Спосіб одержання рибонуклеотидів

Спосіб одержання рибонуклеотидів шляхом гідролізу розчину дріжджової рибонуклеїнової кис 3 66706 4 та стерилізації, згідно з винаходом, гідроліз прово110-112°С протягом 8-10хв. дять протягом 8-10год, осадження етиловим спирВ табл.1-4 наведені дані, які обґрунтовують том виконують при температурі 8-12°С, висушудостатність обраних параметрів для досягнення вання осаду здійснюють ліофілізацією, а забезпеченого винаходом технічного результату. стерилізацію продукту виконують при температурі Таблиця 1 Залежність виходу цільового продукту і ступеню чистоти від часу провадження гідролізу Показники Вихід цільового продукту, % Співвідношення поглинання (ступінь чистоти) при 260 / 230 260 / 280 5 48 6 50 3,15 1,6 3,1 1,64 З даних, наведених у табл.1, видно, що оптимальним є час проведення гідролізу 8-10год. Використання часу менше зазначеного призводить до зменшення виходу цільового продукту (рибону Час провадження гідролізу, год 8 9 10 58 60 62 3,8 1,7 3,7 1,72 3,7 1,75 12 66 13 65,3 3,0 1,4 3,1 1,35 клеотидів). Використання часу вище зазначеного призводить до зниження ступеню чистоти продукту. Таблиця 2 Залежність виходу цільового продукту і характеристик якості від температури осадження (1 осадження) Показники Вихід цільового продукту, % Вміст рибонуклеотидів в цільовому продукті, % Кольоровість 3,5% розчину гідролізату при 400нм Температура осадження, °С 8 10 12 58 60 62 4 36 6 44 87 88 85 84 0,230 0,240 0,250 0,260 З даних, наведених у табл.2, видно, що оптимальною є температура осадження 8-12°С. Використання температури нижче зазначеної призводить до зменшення виходу цільового продукту (рибонуклеотидів) через випадання при низькій температурі більшої кількості рибонуклеотидів в осад. Використання температури вище зазначеної 14 66 16 68 86 78 74 0,275 0,300 0,318 призводить до зниження вмісту рибонуклеотидів в продукті через зменшення випадіння в осад домішок ненуклеотидного походження. Крім того, збільшення температури осадження призводить до підвищення кольоровості розчину гідролізату, що свідчить про нестабільність його рибонуклеотидного складу. Таблиця 3 Залежність характеристик якості готового препарату від температури стерилізації Показники 105 Кольоровість 3,5% розчину гото0,287 вого препарату при 400нм Пірогенність, °С 1,4 Стерильність Нестер. 108 Температура стерилізації, °С 110 111 112 114 119 0,296 0,300 0,315 0,340 0,370 0,400 1,5 Нестер. 0,3 Стер. 0,4 Стер. 0,5 Стер. 0,5 Стер. 0,4 Стер. З даних, наведених у табл.3, видно, що оптимальною є температура стерилізації 110-112°С. Використання температури нижче зазначеної призводить до пірогенності продукту через нестерильність препарату. Використання температури вище зазначеної призводить до руйнування рибонуклеотидів та підвищення кольоровості розчину готового препарату, що свідчить про нестабільність його рибонуклеотидного складу. 5 66706 6 Таблиця 4 Залежність характеристик якості готового препарату від часу стерилізації при оптимальній температурі Показники 4 Кольоровість 3,5% розчину гото0,285 вого препарату при 400нм Пірогенність, °С 1,6 Стерильність Нестер. Час стерилізації, хв 9 10 6 8 0,294 0,300 0,320 1,4 Нестер. 0,2 Стер. 0,3 Стер. З даних, наведених у табл.4, видно, що оптимальним є час стерилізації 8-10хв. Використання часу менше зазначеного призводить до пірогенності продукту через нестерильність препарату. Використання часу більш зазначеного призводить до 12 14 0,345 0,360 0,395 0,5 Стер. 0,5 Стер. 0,4 Стер. підвищення кольоровості розчину готового препарату. Переваги способу, що заявляється, перед способом за прототипом наведені в табл.5. Таблиця 5 Характеристики препарату в залежності від способу одержання Показники Вихід цільового продукту, % Вміст рибонуклеотидів в цільовомупродукті, % Пірогенність, °С Кольоровість 3,5% розчину готового препарату при 400нм Кольоровість 3,5% розчину гідролізату при 400нм Співвідношення поглинання (ступінь чистоти) при 260 / 230 260 / 280 Як видно з табл.5, спосіб, що заявляється, має суттєві переваги перед способом за прототипом: 1. Значно вище вихід цільового продукту. 2. Оптимізація процесів проведення гідролізу та осадження етиловим спиртом дозволили збільшити ступінь чистоти продукту (співвідношення поглинання), що підтверджується також більшим вмістом рибонуклеотидів в продукті. Крім того, це дозволило стабілізувати рибонуклеотидний склад розчину гідролізату, що підтверджується його низькою кольоровістю. 3. Визначений режим стерилізації та заміна вакуум-сушильної обробки ліофілізацією дозволили значно стабілізувати рибонуклеотидний склад готового препарату, що підтверджується низькою кольоровістю розчину готового препарату. 4. Визначені параметри дозволили значно зменшити пірогенність готового препарату. Можливість здійснення винаходу ілюструється наступними прикладами: Приклад 1. 7кг дріжджової рибонуклеїнової кислоти розчиняють в 50л води для ін'єкцій. Доводять рН розчину 2н натрієм гідроксиду до 5,4. Додають 20г панкреатичної рибонуклеази і проводять гідроліз при температурі 62-65°С протягом 8год. Потім гідролізат охолоджують до температури 8°С і додають 15л етилового спирту (1 осадження), охолодженого до температури 8°С. Суміш витримують при зазначеній температурі протягом 2-4год, осад відділяють фільтрацією. Отриманий прозорий роз Спосіб, що заявля ється 58-62 84-86 0,2-0,5 0,300-0,345 0,250-0,275 3,7-3,8 1,7-1,75 Спосіб за прототипом 48-51 70-74 0,7-1,2 0,430-0,470 0,360-0,410 3,15 1,6 чин піддають ультрафільтрації крізь пористі волокна з порогом відсічення 1500 дальтон. Фільтрат охолоджують до температури 0-4°С і додають 810-кратний об'єм охолодженого до температури 04°С етилового спирту (2 осадження). Суміш витримують протягом 12-14год при зазначеній температурі. Осад відділяють фільтрацією, промивають охолодженим до температури 0-4°С етиловим спиртом та розчиняють у воді для ін'єкцій (1кг осаду на 3л води). Одержаний розчин піддають ліофілізації. Одержаний цільовий продукт являє собою субстанцію суміші рибонуклеотидів білого або біло-жовтого кольору. Вихід цільового продукту (субстанції) складає 58%. Кольоровість 3,5% розчину гідролізату при 400нм - 0,250. Співвідношення поглинання (ступінь чистоти) при 260 / 230 -3,7; 260 / 280 -1,7. Вміст рибонуклеотидів в цільовому продукті (субстанції) складає 84%. З отриманої субстанції виробляють готову лікарську форму. Для цього 4 кг субстанції суміші рибонуклеотидів розчиняють у 96л 0,55-0,65% розчину натрію хлориду в воді для ін'єкцій. Одержаний розчин світло-жовтого кольору піддають фільтрації крізь фільтри з розміром пор 0,45мкм та 0,22мкм. Розчин розливають в стерильних умовах в ампули по 3,0мл та піддають обробці в автоклаві при температурі 110°С протягом 8 хв. Одержаний препарат містить від 3,3 до 3,5% рибонуклеотидів, 7 66706 8 пірогенність - 0,2°С. Кольоровість 3,5% розчину при температурі 62-65°С протягом 10год. Потім готового препарату при 400нм-0,300. гідролізат охолоджують до температури 12°С і Приклад 2. додають 15л етилового спирту (1 осадження), 7кг дріжджової рибонуклеїнової кислоти розохолодженого до температури 12°С. Суміш витричиняють в 50л води для ін'єкцій. Доводять рН розмують при зазначеній температурі протягом 2чину 2н натрієм гідроксиду до 5,4. Додають 20г 4год, осад відділяють фільтрацією. Отриманий панкреатичної рибонуклеази і проводять гідроліз прозорий розчин піддають ультрафільтрації крізь при температурі 62-65С протягом 9год. Потім гідпористі волокна з порогом відсічення 1500 дальролізат охолоджують до температури 10°С і додатон. Фільтрат охолоджують до температури 0-4°С і ють 15л етилового спирту (1 осадження), охолододають 8-10-кратний об'єм охолодженого до темдженого до температури 10°С. Суміш витримують ператури 0-4 °С етилового спирту (2 осадження). при зазначеній температурі протягом 2-4год, осад Суміш витримують протягом 12-14год при зазнавідділяють фільтрацією. Отриманий прозорий розченій температурі. Осад відділяють фільтрацією, чин піддають ультрафільтрації крізь пористі волопромивають охолодженим до температури 0-4°С кна з порогом відсічення 1500 дальтон. Фільтрат етиловим спиртом та розчиняють у воді для ін'єкохолоджують до температури 0-4°С і додають 8цій (1кг осаду на 3л води). Одержаний розчин під10-кратний об'єм охолодженого до температури 0дають ліофілізації. Одержаний цільовий продукт 4°С етилового спирту (2 осадження). Суміш виявляє собою субстанцію суміші рибонуклеотидів тримують протягом 12-14год при зазначеній тембілого або біло-жовтого кольору. Вихід цільового пературі. Осад відділяють фільтрацією, промивапродукту (субстанції) складає 62%. Кольоровість ють охолодженим до температури 0-4°С етиловим 3,5% розчину гідролізату при 400нм-0,275. Співспиртом та розчиняють у воді для ін'єкцій (1кг осавідношення поглинання (ступінь чистоти) при ду на 3л води). Одержаний розчин піддають ліофі260 / 230 -3,8; лізації. Одержаний цільовий продукт являє собою 260 / 280 -1,75 субстанцію суміші рибонуклеотидів білого або біВміст рибонуклеотидів в цільовому продукті ло-жовтого кольору. Вихід цільового продукту (су(субстанції) складає 86%. бстанції) складає 60%. Кольоровість 3,5% розчину З отриманої субстанції виробляють готову лігідролізату при 400нм-0,260. Співвідношення погкарську форму. Для цього 4кг субстанції суміші линання (ступінь чистоти) при рибонуклеотидів розчиняють у 96л0,55-0,65% 260 / 230 -3,8; розчину натрію хлориду в воді для ін'єкцій. Одер260 / 280 -1,75. жаний розчин світло-жовтого кольору піддають Вміст рибонуклеотидів в цільовому продукті фільтрації крізь фільтри з розміром пор 0,45мкм та (субстанції) складає 85%. 0,22мкм. Розчин розливають в стерильних умовах З отриманої субстанції виробляють готову лів ампули по 3,0мл та піддають обробці в автоклаві карську форму. Для цього 4кг субстанції суміші при температурі 112°С протягом 10хв. Одержаний рибонуклеотидів розчиняють у 96л 0,55-0,65% препарат містить від 3,3 до 3,5% рибонуклеотидів, розчину натрію хлориду в воді для ін'єкцій. Одерпірогенність - 0,5°С. Кольоровість 3,5% розчину жаний розчин світло-жовтого кольору піддають готового препарату при 400нм-0,345. фільтрації крізь фільтри з розміром пор 0,45мкм та З огляду на викладене вище і з урахуванням розк0,22мкм. Розчин розливають в стерильних умовах ритого причинно-наслідкового зв'язку між сукупнісв ампули по 3,0мл та піддають обробці в автоклаві тю ознак винаходу, що заявляється, та технічним при температурі 111°С протягом 9хв. Одержаний результатом, що отриманий за їх допомогою, мопрепарат містить від 3,3 до 3,5% рибонуклеотидів, жна стверджувати, що задача, поставлена в оснопірогенність - 0,4°С. Кольоровість 3,5% розчину ву створеного способу одержання рибонуклеотиготового препарату при 400нм-0,320. дів, цілком виконана, бо такий спосіб дозволяє Приклад 3 збільшити вихід цільового продукту (рибонуклео7 кг дріжджової рибонуклеїнової кислоти розтидів), підвищити вміст рибонуклеотидів в цільочиняють в 50л води для ін'єкцій. Доводять рН розвому продукті і його ступінь чистоти, стабілізувати чину 2н натрієм гідроксиду до 5,4. Додають 20г риботуклеотидний склад продукту та значно змепанкреатичної рибонуклеази і проводять гідроліз ншити пірогенність готового препарату. Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601