Штам бактерiй bacillus subtilis для одержання препарату проти збудникiв захворювань бавовника

Использование: микробиологическая промышленность, получение средств защи ты растений, в частности хлопчатника, от возбудителей заболеваний Штамм выращивают на сусло-агаре при рН 6,8-7,0 а течение 7-10 сут.при 28-32°С, смывают выросшие колонии физиологическим раствором и готовят суспензию с тиром (2-3)* *10 кл./мл. В суспензию вносят криопротектор (сэхарозожеяатиновую среду) и лиофилизируют. Для обработки семян хлопчатника лифилизированную культуру разбавляют водой до содержания 5,0*10 - 1,0*10 кл./мл. Для обработки 1 т семян хлопчатника используют 500-700 л рабочей суспензии. Препарат на основе штамма позволяет защитить хлопчатник от возбудителей кормовой гнили на 93-94%, вертициллезного вилтэ на 85,2-86%. 7 табл.. Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к защите растений хлопчатника от поражения фитопатогенными грибами. В качестве наиболее распространенного метода предупреждения грибных болезней хлопчатника используется протрзвлиеануіе семян химическими препаратами (формалином, бропокотом, бропокотом с ксзчтаном, бропокотом с ГМТД). Известен способ предпосевной обработки семян хлопчатника синтетическим препаратом с целью повышения семян. Однако химические способы имеют ряд существенных недостатков: высокая токсичность дпя человека и животных, накапливание в почве и растениях остаточных количеств ядовитых веществ, сложная тех нология протравливания, неэффективность против загнивания семян, гнили проростков и корневой гнили всходов, высокая стоимость и др. Известны биологические способы борьбы с различными болезнями растений, в том числе вызываемыми грибами. Способ борьбы с черной ножкой, корневой гнилыо. шейковой гнилью основан на использовании препарата из Irichoderma harzlanum T - 315 (ATCCN? 20671). Однако они не эффективны для защиты растений хлопчатника от таких болезней, как вертициллезный вилт, фузэриозное увядание и др. Наиболее близким к изобретению является способ применения Bacillus polymyxa 9А для защиты растений от еертициллезно -я 1717156 го увядания. В. polymyxa 9A, выделенная из корней растений картофеля, росших на участках, сильно зараженных Verticiilium dahliae, обладает способностью подавлять развитие вертициллезного увядания на та- 5 ких культурах, как картофель и хлопчатник. В. polymyxa может быть использована в форме водных м неводных препаратов. Водные препараты содержат 10 - 10 9 кл/мл, а пасты 10 кл/мл. Неводные препа- 10 раты включают дусты, смачивающие порошки, гранулы, эмульгоконцентраты. Рабочие составы могут применяться в виде растворов, гранул, дуста, Чаще всего составы используют для непосредственной обработки 15 Семен и семенного материала, хотя не исключается возможность обработки почЪы вокруг посадочного материала. Однако данный способ не включает предупреждение таких болезней хлопчатника, 20 как черная корневая гниль и фузариозное увядание. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего более широким спектром действия к возбуди- 25 телям заболеваний хлопчатника. Поставленная цель достигается использованием для предпосевного увлажнения семян хлопчатника суспензии полученной новой живой культуры Bacillus subtilis 26D ЗО с содержанием 5-Ю - 1 '10 кл/мл, применяемой в количестве 0,5-0,7 л на 1 кг семян при экспозиции 12-18 ч. Штамм В.subtilis 26D получен из внутренних тканей стебля здорового растения 35 хлопчатника в лабораторных условиях. После предварительной обработки и стерилизации поверхности стебля стерильным скальпелем снимали кору, и небольшие кусочки стебля помещали на поверхность пи- 40 тательного агара (картофельного агара) в чашку Петри. Чашки инкубировали при 28°С в течение 5-7 сут. Штамм идентифицирован по определителю Берги (1984), на основании работ 45 Gordon (1973), депонирован в коппекцмм Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под № 128. Штамм В. subtilis 26D имеет следующие 50 основные культурально-морфологические и биохимические признаки. Грамположительные подвижные аэробные спорообразующие палочки с закругленными концами, продуцирующие каталазу. Образуют эндос- 55 поры, не раздувающие клетку. Размер клеток - 1,9x0,5 мкм; в мазках 18 ч культуры клетки расположены одиночно, попарно, реже в цепочки. Споры в клетке расположены центрально, размер спор 0,9«0,5 мкм. При культивировании штамма на МПА в течение 24 ч при 37°С образуются складчатые колонии вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии изрезаны. На среде Громыко (сусло-агар + МПА 1:1), рН 6,8-7,0 после 24 ч термостатирования при 37°С образует кремово-белые колонии, складчатые, с кратерообразным центром, консистенция вязкая, края колонии изрезанные. Культура ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, галактозу, лактозу, мзинит, сахарозу с образованием кислоты без газа, не разлагает дульцит, рамнозу. Дает положительную реакцию Фо^ес-Проскауера, гидролизует крахмал, желатину, не гидролизует мочевину; утилизирует цитрат, не использует пропионат. Не растет в анаэробных условиях, не образует включения поли/3-оксимасляной кислоты на среде МПА с глюкозой; не образует индол и сероводород. Не обладает лецитиназой, коагулазой, гиалуронидазой. Патогенными свойствами (токсическими, токсигенными, вирулентными) при парентеральном и пероральном введении белым мышам не обладает. Проверка безвредности осуществлялась следующим образом. Лабораторным животным вводили фильтрат культуральной жидкости В. subtilis 26D, выращенной в течение 10 сут на мясо-пептонном бульоне при 28°С; суспензии клеток В. subrilis 26D, выращенной на мясо-пептонном агаре при 28°С в течение 24 ч, суспензии инактивированных прогреванием клеток В. s u b t i i i s 26D, выращенной в течение 24 ч на МПА при 28°С Проверку патогенности осуществляли на белых мышах весом 18-20 і. Животным вводили суспензии и фильтраты в желудок через зонд и в инъекциях. В табл. Г представлены результаты исследования токсичности Фильтрата культуры В. subtilis 26D после роста на МПБ (токсигенность культуры). В табл. 2 приведены результаты введения животным МПБ (контроль) В табл. 3 приведены результаты исследования вирулентности культуры В subtilis 26D, выращенной на МПА при 28°С в течение 24 ч. В табл. 4 приведены результаты исследования токсичности инактивированных клеток культуры В. subtilis 26D Наблюдения за животными проводили на протяжении 15 дней после окончания курса инъекций или перорального введения. В период наблюдения все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления у них не 1717156 практически не обладающим аллергенными общетоксическим действием, Культура В, subtilis 26D пересевается на среде Громыко (сусло-эгар + МПА 1:1) сусло-агаре, среде Гаузе № 2; рН 6,8-7,0 Растет при 10-50°С, температурный оптимум 37°С. Хранится культура на среде Громыко, либо среде Гаузе № 2, либо картофельном агаре в течение 2-3 мес при комнатной температуре, а под слоем стерильного минерального масла на указанных выше средах -неменее 1-2лет. В лиофильновысушенном состоянии культура хранится до 3 лет и более. Для этого штамм В. subtilis 26D выращивают на среде Громыко или среде Гаузе № 2, или сусло-агаре в течение 5-7 сут при 28 или 37°С. С агаризованной среды биомасса снимается физиологическим раствором. В качестве защитной среды используется сахарозо-желатиновый наполнитель. Температура замораживания не выше -25°С. режим высушивания от -25°С до 32°С в течение 32 ч. После хранения под минеральным маслом или в лиофилизированном состоянии культура образует однотипные колонии, на МПА - складчатые, вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии изрезанные. Антагонистические свойства. Антагонистическую активность В. subtilis 26D по отношению к фитопатогенным грибам определяли методом отсроченного антагоВведение суспензии живых, з также низма, а именно радиальных штрихов. инзктивированных клеток 24-часовой куль- 35 Штамм-знтагонист засевали в центре чашки туры В. subtilis 26D перорально в дозах 0.5Петри на среду Гаузе N;2, инкубировали при 1,0 млрд. микробных клеток и 28°С в течение 72 ч. затем оадиальными внурибрюамнно в дозах 0,5-1.0 млрд. микштрихами подсевали тест-культуры, суспенробных клеток на мышь не вызвало у живозии которых готовили в физиологическом тных каких-либо признаков заболевания. 40 растворе с содержанием 0.5 млрд спор в 1 Изучение внутренних органов животных не мл. Учет результатов проводили по величине выявило у них признаков патологического зоны задержки роста тест-штамма в миллипроцесса и изменений, регистрируемых метрах. макроскопически. В табл. 5 приведены данные по антагоВведение мышам фильтрата среды рос- 45 нистической активности В subtllis 26D по та (после культивирования штамма В. отношению к некоторым фитопатогенным subtilis 26D на мясо-пептонном бульоне) не грибам. выявило у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при Как видно из приведенных в табл 5 дзнмакроскопическом изучении внутренних ор- 50 ных. штамм В. subtilis 26D обладает выраганов животных. женной антифунгэльной активностью в отношении грибов-возбудителей корневых Таким образом, полученные данные дагнилей, фузариозного увядания, вертицил ют основание отнести изученный штамм к лезного вилта. 4-му классу по классификации, приведенной в Методических указаниях МЗ СССР, 55 Культуру В. subtilis 26D использовали Главного санэпидуправления "Постановка для получения препарата. исследований для обоснования предельно Препарат на основе В. subtilis 26D допустимых концентраций производственпредставляет собой лиофилизированную ных штаммов и на их основе готовых форм взвесь культуры в физиологическом рэствопрепаратов...", т.е. к микроорганизмам. ое IMaCI с добавлением защитной среды. В нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменения массы тела животных в опыте и контроле была сходной. Все подопытные и 5 контрольные животные после окончания срока наблюдения были умерщвлены, вскрыты, их органы подвергнуты макроскопическому изучению. Результаты вскрытия показали следую- 10 щее. Сердце обычной формы и величины, у подопытных животных такое же, как и у контрольных. Легкие по объему, строению долей у опытных и контрольных животных 15 одинаковые; поверхности легких гладкие. доли легко отделяются друг от друга, спаек не отмечено. Желудок, петли тонкого и толстого кишечника внешне обычные, признаков воспалительных изменений н-е 20 отмечено При вскрытии просвета виден неизмененный (такой же. как и у контрольных животных) рисунок слизистых. Печень темно-красного цвета, среднего кровенаполнения, не увеличена. Доли отделены друг от 25 друга, поверхности гладкие Почки по размерам v\ форме не отличаются у контрольных и опытных животных, поверхности гладкие, на разрезе виден четкий рисунок коркового и мозгового вещества. Селезенка не увеличена, обычной консистенции. На 30 разрезе пульпа умеренно полнокровна, темно-красного цвета. 1717156 8 качестве защитной среды использовали 1 % желатины и 1%сахарозы. Культуру В. subtilis 26D выращивали на среде суслоагар (рН 6.8-7,0) в течение 7-10 сут при 2832°С. С агаризованной среды биомассу 5 смывали физиологическим раствором NaCI и готовили суспензию, содержащую 2-3-10 клеток в 1 мл. Суспензию соединяли с наполнителем (сахарозо-желатиновой средой). Полученную взвесь разливали в 10 емкости из нержавеющей стали по 300 мл и замораживали при -(25-30)°С в течение не менее 24 ч. Проводили лиофилизацию в камере в режиме от (-30) до 32°С в течение 32 ч. Высушенную биомассу помещали в поли- 15 этиленовые пакеты и укупоривали горячим способом. ходимое количество рабочей суспензии использовали в 2-3 приема с интервалом в 4-6 ч, чтобы семена хорошо впитали раствор, Вслед за каждым увлажнением семян их тщательно перелопачивали и накрывали брезентом. Последнее увлажнение проводили перед посевом. Если посев задерживался, семена подсушивали, рассыпав их слоем в 5-10 см, а непосредственно перед внесением в грунт их увлажняли водой. Результаты предпосевной обработки семян хлопчатника с целью предупреждения поражения растений грибными болезнями, повышения всхожести представлены в табл. 6. Влияние В. subtilis 26D на прорастание семян и пораженность корневыми гнилями. Для обработки семян хлопчатника бакВ табл. 7 приведены результаты предпотериальную лиофилизированную культуру севной обработки семян хлопчатника с за 1-2 ч до начала обработки растворяли в 20 целью предупреждения поражения растенебольшом количестве водопроводной воний корневыми гнилями, вертициллезным ды с целью оживления бактериальных спор вилтом, повышения урожайности. "и клеток. Затем из маточного раствора гоТаким образом, приведенные данные товили рабочую суспензию, доводя титр до свидетельствуют о высокой эффективности 5.0И08 - 1,0'Ю9 кл/мл. Для обработки 1 т 25 предлагаемого способа дія предпосевной семян необходимое приготовление 500-700 обработки семян хлопчатника. л рабочей суспензии. Обработку семян производили либо в имеющейся емкости, либо Ф о р м у Леї и з о б р е т е н и я в специально приготовленной зацементиШтамм бактерий Bacillus subulis BHHрованной яме. Обработку начинали за 12-18 30 ИСХМ i\k 128 для получения препарата ч до начала сева. В емкость всыпали до 1 т против возбудителей заб^ ЄЕЯНИІ, уюпчатсемян и поливали вручную из лейки. Необшка. Т абли ца 1 о о о 0,5 1,0 0.5 о 1,0 Способ вве- Курс введения дения Внутрибрюшинно 1 То же 1 Перорально 5 То же 5 Заболело Пало 0 0 0 0 0 0 0 0 35 Количество мышей Доза, мл 10 10 1,0 1,0 Способ вве- Курс введедения ния Внутрибрюшинно Перорально Воїжило о Доза, мл о о о Количество мышей Таблица 2 Заболело Пало Выжило 10 10 10 1717156 Таблица 3 Количество Доза, млрд Способ вве- Курс введемышей (количество дения ния микробных клеток) Внутрибрюшинно 10 0.5 1 10 То же 1 1,0 Перорально 10 0.5 5 10 1,0 То же 5 Заболело Выжило 0 0 0 0 0 Пало ™j 10 10 10 0 . о 0 І .II Таблица 4 Количество Доза, млрд Способ вве- Курс введемышей (количество дения ния микробных клеток) Внутрибрю10 0,5 1 шинно 1 10 1,0 То же 10 0.5 Перорально 5 10 1,0 То же 5 Заболело Пало Выжило I 0 10 10 10 0 0 0 0 0 0 0 ю Таблица 5 1 Штамм-антагонист Зона задержки роста, мм тест-культуры Fusarium Fusarium Thiefavlopsis Verticil. : um oxysporum 9833 oxysporum 6465 baslcola dahtiae 23+2,2 24(2.4 В subtilis 26D 15+2 3 29+3,1 j П р и м е ч а н и е . 1 В качестве тест-культур использовали штаммы фитопатогенных грибов, изолированные из пораженных растений хлопчатника, выращенных в различных районах Таджикской ССР Штамм Fusarium oxysporum 6365 получен из коллекции Института микробиологии и вирусологии АН VCCP. 2. Время наблюдения зон лизиса фитопатогенных грибов 3-10 сут. Таблица 6 Влияние В. subtllls 26D на прорастание семян и пораженность корневыми Опыт. № > Общее количество всходов Количество растений, пораженных корневыми гнилчми, 1 2 13 16,95 19.75 13,2 15,0 13,5 16,9 12,7 6,2 10,2 8,1 /о 3 4 5 6 7 Контроль (формалин) 8,6 9,0 ,' ч і 7,2 7,3 15,3 , j | 171/156 11 12 Таблица 7 Влияние В. subtllis 26D на пораженность растений хлопчатника корневыми гнилями, вертициллезным вилтом, повышение урожайности Увлажнение семян суспензией В. subtiils26D(1 млрд/мл) Пример 1 0,5 л на 1 кг Пример 2 0.6 л на 1 кг Пример 3 0,7 л на 1 кг Пример 4 0,8 л на 1 кг Пример 5 0,4 л на 1 кг Пример 6 03 л на 1 кг Пример 7 0.2л на 1 кг Пример 8 0.1 л на 1 кг Редактор Н.Швыдкая Пораженность растений, % Вертициллезный вилт Корневые гнили 6.4 6,2 6,1 6.5 6,6 6,7 7,0 6.8 Составитель В Смирнов Техред М Моргентал 14,1 14.0 14,1 14,4 14,5 14,8 14,8 14,7 'Средняя урожайность, ц 41,3 41.7 41,8 40.6 40,8 40,3 39,9 39.4 Корректор Э.Лончакова Заказ 829 Тираж Подписное ВНІ/1ІЛПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб , 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г Ужгород, уп Гагарина, 101