmacia). Клітини CD5+CD19+CD23+, що містилися в В-ХХЛ, очищували, використовуючи набір для виділення Вклітин (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Німеччина), до>95% CD5+CD19+CD23+ клітин (клітини ВХЛЛ). Клітини отримували згідно з керівництвом Miltenyi Biotec. 2. Апоптоз клітин В-ХЛЛ людини, викликаний Оліго-2 Клітини В-ХЛЛ інкубували з Оліго 2 або 2006, або 2216 при кінцевій концентрації 3мкг/мл в середовищі RPMI-1640, що містить 10% сироватки людини групи АВ (НуСlоnе), по 10 клітин/ямку в 48ямкових планшетах. Оліго-2, 2006 або 2216 розбавляли середовищем RPMI-1640 (НуСlоnе), яке не містить сироватки. Рівний об'єм розріджувача (середовища RPMI-1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки) використовували як контроль (середовище). На 3-й, 5-й і 7-й дні після інкубації клітини рахували і забарвлювали складним етиловим ефіром тетраметилродаміну (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) протягом 10 хвилин. TMJAEпозитивні (життєздатні) і TMRE-негативні (апоптотичні) клітини В-ХЛЛ визначали методом проточної цитометрії (B.D. FACS Aria). Кількість життєздатних клітин В-ХЛЛ обчислювали, помножаючи загальну кількість клітин на процентний вміст TMREпозитивних клітин в кожний момент часу. Експеримент повторювали з десятьма пробами крові, отриманими від хворих В-ХЛЛ, і усереднений результат (п=10) показав, що Оліго-2 значно стимулював апоптоз клітин В-ХЛЛ (таблиця 1), і ефект, викликаний Оліго-2, був приблизно в 2 сильніше, ніж викликаний 2006. Крім того, спостерігалося також дозозалежний вплив Оліго-2 і 2006 на апоптоз клітин В-ХЛЛ. Результат показав, що Оліго-2 в різних дозах в діапазоні 0,1-10мкг/мкг явно стимулював апоптоз клітин В-ХЛЛ (Фіг.1). Для порівняння: стимулюючий апоптоз ефект, який викликав Оліго-2 в дозі 1мкг/мл, був приблизно в 3 рази сильніше, ніж ефект, викликаний 2006. Взяті разом, ці результати показують, що Оліго-2 може бути використаний для лікування В-ХЛЛ за рахунок стимуляції апоптозу клітин В-ХЛЛ. Таблиця 1 Апоптоз клітин В-ХЛЛ, викликаний Оліго-2 (Кінетика) Життєздатні клітини В-ХЛЛ (%) (n=10) Час інкубації (дні) Група 3 5 7 Середовище 82,2±12 79,5±9,25 81,3±11,0 2216 67,7+18 57,7±16,7 50,7±13,5 2006 66,5±12 44,4±15,0 40,2±10,8 Оліго-2 45,5±9, 17,6±5,6 14,2±3,1 14 Приклад 3. Підвищення експресії CD40 на клітинах В-ХЛЛ людини, викликане Оліго-2 1. Отримання клітин В-ХЛЛ людини Клітини В-ХЛЛ людини виділяли від хворих ВХЛЛ, використовуючи процедури, описані в прикладі 2. 2. Підвищення експресії CD40 на клітинах ВХЛЛ людини, викликане Оліго-2 Клітини В-ХЛЛ інкубували з Оліго-2 або 2006, або 2216 при кінцевій концентрації 3мкг/мл в середовищі RPMI-1640, що містить 10% сироватки людини групи АВ (НуСlоnе), по 10б клітин/ямку в 48ямкових планшетах. Оліго-2, 2006 або 2216 розбавляли середовищем RPMI-1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки. Рівний об'єм розріджувача (середовища RPMI-1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки) використовували як контроль (середовище). На 7-й день після інкубації клітини рахували і забарвлювали антитілом FITC-CD40 (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyreli, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) протягом 10 хвилин. Забарвлені CD40 клітини В-ХЛЛ визначали методом проточної цитометрії (B.D. FACS Aria). Результат (Фіг.2) показав, що Оліго-2 значно підвищує експресію CD40 на клітинах В-ХЛЛ - це вказує на те, що Оліго-2 може бути використаний для лікування В-ХЛЛ за рахунок підвищення експресії CD40 на клітинах. Підвищення експресії CD40 сприяє апоптозу клітин В-ХЛЛ, інгібує ріст клітин В-ХЛЛ і робить клітини В-ХЛЛ більш імуногенними, стимулюючу утворення CTL, специфічно направлених проти клітин В-ХЛЛ. Експеримент повторювали щонайменше з десятьма пробами крові від хворих В-ХЛЛ, що давало схожі результати. Приклад 4. Апоптоз клітин лімфоми з малих лімфоцитів людини, викликаний Оліго-2 1. Отримання клітин лімфоми з малих лімфоцитів людини Клітини лімфоми з малих лімфоцитів виділяли з біоптатів лімфатичних вузлів від хворих (The First Hospital, Університет Цзіліня, Китай) лімфомою з малих лімфоцитів (підтвердженої морфологічно) після отримання письмової інформованої згоди. Біоптати подрібнювали шорсткими поверхнями предметного скла, щоб вивільнити клітини в 5мл середовища RPMI-1640, що містить 10% сироватки людини групи АВ (НуСlоnе) в 6-сантиметровому культуральному планшеті. Вивільнені клітини фільтрували через сітку з неіржавіючої сталі і збирали в конічну пробірку об'ємом 50мл, що містить 15 мл середовища RPMI-1640 без додавання сироватки (НуСlоnе). Пробірку центрифугували при 300g протягом 10 хвилин, і потім супернатант відкидали. CD5+CD19+CD23+ клітини лімфоми з малих лімфоцитів очищували, використовуючи набір для виділення В-клітин (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Німеччина), до >95% CD5+CD19+CD23+ клітин (клітин лімфоми з малих лімфоцитів). Клітини отримували згідно з керівництвом Miltenyi Biotec. 2. Апоптоз клітин лімфоми з малих лімфоцитів, викликаний Оліго-2 Клітини лімфоми з малих 15 91057 лімфоцитів інкубували з Оліго-2 або 2006, або 2216 в кінцевій концентрації 3мкг/мл в RPMI-1640, що містить 10% сироватки людини групи АВ (НуСlоnе), по 10 клітин/ямку в 48-ямкових планшетах. Оліго-2, 2006 або 2216 розбавляли середовищем RPMI-1640 (НуСlоnе), яке не містить сироватки. Рівний об'єм розріджувача (середовища RPMI- 1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки) використовували як контроль (середовище). На 3-й, 5-й і 7-й день після інкубації клітини рахували і забарвлювали складним етиловим ефіром тетраметилродаміну (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) протягом 10 хвилин. TMREпозитивні (життєздатні) і TMRE-негативні (апоптотичні) клітини лімфоми з малих лімфоцитів визначали методом проточної цитометрії (B.D. FACS Aria). Кількість життєздатних клітин лімфоми з малих лімфоцитів обчислювали, помножаючи загальну кількість клітин на процентний вміст TMREпозитивних клітин в кожний момент часу. Експеримент повторювали з п'ятьма пробами від хворих лімфомою з малих лімфоцитів, і усереднений результат (n=5) показав, що Оліго-2 значно стимулює апоптоз клітин лімфоми з малих лімфоцитів (таблиця 2) - це вказує на те, що Оліго-2 може бути використаний для лікування лімфоми з малих лімфоцитів шляхом стимуляції апоптозу клітин лімфоми з малих лімфоцитів. Таблиця 2 Апоптоз клітин лімфоми з малих лімфоцитів, викликаний Оліго-2 Життєздатні клітини лімфоми з малих лімфоцитів (%) n=5 Час інкубації (дні) Група 3 5 7 Середовище 81,2±7,7 78,4±9,1 77,1±13,2 2216 68,5±15,0 58,7±12,3 52,1+10,2 2006 67,6+10,3 45,3±8,9 41,1±8,2 Оліго-2 60,3±12,2 23,2+5,6 15,5±6,2 Приклад 5. Підвищення експресії CD40 клітинами лімфоми з малих лімфоцитів, викликане Оліго-2 1. Отримання клітин лімфоми з малих лімфоцитів людини Клітини лімфоми з малих лімфоцитів людини отримували від хворих, використовуючи процедури, описані в прикладі 4. 2. Підвищення експресії CD40 клітинами лімфоми з малих лімфоцитів, викликане Оліго-2 Клітини лімфоми з малих лімфоцитів інкубували з Оліго-2 або 2006, або 2216 в кінцевій концентрації 3мкг/мл в середовищі RPMI-1640, що містить 10% сироватки людини групи АВ (НуСlоnе), по 106 клітин/ямку, в 48-ямкових планшетах. Оліго2, 2006 або 2216 розбавляли середовищем RPMI1640 (НуСlоnе), яке не містить сироватки. Рівний об'єм розріджувача (середовища RPMI-1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки) використовували як контроль (середовище). 16 На 7-й день після інкубації клітини рахували і забарвлювали антитілом FITC-CD40 (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) протягом 10 хвилин. Забарвлені CD40 клітини лімфоми з малих лімфоцитів визначали методом проточної цитометрії (B.D. FACS Aria). Результат (Фіг.3) показав, що Оліго-2 значно підвищує експресію CD40 на клітинах лімфоми з малих лімфоцитів - це вказує на те, що Оліго-2 може використовуватися для лікування лімфоми з малих лімфоцитів шляхом підвищення експресії CD40 на клітинах. Підвищення експресії CD40 сприяє апоптозу клітин лімфоми з малих лімфоцитів, інгібує росту клітин лімфоми з малих лімфоцитів і робить клітини лімфоми з малих лімфоцитів більш імуногенними, стимулюючи утворення CTL, специфічних відносно даних клітин. Експеримент повторювали з п'ятьма пробами, що дало схожі результати. Приклад 6. Апоптоз клітин В-клітинного гострого лімфобластного/лімфоцитарного лейкозу людини (В-ГЛЛ), викликаного Оліго-2 1. Отримання клітин В-ГЛЛ людини Проби крові від тих хворих, що не отримували лікування В-ГЛЛ (підтвердженого морфологічно) (The First Hospital, Університет Цзіліня, Китай), брали після отримання письмової інформованої згоди. РВМС виділяли центрифугуванням в градієнті щільності Ficoll-Paque (Pharmacia). CD19+CD10+ клітини В-ГЛЛ, що містяться в РВМС, очищували, використовуючи набір для виділення В-клітин (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Німеччина), до >95% CD19+CD10+ клітин (клітини В-ГЛЛ). Клітини отримували відповідно до керівництва Miltenyi Biotec. 2. Апоптоз В-ГЛЛ клітин, викликаний Оліго-2 Клітини В-ГЛЛ інкубували з Оліго-2 або 2006, або 2216 в кінцевій концентрації 3 мкг/мл в середовищі RPMI-1640, що містить 10% сироватки лю6 дини групи АВ (НуСlоnе), по 10 клітин/ямку, в 48ямкових планшетах. Оліго-2, 2006 або 2216 розбавляли середовищем RPMI-1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки. Рівний об'єм розріджувача (середовища RPMI-1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки) використовували як контроль (середовище). На 3-й, 5-й і 7-й день після інкубації клітини рахували і забарвлювали складним етиловим ефіром тетраметилродаміну (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) протягом 10 хвилин. TMREпозитивні (життєздатні) і TMRE-негативні (апоптотичні) клітини В-ГЛЛ визначали методом проточної цитометрії (B.D. FACS Aria). Кількість життєздатних клітин В-ГЛЛ обчислювали, множачи загальну кількість клітин на процентний вміст TMREпозитивних клітин в кожний момент часу. Результат показав, що Оліго-2 значно стимулює апоптоз клітин В-ГЛЛ (Фіг.4), демонструючи, що Оліго-2 може бути використаний для лікування В-ГЛЛ шляхом стимуляції апоптозу клітин В-ГЛЛ. Експеримент провели з десятьма пробами крові від хворих В-ГЛЛ, що дало схожі результати. 17 Приклад 7. Підвищення експресії CD40 на ВГЛЛ клітинах, викликане Оліго-2 1. Отримання клітин В-ГЛЛ людини Клітини В-ГЛЛ людини виділяли з проб кров хворих, використовуючи процедури, описані в прикладі 6. Клітини В-ГЛЛ інкубували з Оліго-2 або 2216 в кінцевій концентрації З мкг/мл в середовищі RPMI1640, що містить 10% сироватки людини групи АВ (НуСlоnе), по 106 клітин/ямку, в 48-ямкових планшетах. Оліго-2 або 2216 розбавляли середовищем RPMI-1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки. Рівний об'єм розріджувача (середовища RPMI1640 (НуСlоnе), що не містить сироватки) використовували як контроль (середовище). На 3-й, 5-й, 7-й день після інкубації клітини рахували і забарвлювали FITC-СБ40-антитілом (Becton ickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162,2004) протягом 10 хвилин. Забарвлені CD40 клітини ВГЛЛ визначали методом проточної цитометрії (B.D. FACS Aria). Результат (Фіг.5) показав, що Оліго-2 значно підвищує експресію CD40 на клітинах В-ГЛЛ - це вказує на те, що Оліго-2 може бути використаний для лікування лімфоми з малих лімфоцитів шляхом підвищення експресії CD40 на клітинах. Підвищення експресії CD40 сприяє апоптозу клітин В-ГЛЛ, інгібує росту клітин В-ГЛЛ і робить клітини В-ГЛЛ більш імуногенними, стимулюючи утворення CTL, специфічно направлених проти клітин В-ГЛЛ. Експеримент повторювали з десятьма пробами, отриманими від хворих В-ГЛЛ, що дало схожі результати. Приклад 8. Утворення IL-10 клітинами В-ХЛЛ, індуковане Оліго-2 1. Отримання клітин В-ХЛЛ людини Клітини В-ХЛЛ людини виділяли від хворих ВХЛЛ, використовуючи процедури, описані в прикладі 2. 2. Утворення IL-10 клітинами В-ХЛЛ, індуковане Оліго-2 Клітини В-ХЛЛ культивували з Оліго-2 в кінцевій концентрації 3мкг/мл в середовищі RPMI1640 (HyClone), що не містить сироватки, по 106 клітин/ямку, в 48-ямкових планшетах, в трьох паралельних пробах. Оліго-2 розбавляли середовищем RPMI-1640 (HyClone), що не містить сироватки. Як контроль використовували рівний об'єм розріджувача (середовища RPMI-1640 (HyClone), що не містить сироватки) (середовище). Суперна 91057 18 танти культури збирали через 72 години або у вказані моменти часу і визначали в них вміст IL-10 за допомогою системи Fluorokine MAP Immunoarray (R&D Systems). Отримані дані показали, що стимуляція Оліго-2 призводила до утворення високого рівня IL-10 клітинами В-ХЛЛ (Фіг.6). Різке збільшення утворення IL-10 виявлялося через 6 годин, досягало максимуму через 24 години і залишалося високим понад 72 часів культивування. Крім того, отримані дані додатково показали, що додавання екзогенного rh-IL-10 (Schering Corp) в культури клітин В-ХЛЛ призводило до залежної від дози появи IL-10 апоптотичних клітин В-ХЛЛ, що специфічно блокувалося антитілом проти IL-10 (R&D Systems). Ці дані показали, що Оліго-2 може бути використаний для лікування В-ХЛЛ шляхом стимуляції утворення IL-10, що викликає апоптоз клітин В-ХЛЛ за аутокринним механізмом. Експеримент повторювали, використовуючи щонайменше десять проб хворого В-ХЛЛ. Приклад 9. Вплив Оліго-2 на проліферацію нормальних РВМС людини РВМС людини виділяли з лейкоконцентратів здорових донорів (Центр Крові Області Цзіліня, Китай) центрифугуванням в градієнті щільності Ficoll-Hypaque (Pharmacia). Життєздатність РВМС, що визначається витісненням трипанового синього, становила 95-99%. РВМС (6(105/ямку) висівали в 96-ямкові планшети з U-подібним дном (Costar) і культивували окремо або разом з Оліго-2 (6мкг/мл), в 3 повторах, протягом 36 годин, після чого ішла пульсуюча обробка [3Н] тимідином (New England Nuclear, Бостон, MA) тривалістю 16 годин. Клітини збирали на фільтрах із скловолокна і визначали за допомогою сцинтиляційного лічильника. Проліферацію клітин виражали як SI (індекс стимуляції) (за трьома ямками). Наведені дані, отримані на п'яти нормальних пробах крові. Для контролю використовували 2006 і 2216. Результати показали, що Оліго-2 безумовно стимулює проліферацію РВМС (Фіг.7) - це вказує на те, що Оліго-2, замість стимуляції апоптозу, стимулює проліферацію нормальних РВМС людини і не токсичний для клітин, що культивуються. Для фахівців в даній галузі, які ознайомився з докладним описом винаходу і посиланнями на переважні варіанти здійснення, буде очевидно, що можливі модифікації і зміна в обсязі заявленого винаходу, який визначений прикладеною далі формулою винаходу. 19 91057 20 21 Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 91057 Підписне 22 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601