Гомозиготна рослина роду капустяних, резистентна до xanthomonas campestris pv. campestris

Реферат: Даний винахід належить до резистентної до Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) рослини роду капустяних та її насіння, плодів та частин, а також способів її одержання. Зокрема, даний винахід стосується резистентної до Хсс рослини капусти городньої та її насіння, плодів та/або частин, і способів її одержання. Крім того, даний винахід стосується локусів кількісних ознак (QTL), які забезпечують дану резистентність до Хсс, і молекулярних маркерів, зокрема маркерів, випадково ампліфікованого поліморфізму мікросателітів (RAMP), для розпізнавання даних QTL. UA 106742 C2 (12) UA 106742 C2 UA 106742 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Опис винаходу Даний винахід стосується рослини роду капустяних, резистентної до Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), та її насіння, плодів та/або частин, і способів її одержання. Зокрема, даний винахід стосується резистентної до Xcc рослини капусти городньої. Винахід також стосується насіння, плодів та/або інших частин цих резистентних рослин. Крім того, даний винахід стосується локусів кількісних ознак (QTL), які забезпечують дану резистентність до Xcc, та молекулярних маркерів, зокрема, маркерів випадково ампліфікованого поліморфізму мікросателітів (RAMP), для розпізнавання даних QTL. Мікроорганізм Xanthomonas campestris pv. campestris є первинним збудником чорної гнилі у хрестоцвітих. В усьому світі цей мікроорганізм, можливо, є головним патогеном хвороб хрестоцвітих. Чорна гниль є поширеною у регіонах Європи, Америки, Африки, Азії, Австралії та Океанії. Основною рослиною-хазяїном для цієї бактеріальної хвороби є капуста городня. Однак чорна гниль також трапляється й на інших хрестоцвітих, бур’янах та декоративних рослинах. Інфікування Xanthomonas campestris pv. campestris зазвичай відбувається через гідатоди листя або, у деяких випадках, через продихи або місця пошкодження. Після первинного інфікування мікроорганізм поширюється через судинні пучки, таким чином, викликаючи появу чорних жилок та клиноподібних пошкоджень на листах. Внаслідок цього частина або частини листа в’януть і жовкнуть. Xanthomonas campestris pv. campestris є хворобою, яка передається через насіння і здатна інфікувати рослини з насіння на ранніх стадіях розвитку. Цей мікроорганізм здатен виживати на насінні протягом періоду до трьох років. Інфікування цим мікроорганізмом також може відбуватися через зберігання частин рослин, проміжні рослини-хазяї та іригаційні системи. Боротьба з хворобою через застосування хімічних засобів є неможливою. Єдино можливими заходами у боротьбі з хворобою є застосування вільних від хвороби, тобто, мікроорганізму, вихідних матеріалів і вжиття санітарних заходів, таких, як видалення інфікованих клітин-хазяїв. Здоровий вихідний матеріал може бути одержаний шляхом застосування вільного від патогенну насіння або шляхом фізичної обробки інфікованого насіння. Застосування та доступність резистентних видів рослин, які також залишаються вільними від інфекції Xcc протягом вегетаційного періоду, є дуже бажаним для культивування здорових рослин, тобто, вільних від Xcc рослин. Капустяні – це рід рослин родини Brassicaceae (також відомої як хрестоцвіті). З представників цього роду також відомими є капуста або гірчиця. Рід капустяних включає багато важливих сільськогосподарських і садових культур, включаючи рапс, цвітну капусту, червонокачанну капусту, савойську капусту, білокачанну капусту, капусту округло-конічної форми, кале, броколі, брюссельську капусту, пекінську капусту, брюкву та португальську капусту (тронхуду). Для споживання застосовують різні частини рослин роду капустяних, такі, як коріння (ріпа), стебла (брюква), листя (наприклад, біло- та червонокачанна капуста), пазушні бруньки (брюссельська капуста), квіти (цвітна капуста, броколі). Крім того, рапс та рапсове насіння також застосовуються для одержання рослинних олій. Деякі види з білими або пурпуровими квітками, або з певним кольором або формою листя, культивують для декоративних цілей. З огляду на значення рослин роду капустяних для виробництва харчових продуктів та економічні втрати, пов’язані з інфікуванням Xanthomonas campestris pv. campestris, метою даного винаходу, крім інших цілей, є забезпечення резистентної до Xcc рослини роду капустяних та способів її одержання. Потреба у резистентній до Xcc рослині роду капустяних також випливає з відсутності належного, економічного й ефективного засобу боротьби з чорною гниллю. Наприклад, проти цієї бактерії не існує біоцидів. Зазначені цілі даного винаходу, серед інших цілей, можуть досягатися завдяки способові забезпечення резистентних до Xcc рослин роду капустяних,як визначено у пункті 1 супровідної формули винаходу. Зокрема, зазначені цілі даного винаходу, серед інших цілей, досягаються завдяки способові забезпечення резистентної до Xanthomonas campestris pv. campestris рослини-акцептора роду капустяних, який включає: - вибір першої рослини-донора капусти городньої, яка включає локус 1 кількісної ознаки (QTL1) в її геномі; - вибір другої рослини-донора капусти городньої, яка включає локус 2 кількісної ознаки (QTL2) в її геномі; та - інтрогресію або геномне комбінування локусу 1 кількісної ознаки (QTL1) з першої рослинидонора та локус 2 кількісної ознаки (QTL2) з другої рослини-донора у рослині-акцепторі роду 1 UA 106742 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 капустяних; причому локус 1 кількісної ознаки (QTL1) характеризується одним або кількома маркерами RAMP, вибраними з групи, до якої належать фрагмент, який включає від 158 до 162 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 1 та праймером 6; фрагмент, який включає від 283 до 287 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 2 та праймер 6; фрагмент, який включає від 370 до 374 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 3 та праймер 6; і фрагмент, який включає від 41 до 45 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 4 та праймер 6; Локус 2 кількісної ознаки (QTL2) характеризується одним або кількома маркерами RAMP, вибраними з групи, до якої належать фрагмент, який включає від 88 до 92 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 5 та праймер 6; фрагмент, який включає від 125 до 129 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 6 та праймер 6; фрагмент, який включає від 334 до 338 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 7 та праймер 6; і фрагмент, який включає від 47 до 51 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID No: 8 та праймер 6; і рослина-акцептор роду капустяних за її геномом не є ідентичною першій та другій рослинамдонорам роду капустяних. Згідно з цим першим аспектом даного винаходу, вибір або розпізнавання першої або другої рослини-донора забезпечується через визначення присутності локусів кількісних ознак (QTL), які стосуються даної резистентності до Xcc, у геномі відповідних рослин-донорів. Таке визначення в оптимальному варіанті може забезпечуватися через застосування стандартних технологій молекулярної біології, які є загальновідомими серед спеціалістів у даній галузі. Приклад цих технологій включає виділення геномної ДНК потенційної рослини-донора з наступним визначенням присутності відповідних локусів кількісних ознак (QTL) у виділеному геномі наприклад, шляхом ПЛР, фінгерпринтингу ДНК або саузерн-блотингу. Найбільш оптимальним способом розпізнавання даних локусів у геномі відповідних рослиндонорів є технологія фінгерпринтингу ДНК, відома серед спеціалістів як випадково ампліфікований поліморфізм мікросателітів або RAMP. Згідно з цією технологією, ПЛР-реакцію або реакцію ампліфікації на основі нуклеїнових кислот здійснюють на виділеному геномному матеріалі рослини-донора шляхом застосування даних праймерів (SEQ ID Nos: 1-8) та праймерів RAPD (10-мерні комплекти Operon RAPD A-01 – BH-20). Після ПЛР-реакції одержані продукти ампліфікації можуть бути відокремлені, наприклад, шляхом гель-електрофорезу, і їхній розмір у парах нуклеотидів може бути визначений, наприклад, за допомогою молекулярного ледера пар нуклеотидів. Локуси кількісних ознак 1 та 2 (QTL1 та QTL2) згідно з даним винаходом характеризуються принаймні присутністю смуги з зазначеним розміром пар нуклеотидів, крім можливої множини інших смуг з іншими розмірами, які не вказують на резистентність. Після вибору підходящих рослин-донорів локуси (QTL1 та QTL2), розпізнані у рослинахдонорах, можуть бути включені або геномно комбіновані у геномі потрібної рослини-акцептора. Це може забезпечуватися, наприклад, за допомогою стандартного поперечного зшивання або інтрогресії, причому успадкування даних QTL визначають у потомстві, в оптимальному варіанті через визначення присутності маркерів, як описано вище. Технологією, якій віддають особливу перевагу, є повторне зворотне схрещування, в оптимальному варіанті – у комбінації з аналізом маркерів. Згідно з даним винаходом, рослина-акцептор роду капустяних за своїм геномом не є ідентичною першій та другій рослинам-донорам роду капустяних. У даному контексті це можна легко визначити за допомогою встановлення іншого фенотипу між рослиною-донором та рослиною-акцептором, що свідчить про геном рослини-донора та рослини-акцептора, або через загальний геномний аналіз. Відповідно, термін “...не є ідентичною за геномом...” згідно з даним винаходом означає одну або кілька не пов’язаних з резистентністю до Xcc фенотипічних розбіжностей між рослинамидонорами та рослинами-акцепторами. Іншими словами, дані рослини-акцептори спеціалістами зазвичай вважаються різними рослинами. Згідно з оптимальним варіантом втілення даного винаходу, перша рослина-донор роду капустяних та друга рослина-донор роду капустяних є ідентичними за їхнім геномом. Це означає, що вибір першої та другої рослини-донора включає вибір однієї рослини-донора, яка включає як QTL1, так і QTL2 в її геномі. Іншими словами, цей оптимальний варіант втілення включає розпізнавання підходящого сорту донора роду капустяних, який має і QTL1, і QTL2, з наступним включенням QTL1 та QTL2 у потрібну рослину-акцептор роду капустяних, що забезпечує резистентність до Xcc цієї рослини-акцептора. Згідно з оптимальним варіантом втілення даного винаходу, локус 1 кількісної ознаки (QTL1) 2 UA 106742 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 характеризується одним або кількома маркерами RAMP, вибраними з групи, до якої належать фрагмент, який включає 160 п. н. з праймерною комбінацією 1.1 (SEQ ID No: 1) та 6; фрагмент, який включає 285 п. н. з праймерною комбінацією 1.2 (SEQ ID No: 2) та 6; фрагмент, який включає 372 п. н. з праймерною комбінацією 1.3 (SEQ ID No: 3) та 6; і фрагмент, який включає 43 п. н. з праймерною комбінацією 1.4 (SEQ ID No: 4) та 6. Згідно з іншим оптимальним варіантом втілення даного винаходу, локус 2 кількісної ознаки (QTL2) характеризується одним або кількома маркерами RAMP, вибраними з групи, до якої належать фрагмент з 90 п. н. з праймерною комбінацією 2.1 (SEQ ID No: 5) та 6; фрагмент, який включає 127 п. н. з праймерною комбінацією 2.2 (SEQ ID No: 6) та 6; фрагмент, який включає від 336 п. н. з праймерною комбінацією 2.3 (SEQ ID No: 7) та 6; і фрагмент, який включає від 49 п. н. з праймерною комбінацією 2.4 (SEQ ID No: 8) та 6. Згідно з варіантом втілення даного винаходу, якому віддається особлива перевага, вибір рослин-донорів включає визначення або розпізнавання за допомогою технологій молекулярної біології присутності 1 або більше, в оптимальному варіанті – 2 або більше, у ще кращому варіанті – 3 або більше, і у найкращому варіанті – 4 з представлених маркерів RAMP для відповідних QTL у геномі відповідних рослин-донорів роду капустяних. Згідно з найбільш оптимальним варіантом втілення даного винаходу, вибір або розпізнавання також включає вибір гомозиготних локусів кількісних ознак 1 та 2 (QTL 1 та 2) у першій та другій рослинах-донорах роду капустяних. Рослиною-акцептором роду капустяних згідно з даним винаходом в оптимальному варіанті є рослини капусти городньої, в оптимальному варіанті – вибраною з групи, до якої належать Brassica oleracea convar. botrytis var. botrytis (цвітна капуста, романеско), Brassica oleracea convar. botrytis var. cymosa (броколі), Brassica oleracea convar. botrytis var. asparagoides (спаржева капуста), Brassica oleracea convar. oleracea var. gemnifera (брюссельська капуста), Brassica oleracea convar. capitata var. alba (білокачанна капуста, капуста округло-конічної форми), Brassica oleracea convar. capitata var. rubra (червонокачанна капуста), Brassica oleracea convar. capitata var. sabauda (савойська капуста), Brassica oleracea convar. acephela var. sabellica (кале), Brassica oleracea convar. acephela var. gongyloides (брюква) та Brassica oleracea var. tronchuda syn. costata (португальська капуста). З врахуванням переваг описаної вище резистентної до Xcc рослини роду капустяних, даний винахід стосується, згідно з ще одним аспектом, рослини-акцептора роду капустяних, як визначено вище, та насіння, плодів та/або інших її частин, яка включає в її геномі локус 1 кількісної ознаки (QTL1) та локус 2 кількісної ознаки (QTL2), як визначено вище. Згідно з варіантом втілення цього аспекту, якому віддається особлива перевага, даний винахід стосується рослини роду капустяних під реєстраційним номером NCIMB 41553, а також її насіння, плодів та/або інших частин. Згідно з ще одним аспектом, даний винахід стосується застосування локусу 1 кількісної ознаки (QTL1) та локусу 2 кількісної ознаки (QTL2), як визначено вище, для забезпечення резистентної до Xanthomonas campestris pv. campestris рослини-акцептора роду капустяних. Згідно з ще одним аспектом, даний винахід стосується застосування одного або кількох праймерів, вибраних з групи, до якої належать SEQ ID Nos: 1-8 (праймери 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 2.1, 2.2, 2.3 та 2.4, відповідно) для забезпечення даної резистентної до Xanthomonas campestris pv. campestris рослини-акцептора роду капустяних. Даний винахід далі пояснюється на представленому нижче прикладі оптимального варіанта втілення. Цей приклад є лише ілюстративним і жодним чином не обмежує обсягу даного винаходу, який визначається у супровідній формулі винаходу. Короткий опис фігур Фіг. 1 показує польове випробування, у якому присутні резистентні до Xcc та сприйнятливі до Xcc рослини роду капустяних. Фіг. 2 показує таке саме зображення, що й на Фігурі 1 у повному забарвленні. Приклад Селекція капусти городньої для забезпечення резистентності до Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) є складним процесом. Було описано кілька різновидів Xcc, і резистентність до Xcc у капусти городньої, як правило, не спостерігається. Описана авторами резистентність капусти городньої до Xcc має кількісний характер, тобто, резистентність та її рівень залежать від генетичного середовища. Це означає, що кілька генів відповідають за цю резистентність, в результаті чого може спостерігатися певний ступінь резистентність до Xcc. Для одержання якісно резистентної рослини капусти городньої, тобто, рослини, у якої резистентність спостерігається незалежно від генетичного середовища, застосовують генетичне джерело, в якому резистентність є по суті рецесивною. За допомогою програми 3 UA 106742 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 зворотного схрещування резистентність вводять у різні генетичні середовища (сприйнятливі батьківські лінії). Рівень резистентності рослин визначають шляхом польового випробування. Оскільки дана ознака є рецесивною, після кожного схрещування зі сприйнятливою рослиною вирощують інбредне покоління для одержання ознаки у гомозиготній формі. Потомство цього покоління повинно піддаватися випробуванню на рівень резистентності у польовому випробуванні. В результаті вимагається принаймні два роки для однорічної і принаймні чотири роки для дворічної рослини для виявлення ефекту від нового схрещування. Оскільки дана резистентність може бути виражена у різних рівнях резистентності, резистентність виражають у кількісних значеннях (за шкалою від 0 до 9, де 0 представляє повну сприйнятливість, і 9 представляє повну резистентність). Було продемонстровано, що резистентність у різних генетичних середовищах має фенотипічну градацію у межах нормального розподілу, замість простої менделівської спадковості. Цей розподіл може мати зсув у напрямку сприйнятливості, вказуючи на те, що інбредні покоління від схрещування між резистентним джерелом та різними сприйнятливими батьківськими лініями дають різні рівні резистентності рослин. На основі співвідношення розщеплення та розбіжностей у рівні резистентності було продемонстровано, що рівень резистентності рослини визначається кількома генетичними чинниками або локусами якісних ознак. Для розпізнавання маркерів ДНК, які вказують на кількісну ознаку або представляють її, часто застосовують аналізи QTL. QTL є незалежними хромосомними ділянками, які, будучи зв’язаними з основними генами, у комбінації зумовлюють або вказують на генетичну ознаку. Застосовуючи маркери ДНК, здійснювали аналіз геному, який охоплює QTL, на популяціях капусти городньої з різними генетичними середовищами. На рослинах з цих різних популяцій здійснювали польові випробування з метою визначення рівня резистентності окремих рослин. Дані аналізу маркерів та показники польового випробування дозволили розпізнати QTL, які відповідають за резистентність до Xcc, яка спостерігалася. В цілому було розпізнано шість незалежно успадкованих QTL, які певною мірою забезпечували рівень резистентності, який спостерігався. Коливання рівня резистентності, які спостерігалися на полі між різними рослинами, є результатом присутності та/або відсутності QTL та їх різних комбінацій. З шести розпізнаних QTL два QTL, позначені авторами як QTL 1 та QTL 2, були присутні у кожному генетичному середовищі, що забезпечувало резистентність. Іншими словами, ці два QTL свідчать про якісну резистентність, тоді як решта чотири QTL сприяли кількісній резистентності. Один з цих QTL, тобто, QTL 1, може розглядатись як головний QTL, тобто, QTL, який робить найбільший внесок у резистентність, яка спостерігалася. Кожна резистентна до Xanthomonas campestris pv. campestris інбредна лінія, одержана за допомогою процесу селекції, має цей головний QTL. Другий QTL, подібно до головного QTL, сприяє кількісному рівневі резистентності. Однак його внесок є не таким значним, як у головного QTL, хоча він також є незалежним від генетичного середовища. Решта чотири QTL містяться у різних генетичних середовищах. Ці чотири QTL можуть виконувати модифікуючу роль, яка в результаті веде до зміни рівня резистентності. Це проілюстровано нижче у Таблиці 1, у якій рослини капусти городньої з 1 по 6 є прикладами для пояснення цих спостережень. Таблиця 1 Огляд впливу різних QTL на резистентність до Xcc. рослина 1 рослина 2 рослина 3 рослина 4 рослина 5 рослина 6 45 QTL1 + + + QTL2 + + + QTL3 + ± + + + QTL4 + ± + + + QTL5 + ± + + + QTL6 + ± + + + Рівень резистентності резистентна резистентна сприйнятлива сприйнятлива сприйнятлива сприйнятлива Умовні позначення цієї таблиці: + присутній ± може бути присутній, залежно від конкретного генетичного середовища. - відсутній Застосування маркерів ДНК, пов’язаних з двома головними QTL, тобто, QTL 1 та QTL 2, 4 UA 106742 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дозволяло відбирати рослини, які є резистентними до Xcc. Сам лише тест на хворобу по суті не забезпечує рослини, які мають обидва QTL у гомозиготній формі. Тест на хворобу також в результаті може забезпечувати рослини з високим рівнем резистентності, які мають один або кілька QTL у гетерозиготній формі, які по суті не забезпечують стійкої резистентності. Здійснення тесту на хворобу з більш, ніж тисячею рослин є можливим лише для обмеженої кількості схрещувань. Однак застосування маркерів ДНК дозволяло аналізувати більше популяцій, які складалися з однієї тисячі рослин, з метою попереднього відбору потрібних рослин. Крім цього, відбір з застосуванням маркерів ДНК також забезпечував можливість здійснення повторного зворотного схрещування, при якому зберігалися два головні QTL. Цей спосіб дозволяв виграти рік або два на кожне покоління від схрещування, що означає прискорення у програмі селекції від десяти до двадцяти років. Цей прискорений спосіб забезпечує прискорене включення нової резистентності до Xcc у гібридні сорти. Додатковим ускладнюючим чинником в одержанні гібридних сортів є потреба у присутності рецесивної резистентності в обох батьківських рослинах. В оптимальному варіанті обидві батьківські лінії або рослини-донори є гомозиготними для двох головних QTL. При застосуванні маркерів ДНК розпізнавання батьківських рослин, гомозиготних для двох головних QTL і, відповідно, придатних для одержання нового резистентного гібриду, може здійснюватися за відносно короткий період часу. Насіння такого гібриду зберігається у Національних колекціях промислових та морських бактерій (NCIMB), Абердін, Шотландія, AB21, 9YA, Великобританія, під реєстраційним номером NCIMB 41553. Обидва головні QTL характеризуються чотирма маркерами ДНК, які характеризують їх присутність у джерелі. QTL1 є головним QTL, а QTL2 є другорядним QTL. Маркери ДНК було одержано за допомогою технології RAMP. Технологія RAMP, згідно з якою iSSR та RAPD-праймер комбінуються, передбачає смуги, які включають один або кілька фрагментів ДНК, які специфічно косегрегуються з резистентністю. Шляхом картування RAMPфрагментів та показників фенотипу резистентності розпізнавали близько зв’язані RAMPмаркери, які розпізнають QTL (Таблиця 2). Генетична відстань між маркерами ДНК у межах QTL представляється у сантиморганах (cM). Загальні умови ПЛР, які застосовували для створення маркерів ДНК, були такими: ПЛР mix для реакції RAMP: На кожну реакцію ~ 0,2 нг/мкл геномної ДНК рослини 75 мM Tris-HCL (pH 8,8) 20 мM NH4SO4 0,01% (об’єм/об’єм) Tween20 2,8 мM MgCl2 0,25 мM dNTP 0,15 мкM прямого праймера 0,20 мкM зворотного праймера ® 0,04 одиниць/мкл Red Hot ДНК-полімерази (ABgene, Epsom) Програма ПЛР RAPD35: цикли етап 1: 2 хв 93 °C 1 етап 2: 30 сек 93 °C етап 3: 30 сек 35 °C етап 4: нагрівання при 0,3°/сек до 72 °C етап 5: 1 хв 30 сек 72 °C повтор етапів 2-5 40 етап 6: 5 хв 72 °C 1 PAGE/Licor: Для аналізу характеру RAMP застосовували аналізатори “Gene ReadIR 4200 DNA analyzers” (Licor Inc.). На основі оптимальної концентрації 6,5% акриламіду можуть бути відокремлені фрагменти, які мають розбіжності у розмірі окремої основи. Для візуалізації фрагментів у цій системі необхідно застосовувати мічені (мітки IRDye) праймери. З цією метою третину кількості прямого праймера замінювали на мічений праймер з ідентичною послідовністю. Огляд маркерів 5 UA 106742 C2 У дослідженні, яке лежало в основі даного винаходу, праймери, показані у Таблиці 3, застосовували для створення маркерів ДНК, як показано у Таблиці 2. Таблиця 2: Огляд маркерів RAMP для кожного QTL QTL 1 1 1 1 2 2 2 2 комбінація праймерів RAMP 1,1 + 6 1,2 + 6 1,3 + 6 1,4 + 6 2,1 + 6 2,2 + 6 2,3 + 6 2,4 + 6 Розмір фрагмента (п. н.) 160 285 372 43 90 127 336 49 Позиція у QTL (cM) 10,1 18,5 20,9 21,3 28,5 29,4 36,3 37,2 5 Таблиця 3: Огляд ідентифікаційних номерів послідовностей SEQ ID No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Праймер 1.1 1.2 1.3 1.4 2.1 2.2 2.3 2.4 6 10 15 20 25 30 iSSR/RAPD iSSR iSSR iSSR iSSR iSSR iSSR iSSR iSSR Послідовність TTA GCT CTC TCT CTC TC CCA GCA CAC ACA CAC A AGA TTC TCT CTC TCT C CAA CTC TCT CTC TCT TTG TAG AGA GAG AGA G TCT CTT CTT CTT CTT C CAA CTC TCT CTC TCT GAA ATC TCT CTC TCT C RAPD 10-мерні комплекти Operon RAPD® від A-01 до BH20 (Operon Biotechnologies, Inc., Huntsville, США ПЛР-реакції з різними комбінаціями праймерів забезпечують фрагменти нуклеїнових кислот з зазначеним розміром пар нуклеотидів (див. Таблицю 2), які свідчать про присутність відповідного QTL. Ці ДНК-маркери характеризують або вказують на ті чи інші QTL. Комбінація цих ДНК-маркерів, які характеризують QTL, дає беззаперечне свідчення присутності інтрогресії QTL з резистентного до Xcc джерела до рослини-донора. Визначення cM – сантиморган – одиниця генетичної відстані між маркерами на основі кількості схрещувань на тисячу окремих одиниць. Маркер ДНК – фрагмент ДНК, який є зв’язаним з геном або іншим фрагментом ДНК з відомим розташуванням на геномі, який застосовують для спостереження за успадкуванням гена або цим місцем розташування. Гель-електрофорез – спосіб відокремлення молекул (ДНК, РНК, білків) за їхніми розміром, формою або зарядом у матриксі (агарозі або поліакриламіді) під впливом електричного поля. Інбредне покоління (самозапилення) – запліднення окремої рослини власним пилком. Інтрогресія – фрагмент хромосоми лінії (сорту), включений за допомогою схрещування до іншої лінії (сорту). Мітки IRDye – інфрачервоні мітки, які застосовують для систем візуалізації Licor, виявлення яких відбувається при 700 нм або 800 нм. Моногенний – такий, що визначається одним геном. ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) – спосіб in vitro ампліфікації для розмноження конкретного фрагмента ДНК. У цій реакції синтезу використовується мінімум одного олігонуклеотидного праймера, який гібридизується з фрагментом ДНК, після чого ДНКполімераза ампліфікує фланкуючу ділянку через послідовні температурні цикли. Праймер – короткий олігонуклеотид (~20-50 п. н.), комплементарний послідовності молекули 6 UA 106742 C2 5 10 одноланцюгової ДНК, який служить як вихідна точка полімерази. QTL (локус кількісної ознаки) – незалежна(і) ділянка(и) хромосоми, які, будучи з’єднаними з генами, разом зумовлюють ознаку. RAMP (випадково ампліфікований поліморфізм мікросателітів) – технологія фінгерпринтингу ДНК на основі праймерів RAPD та iSSR, за допомогою якого виявляють поліморфізми між різними зразками ДНК. RAPD-праймер (праймер випадково ампліфікованої поліморфної ДНК) - 10-мер з “випадковою” послідовністю, у якому вміст GC складає від 60% до 70%, і кінці праймера не є самокомплементарними. iSSR (повтор між простими послідовностями) – праймер, передбачений на 5' кінці SSR (повтор однієї послідовності); фрагмент ДНК, який складається з повторів 2 або 3 нуклеотидів. BC (зворотне схрещування) – схрещування окремої рослини з однією з первісних батьківських рослин. XCC Xanthomonas campestris pv. campestris. 7 UA 106742 C2 8 UA 106742 C2 9 UA 106742 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 1. Гомозиготна рослина роду капустяних, резистентна до Xanthomonas campestris pv. campestris, що містить в її геномі локус 1 кількісної ознаки (QTL1) та локус 2 кількісної ознаки (QTL2) рослини з реєстраційним номером NCIMB 41553; де згаданий локус 1 кількісної ознаки (QTL1) характеризується одним або кількома маркерами RAMP, вибраними з групи, до якої належать фрагмент, який включає від 158 до 162 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 1 та праймер 6; фрагмент, який включає від 283 до 287 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 2 та праймер 6; фрагмент, який включає від 370 до 374 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 3 та праймер 6; і фрагмент, який включає від 41 до 45 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 4 та праймер 6; та де згаданий локус 2 кількісної ознаки (QTL2) характеризується одним або кількома маркерами RAMP, вибраними з групи, до якої належать фрагмент, який включає від 88 до 92 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 5 та праймер 6; фрагмент, який включає від 125 до 129 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 6 та праймер 6; фрагмент, який включає від 334 до 338 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 7 та праймер 6; і фрагмент, який включає від 47 до 51 п. н. з праймерною комбінацією SEQ ID NO: 8 та праймер 6. 2. Насінина, плід та/або інша частина рослини роду капустяних за п. 1, де насінина, плід та/або інша частина містить локус 1 кількісної ознаки (QTL1) та локус 2 кількісної ознаки (QTL2). 3. Застосування локусу 1 кількісної ознаки (QTL1) та локусу 2 кількісної ознаки (QTL2), як визначено у п. 1, для забезпечення резистентної до Xanthomonas campestris pv. campestris рослини роду капустяних. 4. Застосування одного або кількох праймерів, вибраних з групи, що містить SEQ ID NO: 1-4, та одного або кількох праймерів, вибраних з групи, що містить SEQ ID NO: 5-8, для забезпечення резистентної до Xanthomonas campestris pv. campestris рослини роду капустяних. 10 UA 106742 C2 11 UA 106742 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12