Вакцина для імунізації свиней проти плевропневмонії, спосіб її приготування та спосіб імунізації свиней проти плевропневмонії

Винахід стосується загалом вакцин, що використовуються за ветеринарними призначеннями, більш конкретно, живої рекомбінантної атенуйованої вакцини для хворобливих станів, спричинених організмами, які включають капсулу, причому наявність капсули є потрібною для вірулентності, а не для імунозахисту. Винахід, зокрема, може бути використаний у виробництві рекомбінантно продукованої вакцини, яка одержується таким чином, щоб не мала капсули. Вакцини є препаратами, які використовуються для попередження певних хвороб у тварин та людей шляхом індукування імунітету. Це здійснюється шляхом піддавання пацієнта дії антигену до певної хвороби, який, в свою чергу, спричинює продукування імунною системою пацієнта великої кількості антитіл. Наявність антитіла у крові пацієнта захищає пацієнта від подальшого нападу збудника хвороби. Вакцини можуть складатись із субодиниць збудника, або з самого живого чи вбитого збудника. Наприклад, профілактику поліомієліту, який звичайно називають «поліо» (polio), типово здійснюють шляхом введення перорально живої атенуйованої вакцини поліовірусу, що є звичайною практикою у лікування дітей, або шляхом введення вбитої чи інактивованої вакцини поліовірусу, що є звичайною практикою у лікуванні дорослих, оскільки вони загалом мають підвищений ризик захворювання на поліомієліт від живої вакцини. Якщо треба використовувати живу вакцину, її вірулентність повинна бути якимось чином атенуйованою; інакше вірус у вакцині може спричинити хворобу, від якої вона повинна захищати. Ряд хвороб спричинюється інкапсульованими бактеріями, у яких капсула, яка є смолоподібним шаром полісахариду чи поліпептиду, що знаходиться ззовні клітинної стінки цих бактерій, потрібна для патогенезу. Одним з прикладів є плевропневмонія свиней, а фактори вірулентності бактерії Actinobacillus pleuropneumoniae, яка спричинює хворобу, включають капсульний полісахарид, ендотоксин та білкові екзотоксини. Плевропневмонія свиней є однією з головних респіраторних хвороб, які завдають шкоди виробництву свинини у всьому світі та спричинюють у промисловості щорічні збитки на мільйони доларів у самих Сполучених Штатах. У патенті США №5429818, виданому на ім'я Inzana, розкрито, що не-інкапсульовані мутанти Actinobacillus pleuropneumoniae є авірулентними і здатні забезпечити чудовий захист проти подальшої дії вірулентних бактерій. Не-інкапсульовані мутанти, описані у патенті Inzana, були одержані шляхом етилметансульфонатного мутагенезу. Однак така методика має ті недоліки, що деякі спонтанно чи хімічно індуковані мутанти можуть бути нестабільними, а характер мутації (мутацій) є невідомим. Метою даного винаходу є створення безпечної та ефективної живої атенуйованої рекомбінантної вакцини для хвороб, спричинених бактеріями та грибками, які звичайно є інкапсульованими, і у яких капсула потрібна для вірулентності, але не для імунозахисту. Іншою метою даного винаходу є генетична інженерія певних бактерій та грибків з метою вилучення капсули, щоб зробити їх авірулентними при відомій генетичній природі мутації. Ще іншою метою даного винаходу є створення безпечної та ефективної живої атенуйованої рекомбінантної вакцини проти плевропневмонії. Згідно з винаходом, було одержано рекомбінантний живий атенуйований штам Actinobacillus pleuropneumoniae, який було позбавлено капсули методами генетичної інженерії. Оскільки капсула потрібна для вірулентності, а не для імунозахисту, штам може бути використаний як вакцина проти плевропневмонії свиней. Вакцина була продукована за допомогою клонованого плазмідного вектора, який не може репродукуватись у А. pleuropneumoniae. Було секвеновано гени екскреції та синтезу капсули серотипу 5 А.pleuropneumoniae. У клонованих генах синтезу капсули було зроблено велику делецію, після чого гени, що кодують стійкість до канаміцину та чутливість до сахарози, було клоновано до вилученого сайта для використання як маркерні гени. Суїцидальний вектор введено до вірулентного штаму серотипу 5 A.pleuropneumoniae методом електропорації для забезпечення гомологічної рекомбінації шляхом подвійного кросоверу між гомологічними ділянками хромосоми та плазміди. Було одержано чотири ізоляти, кожен з яких не виявляв іридисценції, що дозволяє припустити відсутність капсули. Відсутність капсули та вилучення ділянки генів капсули було підтверджено для одного штаму методами дот-блотування та саузерн-блотування, відповідно. Було також підтверджено наявність у рекомбінантному штамі маркерних генів. Ніяких інших змін будь-яких фенотипічних властивостей виявлено не було, і маркерних генів в інших ділянках хромосоми знайдено не було. Рекомбінантний штам, який було позначено як J45-100, був дуже чутливим до сироватки, мав знижену вірулентність у свиней при введенні дози, яка у десять разів перевищувала дозу половинної смертності вихідного штаму, і повинен забезпечити захист свиней проти плевропневмонії. Цей винахід буде корисним для одержання вакцин проти будь-якого інкапсульованого організму, що продукує токсини чи інші фактори вірулентності, у якого капсула потрібна для вірулентності, а не для імунозахисту. Потрібно лише здійснити тонування генів, що кодують синтез капсули в організмі, а потім вилучити та замінити ділянку клонованого гена маркерним геном на суїцидальному векторі, а потім ввести вектор до потрібного організму та відібрати генетично модифіковані організми, які позбавлені капсули. Винахід повинен бути корисним у одержанні вакцин проти додаткових бактеріальних інфекцій, які включають Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica та Pseudomonas aeruglnosa, а також грибки, такі як Cryptococcus neoformans, який є патогеном, асоційованим з синдромом набутого імунодефіциту (СНІД) у котячих та людини. Вищевказані та інші цілі, аспекти та переваги можна краще зрозуміти із наведеного далі детального опису варіантів втілення винаходу, яким надається перевага, з посиланнями на креслення, на яких: Фігура 1 є фізичною картою клонованої ДНК pCW-11Ε із ділянки синтезу капсули А.pleuropneumoniae J45. Вказано місце знаходження та напрям транскрипції двох повних відкритих рамок зчитування (cpsA та cpsB, суцільна заливка), ідентифікованих дидезокси-методом визначення первинної структури. Вказано також положення часткової третьої потенційної відкритої рамки зчитування (cpsC). Вказано також положення та напрям транскрипції неповного гена екскреції капсули cpxD, розміщеного на цьому фрагменті ДНК. Вказано фрагмент Bglll-Stul розміром 2,1тис.пар, що використовувався як ДНК-проба. Крапкова заливка вказує на неповні рамки зчитування. Фігура 2 зображує результати саузерн-блот аналізу геномної ДНК A.pleuropneumoniae, гібридизованої до дигоксигенін-міченого 2,1тис.пар Bglll-Stul фрагменту pCW11E. Здійснювали гібридизацію ВатНІ-гідролізованої геномної ДНК штаму 4074 серотипу 1 (смужка 1), штаму 1536 серотипу 2 (смужка 2), штаму J45 серотипу 5а (смужка 3), штаму К17 серотипу 5а (смужка 4), штаму 178 серотипу 5 (смужка 5), штаму 29628 серотипу 7 (смужка 6) та штаму 13261 серотипу 9 (смужка 7) з пробою, як описано нижче. Вказано молекулярну масу гібридизуючих смуг (у тис.пар). Фігури 3а та 3b зображує нуклеотидну послідовність Hindlll-EcoRV фрагменту pCW-11Е довжиною 3,2тис.пар, який містить серотип-специфічну J45 ДНК A.pleuropneumoniae (ідентифікатор послідовності №1, SEQ ID No.1). Одержані амінокислотні послідовності двох повних відкритих рамок зчитування, виявлених у цій послідовності - cpsA (ідентифікатор послідовності №2. SEQ ID No.2) та cpsB (ідентифікатор послідовності №3, SEQ ID No.3) - та одержану N-термінальну послідовність третьої неповної відкритої рамки зчитування - cpsC (ідентифікатор послідовності №4, SEQ ID No.4) - вказано під нуклеотидною послідовністю. Гадані рибосомнозв'язуючі сайти, що передують кожній відкритій рамці зчитування, виділено жирним шрифтом, і вказано гадані -10 та -35 промоторні послідовності, які йдуть слідом за cpsA. Фігура 4 описує конструкцію суїцидального вектора, що містить вилучену ДНК синтезу капсули pCW11 ΕΔ1 KS1 та J45 A.pleuropneumoniae продукування некапсульованих мутантів шляхом алельного обміну. Плазмідний вектор pCW11ED1KS1 було сконструйовано шляхом гідролізу pCW-11Ε за допомогою Bg/ll та Stul, затуплення кінців та лігування великого фрагмента довжиною 6,4тис.пар з 3,8тис.пар ВатНІ фрагментом pKS (також затупленого), що містить картридж nptl-sacRB (KanrSucs). Сайти рестрикції у дужках вказують початкові кінці фрагментів, лігованих у pCW11ED1KS1. Вектор pCW11ED1KS1 був електротрансформований до А.ріеигорпеитопіае, і некапсульовані Kanrтрансформанти відбирались за ознакою відсутності іридисценції на середовищі, що містило 85мг/мл канаміцину. Фігура 5 зображує результати саузерн-блот аналізу геномної ДНК, ізольованої із J45 А.pleuropneumoniae (смужка 1) або J45-100 (смужка 2) за допомогою дигоксигенін-мічених проб, специфічних до nptl або ділянок локусу капсуляції А.pleuropneumoniae. J45 (смужка 1) або J45-100 (смужка 2) геномну ДНК А.pleuropneumoniae гідролізували за допомогою Xbal (стекла А та С) або ВатНІ (скло В) і гібридизували за допомогою 1,24тис.пар Pstl-фрагмента pKS (nptl-специфічний), скло А; 2,1тис.пар Bg/ll-Stul фрагмента pCW-11E (cpsABCспецифічний, дивись Фіг.1), скло В; або 2,1тис.пар С/al фрагмента pCW-1C (срхСВА-специфічний, дивись Фіг.3.2), скло С. Фігура 6 зображує імуноблот колонії J45 та J45-100 А.pleuropneumoniae після проведення реакції з антисироваткою свиней, специфічною до капсульного полісахариду. На нітроцелюлозну мембрану наносили приблизно 5x105 (смужка 1) або 5x104 (смужка 2) колонієутворюючих одиниць (CFU) на лунку. Мембрану піддавали лізису у хлороформі та інкубували з антисироваткою свиней, яка містила антитіла до капсульного полісахариду серотипу 5а і не містила інших поверхневих антигенів А.pleuropneumoniae. Фігура 7 зображує імуноблоти концентрованої надосадної рідини культур J45 (смужка 1) та J45-100 (смужка 2) А.pleuropneumoniae, яка містить переважно екзотоксини АрхІ та АрхІІ. Скло А обробляли Apxlспецифічним моноклональним антитілом, а скло В - Apxll-специфічним моноклональним антитілом. Препарат на склі А містив як негативний контроль концентровану надосадну рідину культури штаму 1536 серотипу 2 А.pleuropneumoniae (смужка 3), оскільки цей серотип не синтезує АрхІ. Блот на склі А обробляли Apxlспецифічним моноклональним антитілом. Фігура 8 зображує електрофоретичні профілі ліпополісахаридів (LPS), ізольованих із J45 А.pleuropneumoniae (смужка 1) та рекомбінантного некапсульованого мутанта J45-100 (смужка 2). Ліпополісахариди піддавали електрофорезу через 15%-ний розділюючий гель та забарвлювали аміачним розчином хлориду срібла. Фігура 9 зображує бактерицидну активність преколостральної сироватки теляти щодо J45 та J45-100 А.pleuropneumoniae. Життєздатність бактеріальних штамів у відсотках оцінювали після 60 хвилин інкубації при 37°С. Кожна точка даних є середнім значенням для трьох окремих експериментів, проведених з дублюванням. «Вуси» позначають стандартне відхилення для кожного середнього. Максимальна життєздатність у відсотках, зареєстрована для J45, становила 100%, хоч звичайно ці величини були більше, оскільки бактерії звичайно росли під час експерименту. Величини, що перевищували 100%, не реєструвались, оскільки їх не можна було точно визначити. Фігури 10а та 10b зображують нуклеотидну послідовність фрагмента Xbal-Clal pCW-1С довжиною 3,2тис.пар, який кодує гени J45 ДНК екскреції капсули А.pleuropneumoniae (Ідентифікатор послідовності №5, SEQ ID No.5). Вказано виявлені амінокислотні послідовності (Ідентифікатори послідовності №№6-8, SEQ ID Nos.6-8) протеїнів, що беруть участь у екскреції капсульного полісахариду А.pleuropneumoniae серотипу 5а. Фігура 11 є фізичною картою ДНК pCW-1C, одержаної із J45 А.pleuropneumoniae. Винахід пропонує використання живого рекомбінантно-продукованого авірулентного штаму мікроорганізму (наприклад, бактерії чи грибка), який методом генетичної інженерії був позбавлений капсули, як вакцини проти хвороб, що спричинюються цим мікроорганізмом. Винахід може бути корисним у профілактиці хвороб, у яких капсула мікроорганізму потрібна для вірулентності, але не для імунозахисту, і хвороба викликана токсинами або іншими факторами вірулентності. Як конкретний приклад винаходу було продуковано некапсульований штам Actinobacillus pleuropneumoniae, який може бути використаний як вакцина проти плевропневмонії свиней. Головною ознакою винаходу є генетична модифікація мікроорганізму, яка, у конкретному варіанті втілення на Actinobacillus pleuropneumoniae, включає делецію у її дезоксирибонуклеїновій кислоті (ДНК) ділянки, яка кодує синтез капсули. Тільки як приклад описано синтез трансформованого мутанта серотипу 5 Actinobacillus pleuropneumoniae; однак, слід розуміти, що інші серотипи можуть бути одержані за методиками, аналогічними до описаної нижче, і можуть бути придатними для використання у вакцині самі або у сполученні з одним чи кількома рекомбінантними мутантами інших серотипів. Штам, який описано нижче, разом з іншими штамами некапсульованих токсигенних бактерій або інших мікроорганізмів, одержаних згідно з описаною нижче методикою, буде чудовою вакциною, оскільки вони є авірулентними, але продукують антигени, потрібні хазяїну для створення захисної імунної реакції. Вакцини можуть бути введені різними методами, однак перевага надається внутрішньом'язовій або підшкірній ін'єкції. Перевагою цих живих вакцин є те, що токсини, які є головною причиною хвороби, та інші компоненти, що утворюються лише живими організмами або in vivo, будуть утворюватись лише у місці імунізації і організмхазяїн виробить імунну реакцію для свого захисту від ушкоджень, спричинених токсинами. Внаслідок цього хвороба (гостра або хронічна) не розвивається. Однак, організми не можуть поширюватись, оскільки без капсули вони є дуже чутливими до сироватки і негайно знищуються у кровотоку або респіраторному тракті. Крім того, імунна реакція, викликана клітинами живої вакцини, буде дужчою, і захист буде тривати довше, ніж при використанні вбитих вакцин. ПРИКЛАД Було ідентифіковано та проаналізовано ділянку ДНК, пов'язану з біосинтезом капсульного полісахариду Actinobacillus pleuropneumoniae. Пробу, специфічну до гена cpxD, який бере участь у екскреції капсульного полісахариду A.pleuropneumoniae серотипу 5а J45, було використано для ідентифікації та клонування прилягаючого фрагмента ВатНІ розміром 5,8тис.пар геномної ДНК J45. Саузерн-блот аналіз засвідчив, що частина цієї ділянки містить ДНК, яка є серотип-специфічною. Аналіз послідовності ДНК показав, що ця ділянка містить дві повні відкриті рамки зчитування - cpsA та cpsB - та неповну третю потенційну відкриту рамку зчитування - cpsC. cpsA та cpsB мають на низькому рівні спільну гомологію з глікозилтрансферазами, які беруть участь у біосинтезі ліпополісахариду Escherichia coli та капсульного полісахариду Haemophilus influenzae типу b, відповідно. Було сконструйовано вилучаемий фрагмент розміром 2,1тис.пар, який охоплював клоновані відкриті рамки зчитування cpsABC, який рекомбінували до хромосоми J45 методом алельного обміну для одержання мутанта J45-100. Цей мутант не продукував внутрішньоклітинного чи зовнішньоклітинного капсульного полісахариду, що свідчить про те, що cpsA, cpsB та/або cpsC беруть участь у біосинтезі капсульного полісахариду A.pleuropneumoniae. Токсин Арх та ліпополісахаридні профілі J45-100 були ідентичними до показників інкапсульованого батьківського штаму J45. Однак J45-100 in vitro ріс скоріше, ніж J45. J45-100 був чутливим до знищення у преколостральній сироватці теляти, a J45 - ні. J45-100 був авірулентним при використанні для введення свиням внутрішньотрахеально у дозах, які втричі перевищували дозу 50%-ної смертності штаму J45. При дозах, які у шість разів перевищували дозу 50%-ної смертності J45, J45-100 спричинював ушкодження легень від слабкого до середнього ступеню, але не смерть. Ці результати демонструють, що капсульний полісахарид є важливим детермінантом стійкості до сироватки та вірулентності А.pleuropneumoniae. Бактеріальні штами, плазміди та умови вирощування. Бактеріальні штами та плазміди, використані у цих дослідженнях, описані у Таблиці 1. Для екстракції геномної ДНК та проведення бактеріальних аналізів А.pleuropneumoniae вирощували зі струшуванням при 37°С на мозково-серцевому бульйоні (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), який містив 5мкг/мл нікотинамідаденіндинуклеотиду (НАД) (Sigma Chemical Co., St.Louis, Mo). Для електропорації штами А.pleuropneumoniae вирощували зі струшуванням при 37°С на трипсинизованому соєвому бульйоні (Difco Laboratories), який містив 0,6% екстракту дріжджів (Difco Laboratories) та 5мкг/мл НАД (TSY-N). Для проведення експериментів з провокаційними пробами на свинях штами А.pleuropneumoniae вирощували зі струшуванням при 37°С на бульйоні Columbia (Difco Laboratories), який містив 5мкг/мл НАД. Штами Escherichia coli вирощували на бульйоні Луріа-Бертані (Luria-Bertani) (Sambrook та ін., 1989) для звичайної культивації, або на бульйоні Terrific (Tartof and Hobbes, 1987) для екстракції плазмід. Антибіотики використовували у живильному середовищі для підтримування плазмід в Е.соlі у таких концентраціях: ампіцилін (Amp) - 100мкг/мл, і канаміцин (Кап) - 50мкг/мл. Для селекції рекомбінантних мутантів А.pleuropneumoniae канаміцин використовували у концентрації 85мкг/мл. Таблиця 1 Використані бактеріальні штами та плазміни А.pleuropneumoniae штами 4074 АТССа1536 АТССа J45 FenwickTa ін., 1986а К17 Nielsen, 1986a 178 m.Muiks 29628 LHoffman 13261 J.Nicolet J45-C J-45 Inzana та ін., 1993f J-45-100 E.coli штами XL-1-Blue Stratagene, La Jolla, Calif., плазміди pGEM-3z Promega pCW-1C PCW-11E pKS S.M.Boyle PCW11ED1KS1 серотип 1; (АТСС 27088) серотип 2; (АТСС 27089) серотип 5а серотип 5а серотип 5 серотип 7 серотип 9 некапсульований мутант, ізольований після етилметансульфонатного метагенезу штаму рекомбінантний некапсульований мутант із штаму J45 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 rеlА1 lac(F+proAB laclqZDM15 TN10); хазяїн для рекомбінантних плазмід Клонуючий вектор, 2,74тис.пар; Аmpr Хbal фрагмент J45 розміром 5,3тис.пар, клонований до pGEM-3Z BamHI фрагмент J45 розміром 5,8тис.пар, клонований до pGEM-3Z BamHI фрагмент розміром 3,8тис.пар, що містить картриджc nptlbsacRB, клонований до BamHI-ділянки pGEM-3Z; Ampr, Kanr pCW-11Ε з вилученим фрагментом Вg/ll-Stul та з лігованим картриджем BamHl nptl-sacRB розміром 3,8тис.пар із pKS, який описано у цій главі a Американська колекція типових культур (American Type Culture Collection, Rockville, MD) Цей маркер було спочатку одержано із гена Tn903 nptl pUC4K (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) с Цей картридж було описано раніше (Ried and Collmer, 1987) b Розрахунок часу генерації. Час генерації логарифмічної фази росту штаму А.pleuropneumoniae у TSY-N розраховували за формулою: R=1/g, де. R позначає середню швидкість бактеріального росту, a g - час генерації популяції бактерій (Pelczar та ін., 1993). Середня швидкість росту R розраховувалась за такою формулою: R=3,32(log10N – log10N0) / t, де t позначає час, що минув, N позначає кількість бактерій у момент часу =t, і N0 позначає початкову кількість бактерій у момент часу =0 (Pelczar та ін., 1993). Аналіз гібридизації ДНК. Гідролізовану за допомогою ендонуклеази рестрикції ДНК (приблизно 5мкг на лунку) піддавали електрофорезу через 0,7% агарозні гелі і переносили під дією капілярних сил на найлонові мембрани MagnaGraph (Micron Separations Inc., Westboro, Mass.), використовуючи 20Х сольовий розчин цитрату натрію (20Х SSC (сольовий розчин цитрату натрію) відповідають 3М NaCI, 300мМ цитрату натрію, рН7), як було описано раніше (Sambrook та ін., 1989; Southern, 1975). ДНК ковалентно зв'язували з найлоновими мембранами за допомогою ультрафіолетового випромінювання, використовуючи UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, Calif.). Дигоксигенін-мічені проби для гібридизації ДНК синтезували за методом випадкового праймера, використовуючи набір нерадіоактивного мічення та детектування Genius System (Boehringer Mannheim Corp., Indianopolis, Ind.) відповідно до інструкцій виробника. Гібридизацію ДНК здійснювали при 68°С у розчинах, які містили 5Х SSC. Мембрани промивали та проявляли згідно з інструкціями Genius System для колориметричного Детектування. Методи та реагенти для рекомбінантної ДНК. Геномну ДНК ізолювали із вирощених на бульйоні клітин А.pleuropneumoniae згідно з методом, описаним S.Spinola. Стисло, він полягав у тому, що бактерії ресуспендували у 10мМ Трис - 1мМ ЕДТА (рН8) та інкубували з додецилсульфатом натрію (0,66%) та РНКазою протягом 1 години при 37°С. Додавали протеїназу К до кінцевої концентрації 100мкг/мл, і суміш інкубували при 56°С протягом 1 години. Суміш екстрагували однократно буферизованим фенолом та чотири рази буферизованою сумішшю фенол-хлороформ (Amresco, Inc., Solon, Ohio), геномну ДНК осаджували етанолом та ресуспендували у 10мМ Трис-1мМ ЕДТА (рН8). Плазмідну ДНК ізолювали методом швидкого лужного лізису (Ish-Horowicz and Burke, 1981). Фрагменти рестрикції, потрібні для клонування та синтезу проб, елюювали із агарозних гелів, як описано раніше (Zhen and Swank, 1993). Рестрикційний гідроліз, електрофорез на агарозному гелі та лігування ДНК здійснювали, як було описано раніше (Sambrook та ін., 1989). Кінці фрагментів рестрикції затуплювали шляхом заповнення 5'-кінцевих надмірностей нуклеотидами (dNTPs), використовуючи фрагмент Кльонова (Klenow fragment) ДНК-полімерази Ш, як було описано раніше (Sambrook та ін., 1989). Плазмідну ДНК трансформували до штамів Е.соli методом електропорації (Dower та ін., 1988), використовуючи електропоратор ВТХ ЕСМ 600 (ВТХ, Inc., San Diego, Calif.). Ендонуклеази рестрикції та фрагмент Кльонова ДНК-полімерази І були одержані від Promega Corporation (Madison, Wis.). ДНК-лігаза Т4 була одержана від Gibco BRL (Gaithersburg, Md.). Нуклеотиди (dNTPs) для реакцій заповнення були одержані від Boehringer-Mannheim Corporation (Indianapolis, Ind.). Секвенування та аналіз ДНК. Нуклеотидні послідовності обох нитей 2,7тис.пар (kb) Xbal-EcoRV фрагменту ДНК pCW-11E визначали дидезокси-методом встановлення первинної структури з обривом ланцюга (Sanger та ін., 1977), з використанням набору для секвенування Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) з a-35[S]dATP (DuPont/NEN Research Products, Boston, Mass). Двонитеві кодуючі фрагменти ДНК секвенували з використанням звичайних олігонуклеотидних праймерів (DNAgency, Inc., Malveme, Pa.) для продовження зчитування кожної ниті. Одержані нуклеотидні послідовності комбінували з нуклеотидною послідовністю 4,6 тис.пар Xbal-Clal фрагмента ДНК pCW-1C, кодуючого структурні гени капсули (Фігура 10), і аналізували за допомогою комп'ютерної програми для проведення аналізу DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.). Пошуки подібності послідовностей по базам даних EMBUGenBank/DDBJ проводили з використанням комп'ютерної програми BLAST (Altschul та ін., 1990) у Національному центрі біотехнологічної інформації (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Md.). Стійкі ділянки сар-локусу H.influenzae типу b (capb), який бере участь у екскреції капсульного полісахариду, були використані для ідентифікації, клонування та аналізу ділянки локусу А.pleuropneumoniae серотипу 5а, який бере участь у екскреції капсульного полісахариду. Було проведено саузерн-блот аналіз геномної ДНК штаму J45 А.pleuropneumoniae серотипу 5а з використанням проб, специфічних до зціплених ділянок локусу капсуляції H.influenzae типу b (capb). Ці проби не гібридизувались з геномною ДНК А.pleuropneumoniae за дуже жорстких умов (68°С, 5хSSC), але гібридизувались за умов від середньої до низької жорсткості (55°С, 5хSSC). Фрагмент EcoRI розміром 4,4тис.пар локусу capb H.influenzae із плазміди pSKH1, який містить ділянку 1 гена bexD, що бере участь у екскреції капсульного полісахариду та дві відкриті рамки зчитування ділянки 2, що беруть участь у біосинтезі капсульного полісахариду, гібридизували з фрагментами Hindlll розміром 1,2тис.пар та ХbаІ розміром 5,3тис.пар геномної ДНК J45. Фрагмент EcoRI локусу capb H.influenzae розміром 9,0тис.пар із плазміди pSKH2, який містить ділянку 1 генів bехСВА, що беруть участь екскреції капсульного полісахариду, певну неохарактеризовану ділянку 3 ДНК, яка є спільною для кількох серотипів H.influenzae, та певні фрагменти ділянки 2 ДНК, що беруть участь у біосинтезі капсульного полісахариду, гібридизували з фрагментами 1,5тис.пар Hindlll, 5,3тис.пар Хbаl та 2,4тис.пар Хhol геномної ДНК J45. Ці дані вказують на те, що локуси капсульних генів H.influenzae типу b та А.pleuropneumoniae серотипу 5а мають спільні гомологічні ділянки. Обидві проби, специфічні до H.influenzae capb, містять ДНК ділянки 1, що бере участь у екскреції капсульного полісахариду, внаслідок чого можна припустити, що фрагмент 5.3тис.пар Хbal геномної ДНК J45, який гібридизується з обома H.influenzae capbпробами, може містити гени, які кодують протеїни, що беруть участь у екскреції капсульного полісахариду серотипу 5а А.pleuropneumoniae. Фрагмент 5,3 Хbal геномної ДНК J45, який гібридизується з двома H.influenzae capb-пробами, клонували до ділянки Хbal плазміди pGEM-3Z (в обох напрямках) із Хbalгідролізованих фрагментів геномної ДНК J45 в інтервалі від 4,8 до 6,0тис.пар, які одержували електроелюцією (після електрофоретичного розділення) із агарозного гелю. Одну з одержаних плазмід було позначено pCW1C. Здійснювали саузерн-блот аналіз для визначення того, чи будуть bexD, bехС, bехВ та hexA H.influenzae типу b гібридизуватись з прилягаючими фрагментами pCW-1C у такому самому порядку (bexDCBA), в якому ці гени знаходяться в H.influenzae. Результати дають змогу припустити, що ділянка ДНК A.pleuropneumoniae серотипу 5а, потрібна для екскреції капсульного полісахариду, була клонована вдало, і що ця ділянка організована аналогічно до бех-локусу H.influenzae типу b. Визначали нуклеотидну послідовність фрагмента рестрикції 4,6тис.пар ХbаІ-СlаІ pCW-1C, і фрагмент рестрикції 3,2тиc.пар Хbal-СІаl наведено на Фігурах 10а-b (Ідентифікатор послідовності №5, SEQ ID No.5). Зовсім поряд з ним на тій самій нитці ДНК було виявлено чотири відкриті рамки зчитування (зображені на Фігурах 10а-b та Фігурі 11), які позначено cpxDCBA (cpx використано для позначення екскреції капсульного полісахариду). Ініціюючий кодон AUG срхС (Ідентифікатор послідовності №7, SEQ ID No.7) складався з 26 нуклеотидів, розміщених після термінуючого кодону UAA cpxD (Ідентифікатор послідовності №6, SEQ ID No.6), тоді як ініціюючий кодон AUG срхВ (Ідентифікатор послідовності №8, SEQ ID No.8) перекривав термінуючий кодон UAA срхС (Ідентифікатор послідовності №7, SEQ ID No.7), а ініціюючий кодон AUG срхА перекривав частково присутній термінуючий кодон UGA срхВ (Ідентифікатор послідовності №8, SEQ ID No.8). Узагальнюючі послідовності зв'язування рибосом Шайна-Далгарно (Shine-Dalgarno) було ідентифіковано на відстані 17 основ після кожного ініціюючого AUG-кодону, а гадані промотор-вміщуючі послідовності, аналогічні до узагальнюючих послідовностей -10 (ТАТААТ) та -35 (TTGACA) Е.соli σ70, були ідентифіковані слідом за cpxD (Ідентифікатор послідовності №6, SEQ ID No.6). Паліндромна послідовність, яка може функціонувати як rho-незалежний сигнал термінації транскрипції, була ідентифікована перед срхА (не зображена). Генетична організація дає змогу припустити, що cpxDCBA транскрибуються на окрему поліцистронну мРНК. Електротрансформування A.pleuropneumoniae. A.pleuropneumoniae вирощували до фази середини логарифмічного росту у TSY-N, збирали центрифугуванням при 7000хg при 4°С і промивали чотири рази у охолодженому (4°С) стерилізованому на фільтрі буфері, який містив 272мМ манітолу, 2,43мМ К2НРО4, 0,57мМ КН2РО4, 15% гліцерину, рН 7,5. Цей буфер було модифіковано (так, щоб він замість сахарози містив манітол) порівняно з раніше описаним буфером, який використовувався для промивання клітин A.pleuropneumoniae перед електропорацією (Lalonde та ін., 1989b). Потім клітини один раз промивали у охолодженому стерилізованому на фільтрі 15%-ному гліцерині та ресуспендували до приблизно 1010 колонієутворюючих одиниць (CFU)/мл у 15%-ному гліцерині. Аліквоти цієї суспензії змішували з 1,5-2,0мкг плазмідної ДНК (у 1,5мкл дистильованої води), яку очищали ультрацентрифугуванням у градієнті густини хлориду цезію (Sambrook та ін., 1989), поміщали до охолоджуваних кювет для електропорації з 2мм зазором (ВТХ, Inc.) і піддавали електропорації за допомогою електропоратора ВТХ ЕСМ 600 (ВТХ, Inc.) при напрузі заряду 2,5кВ та регуляторі опору, встановленому у положення R7 (246Ом). Реально був генерований імпульс 2,39кВ тривалістю 10,7 мілісекунд. Після електропорації клітини відновлювали у 1мл TSY-N, що містив 5мМ МgСІ2, при слабкому струшуванні протягом 3,5 годин при 37°С. Після відновлювання клітини культивували на TSY-Naгapi, який містив 85мкг канаміцину на мл та інкубували при 37°С. Імуноблотування. Для одержання імуноблотів колоній цілі клітини A.pleuropneumoniae, які вирощували протягом ночі на планшетах з TSY-N агаром, зішкрібали до фосфатно-сольового буфера (PBS) та встановлювали концентрацію у 10 колонієутворюючих одиниць (СFU)/мл, яку визначали спектрофотометрично. Приблизно 5x104 або 5x105 колонієутворюючих одиниць (CFU) на лунку наносили на нітроцелюлозну мембрану (NitroBind; Micron Separations Inc.) за допомогою апарату Bio-Dot (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.). Мембрану поміщали на 15 хвилин у хлороформ при кімнатній температурі для лізису бактеріальних клітин на мембрані. Мембрану повністю висушували на повітрі і інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі у Трис-буферизованому сольовому розчині, рН7,5 (TBS), який містив 2% знежиреного молока для блокування неспецифічних місць зв'язування на мембрані. Мембрани інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі з розведеною 1:200 (у 2% молоко-TBS) адсорбованою антисироваткою свиней, яка містила антитіла до капсульного полісахариду серотипу 5а, але не до інших поверхневих антигенів А.pleuropneumoniae. Ця збагачена капсульним полісахаридом антисироватка була одержана шляхом адсорбції гіперімунної антисироватки свиней на A.pleuropneumoniae K17 зі спонтанним некапсульованим мутантом К17-С (Inzana and Mathison, 1987), як було описано раніше (Inzana, 1995). Мембрану промивали TBS, який містив 0,05% Твін-20, а потім інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі у розведеному 1:1000 анти-свинячому IgG кроля, кон'югованому з пероксидазою хрону (важкі та легкі ланцюги; Cappel, Durham, N.C.). Мембрану промивали у TBS, а потім проявляли 4-хлор-1-нафтолом (BioRad Laboratories) у TBS, який містив 0,02% Н2О2. Імуноблотування концентрованої надосадної рідини культур А.pleuropneumoniae проводили за описаною раніше методикою (Ma and Inzana, 1990). Стисло, вона полягала у тому, що відокремлювали приблизно 15мкг загального протеїну надосадної рідини культури методом безперервного електрофорезу у поліакриламідному гелі, який містив додецилсульфат натрію SDS-PAGE (Laemmli, 1970), через 8% розділюючий гель. Протеїни переносили на нітроцелюлозну мембрану (NitroBind; Micron Separations, inc.) за методикою Towbin та ін. (1979). Мембрану інкубували у TBS, який містив 2% бичачого сироваткового альбуміну для блокування неспецифічного зв'язування і розрізали на смужки. Смужки інкубували протягом ночі при 4°С або з моноклональним антитілом, специфічним до токсину Apxll (Ma and Inzana, 1990), або з моноклональним антитілом, специфічним до токсину Apxl (Devendish та ін., 1989; Frey та ін., 1992), і промивали у TBS. Відбиток, що реагував з Apxll-специфічним моноклональним антитілом, інкубували з анти-мишачим козиним IgG, кон'югованим до пероксидази хрону, у розведенні 1:2000 (Cappel), промивали у TBS та проявляли, як описано вище. Відбиток, що реагував з АрхІ-специфічним моноклональним антитілом, інкубували з анти-мишачим козиним IgG, кон'югованим до лужної фосфатази, у розведенні 1:2000, і проявляли, як було описано раніше (Frey та ін., 1992). Екстракція та електрофорез ліпополісахаридів (LPS). Ліпополісахариди ізолювали із А.pleuropneumoniae за методом мікроекстракції у гарячому фенолі-воді, як було описано раніше (Inzana, 1983). Очищені ліпополісахариди піддавали електрофорезу через 15%-ний розділюючий поліакриламідний гель, який містив сечовину, як було описано (Inzana та ін., 1988). Електрофоретичні профілі ліпополісахаридів візуалізували шляхом забарвлення гелю аміачним розчином хлориду срібла (Tsai and Frasch, 1982). Аналіз бактерицидності сироватки. Визначали чутливість А.pleuropneumoniae до бактерицидної активності преколостральної сироватки теляти. Відносну життєздатність бактеріальних штамів у 5, 10, 15, 20, 30, 40 та 50%-ній преколостральній сироватці теляти визначали після 60 хвилин інкубування при 37°С. Дослідження вірулентності. Свиней у віці від 7 до 9 тижнів одержували із двох місцевих стад, не вражених інфекцією А.pleuropneumoniae, і випадковим чином розподіляли на групи. Групи свиней поміщали до окремих загонів, не дозволяючи прямого фізичного контакту між групами. Приміщення для тварин Політехнічного інституту та Університету штату Віргінія функціонують та утримуються у відповідності до вимог Американської асоціації акредитації догляду за тваринами у лабораторіях. Для проведення експерименту з контрольним зараженням штами А.ріеигорпеитопіае вирощували зі струшуванням у бульйоні Columbia (Difco Laboratories) з доданням 5мкг/мл нікотинамідаденіндинуклеотиду (NAD) до середини лог-фази (109 CFU/мл). Бактерії збирали центрифугуванням при 7000хg і ресуспендували до концентрації приблизно 109 CFU/мл у фосфатносольовому буфері. Свиней заражали інтратрахеально 10мл розбавленого препарату цієї суспензії з наступним слабким заспокоєнням седативним засобом Stresnil (Pittman-Moore, Inc., Washington Crossing, N.J.). Аутопсію свиней здійснювали якомога скоріше після смерті або негайно після еутаназії пентобарбіталом натрію. Ступінь ушкодження легень оцінювалась патологом-ветеринаром у відповідності до таких критеріїв: 0 - непримітні легені (великих ушкоджень не спостерігається); 1+ -1-10% тканини легень вражено будь-якою комбінацією гіперемії, набряку, кровотечі, консолідації та/або плевриту; 2+ - вражено 11-49% тканини легень; 3+ - вражено 50-74% тканини легень; 4+ - вражено 75% або більше тканини легень. Зразки легень брали при аутопсії із правої краніально-дорсальної сторони каудальної долі і культивували на мозково-серцевому живильному середовищі, яке містило нікотинамідаденіндинуклеотид (NAD) для виявлення присутності А.pleuropneumoniae. Ідентифікація та клонування серотип-специфічної ділянки ДНК А.pleuropneumoniae. Для ідентифікації та клонування ДНК А.pleuropneumoniae J45, що бере участь у біосинтезі капсульного полісахариду, було здійснено саузерн-блот аналізи для ідентифікації суміжної ділянки ДНК (в напрямку 5'), розміщеної слідом за генним кластером cpxDCBA, що бере участь у екскреції капсульного полісахариду, який було описано вище (Фігури 10а-b та 11). Очікувалось, що ця наступна ділянка ДНК буде кодувати серотип-специфічні гени, які беруть участь біосинтезі капсульного полісахариду, оскільки, як вважалось, локус капсуляції (cap) А.pleuropneumoniae організований аналогічно до локусів капсуляції Haemophilus influenzae типу b та Neisseria meningitidis групи В. Для аналізу ВаmНl-гідролізованої геномної ДНК А.pleuropneumoniae J45 використовували мічений дигоксигеніном 1,2тис.пар BamHI-Xbal фрагмент pCW-1C, який містив частину гена cpxD. Цю cpxDспецифічну пробу гібридизували до окремого ВаmНІ-фрагмента геномної ДНК J45 розміром приблизно 5,8тис.пар (дані не зображено). Цей 5,8тис.пар BamHl-фрагмент клонували до BamHl-ділянки pGEM-3Z із BamНІ-гідролізованих фрагментів геномної ДНК J45 в інтервалі 5,0-6,5тис.пар, які одержували електроелюцією (після електрофоретичного розділення) із агарозного гелю. Одержана плазміда була позначена pCW-11E, і було складено її рестрикційну карту (Фіг.1). Частина pCW-11 Ε-вставки ДНК (фрагмент 1,2тис.пар BamHI-Xbal) перекривала ДНК, присутню на вставці pCW-1C. BamHI-гідролізована геномна ДНК від кількох різних серотипів A.pleuropneumoniae гібридизували з 2,1тис.пар Bglll-Stul фрагментом pCW-11E (Фіг.1) для визначення специфічності цієї ділянки ДНК щодо серотипу (Фіг.2). Фрагмент ДНК BglIl-Stul розміром 2,1тис.пар гібридизувались з ВаmНІ-фрагментом геномної ДНК розміром 5,8тис.пар від Трьох протестованих штамів A.pleuropneumoniae серотипу 5, але не гібридизувались з геномними ДНК від серотипів 1, 2, 7 та 9 (Фіг.2). Таким чином, ДНК A.pleuropneumoniae у pCW-11E містить ДНК, яке є специфічним до штамів серотипу 5. Оскільки ця ДНК була специфічною щодо серотипу, вона, імовірно, брала участь у біосинтезі капсульного полісахариду. Нуклеотидна послідовність та аналіз серотип-специфічної ділянки ДНК A.pleuropneumoniae. Було визначено нуклеотидну послідовність Xbal-EcoRV фрагмента ДНК pCW-11E розміром 2,7тис.пар. Цю нуклеотидну послідовність об'єднували з нуклеотидною послідовністю Clal-Xbal фрагмента pCW-1C та аналізували на присутність відкритих рамок зчитування, які не були раніше ідентифіковані. Нуклеотидна послідовність Hindlll-EcoR\/ фрагмента pCW-11E розміром 3,2тис.пар, яка містила щойно ідентифіковані відкриті рамки зчитування, наведена на Фіг.3. Дві повні відкриті рамки зчитування, позначені cpsA та cpsB (cps використано для позначення синтезу капсульного полісахариду), були ідентифіковані далі та на протилежному ланцюгу від гена cpxD, який бере участь у екскреції капсульного полісахариду A.pleuropneumoniae (Фіг.1 та Фіг.3). Ініціюючий кодон AUG cpsB був розміщений через 3 нуклеотиди після термінуючого кодону UAA cpsA. Ініціюючий кодон AUG третьої потенційної відкритої рамки зчитування -cpsC - був ідентифікований на 15 нуклеотидів далі від термінуючого кодону UAA cpsB. Узагальнюючі послідовності зв'язування рибосом ШайнаДалгарно (Shine and Dalgarno, 1974) були ідентифіковані у межах 13 основ від ініціюючих AUG-кодонів cpsA, cpsB та cpsC (Фіг.3). Гаданий промотор, який містив послідовності, аналогічні до узагальнюючих -10 (ТАТААТ) та -35 (TTGACA) послідовностей E.coli70 (Hawley and McCIure, 1983), був ідентифікований після cpsA (Фіг.3). Близькість до cpsABC та ідентифікація гаданого промотора, розміщеного далі по ланцюгу, дають змогу припустити, що ці відкриті рамки зчитування можуть бути спів-транскрибовані. Вміст G+C для ділянки ДНК, кодуючої cpsABC, становив 28%. Передбачені поліпептиди cpsA та cpsB складались з 321 (CpsA) та 526 (CpsB) амінокислот (Фігура 3). Передбачені молекулярні маси CpsA та CpsB становили 36,9 та 61,7 кілодальтонів (кДа), відповідно. Графіки гідропатії демонструють, що CpsA та CpsB є відносно гідрофільними протеїнами, що дає змогу припустити, що ці протеїни можуть бути асоційовані з цитоплазматичною ділянкою А.pleuropneumoniae (дані не зображено). Пошуки з використанням системи BLAST (Altschul та ін., 1990) в об'єднаних базах даних нуклеотидів та протеїнів, що не містять надлишкових послідовностей, Національного центра біотехнологічної інформації не виявили скільки-небудь суттєвої гомології між cpsABC на нуклеотидному або амінокислотному рівні з іншими послідовностями у базах даних (дані не зображено). Однак спостерігався низький рівень гомології (ступінь подібності 15%) між CpsA та протеїном Rfb E.coli, який є О-антигенглікозилтрансферазою, що бере участь у біосинтезі ліпополісахаридів (Cheah and Manning, 1993). Було виявлено низький рівень гомології (приблизно 14% подібності) між CpsB та ділянкою 2 відкритої рамки зчитування 3 передбачуваного протеїнового продукту локусу капсуляції H.influenzae типу b. Передбачуваний протеїн відкритої рамки зчитування 3 бере участь у біосинтезі капсульного полісахариду полірибосилрибітолу H.influenzae типу b (Van Eldere та ін., 1995). Ніякої суттєвої гомології не спостерігалось між 83 N-термінальними амінокислотами CpsC та будь-якими протеїнами у базах даних. Продукування канаміцин-стійких некапсульованих трансформантів А.pleuropneumoniae серотипу 5а. На Фіг.4 схематично зображено процедури, які було використано для продукування рекомбінантних некапсульованих мутантів А.pleuropneumoniae J45 шляхом гомологічної рекомбінації та алельного обміну. Вектор pCW11Ed1KS1 було вперше сконструйовано для використання як суїцидальний вектор, що не реплікується, для сприяння обміну ДНК капсуляції А.pleuropneumoniae дикого типу з генетично-зміненим ДНК капсуляції А.pleuropneumoniae шляхом подвійної гомологічної кросовер-рекомбінації. Вектор pCW11ED1KS1 було сконструйовано шляхом проведення спочатку гідролізу pCW-11E за допомогою Вg/ll та Stul для створення великої делеції у серотип-специфічній ДНК капсуляції А.pleuropneumoniae. Кінці цієї гідролізованої ДНК затуплювали, і великий 6,4тис.пар фрагмент лігували до 3,8тис.пар ВаmНІ-фрагмента pKS (кінці якого також затуплювали), що містив картридж nptl-sacR-sacB. Цей картридж містив ген Тn903 nptl, який, як було визначено раніше, надає А.ріеигорпеитопіае стійкість до канаміцину (Капг) (Tascon та ін., 1994), і послідовності sacRB, які надають чутливість до сахарози (Sucs) багатьом грам-негативним бактеріям (Gay та ін., 1983; Ried and Collmer, 1987). Ділянка делеції, створена у PCW11ED1KS1, охоплювала cpsABC (Фіг.1, Фіг.4) і тому, імовірно, впливала на продукування протеїнів з цих відкритих рамок зчитування. Вектор pCW11ED1KS1 не реплікується у А.pleuropneumoniae і, таким чином, функціонує як суїцидальний вектор. Після електропорації pCW11ED1KS1 до А.pleuropneumoniae J45 та інкубування одержаних сумішей при 37°С протягом 2 днів було одержано сім стійких до канаміцину трансформантів. Чотири з цих канаміцинстійких трансформантів J45 не давали іридисценції при візуалізації на планшетах з навскісним напрямом світла від джерела, що дає змогу припустити, що ці трансформанти є некапсульованими (дані не зображено). Одним із факторів впливу було середовище, яке використовували для вирощування А.pleuropneumoniae перед електропорацією з PCW11ED1KS1, оскільки некапсульовані канаміцин-стійкі трансформанти ніколи не одержували при вирощуванні А.ріеигорпеитопіае на мозково-серцевому бульйоні з доданням NAD. Генотипний аналіз канаміцин-стійких трансформантів А.pleuropneumoniae. Попередні аналізи гібридизації колоній для семи канаміцин-стійких трансформантів показали, що чотири трансформанти, які здавались некапсульованими (при візуальному спостереженні), гібридизувались з nptl-специфічною ДНК-пробою (1,24тис.пар Pstl-фрагмент pKS), але не гібридизувались з пробами, специфічними до pGEM-3Z (1,1тис.пар Вgll-фрагмент pGEM-3Z) або з серотип-специфічним 2,1тис.пар Bg/ll-Stul фрагментом pCW-11E (дані не зображені). Ці результати вказують на те, що подвійна рекомбінація відбулась в кожному з цих чотирьох канаміцин-стійких трансформантів. Навпаки, колонії інших трьох канаміцин-стійких трансформантів гібридизувались з пробами, специфічними до гена nptl pGEM-3Z та до 2,1тис.пар Bg/ll-Stul фрагмента pCW-11 Ε, що дає змогу припустити, що відбувся один кросовер, і суїцидальний вектор pCW11ED1KS1 було цілком інтегровано до хромосоми цих трансформантів (дані не зображені). Результати саузерн-блот аналізів геномної ДНК, виділеної з чотирьох канаміцин-стійких, потенційно некапсульованих трансформантів (з використанням проб, як було описано вище), були ідентичними, що вказує на те, що одна й та сама подвійна рекомбінація відбулась у кожному з цих трансформантів. Один з цих трансформантів було обрано випадковим чином для подальших досліджень і позначено J45-100. Було здійснено саузерн-блот аналізи геномної ДНК, ізольованої із J45 та J45-100 за допомогою ДНК-проб, специфічних до гена nptl, 2,1тис.пар Bglll-Stul фрагмента pCW-11E та 2,1тис.пар Сlal-фрагмента pCW-1C (Фіг.5). nptl-специфічна ДНК-проба гібридизувалась з 5,0тис.пар фрагментом Хbаl-гідролізованої ДНК J45-100, але не гібридизувалась з ДНК J45, що засвідчує наявність маркера nptl в хромосомі J45-100 (Фіг.5А). Гібридизація nptl-проби з 5,0тис.пар Хbal-фрагментом геномної ДНК J45-100 узгоджується з розміром цього Хbal-фрагмента у суїцидальному векторі pCW11ED1KS1, який було використано для одержання J45-100. 2,1тис.пар Bglll-Stul фрагмент pCW-11E гібридизувався з 5,8тис.пар фрагментом ВаmНІ-гідролізованої ДНК J45, але не гібридизувався з ДНК J45-100, що засвідчує делецію цього фрагмента у J45-100 (Фіг.5В). Проба, специфічна до генів срхСВА (2,1тис.пар СІаІ фрагмент pCW-1C), які беруть участь у екскреції капсульного полісахариду, гібридизувався з 5,3тис.пар Хbal-фрагментом як J45, так і J45-100 (Фіг.5С). Цей результат засвідчує, що ця ділянка локусу капсуляції А.pleuropneumoniae залишається незачепленою подвійною рекомбінацією, яка відбувається на суміжній ділянці ДНК. Проба, специфічна до pGEM-3Z, не гібридизується з геномною ДНК як J45, так і J45-100, що засвідчує відсутність векторної ДНК у геномі J45-100. Загалом, ці результати гібридизації ДНК вказують на те, що у J45-100 відбулась бажана подвійна рекомбінація та алельний обмін. Фенотипічний аналіз канаміцин-стійкого трансформанта A.pleuropneumoniae J45-100. Оцінювали рівень продукування капсульного полісахариду у J45-100 шляхом імуноблотування колоній та аглютинації з латексом. Антисироватка, яка містила антитіла, специфічні до капсульного полісахариду A.pleuropneumoniae серотипу 5а, але не містила інших поверхневих компонентів бактерій, вступала до реакції з J45, але не реагувала з J45-100 (Фіг.6). Оскільки бактеріальні колонії на мембрані було піддано лізису у хлороформі, ці результати вказують на те, що J45-100 не продукує внутрішньоклітинного або зовнішньоклітинного капсульного полісахариду. Цілі або озвучені J45-100 не аглютинують з латексними кульками, ковалентно кон'югованими з очищеним антитілом до капсульного полісахариду A.pleuropneumoniae серотипу 5а (Inzana, 1995), тоді як цілі клітини J45 та озвучені клітини J45-C сильно аглютинують з реагентом, нанесеним на латексні кульки (дані не зображено). Ці результати засвідчують, що делеція, зроблена у cap локусі A.pleuropneumoniae J45-100, призвела до втрати здатності біосинтезу капсульного полісахариду. Крім того, ці результати вказують на те, що некапсульований мутант J45, ізольований після етилметансульфонатного мутагенезу (Inzana та ін., 1993а), а саме J45-C. продукував внутрішньоклітинний, але не зовнішньоклітинний капсульний полісахарид. Було проведено порівняння експресії токсину Арх та електрофоретичних профілів ліпополісахаридів J45 та J45-100 для визначення того, чи вплинула мутація, здійснена у cap локусі J45-100, на ці важливі детермінанти вірулентності. Не було виявлено ніякої різниці у секреції протеїнів токсинів АрхІ та АрхІІ вагою 105кДа до надосадної рідини культур між J45 та J45-100 (Фіг.7). Крім того, не було виявлено ніякої різниці між електрофоретичними профілями ліпополісахаридів J45 та J45-100 (Фіг.8). Було досліджено ріст J45 та J45-100 у TSY-N та чутливість J45 та J45-100 до бактерицидної дії преколостральної сироватки теляти для визначення впливу втрати капсуляції на ці фенотипічні властивості. Криві росту J45 та J45-100 у TSY-N були аналогічними, але не ідентичними (дані не зображено). Однак, визначення титру життєздатності на планшетах продемонструвало, що під час логарифмічної фази росту J45100ріс скоріше (час генерації = біля 23 хвилин), ніж батьківський капсульований штам J45 (час генерації = біля 28 хвилин) (дані не зображено). Рекомбінантний некапсульований мутант J45-100 був ефективно знищений при витримуванні протягом 60 хвилин у 10-50% преколостральній сироватці теляти як джерелі живлення, тоді як капсульований батьківський штам J45 не був знищений (Фіг.9). Дослідили чутливість J45-100 до сахарози для визначення того, чи можуть послідовності sacRB функціонувати як контрселективний маркер у А.pleuropneumoniae і внаслідок цього викликати ексцизію картриджу nptl-sacRB із хромосоми J45-100. Вирощені на бульйоні J45-100 росли дуже бурхливо при прямому висіванні або при розведенні з послідуючим висіванням на TSY-N або середовище Луріа-Бертано (LuriaBertani) (до якого було додано 5 llg/мл NAD), що містило від 5 до 8% сахарози. Присутність послідовностей sacRB у хромосомі J45-100 була підтверджена саузерн-блотуванням. Ці результати дають змогуприпустити, що або sac/RS-маркер не експресувався у А.pleuropneumoniae, або, можливо, леван, який утворюється sacRSлевансахарозою у присутності сахарози, був нетоксичним для J45-100. Інтратрахеальне контрольне зараження свиней рекомбінантним некапсульованим мутантом А.ріеигорпеитопіае J45-100. Рекомбінантний некапсульований мутант J45-100 не спричинював ніякої смертності у свиней при введенні у дозах, які в 3 та в 6 разів (1,45´107 колонієутворюючих одиниць та 2,95´107 колонієутворюючих одиниць, відповідно) перевищували дозу половинної смертності (LD50) капсульованого батьківського штаму J45 (5´106 колонієутворюючих одиниць) (Inzana та ін., 1993а) (Таблиця 2). Навпаки, у всіх трьох свиней, яких було заражено дозами, що у 6,5 разів перевищували LD50 J45, розвились тяжкі ушкодження легень, які призвели до їх загибелі (Таблиця 2). Таблиця 2 Вірулентність A.pleuropneumoniae J45 ТА J45-100 для свиней Штам, використаний для контрольного зараження J45 J45-100 J45-100 J45-100 J45-100 J45-Cf Доза контрольного зараження Середня оцінка ушкодження легень 1,6-3,3´107 CFUb 1,5´107 CFU 3,0´107CFU 8,4´107 CFU 1,8´108 CFU 1,7´108 CFU 4+ 0 1+ 1+ 2+ 1+ Кількість позитивних/загальна кількість тестованих Смертність Виділенняa c 3/4 4/4 0/5 0/5 0/5 2/5d е 1/4 4/4d 0/4 4/4d 0/2 2/2d а Виділення штаму, використаного для контрольного зараження, із зразка легень, взятого при аутопсії. Аутопсію свиней, заражених J45-100, проводили через 4 дні після зараження. b Ця доза у 6,6 разів перевищує дозу 50%-ної смертності (5x106 CFU), описану у попередніх дослідженнях (Inzana та ін., 1993а). с Всі свині у цій групі померли на протязі 36 годин після контрольного зараження. d A.pleuropneumoniae виділяли з легень, а некапсульований характер встановлювали за відсутністю іридисценції та нездатності аглютинувати серотип 5-специфічні сенситизовані латексні частинки. е Аутопсія однієї з померлих свиней вказувала на те, що смерть була спричинена неналежним введенням контрольної дози. f J45-C є хімічно індукованим некапсульованим мутантом, який було описано раніше. П'ять свиней, який було піддано контрольному зараженню низькою дозою J45-100 (1,45´107 колонієутворюючих одиниць (CFU)), не виявляли ніяких клінічних симптомів, характерних для плевропневмонії свиней, і у них не утворювалось ніяких ушкоджень легень. Крім того, із зразків легень, взятих при аутопсії через чотири дні після контрольного зараження, не було виділено культур А.pleuropneumoniae. Дві з п'яти свиней, заражених більш високою дозою J45-100 (2,95´107 CFU), були клінічно нормальними, і при аутопсії ушкоджень легень у них виявлено не було. У однієї свині з цієї групи, зараженої більш високою дозою J45-100, спостерігалась помірна задишка, а при аутопсії було виявлено певні ознаки гіперемії легень та легку кровотечу (оцінка ушкодження легень = 1+). У двох свиней з цієї групи, що залишились, спостерігалась слабка задишка, а при аутопсії було виявлено певні ознаки плевриту та консолідації (оцінка ушкодження легень =2+). Культури А.pleuropneumoniae J45-100 було виділено лише з цих двох свиней з найбільш тяжкими ушкодженнями легень. Бактерії, виділені з цих двох свиней, не аглютинують латексні кульки з реагентом аглютинації серотипу 5а. Таким чином, виділені бактерії залишались некапсульованими, що вказує на те, що J45-100 не перетворюються на капсульований фенотип in vivo. Хоч гени nptl (надає стійкості до канаміцину) та SacB/SacR (надає чутливості до сахарози) були клоновані до ділянки делеції, вони були призначені для використання лише як маркерні гени. Можуть бути також використані альтернативні варіанти маркерних генів. З причин, пов'язаних з охороною здоров'я та безпекою, може бути бажаним уникнення використання антибіотик-стійких маркерів, таких як nptl, або створення механізму вилучення або інактивації антибіотичного маркера. Придатні не-антибіотичні маркери можуть включати стійкість до ртуті. Некапсульований штам Actinobacillus pleuropneomoniae серотипу 5, одержаний згідно з описаною вище процедурою, продукує лише два з трьох токсинів, які виробляються Actinobacillus pleuropneomoniae. Крім того, що модифіковані Actinobacillus pleuropneomoniae мають захисну та імуногенну дію, вони можуть бути також корисними для клонування до ділянки делеції гена третього RTX токсину. Це можна зробити шляхом клонування гена токсину RTX до касети гена канаміцину штаму J45-100, тим самим інактивуючи ген канаміцину. Вакцина повинна бажано бути виготовлена у формі, аналогічної до інших вакцин, добре відомих фахівцям. Бажано, щоб вакцина була закупорена у вигляді ліофілізованої мікстури, і вона може включати один чи кілька серотипів мутантних штамів. Для збереження життєздатності може бути додана речовина, така як бульйон Columbia, трегапоза, або альбумін, гліцерин чи деякі інші агенти. Треба буде лише регідратувати вміст ліофілізованої мікстури стерильною водою або сольовим розчином та зробити ін’єкцію (внутрішньом'язову, внутрішньовенну, інтраперитонеальну, підшкірну і т.ін.). Композиція вакцини може бути також сформульована і для інших шляхів введення (наприклад, перорального, трансдермального, сублінгвального і т.ін.), з використанням відповідних матриць носіїв (наприклад, крохмаль, полісахариди, масла, ліпосоми, смоли і т.ін.). Доза вакцини, яка вводиться тварині» буде залежати від таких факторів, як вік або стать тварини, а також спосіб введення. У всіх випадках, треба забезпечити введення достатньої кількості живої авірулентної некапсульованої Actinobacillus pleuropneomoniae для викликання у вакцинованої тварини імуногенної реакції. Вдалі результати було одержано при 2 імунізаціях по 10 колоніеутворюючих одиниць, проведених через інтервал часу від 2 до 3 тижнів. Хоч даний винахід було описано на, прикладі варіантів втілення, яким надається перевага, фахівцям у цій галузі зрозуміло, що винахід може бути використаний з певними модифікаціями у межах духу та обсягу формули, що додається.