Спосіб одержання консорціуму мікроорганізмів, консорціум мікроорганізмів aeromonas sp., arthrobacter globiformis, bacillus sp., b. subtilis, citrobacter sp., flavobacterium tirrenicum, nocardia sp., pseudomonas

1. Способ получения консорциума микроорганизмов, включающий отбор образцов почв, содержащих микроорганизмы и длительное время контактировавших с нефтепродуктами, разведение смеси в водной среде, содержащей деструктируемый продукт, культивирование ассоциации микроорганизмов, по мере деструкции деструктируемого вещества повышение его концентрации, отбор наиболее активных и типичных колоний, концентрирование микроорганизмов, отличающийся тем, что в качестве источников исходных ассоциаций микроорганизмов берут смесь образцов почвы, загрязненной нефтепродуктами 18-20% от массы почвы, отобранной возле водномасляных отстойников на глубине 0-3 см от поверхности с содержанием тяжелых металлов: Рb 800-915 мкг/г почвы, Сu 180-240 мкг/г, Fe 2000 2700 мкг/г, Мn 1300-1700 мкг/г, а также образцов отложений со стенок отстойников трубопроводов водно-эмульсионной системы охлаждения с содержанием нефтепродуктов 76-80%, а в качестве среды для культивирования берут отработанную смазочно-охлаждающую жидкость после сепарации масла и содержащую нефте продукты в концентрации 0,5-1 г/л, добавляют минеральные соли: NH4(NO3)2 в концентрации - 0,2 - 0,4 г/л, К2НРO4 - 0,2 - 0,4 г/л, КН2PO4 - 0,2 - 0,4 г/л, концентрацию нефтепродуктов в отработанной смазочно-охлаждающей жидкости повышают после стабильного снижения содержащи хся в ней нефтепродуктов на 90% и последовательно доводят до 10 г/л. 2. Консорциум микроорганизмов, включающий штаммы бактерий: Aeromonas sp., Arthrobacter globiformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Citrobacter sp., Flavobacterium tirrenicum, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, штаммы микромицетов: Aspergillus candidus, Link, Aspergillus glaucus, Link, Aspergillus terreus, Thom, Penicillium frequentans, Westling, для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. 3. Способ ликвидации нефтяных загрязнений, включающий обработку консорциумом микроорганизмов, отличающийся тем, что обработку ведут консорциумом микроорганизмов, содержащим штаммы бактерий: Aeromonas sp., Arthrobacter globiformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Citrobacter sp., Flavobacterium tirrenicum, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, штаммы микромицетов: Aspergillus candidus, Link, Aspergillus glaucus, Link, Aspergillus terreus, Thom, Penicillium frequentans, Westling, при концентрации клеток от 10 до 103 клеток на мл воды. (19) (21) 97062870 (22) 18.06.1997 (24) 15.06.2001 (46) 15.06.2001, Бюл. № 5, 2001 р. (72) Целінко Олександр Михайлович, Поєдинок Наталія Леонідівна (73) ЦЕЛІНКО ОЛЕКСАНДР МИ ХАЙЛОВИЧ (56) 1. Плешакова Е.В., Турковская О.В. Создание и использование биокатализаторов для деструкции минеральных масел. Биотехнология, 1994, № 3, с. 46–49. 2. Турковская О.В., Муратова А.Ю., Плешакова Е.В., Панченко Л.В. Утилизация отработанных моющих растворов с помощью микроорганизмов. Химия и технология воды, 1996, т. 18, № 2, с. 212– 216. 3. Degradation of crude oil by a mixed population of bacteria isolation from sea-surface foenans/E. Rambeloarisos, J.F. Rontani et al//Mar. Biol/ – 1984, N1. – P. 69–81. 4.А.с. СССР № 823314, МПК С02F3/34, 1979. C2 (54) СПОСІБ ОД ЕРЖАННЯ КОНСОРЦІУМУ МІКРООРГАНІЗМІВ, КОНСОРЦІУМ МІКРООРГАНІЗМІВ AEROMONAS SP., ARTHROBACTER GLOBIFORMIS, BACILLUS SP., B. SUBTILIS, CITRO BACTER SP., FLAVOBACTERIUM TIRRENICUM, NOCARDIA SP., PSEUDOMONAS AERUGINOSA, P. FLUORESCENS, P. PUTIDA, P. STUTZERI, ASPERGILLUS CANDIDUS, LINK, A. GLAUCUS, LINK, A. TERREUS, THOM, PENICILLIUM FREQUENTANS, W ESTLING ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДИ ТА ГРУНТУ ВІД НАФТИ ТА НАФТОПРОДУКТІВ, СПОСІБ ЛІКВІДАЦІЇ НАФТОВИХ ЗАБРУД НЕНЬ 22967 Изобретение относится к биотехнологии в частности к микробиологии очистки различных сред от нефти и нефтепродуктов. Известен способ получе ния ассоциации микроорганизмов (см. А.с. СССР № 1465426, М.кл. С 02 F 3/34, 1987), предусматривающий формирование ассоциации коллекционных микроорганизмов Bacillus sphaericus, Pseudomonas acruginosa, Bacillus freudenreichii, Pseudomonas acrantioca, в соотношении 3:2:2:3, разведение смеси в водной фазе сточных вод в концентрации 105 кл/мл. Недостатками такого способа а также ассоциации, получаемой при реализации способа, является низкая стабильность ассоциации в нестерильных условиях, отсутствие специфичности к эмульги рованным нефтепродук там и маслам, необхо димость специальной подготовки сточных вод (отделение или эмульгирование масел, разбавление, использование реагентов) для приведения их к условиям работы ассоциации микроорга низмов. Известен способ получе ния ассоциации микроорганизмов, предусматривающий и х вы деление из морской пены, собранной в районе, непосредственно подверженном влиянию выбросов НПЗ. Ассоциация полученных микроорганизмов состоит из 8 штаммов бактерий родов Acinetobacter, Alcaligenes, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Mra xella (Degradation of crude oil by a mixed population of bacteria isolation from sea-surface foenans / E.Rambeloarisos, J.F.Rontani et al // Mar. Biol. -1984, N1.-P.69-81). Недостатком этого способа, а также ассоциации, получаемой при реализации способа, следует счи тать недостаточно высокую скорость деструкции нефти и неполную ее минерализацию, особенно полициклических углеводородов и асфальтенов (тяжелой фракции) при исходной концентрации нефтепродуктов 1 г/дм 3. При добавлении полученной ассоциации в раствор, содержащий 1 г/л нефти, за 12 суток разрушается 92 % насыщенных углеводородов, 83% ароматических - с количеством колец не более 3-х, 63 полярных соединений, 49% асфальтенов. Наиболее близким к способу получе ния консорциума микроорганизмов по технической сущности и дости гаемому результа ту является способ получе ния биокатализаторов, представляющих собой консорциум микроорганизмов - деструкторов (см. Е.В. Плешакова. О.В. Тур ковская. Создание и использование биокатализаторов для деструкции минеральных масел. - Биотехнология. 1994 № 3, с. 46-49; О.В. Турковская, А.Ю. Муратова, Е.В. Плешакова, Л.В. Панченко. Утилизация отработанных моющи х растворов с помощью микроорганизмов. - Хи мия и технология воды, 1996, т. 18, № 2, с. 212 - 216). Для получения микроорганизмов - деструкторов минеральных масел применяли метод накопительных культур, используя пробы почвы и воды из природных биоценозов, длительно контактирующих с не фтепродуктами. Процесс иммобилизации выделенных культур на инертном носителе проводили в условиях периодического и непрерывного культи вирования. Пробы почв, ила или воды помещали в колбы Эрленмейера или в стеклянные колонки лабораторной модельной уста новки, заполненные специальной насадкой из текстурированного капронового жгута. В первом случае селекцию биокатализатора осуществляли на качалке при 160 мин -1 и 26-28°С с ежедневной заменой модельного раствора на основе солевой среды с индустриальным маслом И-20 (0,1 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. В течение первых 1 - 1,5 месяцев направленной селекции в колбы вносили дополнительные источники питания: бульон Хоттингера или глицерин в количестве 10 г/л. В условиях непрерывного культивирования рабочий раствор, аналогичный по составу раствору в колбах, подавали непрерывно с помощью перистальтического насоса со скоростью 0,01 ч-1. Аэрацию осуществляли мембранным компрессором АЭН-3. Концентрацию индустриального масла постепенно повышали от 0,1 до 1,0 г/л. При достижении стабильного разрушения масла не менее чем на 70 % количество субстрата увели чивали до 0,2, затем до 0,3 г/л и т.д. Достигнутая максимальная концентрация масла в условиях периодического культивирования, подвергшегося деструкции на 8692%, составляла 0,5 г/л. Недостатками такого способа, а также консорциума, получаемого при реализации способа, являются: узкая специфичность к определенному типу минерального масла, в связи с тем, что не учиты вались изменения химического и физического состояния масел, происходящие в процессе их эксплуа тации; так как в способе использовались модельные растворы, и получае мый консорциум не адапти рован к негативному влиянию сопутствующи х компонентов, входящих в состав отработанных нефтепродук тов (сода кальцинированная, аналоги сульфо фризонов, ионы тяжелых металлов, следы оксидов металлов и пр.). Невысока эффективность консорциума при концентрациях нефтепродуктов вы ше 0,5 %. При осуществлении очистки с применением такого консорциума необхо дима специальная подготовка сточных вод (отделение или эмульгирование масла, разбавление, использование реагентов) для приведения их к условиям жизнедеятельности ассоциации. Наиболее близким к консорциуму микроорганизмов является ассоциация микроорганизмов которая состоит из 8 штаммов бактерий родов Acinetobacter, Alcaligenes, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Mraxella (Degradation of crude oil by a mixed population of bacteria isolation from seasurface foenans / E.Rambeloarisos, J.F.Rontani et al // Mar. Biol.-1984, N1.-P.69-81). Недостатком этой ассоциации, является недостаточно высокая скорость деструкции нефти и неполная ее минерализация, особенно полициклических углеводородов и асфальтенов (тяжелой фракции) при исходной концентрации нефтепродуктов 1 г/дм 3. При добавлении полученной ассоциации в раствор, содержащий 1 г/л нефти, за 12 суток разрушается 92 % насыщенных углеводородов, 83% ароматических - с количеством колец не более 3-х, 63 полярных соединений, 49% асфальтенов. В настоящее время существует несколько подхо дов к ликвидации нефтяных загрязнений. В основу фи зико-химических методов очистки, например, сточных вод о т нефтепродук тов положены процессы коагуляции, флотации и сорбции, позво 2 22967 ляющие снизить содержание основных загрязнителей до 25 мг/л. Их недостатками следует счи тать сложность и многостадийность схемы, дороговизну процессов за счет применения специальных сорбентов, кислотостойкого оборудования и т.д. Ме тод термической обработки находит наиболее широкое применение при утилизации маслосодержащих вод, но характеризуется чрезвычайно высокими энергозатратами. Наиболее перспективным направлением в настоящее время является биохимическое разрушение нефтяных загрязнений с помощью микроорганизмов-деструкторов. Одним из основных достоинств этих способов является возможность дости жения практически полной минерализации органического субстрата, которая происходит без больших энергозатрат при положительных температурах окружающей среды и атмосферном давлении. Однако, естественная скорость микробного разрушения нефтяных загрязнений в воде достаточно низкая. Кроме того, как показывает практика использования отдельных штаммов-деструкто ров нефти, не существует универсальных микроорганизмов, способных утили зировать весь спектр углеводородов нефти. Известен способ очистки сточных вод от нефтепродуктов (см. А.с. СССР № 823314, М.кл. СО 2 F 3/34, 1979), заключающий ся в том, что для очистки применяют концентрированные бактериальные суспензии культур (108-1010 клеток/мл) ассоциации из коллекционных нефтьокисляющих микроорганизмов Pseudomonas aeruginosaa и Mycobacterium lacticolum и регенерированную биопленку. При осуществлении способа два раза в месяц в отдельно стоящую емкость подают биопленку, осевшую во вто ричном отстойнике, и туда же вносят культуры микроорганизмов из расчета 2030 мл на 1 г сухого вещества биопленки. Смесь продувают 3-4 ча са, потом ее постепенно вво дят в подающий трубопровод и вместе с неочищенной водой равномерно распределяют по поверхности биофильтра. Недостатками такого способа следует считать чувствительность микроорганизмов к высоким концентрациям нефтепродуктов, невысокий процент деструкции при исходной концентрации основного загрязнителя менее 50 мг/л, неста бильность ассоциации в нестерильных условиях, необхо димость периодического внесения активной биомассы бактерий - деструкторов. Известен способ очистки сточных вод от нефтепродуктов предусматривающий применение для очистки сточных вод с концентрацией нефтепродук тов 1 г/дм 3 консорциума из 8 штаммов бактерий родов Acinetobacter, Alcaligenes, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Mraxella (Degradation of crude oil by a mixed population of bacteria isolation from sea-surface foenans / E.Rambeloarisos, J.F.Rontani et al // Mar. Biol. -1984, N1. -P.69-81). Недостатком этого способа следует считать недостаточно высокую скорость деструкции нефти и неполную ее минерализацию, особенно полициклических углеводородов и асфальтенов (тяжелой фракции) при исходной концентрации нефтепродуктов 1 г/дм 3. При применении этого способа за 12 суток разрушается 92 % насыщенных углеводородов, 83% ароматических - с количеством колец не более 3-х, 63 полярных соединений, 49% асфальтенов. В основу изобретения способа получе ния консорциума микроорганизмов поставлена задача усовершенствования способа, в котором путем применения ряда новых подобранных эмпирическим путем образцов, содержащи х исходные микроорганизмы, культуральной среды, порядка осуществления операций и их режима обеспечивается улучшение показателей стабильности консорциума во времени и в нестерильных условиях, обеспечивается возможность деструкции как свободных, так и эмульгированных нефтепродуктов (в том числе масла) в концентрации до 10 г/л на 90 - 93 % в прямоточном режиме и на 78 - 85% в периодическом. Отсутствует необхо димость специальной подготовки стока (отделение или эмульгирование масел, разбавление, использование реагентов). Процесс деструкции идет в широком диапазоне положительных температур и рН, при атмосферном давлении. Поставленная задача решается тем, что в способе получе ния ассоциации микроорганизмов, включающем отбор образцов, содержащи х природные ассоциации микроорганизмов, разведение смеси в водной среде, содержащей деструктируемый продукт, культи вирование ассоциации микроорганизмов, по мере деструкции деструктируемого вещества повыше ние его концентрации, отбор наиболее активных и типичных колоний, концентрирование микроорганизмов, согласно изобретению в качестве источников исходных ассоциаций микроорганизмов берут смесь образцов почвы, загрязненной нефтепродуктами 18 - 20% от массы почвы, отобранной возле отстойников водно-маслянных стоков, на глубине 0-3 см от поверхности с содержанием тяжелых металлов: Рb 800915 мкг/г почвы, Сu 180-240 мкг/г, Fe 2000-2700 мкг/г, Мn 1300-1700 мкг/г; а также образцов отложений со стенок отстойников с содержанием нефтепродуктов - 80-86 %; и образцов отложений со стенок трубопроводов водно - эмульсионной системы охлаждения с содержанием нефтепродуктов 76 - 80 %, а в качестве среды для культивирования берут отработанную смазочно-охлаждающую жидкость после сепарации масла и содержащую не фтепродукты в концентрации 0,5 - 1 г/л, добавляют минеральные соли NН4(NО3)2 в концентрации - 0,2 - 0,4 г/л, К2НРО4 - 0,2 - 0,4 г/л, КН2РО4 0,2 - 0,4 г/л, концентрацию нефтепродуктов в отработанной смазочно-охлаждающей жидкости повышают после ста бильного снижения содержащи хся в ней нефтепродуктов на 90 % и последовательно доводят до 10 г/л. Вследствие проведенных операций способа формируется консорциум микроорганизмов, включающи х: Бактерии: Aeromonas sp. Arthrobacter globiformis Bacillus sp. Bacillus subtilis Citrobacter sp. 3 22967 Flavobacterium tirrenicum Nocardia sp. Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Микромицеты : Aspergillus candidus, Link Aspergillus glaucus, Link Aspergillus terreus, Thom Penicillium frequentans, Westling В основу изобретения консорциума микроорганизмов поставлена задача создания консорциума микроорганизмов в котором путем применения новой композиции бактерий и микромицетов улучшаются показатели стабильности консорциума во времени и в несте рильных условиях, обеспечивается таким консорциумом возможность деструкции как свободных, так и эмульгированных нефтепродуктов (в том числе масла) в концентрации до 10 г/л на 90 - 93 % в прямоточном режиме и на 78 - 85% в периодическом. Отсутствует необхо димость специальной подготовки стока (отделение или эмульгирование масел, разбавление, использование реагентов). Процесс деструкции при применении такого консорциума идет в широком диапазоне положительных температур и рН, при атмосферном давлении. Поставленная задача решается тем, что консорциум микроорганизмов включает штаммы бактерий: Aeromonas sp., Arthrobacter globiformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Citrobacter sp., Flavobacterium tirrenicum, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri; штаммы микромицетов: Aspergillus candidus, Link, Aspergillus glaucus, Link, Aspergillus terreus, Thom, Penicillium frequentans, Westling. Происхождение и источник выделения консорциума микроорганизмов описаны выше в способе его получе ния, который включает также условия адаптации и селекции. Консорциум функционирует как микобактериальный комплекс и в различных условиях рН среды, соста ва загрязнения или этапа его деструкции доминируют различные компоненты его состава. При рН 5-6 путем микроскопирования выявлен преимущественно рост мицелиальных структур с характерным пигментированием желтого цвета питательной среды. Сдвиг рН к 7 вы зывает увели чение количества бактерий и снижает относительное содержание микромицетов. В щелочной зоне рН выше 9 наблюдается преимущественно бактериальный рост. Оптимальными значениями рН, при которых консорциум проявляет высокую деструктивную активность, являются значения 6-9. В этих условиях консорциум функционирует как микобактериальный комплекс, где оптимально сочетаются метаболические возможности как бактерий, так и грибов, и происхо дит наиболее полная минерализация нефтеотхо дов за счет процессов соокисления. На физиологическую активность консорциума влияет содержание минеральных компонентов среды, особенно (г/л): КNО3 - 0,2-0,4; КН2РO 4 -0,2 0,4; К2НРO4 -0,2-0,4. Увеличение содержания указанных компонентов не приводит к улучшению качества очистки. Динамика накопления биомассы и деструктивная активность консорциума изучались при различных концентрациях нефтеотхо дов. Концентрации варьировали от 0,1 до 5 %. При концентрациях загрязнителя до 1% практи чески не наблюдалось лаг-периода и культура выходит на ста ционарную фа зу уже к 40 часам инкубации. При концентрациях выше 1 % наблюдается лаг-период, при содержании нефтепродуктов 2% отмечается 20-часовой лаг-период и микроорганизмы выходят на стационарную фа зу к 70-му часу инкубации. Максимальное накопление биомассы (9,5-10,5 г/л) получе но при содержании загрязнителя - 1%. При увели чении концентрации до 3% скорость накопление биомассы снижается вдвое. Ха рактеристика индивидуальных штаммов микроорганизмов консорциума. Бактерии AEROMON AS SP. Klu yver et van Niel 1 936, 398, HP-9. Клетки прямые, от палочковидных с закругленными концами до кокковидных 1,0 - 4,0 мкм в диаметре, встречаются поодиночке, в парах или цепочках; движутся при помощи полярных жгутиков, обычно монотрихальных. Грамотрицательные. Хе моорганотрофы. Метаболизм и дыхательный, и бродильный; углеводы расщеп ляются до кислоты и газа (СО2 и Н). Растут на минеральной среде с аммонием и глюкозой, аргинином, аспарагином, а также на минеральной среде со смесью углеводородов в качестве единственного источника углерода. Гидролизует крахмал, казеин и глицерин; разжижают желатину. Нитрат восста навливают до нитрита. Положительны по цитохромоксидазе, оксидазе и каталазе. Факультативные анаэробы. Растут при температуре 5-45°С, оптимальная 30°С. Диапазон рН 5,5 - 9,0. ARTHROBACTER GLOBIFOR MIS HP-5. Старые культуры состоят, главным образом из кокковидных клеток. При пересеве на свежую среду рост происхо дит путем увеличения кокковидных клеток, после чего один или оба конца клетки удлиняются; в результате образуются палочки неправильной формы, которые значительно варьируют по ве личине и форме и могут быть прямыми, изогнутыми, клиновидными и булавовидными. Часть палочек расположена под углом к друг другу. По мере прохождения экспоненциальной фа зы палочки укорачиваются и заменяются кокковидными клетками, которые характерны для стационарной фазы культуры. Палочки движутся с помощью нескольких латеральных жгутиков. Эндоспор не образуют. Грамположительные, однако палочки могут легко обесцвечиваться и грамположительными могут быть только гранулы. Не кислото устойчивые. Клеточные стенки не содержат мезо-диаминопимелиновой кислоты и арабинозы. Ме таболизм дыхательный. Не расщепляют целлюлозу. Каталазоположительные. Растут на питательной среде, содержащей почвенный и дрожжевой экстракт, а также на ми 4 22967 неральной среде Таусона, содержащей в качестве единственного источника углерода углеводороды. Кроме того, в качестве источников углерода могут использовать глицин, тирамин мочевую кислоту, пара- и мета-оксибензоат, D-ксилозу. Потребность в ви таминах отсутствует. Строгие аэробы. Температур ный оптимум 20 - 30°С. Не выносят нагревания до 63°С в течение 30 минут. Лучше растут при нейтральном или слегка щелочном рН. BACILLUS SP. HP-13. Клетки палочковидные, прямые или почти прямые, 0,3 - 2,2 х 1,2-6,0 мкм. Подвижны; жгутики латеральные. Образуют термоустойчивые эндоспоры, не более одной в клетке-спорангии. Грамположительные. Хемоорганотрофы. Ме таболизм строго дыхательный. Образует каталазу. Строгий аэроб. Оптимальные значения рН - 5,5-8,0 BACILLUS SUBTILIS HP-8. Клетки палочковидные, прямые или почти прямые, 0,7 - 0,8 х 2,0-3,0 мкм, большинство подвижно. Эндоспоры эллиптические или цилиндрические, их расположение в клетке в основном центральное. Каталазоположительные; внутриклеточные гранулы не окрашиваются фуксином, не встречаются в клетках, выращенных на глюкозном агаре; реакция с яичным желтком отрицательная. Гидролизуют казеин и крахмал. Грамположительные. Максимальная температура роста 55° С, минимальная - 5° С, оптимальная - 28-30° С. Оптимальные значения рН 6,0-8.0. CITROBACTER SP. HP-4. Подвижные палочки с перитрихальными жгутиками, некапсулированные и могут использовать цитрат как единственный источник углерода. Глюкозу и другие углеводы сбраживает с образованием кислоты и газа. Из глицерина образуется триметиленгликоль. KCN не ингибирует рост. Растут на минеральной среде Таусона с углеводородами в качестве единственного источника углерода. Грамотрицательные. Факульта тивный анаэроб. Каталазоположительные, оксидазоотрицательные. Максимальная температура роста 65°С, минимальная - 5° С. рН - 5,0 - 8,5. NOCARDIA SP. HP-3 Аэробные акти номицеты. Грамположительные. Развитие мицелия ограниченное, так как после 12-14 часов инкубации в центре колонии начинается фрагментация. Споры не образуются на дифференцированных ги фах. Репродук тивными телами служат фрагменты мицелия. Консистенция колоний мягкая, слизистая. Кислотоустойчивы, образуют коричневый экзопигмент. Нитраты не восстанавливают до нитритов. Желатину гидролизуют. В зрелых к ультурах со храняются фрагменты гиф до 15 мкм, в старых культурах обычны микроцисты диаметром 0,8 - 1,5 мкм. Они выдерживают нагревание до 80°С в течение 8 часов. В качестве источника углерода используют декстрин, фенол и другие углеводороды. Температура роста - 0 50°С. РН - 4,0-7,5. PSEUDOMON AS AERUGINOSA HP-7. Клетки одиночные палочковидные, прямые или слегка изогнутые, размеры обычно 0,5-1,0 х 1,5-4,0 мкм. Движутся при помощи полярных монотрихальных жгутиков. Не образуют чехлов или простек. Грамотрицательные. Хе моорганотрофы. Ме таболизм дыхательный. Способны к денитрификации. Аэробы. Каталазо- и оксидазоположительные. Гидролизуют желатин и не гидролизуют крахмал. В качестве источников углерода могут использовать глюкозу, сахарозу, ге раниол, L- валин и углеводороды. Растет при температуре от 5 до 55°С. рН - 6,0-8,5. PSEUDOMON AS FLUORESCENS HP-16. Клетки одиночные палочковидные, размеры 0,5-1,0 х 1,5-4,0 мкм. Подвижные. Грамотрицательные. Хе моорганотрофы. Ме таболизм дыхательный. Аэробы. Не нуждаются в факторах роста. Способны расти в чисто минеральной среде с добавлением источников углерода: сахарозы; Lарабинозы, сорбита, углеводородов. Образуют леван из сахаро зы. Не способны к денитрификации. Каталазоположительные. Образуют флуорисцирующий пигмент. Температура роста - 5 - 50°С, оптимальная - 25-30°С. рН - 5,5-9,0. PSEUDOMON AS PUTID A HP-1. Клетки одиночные палочковидные, прямые или слегка изогнутые. Размеры 0,5-1,0 х 1,5-4,0 мкм. Подвижные, жгутики политрихальные, полярные. Грамотрицательные. Хеморганотрофы. Метаболизм дыхательный. Строгие аэробы. Не способны к денитрификации. Не нуждаются в факторах роста, способны расти на чисто минеральной среде при добавлении источников углерода: глюкозы, 2-кетоглюконата, DL-аргинине, L-валине, -аланине и углеводородах. Образование левана из сахарозы отсутствуе т. Образует флуорисцирующий пигмент. Каталазо- и оксидазоположительные. Крахмал и желатин не гидролизует. Растет при температурах от 5 до 38°С, оптимальная температура - 25°С. рН - 6,5-9,0. FLAVOBACTERIU M TIRRENICUM HP-14. От коккобацилл до тонких палочек. Движутся при помощи перитрихальных жгутиков. Эндоспор не образуют. Грамотрицательные. Колонии на поверхности твердых сред, в том числе и на минеральной среде Таусона с углеводородами - красные; оттенок зависит от среды и температуры культивирования. Цвет наиболее ярко выражен при пониженных температурах. Пигмент не растворим в средах. Ко лонии прозрачные, гладкие и цельные. Не гидролизует желатин и крахмал. Аэробы. Метаболизм - дыхательный. Образования кислоты или газа при росте в углеводсодержащи х средах не характерно. Оптимальная температура - 30° С. Биохимическая активность и рост лучше при нейтральных и кислых значениях рН - 4,5-7,5. PSEUDOMON AS STUTZERI HP-6. Клетки одиночные палочковидные, подвижные. Жгутики латеральные, волнистые, короткие. Грамотрицательные. Аэробы, но способны использовать денитрификацию как способ анаэробного дыхания. 5 22967 В факторах роста не нуждаются. Способны расти в чисто минеральных средах при добавлении подходяще го единственного источника углерода: глюкозы, L- валина и углеводородов. Каталазо- и оксидазоположительные. Флуоресцирующих пигментов не образовывает. Гидролизует крахмал и не гидролизует желатин. Оптимальная температура роста - 25-30° С. Растет при рН -5,08,5. Микромицеты ASPERGILLUS CANDIDUS Link.AZ-9. Колонии на агаризованной среде Чапека белые, со временем становятся желто-кремовые. Вегетативный мицелий тонкий, большей частью погруженный в субстрат. Поверхность роста обычно состоит из конидиеносцев с головками и ползущего стерильного мицелия или анасто мозирующи х липких гиф, образующи х репродуктивные структуры на коротких ножках. Головки белые, шаровидные, радиально-симметричные, от 200 до 300 мкм в диаметре. Конидиеносцы от 500 до 700 мкм длиной, 10-15 мкм толщи ной с тонкими стенками, гладкие неокрашенные или слегка желтоватые в центре колонии. Вeзикулы типично круглые, около 40 мкм в диаметре. Стеригмы двух видов, обычно неокрашенные. Первичные -септированные 15-20 мкм длиной, вторичные - одинаковые во всех головках, размером 5-8 х 2-2,5 мкм. Конидии неокрашенные, круглые, тонкостенные 2,5-3,5 мкм, гладкие. Растет на всех классических средах для культи вирования грибов и на минеральной среде Чапека, где в качестве единственного источника углерода используются сложные смеси углеводородов. Растет при температурах от 5 до 50°С, опти мальная - 25-32°С. рН - 3,59,5, оптимальная - 5,5 -8,0. ASPERGILLUS GL AUCUS Link AZ-13. Колонии на агаризованной среде Чапека (3% сахаро зы) обладают ограниченным ростом, складчатые, плотновойлочные, по краю зеленые с развивающимися головками конидиеносцев, другие области желто-зеленые с многочисленными недоразвитыми перитециями, формирующими незначительное количество аскоспор. На агаризованной среде Чапека с 20% сахарозы или с углеводородами (10 г/л) в качестве единственного источника углерода перитеции обильные, образуют сеть на желтых гифа х, желтые, сферические, 75-100 мкм, аскоспоры чечевицевидные, 4,85,6х3,8-4,4 мкм, тонкостенные. Конидиальные головки многочисленные, 125-150 мкм в диаметре, состоящие из разветвленных цепочек конидий, расположенных радиально на полусферических конидиефорах. Ко нидиеносцы гладкие, неокрашенные, 500-1000 мкм длиной. Стеригмы одного вида 7-10х3,5-4,5 мкм, конидии эллиптические 56,5 мкм. Оптимальные температуры роста 1828°С, рН - 5-8,5. ASPERGILLUS TERREUS Thom AZ-6. Колонии хорошо растут на агаризованной среде Чапека с сахарозой или с углеводородами (10 г/л) при 18-37°С, стелющиеся, плоские с мелкими радиальными бороздками, барха тистые, центральная часть колонии хлопьевидно-опушенная. Спороношение формируется в виде колоновидных го ловок, дающих колонии характерный цвет и текстуру, желто-коричневого цвета. Ко нидиальные головки сильно удлиненные с цепочками конидий, собранных вместе, одного размера, 150 мкм в длину и 30-50 мкм толщиной. Конидиеносцы изви листые, гладкие, неокрашенные, 100150 х 4,5-6,0 мкм. Везикулы полусферические, куполообразные, 10-16 мкм в диаметре. Стеригмы 2х видов: первичные густорасположенные, параллельные 5,0-7,0 х 2.0-2,5 мкм, вто ричные - 5,5-7,5 х 1,5-2,0. Конидии круглые, 1,8-2,4 мкм в диаметре. Оптимальные значения рН - 4- 9,5. PENICILLIUM FREQUENTANS Westling AZ-1. Конидии более или менее шаровидные. Колонии широко-раcпростертые, радиальноскладчатые, барха тистые, обильноспороносящие, Светложелтовато-серо-зеленые, потом оливково-пепельно-серые, на обратной стороне большей частью желто-оранжевого цвета. С плесневым запахом. Конидиеносцы до 100-200 мкм длины, 3-3.5 толщи ны, гладкие или мелко-шероховатые. Стеригмы по 10-12 в пучке, 8-12 х 3-3,5 мкм. Конидии со сравнительно тонкой оболочкой, гладкие или мелко-шероховатые 3-3,5 мкм в диаметре, в хорошо выраженных колонках. Растет на классических питательных средах - сре де Чапека, сусло-агаре, а также на минеральной среде с углеводородами. Температура роста - 10-35°С, опти мальная - 25°С, рН - 3,5 - 7,5. В основу изобретения способа ликвидации, нефтяных загрязнений поставлена задача усовершенствования способа, в котором путем применения нового консорциума микроорганизмов, порядка осуществления операций и их режима обеспечивается улучшение показателей стабильности консорциума во времени и в несте рильных условиях, обеспечивается возможность деструкции как свободных, так и эмульгированных нефтепродуктов (в том числе масла) в концентрации до 10 г/л на 90 - 93 % в прямоточном режиме и на 78 - 85% в периодическом. Процесс деструкции при применении такого консорциума идет в широком диапазоне положительных температур и рН, при атмосферном давлении. При очистке сточных вод отсутствует необхо димость специальной подготовки стока (отделение или эмульгирование масел, разбавление, использование реагентов). Поставленная задача решается тем, что в способе ликвидации нефтяных загрязнений, включающем обработку консорциумом микроорганизмов согласно изобретению обработку ведут консорциумом микроорганизмов, содержащим штаммы бактерий: Aeromonas sp., Arthrobacter globiformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Citrobacter sp., Flavobacterium tirrenicum, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri; штаммы микромицетов: Aspergillus candidus, Link, Aspergillus glaucus, Link, Aspergillus terreus, Thom, Penicillium frequentans, Westling, при концентрации клеток от 10 до 103 клеток на мл воды. Новые операции и режимы осуществления способа, применение нового исходного вещества позволяют улучшить технические характеристики способа получения консорциума микроорганизмов, консорциума микроорганизмов и cпособа ликвидации нефтяных загрязнений. 6 22967 Сущность заявляемых изобретений поясняется примерами. В таблице 1 даны показатели состава сточной воды, в частности отработанной смазочно-охлаждающей жидкости (СОЖ), используемой в примерах конкретного исполнения. В таблице 2 даны показатели примеров конкретного выполнения вариантов осуществления способа получе ния консорциума микроорганизмов и соответственно получае мого консорциума микроорганизмов с указанием режимов, параметров и применяемых веществ, а в таблицах 3-11 достигаемые качественные характеристики консорциумов в различных примерах использования консорциума. Примеры применения способа получе ния заявляемого консорциума микроорганизмов. Способ получе ния консорциума микроорганизмов в указанных примерах (таблица 2) осуществляли следующим образом. Для получения консорциума микроорга низмов - деструкторов нефтепродуктов применяли известный метод накопительных,культур, используя пробы почвы и отложений, содержащих био ценозы, длительно контактирующие с нефтепродуктами. Образцы почвы по 100 г почвы из слоя 0-3 см от поверхности отбирались возле отстойников водно-маслянных стоков из 15 различных то чек, загрязненных нефтепродукта ми, и имеющи х повышенное содержание тяжелых металлов Pb, Cu, Fe, Mn. Большая часть образцов отбиралась возле отстойников водно-маслянных сто ков цеха холодного проката Мариупольского металлургического комбината им. Ильича, имеющего подобный состав почвы; Пробы почвы смешивались, определялось содержание в них нефтепродуктов и тяжелых металлов (методом атомно-адсорбционной спектрометрии). Отбирались также отложения со стенок отстойников нефтепродук тов и отложения со стенок трубопроводов водно-эмульсионной системы охлаждения. Дальнейшие операции производились с образцами, имеющими указанное в таблице содержание загрязнений. Пробы почвы (100 г) и отложений (по 50 г) смешивали и помещали в колбы Эрленмейера емкостью 0,5 л и заливали минеральной средой (состав добавок см. таблицу 2), приготовленной на основе реальной сточной воды, в частности отработанной смазочно-охлаждающей жидкости (СОЖ), включающей отхо ды следующего хи мического строения. Таблица 1 Тип соединения 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Относительнoe содерж ание (%) Парафины Нафтены - моноциклические - бициклические - трициклические 18,1 Алкилбензолы Инданы, тетралины Динафтенбензолы Нафталины Аценафтены Флуо рены Фенантрены, антрацены Асфальтены 7,6 2,0 2,5 2,9 2,8 2,6 1,9 1,1 42,9 12,2 3,4 Селекцию осуществляли на качалке УВМТ12-250 при 200 мин -1 и 22 -28° С в течение 8 суток. Да лее содержимое колб отфильтровывали через ватно-марлевый фильтр, суспензию микроорга низмов отделяли центрифуги рованием и залива ли свежей селективной средой то го же соста ва. Туда же помещали насадку из текстурированного капронового во локна (Глоба Л.И., Гвоздяк П.И., Загорная Н.Б. и др. // Хи мия и технология воды.- 1992.-Т.14. - № 1.- С. 68-73.). Иммобилизацию накопительной культуры проводили на качалке в течение 8 суток. Адап тацию иммобилизованной культуры проводили в условиях постоянно повышающей ся концентрации ксенобиотика. Начальное содержание нефтепродуктов в каждом примере указано в таблице 2. При дости жении стабильного его разрушения не ме нее чем на 90%, количество субстрата увеличива ли на 0,2-0,3 г/л и так далее до 10 г/л. Замена питательной среды и контроль содержания нефтепродуктов про водились ежедневно. Для проверки наличия и качественного состава микромицетов суспензию (10000 кл/мл) рассевали на агаризованную минеральную среду Чапека, содержащую в качестве единственного источника углерода эмульсол ЭТ-2У, представляющий собой смесь различных гр упп углеводородов, получен ных путем перегонки нефти, и эмульгатор, позволяющий образовывать стойкую эмульсию с водой. Для проверки наличия и качественного состава углеводородокисляющи х бактерий и актиномицетов суспензию микробиологического пре 7 22967 парата (1000 кл/мл) рассевали на агаризованную среду Та усона, содержащую 1 г/л эм ульсола ЭТ2У. Отдельные колонии изолировали, микроскопировали и иденти фицировали по выше указанным признакам для индивидуальных штаммов. Таблица 2 Пpимеры Компоненты 1 Смесь Объем загрязнений нефтепродукта ми, % 2 3 4 5 6 19 18 20 20 18 19 образцов Рb, мкг/г 850 915 889 800 902 863 почвы Сu, мкг/г 210 200 180 180 240 216 Fе, мкг/г 2350 2000 2700 2650 2000 2400 Мn, мкг/г 1500 1450 1700 1600 1300 1350 Содержание нефтепродуков, % 83 86 82 80 85 85 Отложения со Содержание нефстенок трубопротепродуктов, % водов 77 76 79 80 80 77 Отработанная СОЖ Концентрация нефтепродуктов, г/л 0,7 0,6 0,5 1 0,9 0,8 NН4(NО3)2 Концентрация, г/л 0,3 0,2 0,4 0,3 0,2 0,3 К2НРO4 Концентрация, г/л 0,2 0,2 0,3 0,4 0,3 0,4 КН2РO4 Концентрация, г/л 0,3 0,2 0,3 0,4 0,2 0,4 Отложения со стенок отстойников В результате проведенных селекции и адаптации в указанных примерах получе но 6 образцов консорциума. Анализ их состава показал наличие в каждом из образцов консорциума микроорганизмов, включающи х штаммы бакте рий: Aeromonas sp., Arthrobacter globiformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Citrobacter sp., Flavobacterium tirrenicum, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri; и штаммы микромицетов: Aspergillus candidus, Link, Aspergillus glaucus, Link, Aspergillus terreus, Thom, Penicillium frequentans, Westling. Дальнейшие исследования качественных ха рактеристик полученного консорциума велись с отдельными образцами консорциума в различных условиях осуществления способа использования консорциума при различных указанных в примерах режимах и параметрах. Все исследования проводились в нестерильных условиях с использованием натуральных сточных вод или естественных нефтяных загрязнений. Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для деструкции плавающей нефти. В колбы Эрленмейера объемом 0,5 л содержащей 100 мл минеральной среды и 1 г/л плавающей нефти вносили микроорганизмы консорциума, полученные в указанных в таблице 2 примерах получе ния консорциума из расчета 103 кл/мл. Ин кубировали 12 суток при 28°С без перемешивания. Углеводо роды из различных сред экстрагиро вали смесью эти ло вый спирт : че тыре ххлористый углерод в соо тношении 1 :2 . Ко личество и струк тур но-груп повой соста в углеводо родов определяли с использованием методов о бозревае мого и прямого вво да образца в масс-спектрометр LKB-2091. Образец до микробиологической обработки иссле довали методом масс-спектральной термодесорбции с использованием прямого вво да. Для это го определенное количество образца наносили на сорбент те накс, а затем, поместив е го в ампулу прямого вво да, испаряли орга ническую часть при раз личных температурах образца от комнатной до 250°С. Для анализа образцов после микробиологической обработки наиболее полн ую ин фор мацию обеспечивае т метод обозревае мого вво да: образец из балло на напуска, обогретого до 250°С, через молекулярный натекатель поступал ионный источник масс-спектрометра. Ма сс-спектр снимали с помощью све толучево го осциллографа в диа пазоне масс 10-600 а.с.м. Эти прие мы позво ляют разделить компоненты углеводо родной смеси по температурам кипения, что значитель но уп рощает расши фровку масс-спектров. Ма сс-спектры, по лучен ные при разных температурах, сум мировали и определяли стр уктурно-груп повой состав углеводо родов. 8 22967 Таблица 3 Группа соединений Разрушение соединений нефти, % пpи использовании заявленного консорциума, пpимеры 1 2 3 4 5 6 при использовании консорциума прототипа углеводороды 99,8 99,3 99,1 98,9 99,5 99,0 92 Ароматические углеводороды 92,7 90,9 91,3 94,4 93,6 92,3 82 Полярные соединения 82,0 80,0 79,4 78,6 81,3 83,0 63 Асфальтены 100,0 98,4 100 99,9 100 100 49 Насыщенные Представленные выше результаты показывают, что использование предлагаемого консорциума позволяет практически полностью разрушить асфальтены и насыщенные углеводороды и значительно снизить содержание ароматических углеводородов, в том числе с числом колец более 3-х, и полярных соединений, в сравнении с прототипом. Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для деструкции нефтепродук тов в водно-масляном стоке и почве в условиях различных концентраций микроорганизмов консорциума. Исследовалось влияние концентрации микроорганизмов консорциума на деструкцию нефтепродуктов (%) в водно-масляном стоке (24 часа) и почве (3 мес.). Исследование деструкции нефтепродуктов в почве изуча ли в ла бораторных условиях при ком натной температуре и влажности 60%. В почву искусствен но вносили различные дозы масел, отсепарированных из о тработанной смазочноохлаждающей жидкости, и тща тель но перемеши вали. Туда же вносили суспензию микроорганизмов в раз ных концентрациях в разных варианта х опыта. Че рез 3 месяца оста точные углеводо роды из почвы экстрагиро вали смесью этило вый спир т : че тыре ххло ристый углерод = 1:2. Ра ство ритель вы паривали при комнатной температуре и оставшие ся масла определяли гра виметрически. Влия ние концентрации микроорганизмов консорциума на деструк цию нефтепродукто в в водно-масляном сто ке изуча ли в условиях пе риодического куль ти вирования (табл.4). Оста точные углеводо роды экстрагировали вы ше указанным способом и количество их определяли гра виметрически. Таблица 4 Субстрат Концентрация микроорганизмов кл/мл; кл/г Заявляемый консорциум Прототип Исходные концентрации нефтепродуктов, г/л; г/кг 5 10 Примеры 20 Примеры 5 3 6 1 3 6 1 3 90 52 28 100 85 56 6 90 92 91 88 86 85 60 62 58 102 92 90 89 87 84 90 59 60 56 103 94 96 82 90 91 87 64 61 60 105 95 91 93 80 86 84 56 60 54 108 89 90 93 89 90 85 68 66 66 103 92 96 99 80 87 80 70 79 76 105 100 100 98 93 90 89 89 86 89 106 100 100 100 95 96 92 85 86 89 108 100 100 100 92 94 94 80 82 84 109 Почва 20 Примеры 1 10 Водно-масляный сток 10 100 100 100 90 90 90 90 89 86 Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для деструкции нефтеп родук тов в различных условиях периодического культивирования. 9 22967 В колбы Эрленмейера емкостью 0,5 л помещали 200 мл водно-масляного стока с разным содержанием нефтепродуктов, рН - 7 - 7,6. Суспензии микроорганизмов консорциума, полученные в примерах получе ния консорциума (таблица 2) вносили из расчета 10 кл/мл. Встряхива ли на качалке 160 мин-1 при t=28°C. Суспензии микроорганизмов консорциума, получен ных в примерах получе ния консорциума (таблица 2), заливали свежей селективной средой того же состава. Туда же помещали насадку из текстурированного капронового волокна (Гло ба Л.И., Гвоздяк П.И., Загорная Н.Б. и др.//Хи мия и технология воды.- 1992.-Т. 14. - № 1.- С. 68-73.) и помещали на качалку УВМТ-12-250 при 200 мин -1 и 22 - 28°С. Иммобилизацию накопительной культуры проводили на качалке в течение 8 суток. Количество углеводородов анализировали вышеуказанным способом. В таблице 5 представлены граничные значения показателей разрушения нефтепродуктов (max и min) за 24 часа для различных примеров консорциумов, полученных при селекции консорциума (примеры 1-6 таблицы 2). Таблица 5 Разрушение нефтепродуктов за 24 часа, % Концентрация нефтепродуктов, г/л Заявленного консорциума Свободные, 103 кл/мл Иммобилизованные Примеры 1-6 Примеры 1-6 0,2 0,3 0,4 100 100 97-100 100 100 100 0,5 1,0 3,0 95-99 90-98 86-90 100 99-100 96-98 5,0 10,0 20,0 80-83 51-55 25-30 Прототип 80-90 78-85 50-66 Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для деструкции нефтепродук тов в различных условиях непрерывного культивирования. Иммобилизованные 80-89 69-76 51-67 91-98 80-98 67-90 Объём установки, л 1,4 Скорость протока, ч 0,04 t , °С 28 рН 6,5 - 7,5 Расход воздуха, м /г 15 - 20 Количество углеводородов анализировали вышеуказанным способом. В таблице 6 также представлены граничные значения показателей разрушения нефтепродуктов для различных примеров консорциумов, полученных при селекции консорциума (примеры 1-6 таблицы 2). Таблица 6 Водно-масляный сток подавали на четырех секционную ла бораторную установку, состоящую из 4-х стеклянных колонок, соединенных последовательно и заполненных во локнистым носителем с иммобилизованным Консорциумом микроорганизмов. Концентрация нефтепродуктов, г/л Свободные, 5х108 кл/мл Деструкция нефтепродуктов, % Заявленным консорциумом Примеры 1-6 Прототипом 1,0 99,8 80-85 3,0 96,0-99,0 69-73 5,0 92,0-95,0 28-34 10,0 90,0-93,0 20,0 60,0-66,0 30,0 20,0-26,0 50,0 1,0-2,3 Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для деструкции нефтепродук тов в различных температур ных условиях непрерывного и периодического культи вирования. Иссле довалось влия ние температуры на разрушение не фтепродуктов кон сорциумом и на накопление био массы (при рН 7 ,0 - 7 ,6) 10 22967 Биомассу отфильтровывали, высуши вали при комнатной температуре до постоянного веса и определяли ее количество на известный объем культуральной жидкости. Таблица 7 Варианты 5 1 2 3 4 5 10 5 20 5 30 5 40 6 7 8 10 10 10 20 10 30 10 40 Исходная концентрация нефтепродукта, г/л t° процесса, °С Заявляемый консорциум Периодический режим æ % ö ç ÷ èг/ лø 72-74 7,4-7,8 80-82 8,6-9,0 82-84 8,8-8,9 78-82 7,8-8,0 60-64 5,8-6,0 66-70 9,6-10 63-71 10-10,2 63-66 9,0-9,4 Непрерывный режим, % 80-84 88-91 90-92 88-90 76-79 84-84 79-91 80-82 Прототип Периодический режим æ % ö ç ÷ èг/ лø 59 5,2 69 6,6 70 7,0 578 4,2 Непрерывный режим, % 58 62 66 49 Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для деструкции нефтепродук тов в условиях различных концентраций нефтепродуктов. Исследовалось влияние концентрации нефтепродуктов на прирост биомассы (г/л сухой биомассы) консорциума. Исследования проводились в ферментере АК-203. Условия фермента ции: объем культуральной среды - 1,5 л; скорость перемешивания - 350 мин -1; аэрация 1:1 мин-1; температура 28 - 30°С; рН 7 - 7,6; исходная концентрация микроорганизмов консорциума 103 кл/мл. Таблица 8 Время инкубации (сутки) Концентрация нефтепродуктов, г/л 0,5 0,7 1,0 3 5 10 20 Заявляемый консорциум 1 1,61 1,52 2,00 1,90 1,80 1,85 0,80 2 4,32 5,66 8,22 4,44 5,30 5,50 2,25 3 7,02 8,09 6,91 8,88 7,66 7,18 3,4 4 9,09 9,24 8,25 10,19 10,12 10,50 5,0 5 8,54 10,00 8,99 8,62 9,33 9,62 5,8 Прототип 1 1,1 1,0 1,4 0,9 0,3 0,3 2 3,2 2,8 4,0 1,0 0,4 0,5 3 5,1 6,0 5,1 3,3 0,5 0,6 4 6,2 7,1 6,6 3,4 0,8 0,6 5 4,3 8,0 6,2 4,0 0,8 0,6 Приме ры при менения получен но го консор циума микроорга низмов для де струк ции нефти в почве при инок уляции угле водо родоо кисляющими микроорга низмами (УОМ) в ус 11 22967 ловия х р азли чных кон центраций не фтепро дуктов. Исследования проводили в лабораторных условиях, описанных в примере (табл. 4). Углеводородокисляющие микроорганизмы вносили в почву в количестве 103 кл/г почвы. Содержание нефти в почве определяли вышеописанными способами. Исследовалась деструкция нефти в почве (%) через 3 месяца, при инокуляции УОМ. Таблица 9 Содерж ание нефти в почве (%) 0,5 1,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 20,0 100,0 93,9 88,8 81,0 77,1 60,9 62,2 61,0 42,2 28,0 22,0 20,4 18,6 15,3 14,9 15,0 100 85,0 56,0 73,0 66,3 58,6 48,2 59,8 54,0 39,0 28,0 32,75 43,8 33,4 24,2 25,45 Контроль 1 (почва 1+нефтепродукты) Предлагаемый консорциум микроорганизмов Контроль 2 (почва 1+нефтепродукты) Ассоциация по прототи пу Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для очистки нефтесодержащих сточных вод в аэротенке. На модели аэротенков высотой 1,65 м, объемом 8 л, подавали водно-масляный сток, содержащий 100 г/л нефтепродуктов. Исследо ва ния проводи ли на двух а эротен ках с пе рио дом аэрации 5 и 8 ча со в с вне сением консор циума микроорга низмов (103 /мл) и без е го вне сения (о чистка толь ко акти вным илом). Таблица 10 Вода на выходе (очищенная) Показатели Вода на входе Активный ил С внесением консорциума Прототип Период аэрации, час 8 5 8 5 8 БПК полн, мг/л 160 20 13 11 16 16 Нефтепродук ты, мг/л 100 16 5 3 16 14 Биологическое потребление кислорода (БПК) определяли по общепринятой методике (см. Лур ье Ю.Ю., Рыбникова А.И. Хи мический анализ производственных сточных вод. – М., 1985.) Примеры применения полученного консорциума микроорганизмов для деструкции нефтепродук тов в условиях различных рН среды. Влияние рН среды на накопление биомассы культуры микроорганизмов, ее деструктивную активность и структуру консорциума изучали на солевой среде вышеуказанного состава при содержании в ней 1 г/л нефтеотходов и температуре роста - 28 °С. Исследования показывают, что применение консорциума вместе с активным илом позволяет повысить глубину очистки в 3-4 раза. Таблица 11 Заявленный консорциум рН среды Биомасса сухая, г/л Прототип Деструкция нефтеотходов, % Биомасса сухая, г/л Деструкця нефтеотходов, % 4 5,6 70,4 1,4 12,0 5 6,6 77,4 3,2 24,0 12 22967 Продолжение табл. 11 Заявленный консорциум рН среды Биомасса сухая, г/л Прототип Деструкция нефтеотходов % Биомасса сухая, г/л Деструкця нефтеотходов % 6 9,3 80,8 5,5 89,4 7 10,0 92,8 6,1 80,3 8 8,5 86,7 4,3 75,0 9 4,9 79,3 2,6 19,4 10 3,1 55,0 1,1 8,4 Во всех примерах также исследовалось влияние условий на стабильность образцов консорциума и стойкость его к заражению побочными микроорганизмами. Все представленные исследования проводились в нестерильных условиях с использованием натуральных сточных вод или естественных нефтяных загрязнений. В результате проведенных исследований анализ состава консорциума (проведенный по методике описанной в примерах получения к таблице 2) показал, после проведенных испытаний, наличие в каждом из образцов консорциума микроорганизмов, включающих штаммы бактерий: Aeromonas sp., Arthrobacter globiformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis, Citrobacter sp., Flavobacterium tirrenicum, Nocardia sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri; и штаммы микромицетов: Aspergillus candidus, Link, Aspergillus glaucus, Link, Aspergillus terreus, Thom, Penicillium frequentans, Westling. Предста вленные в при мерах показатели применения нового консорци ума микроорга низмов показывают, что предста вленным консорциумом обеспечивается улучше ние показателей ста бильности консорци ума во вре мени и в несте рильных условия х, обе спечивае тся возможность дестр укции как свободных, так и эмуль гированных не фтеп родук тов (в том числе масла) в концентрации до 10 г/л на 90 - 93 % в прямоточном режиме и на 78 - 85% в периодическом. Процесс деструкции при применении та кого консорци ума идет в ши роком диапазоне положитель ных температур и рН, при атмосфер ном давлении. При очистке сточных вод отсутствует необхо димость специальной подгото вки стока (отделение или эм уль гирова ние масел, разбавление, использование реагенто в). При дли тельном культивиро вании консорциум ста билен и стоек к заражению побочными микроорга низмами. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 13 22967 14