Спосіб лікування лімфоми в-клітин, імунологічно активне химерне антитіло анти-сd20

1. Способ лечения лимфомы В-клеток, включающий введение человеку терапевтически эффективного количества иммунологически активного антитела анти-СД20, отличающийся тем, что в качестве указанного антитела используют химерное антитело анти-СД20, вырабатываемое трансфектомой, включающей анти-СД20 в векторе ТСАЕ8, имеющем депозитный номер 69119 АТСС. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно вводят мышиное моноклональное анти C2 (54) СПОСІБ ЛІКУВАННЯ ЛІМФОМИ В-КЛІТИН, ІМУНОЛОГІЧНО АКТИВНЕ ХИМЕРНЕ АНТИТІЛО АНТИ-СD20 27946 В-клетки. Т-клетки отвечают за промежуточный иммунитет клетки, в то время как В-клетки отвечают за продукцию антител (гуморальный иммунитет). Однако Т-клетки и В-клетки можно рассматривать как взаимосвязанные в типичном иммунном ответе, Т-клетки активизируются, когда рецептор Т-клетки связан с фрагментами антигена, которые связаны с главным комплексом гистосовместимости ("МНС") из гликопротеинов на поверхности клетки, представляющей антиген, причем такая активация вызывает высвобождение биологических медиаторов ("интерлейкинов"), который, в сущности, стимулируют дифференциацию и продукцию В-клетками антител ("иммуноглобулинов") против антигена. Каждая В-клетка внутри хозяина экспрессирует различное антитело на своей поверхности. Таким образом одна В-клетка экспрессирует специфическое для одного антигена антитело, в то время как другая В-клетка экспрессирует антитело, специфическое для другого антигена. Таким образом, В-клетки являются совершенно разными, и это многообразие имеет важное значение для иммунной системы. У человека каждая В-клетка может производить огромное количество молекул антител (то есть приблизительно от 107 до 108). Как правило, такая продукция антител обычно прекращается (или значительно снижается) после нейтрализации чужеродного антигена. Иногда, однако, пролиферация определенных В-клеток продолжается непрерывно; причем такая пролиферация может вызвать рак, называемый "лимфомой В-клеток". Как Т-клетки, так и В-клетки содержат поверхностные протеины, который используют как "маркеры" для дифференциации и идентификации. Одним из таких маркеров В-клеток человека является антиген Вр35 человека с ограниченной дифференциацией В-лимфоцитов, обозначаемый как "СD20". СD20 экcпрессируется во время раннего развития пре-В-клеток и сохраняется до дифференциации клеток плазмы. В частности, молекула СD20 может регулировать этап в процессе активации, который необходим для инициации и дифференциации клеточного цикла и обычно экспрессируется на сверхвысоких уровнях неопластических ("опухолевых") В-клеток. СD20, при определении, присутствует как на "здоровых" В-клетках, так и на "злокачественных" В-клетках, то есть на тех В-клетках, непрерывная пролиферация которых может привести к лимфоме В-клеток. Таким образом, у поверхностного антигена СD20 имеется возможность быть "пораженным" лимфомой Вклеток. В сущности, такое поражение выглядит следующим образом: пациенту, к примеру, вводят антитела, специфические к поверхностному антигену СD20 В-клеток. Эти анти-СD20 антитела специфически связываются с поверхностным антигеном СD20 клетки, очевидно, как с нормальными, так и со злокачественными В-клетками. Анти-СD20 антитело, связанное с поверхностным антигеном СD20, может вызвать разрушение и истощение неопластических В-клеток. Кроме того, химические вещества или радиоактивные метки, имеющие возможность разрушать опухоль, могут быть конъюгированы с анти-СD20 антителом так, что вещество специально "доставляется", например, в неопластические В-клетки. Независимо от способа, основная цель состоит в разрушении опухоли. Специфический способ детерминируется определенным используемым анти-СD20 антителом и, таким образом, позволяет значительно варьировать способы поражения антигена СD20. Например, известны попытки поражения поверхностного антигена СD20. По сообщениям, мышиное моноклональное антитело 1F5 (антиСD20 антитело) вводили пациентам с лимфомой В-клеток путем непрерывной внутривенной инфузии. Согласно сообщениям, для истощения циркулирующих опухолевых клеток требовались чрезвычайно высокие уровни (>2 граммов) 1F5, а результаты описывали как "неустойчивые". Ргеss еt. аl., "Моnосlоnаl Аntibody 1F5 (Аnti-СD20) Serotherapy of Human B-cell Lymphomas." Blood 69/2:584591 (1987). Возможной проблемой при настоящем подходе является то, что моноклональные антитела кроме человеческих (например, мышиные моноклональные антитела) обычно не обладают функциональностью эффекторов человека, то есть они не способны при этом дополнять зависимый от комплемента лизис или лизировать клеткимишени человека посредством неточной токсичности, зависящей от антител, или дополненным Fс-рецепторами фагоцитозом. Кроме того, моноклональные антитела кроме человеческих могут быть распознаны человеком-хозяином как чужеродные белки. Следовательно, повторные инъекции таких чужеродных антител могут привести к индукции иммунного ответа, вызывая опасные реакции гиперчувствительности. Для моноклональных антител на основе мышиных часто ссылаются на наличие ответа анти-мышиных антител человека, или ответ "НАМА". Кроме того, эти "чужеродные" антитела могут быть подвергнуты воздействию иммунной системы хозяина так, что они в действительности нейтрализуются прежде, чем достигнут своей мишени. Лимфоциты и клетки лимфомы наследственно чувствительны к радиотерапии по нескольким причинам: локальная эмиссия ионизирующей радиации меченных радиоактивными изотопами антител может уничтожать клетки, имеющие или не имеющие целевой антиген (например, СD20) в непосредственной близости с антителами, связанными с антигеном; проникающее излучение может устранять проблему ограниченного доступа к антителу в обширной или слабо васкуляризированных опухолях; общее количество необходимого антитела может быть снижено. Радионуклид испускает радиоактивные частицы, которые могут повреждать клеточную ДНК до стадии, при которой клеточные механизмы репарации неспособны обеспечить жизнедеятельность клетки; следовательно, если целевые клетки являются опухолевыми, то радиоактивная метка преимущественно уничтожает опухолевые ячейки. Использование меченных радиоактивными изотопами антител, по определению, включают применение радиоактивного вещества, которое требует соблюдения предосторожностей как для пациента (например, при возможной трансплантации костного мозга), так и для обслуживающего персонала (то есть необхо 2 27946 димость обеспечить высокую степень безопасности при работе с радиоактивными веществами). Следовательно, для улучшения способности мышиных моноклональных антител осуществлять эффективное лечение нарушений В-клеток требуется конъюгировать радиоактивную метку или токсин с антителом так, чтобы метка или токсин локализировались в месте расположения опухоли. Например, вышеупомянутое антитело 1F5 "помечали йодом -131 ("131 I") и оценивали по биораспределению у двух пациентов. См. Еаrу, J.F. et al., "Imaging and Treatment Of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268 (1990); см. также Ргеss O.W. et al., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin`s Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD-37) Antibody" J; Clin. Onc. 7/8:1027-1038 (1989) (указано, что у одного пациента, которого лечили 1F-5, 131 маркируемым I, получен "частичный ответ"); Goldenberg, D.M. et al., "Тargeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. Clin. One. 9/4:548-564 (1991) (у трех из восьми пациентов, получавших многократные инъекции, зафиксировано развитие ответа НАМА); Appelbaum, F.R. "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem. /Onс. Clinics of N.A. 5/5:1013-1025, (1991) (обзорная статья); Press, O.W. et al., "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cells Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support" New England Journal of Medicine 329/17: 1219-12223 (1993) (анти-СD20 антитело IF5, маркированное йодом-131 и В1); Kaminski M. G. et al., "Radioimmunotherapy of B-cеlls Lymphoma with Radiolabeled [131l] Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody". NEJM 329/7 (1993) (анти-СD20 антитело В1, маркированное йодом-131; в дальнейшем "Kaminski"). Токсины (то есть химиотерапевтические агенты, например доксорубицин или митомицин С) также были сконъюгированы с антителами. См., например, публикацию международной заявки WO 92/07466 (опубл. 14 мая 1992). "Химерные" антитела, то есть антитела, которые включают участки из двух или более различных видов (например, мыши и человека) были разработаны как альтернатива "конъюгированным" антителам. Например, Liu, A.Y. et al., "Production of a Mouse - Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), описывает химерное антитело мыши/человека, направленное против антигена CD20. См. также публикацию № WO 88/04936. Однако в ссылке нет сообщения, касающегося возможности, эффективности или практичности использования таких химерных антител для лечения нарушений В-клеток. Следует отметить, что функциональные анализы in vitro (например опосредованный комплементом лизис ("CDC"), опосредованная антителами клеточная цитотоксичность ("ADCC") и т.д.) не могут предсказывать in vivo способность химерных антител разрушать или истощать целевые клетки, экспрессирующие специфический антиген. См., например, Robinson, R.D. et al., "Chimeric mousehuman anti-carcinoma antibodies that mediate different anti-tumor cell biological activities, "Hum. Antibod. Hybridomas 2:84-93 (1991) (химерное антитело мыши/человека с неопределяемой активностью, опосредованной антителами клеточной цитотоксичностью (ADCC). Следовательно, потенциальная терапевтическая эффективность химерных антител может быть верно оценена только при экспериментах in vivo. Таким образом, значительным усовершенствованием в данной области техники является разработка терапевтических способов направленного введения антигена CD20 для лечения лимфом Вклеток у приматов, включая человека, но не ограничиваясь им. Описываются терапевтические способы, разработанные для лечения нарушений В-клеток, и в частности лимфомы В-клеток. Настоящие протоколы основаны на введении иммунологически активных химерных антител анти-СD20 для истощения B-клеток периферической крови, включая Вклеток лимфомы; введение меченных радиоактивными изотопами антител анти-СD20 для направленного поражения опухолей, связанных с локализованными и периферическими В-клетками; введение химерных антител анти-СD20 и меченных радиоактивными изотопами антител антиСD20 при комбинированной терапевтической стратегии. Фиг. 1 - схематическое изображение вектора экспрессии тандемных химерных антител, используемого при получении иммунологически активных химерных антител анти-СD20 ("ТСАЕ 8"). Фиг. 2А-2Е - последовательность нуклеиновой кислоты вектора на фиг. 1. Фиг. 3А-3F - последовательность нуклеиновой кислоты вектора на фиг. 1, далее включающие вариабельные участки легких и тяжелых цепочек у мыши ("анти-СD20 в ТСАЕ 8"). Фиг. 4 - последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот (включая СDR и константные участки) вариабельного участка легкой цепочки у мыши, полученные из мышиного моноклонального антитела 2В8 анти-СD20. Фиг. 5 - последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот (включая СDR и константные участки) вариабельного участка тяжелой цепочки у мыши, полученные из мышиного моноклонального антитела 2В8 анти-СD20. Фиг. 6 - результаты проточной цитометрии, подтверждающие связывание флуоресцентно маркированного С1q человека с химерным антителом анти-СD20, которое включает в качестве контрольного меченный С1q, меченного С1q с мышиным моноклональным антителом 2В8 антиСD20 и меченного С1q с человеческим IgGl, k. Фиг. 7 представляет результаты опосредованного комплементом лизиса, сравнивающие химерное антитело анти-СD20 и мышиное моноклональное антитело 2В8 анти-СD20. Фиг.8 представляет результаты клеточной цитотоксичности, опосредованной антителами с эффекторными клетками человека in vivo, сравнивающие химерное антитело анти-СD20 и 2В8. На фиг. 9А, 9В и 9С представлены результаты лимфопении В-клеток периферической крови приматов кроме человека после инфузии 0,4 мг/кг (А); 1,6 мг/кг (В); и 6,4 мг/кг (С) иммунологически активного химерного антитела анти-СD20. 3 27946 На фиг. 10 представлены результаты лимфопении В-клеток периферической крови приматов кроме человека после инфузии 0,01 мг/кг иммунологически активного химерного антитела анти-СD20. На фиг. 11 представлены результаты воздействия Y2В8, который уничтожает опухолевые клетки в ксенографической модели мыши, использующей лимообластическую опухоль В-клеток. На фиг. 12 представлены результаты воздействия С2В8, который уничтожает опухолевые клетки в ксенографической модели мыши, использующей лимфобластическую опухоль В-клеток. На фиг. 13 представлены результаты воздействия комбинации Y2В8 и С2В8, которые уничтожают опухолевые клетки в ксенографической модели мыши, использующей лимфобластическую опухоль В-клеток. На фиг. 14А и 14В представлены результаты клинического анализа фазы I/II, доказывающего истощение популяции В-клеток при воздействии С2В8 через определенное время у пациентов, обнаруживающих частичную ремиссию (14А) и малую ремиссию (14В). Как правило, антитела состоят из двух легких цепочек и двух тяжелых цепочек молекул. Эти цепочки образуют полную форму "Y", причем легкая и тяжелые цепочки образуют ветви Y, а тяжелые цепочки образуют основание Y. Тяжелые цепочки разделены на домены структурной и функциональной гомологии. Вариабельные домены легкой ("VL") и тяжелой ("VН") цепочек обеспечивают распознавание и специфичность. Константные участки доменов легких ("СL") и тяжелых ("СН") цепочек придают важные биологические свойства, например ассоциацию цепочек с антителами, секрецию, трансплацентарную подвижность, связывание с Fс-рецептором, связывание комплемента и т.д. Последовательность явлений, которые приводят к генной экспрессии иммуноглобулина в клетках, вырабатывающих антитела, является сложной. Вариабельные участки доменов генных последовательностей размещаются в отдельных герминальных линиях генных сегментов, обозначаемых как "VН", "D", и "JH", или "VL" и "JL". Эти генные сегменты соединены перегруппировками ДНК для формирования целых V-участков, экспрессированных в тяжелых и легких цепочках соответственно. Перегруппированные соединенные V-сегменты (VL-JL и VH-D-JH) кодируют целые вариабельные участки или связывающие антигены домены легких и тяжелых цепочек. Серотерапия лимфомы В клеток человека с применением моноклонапьного мышиного (1F5) антитела анти-СD20 описана Press et al., (69 Blood 584, 1987, supra); к сожалению, полученные терапевтические ответы были неустойчивыми. Кроме того, по сообщениям у 25% тестированных пациентов развивался ответ антимышиных антител человека (НАМА) на серотерапию. Press et al. предполагают, что эти антитела, конъюгированные к токсинам или радиоизотопам, могут принести более продолжительный клинический положительный эффект, чем неконъюгированное антитело. Вследствие ослабляющего воздействия лимфомы В-клеток и самой насущной потребности в практическом лечении этой болезни, были разработаны различные способы, использующие специфическое антитело 2В8 в качестве общего связующего между способами. При одном способе используют способность систем млекопитающих легко и эффективно восстанавливать В-клетки периферической крови. При применении этого способа очищают или истощают В-клетки периферической крови и лимфатической ткани для устранения лимфомы В-клеток. Это осуществляют путем применения иммунологически активных химерных антител анти-CD20. При другом способе делали попытки целенаправленного поражения клетки опухоли радиоактивными метками для их деструкции. Используемый здесь термин "антитело антиСD20" обозначает антитело, которое специфически распознает негликозилированный фосфопротеин массой 35000 Дальтон на поверхности клетки, обычно обозначаемый как антиген Вр35 с ограниченной дифференциацией В-лимфоцитов человека, упоминаемый как СD20. Используемый в отношении антител анти-СD20 термин "химерный" обозначает антитела, которые наиболее предпочтительно получают при использовании рекомбинантных методов дезоксирибонуклеиновой кислоты, которые содержат компоненты человека (включая иммунологически "родственные" виды, например, шимпанзе): константный участок химерного антитела, наиболее предпочтительно идентичный константному участку природного человеческого антитела. Вариабельный участок химерного антитела предпочтительно получают от животных кроме человека, причем этот участок имеет желательную антигенность и специфичность к антигену СD20 на поверхности клетки. Животным кроме человека может быть любое позвоночное животное, которое используют для получения антител к антигену СD20 человека на поверхности клетки или материал, включающий антиген СD20 человека на поверхности клетки. Такие животные кроме человека включают (но не ограничены), грызунов: кролик, крыса, мышь; и приматов кроме человека: низшие узконосые обезьяны, человекообразные обезьяны. Компонент кроме человека (вариабельный участок) получают наиболее предпочтительно от мыши. Используемая здесь фраза "иммунологически активный" в отношении химерных антител анти-СD20 означает химерное антитело, которое связывает С1q человека и является промежуточным звеном опосредованного комплементом лизиса ("СDС") линий лимфоидных В-клеток человека и лизиса целевых клеток человека благодаря опосредованной антителами клеточной цитотоксичности ("АDСС"). Используемые здесь обе фразы "непрямое мечение" и "принцип непрямого мечения" означают, что хелатный агент ковалентно связан с антителом и по крайней мере один радионуклид встроен в хелатный агент. Предпочтительные хелатные агенты и радионуклиды описаны Srivagtava, S.C. and Mease, R.C., "Progress in Research on Ligands, Nuclides and Techniques for Labeling Monoclonal Antibodies", Nucl. Med. Bio.18/6: 589-603 (1991) ("Srivagtava"), на который здесь произво 4 27946 дится ссылка. Наиболее предпочтительным хелатным агентом является 1-изоцисматобензил-3метилдиотилен триаминпент уксусной кислоты ("МХ-DTPA"); предпочтительные радионуклиды для непрямого мечения включают индий [111] и иттрий [90]. Используемые здесь обе фразы "прямое мечение" и "принцип прямого мечения" означают, что радионуклид ковалентно присоединен непосредственно к антителу (обычно через аминокислотный остаток). Предпочтительные радионуклиды описаны у Srivagtava; а наиболее предпочтительным радионуклидом для прямого мечения является йод [131], ковaлентно присоединенный через остатки тирозина. Наиболее предпочтительным является принцип непрямого мечения. Терапевтические способы, изложенные здесь, основаны на способности иммунной системы приматов быстро восстанавливать или омолаживать В-клетки периферической крови. Кpоме того, поскольку основной иммунный ответ у приматов осуществляется Т-клетками, то если иммунная система имеет недостаток В-клеток периферической крови, исключается потребность в "экстраординарных" предосторожностях (то есть в изоляции пациента, и т.д.). В результате этих и других особенностей иммунной системы приматов предлагаемый принцип терапии нарушения В-клеток предусматривает очистку В-клеток периферической крови с помощью иммунологически активных химерных антител анти-СD20. Поскольку нарушения В-клеток периферической крови, по определению, могут указывать на необходимость осуществления лечения крови, способ введения иммунологически активных химерных антител анти-СD20 и меченных радиоактивными изотопами антител анти-СD20 является предпочтительно парентеральным. Используемый здесь термин "парентеральный" включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Среди них наиболее предпочтительно внутривенное введение. Иммунологически активные химерные антитела анти-СD20 и меченные радиоактивными изотопами антитела анти-СD20, как правило, получают обычными способами с помощью фармацевтически приемлемого буфера, например, стерильного физиологического раствора, стерильной буферной воды, пропиленгликоля, либо их комбинации и т.д. Способы приготовления агентов для парентерального введения изложены в Pharmaceutical Carriers & Formulations, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed, (Mack Pub. Co., Easton, PA 1975), на который здесь производится ссылка. Специфическое, терапевтически эффективное количество иммунологически активных химерных антител анти-СD20, необходимых для оказания уникального терапевтического воздействия на любого данного пациента, может быть определено стандартными методами, хорошо известными обычным специалистам в области техники. Эффективные дозировки (то есть терапевтически эффективные количества) иммунологически активных химерных антител анти-СD20 располагаются в диапазоне приблизительно от 0,001 до 30 мг/кг веса тела, предпочтительно приблизи тельно от 0,01 до 25 мг/кг веса тела, и наиболее предпочтительно приблизительно от 0,4 до 20,0 мг/кг веса. Возможны также другие дозировки. Факторы, влияющие на дозировку, включают, но не ограничены серьезностью заболевания, способами предыдущего лечения, общим состоянием здоровья пациента, наличием других заболеваний и т.д. Опытный специалист может легко произвести оценку состояния пациента и определить необходимую дозу, которая располагается в указанных диапазонах либо, в случае необходимости, вне этих диапазонов. Введение иммунологически активных химерных антител анти-СD20 в этих диапазонах дозы может быть осуществлено в виде однократного введения или ряда последовательных введений. Что касается химерных антител, предпочтительно, чтобы такое введение проводилось путем ряда последовательных введении. Настоящий предпочтительный способ выработан на основании методологического лечения настоящего заболевания. Не вдаваясь глубоко в теорию, следует заметить, что поскольку иммунологически активные химерные антитела анти-CD20 являются также иммунологически активными и связанными с СD20, то уже при начальном введении индивиду иммунологически активных химерных антител анти-СD20, начинается истощение В-клеток периферической крови, причем наблюдается почти полное истощение в течение приблизительно 24 часов после инфузии. Вследствие этого показанием для последующего введений(я) пациенту иммунологически активных химерных антител антиСD20 (или меченных радиоактивными изотопами антител анти-СD20) является: а) чистые остающиеся В-клетки остальной периферической крови; б) начало истощения В-клетки лимфатических узлов; в) начало истощения В-клеток из других тканевых источников, например, костного мозга, опухоли и т.д. При повторных введения иммунологически активных химерных антител анти-СD20 происходит ряд явлений, каждое из которых рассматривалось как важное для эффективного лечения заболевания. Первое "явление" можно считать преимущественно направленным на истощение в основном В-клеток периферической крови пациента; последующие "явления" можно рассматривать либо как преимущественно направленные на одновременное или последовательное очищение остающихся В-клеток из системы лимфатических узлов, очищающей В-клетки, или очищение В-клеток другой ткани. В действительности, в то время как одиночная дозировка обеспечивает положительный эффект и может действительно использоваться для лечения и управления ходом заболевания, предпочтительно проводить курс лечения в несколько этапов. Рекомендуется вводить пациенту раз в неделю в течение от 2 до 10 недель, предпочтительно в течение 4 недель, приблизительно от 0,4 до 20 мг/кг веса иммунологически активных химерных антител анти-СD20. Что касается применения меченных радиоактивными изотопами антител анти-СD20, то предпочтительно, чтобы антитело не было химерным. Это предпочтение основано на значительно более длительном циркуляционном периоде полураспа 5 27946 да химерных антител по отношению к мышиным антителам (то есть радионуклид с более длинным циркуляционном периодом полураспада присутствует в организме пациента более длительное время). Однако меченные радиоактивными изотопами химерные антитела могут давать положительный эффект при более низких дозировках в милли-Кюри ("мКи"), при применении вместе с химерным антителом, родственным мышиному антителу. Это позволяет снизить токсичность в костном мозге до приемлемого уровня при сохранении терапевтического эффекта. Согласно настоящему изобретению, можно применять множество разных радионуклидов, и специалисты в области техники смогут легко определить, какой радионуклид является соответствующим при определенных обстоятельствах. Например, йод-[131] - хорошо известный радионуклид, используемый для направленной иммунотерапии. Однако, клиническое воздействие йода [131] может быть ограничено несколькими факторами, включая: восьмидневный физический период полураспада, дегалогенизацию йодируемого антитела как в крови, так и в местах расположения опухоли, и характеристики эмиссии (например, большое гамма-излучения), которые могут являться сверхоптимальными для локализованного введения дозы в опухоль. С появлением превосходных хелатных агентов возможность присоединения металлических хелатных групп к протеинам позволила использовать другие радионуклиды, например, индий [131] и иттрий [90]. Иттрий [90] имеет несколько преимуществ при применении в радиоиммунотерапии: 64-часовой период полураспада иттрия [90] является достаточно продолжительным для накопления антител в опухоли и, например, в отличие от йода [131], иттрий [90] является чистым эмиттером высокоэнергетического бета-излучения без сопутствующего гаммаизлучения при его затухании, с диапазоном в ткани от 100 до 1000 диаметров клеток. Кроме того, минимальное количество проникающего излучения позволяет вводить антитела, помеченные иттрием [90], амбулаторному больному. Кроме того, не требуется интерализация меченного антитела для уничтожения клетки, а локальная эмиссия ионизирующей радиации должна быть летальной для прилегающих клеток опухоли, в которых недостает целевого антигена. Единственное нетерапевтическое ограничение для иттрия [90] основано на отсутствии значительного гамма-излучения, затрудняющего получение изображения. Эту проблему решают, используя такой диагностический "визуализирующий" радионуклид как индий [111] для определения местонахождения и относительного размера опухоли перед введением терапевтических дозировок анти-СD20, маркированных иттрием [90]. Индий [111] является особенно предпочтительным в качестве диагностического радионуклида, так как приблизительно от 1 до 10 мКи индия [111] можно вводить безопасно без наблюдаемой токсичности и томографические данные обычно прогнозируют с помощью последующего распределения антитела, помеченного иттрием [90]. В основном при томографических исследованиях используют антитело, помеченное индием [111] в дози ровке 5 мКи, поскольку эта дозировка является безопасной и увеличивает эффективность томографии по сравнению с более низкими дозировками, причем оптимальное изображение получают на третий-шестой день после введения антител. Cм., например, J.L Murray., 26 J. Nuc. Med. 3328 (1985) и Carraguillo, J.A. et al., 26 J; Nuc. Med. 67 (1985). Эффективные однократные лечебные дозировки (то есть терапевтически эффективные количества) антител анти-СD20, маркированных иттрием [90] располагаются в диапазоне приблизительно от 5 до 75 мКи, более предпочтительно от 10 до 40 мКи. Эффективные однократные лечебные для некостного мозга абляционные дозировки антител анти-СD20, маркированных йодом [131], располагаются в диапазоне приблизительно от 5 до 70 мКи, наиболее предпочтительно приблизительно от 5 до 40 мКи. Эффективные однократные лечебные абляционные дозировки антител антиСD20, маркированных йодом [131] (которые могут потребовать аутогенной трансплантации костного мозга) располагаются в диапазоне приблизительно от 30 до 600 мКи, более предпочтительно от 50 до менее 500 мКи. В соединении с химерным антителом анти-СD20 благодаря более длительному циркуляционному периоду полураспада по сравнению с мышиными антителами, эффективные однократные лечебные для некостного мозга абляционные дозировки химерных антител антиСD20, маркированных йодом [131], располагаются в диапазоне приблизительно от 5 до 40 мКи, наиболее предпочтительно менее 30 мКи. Необходимая дозировка, например, метки индия [111] для получения изображения составляет обычно менее 5 мКи. Что касается меченных радиоактивными изотопами антител анти-СD20, то терапию можно осуществлять также путем однократного терапевтического лечения либо многократного лечения. Из-за использования радионуклидного компонента предпочтительно перед проведением лечения сделать сбор периферических стволовых клеток ("РSС") или костного мозга ("ВМ") у пациентов, проявляющих потенциально смертельную токсичность костного мозга при действии ионизирующего излучения. Сбор ВМ и/или РSС производили, используя стандартные методы, затем очищали и замораживали для возможных повторных инфузий. Кроме того, предпочтительно, чтобы перед проведением лечения было проведено диагностическое дозиметрическое исследование пациента с использованием диагностики меченных антител (например, при использовании индия [111]), цель которого состоит в том, чтобы удостовериться, что терапевтически меченное антитело (например, при использовании иттрия [90]) не будет без надобности "концентрироваться" в любом здоровом органе или ткани). Известны химерные антитела мыши/человека. См., например, Morrison, S.L. et al., PNAS l1:68516854 (November 1984); Европейский патент № 172494; Baulianne, G.L et al., Nature 312:642 (December 1984); Neubeiger, M. S. et al., Nature 314:268 (March 1985); Европейский патент № 125023; Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (November 1985); Sun, L. K. et al., 5/1:517 Hybridoma 6 27946 вектор ТСАЕ 8. ТСАЕ 8 является производным вектора, принадлежащего владельцу этого патентного документа, упоминаемого под маркировкой ТСАЕ 5.2. Разница, однако, заключается в том, что в ТСАЕ 5.2 сайтом начала трансляции доминантного селективного маркера (фосфотрансфераза неомицина, "NЕО") является последовательность согласно Коzаk, в то время как в ТСАЕ 8 эта область представляет собой частично ослабленную последовательность согласно Коzak. Подробности, касающиеся влияния сайта начала инициации доминантного селективного маркера векторов ТСАЕ (также упоминаемых как "вектор АNЕХ") по сравнению с экспрессией белка, подробно раскрыты в параллельно рассматриваемой поданной заявке. ТСАЕ 8 включает: четыре (4) блока транскрипции, расположенные в тандемном порядке, легкую цепочку иммуноглобулина человека без вариабельного участка; тяжелую цепочку иммуноглобулина человека без вариабельного участка; DНFR и NЕО. Каждый блок транскрипции содержит собственный эукариотический промотор и область полиаденирования (см. фиг. 1 - схематическое изображение вектора ТСАЕ 8). В частности: 1) Промотор/энхансер СМV перед тяжелой цепочкой иммуноглобулина является укороченным вариантом промотор/энхансер перед легкой цепочкой, от сайта Nhe I около -350 до сайта Sst l около -16 (см. 41 Сеll 521, 1985). 2) Константный участок легкой цепочки иммуноглобулина человека получали путем амплификации участка PCR в кДНК. В ТСАЕ 8 использовали константные участки каппа легких цепочек иммуноглобулина человека (нумерация согласно Kabat, аминокислоты 108-214, аллотип Km 3, (см., Kabat, E.A. "Sequences of proteins of immunogical interest", NIH Publication, Fifth Ed. No. 91-3242, 1991)), и константный участок гамма 1 тяжелых цепочек иммуноглобулина человека (Kabat, нумерация аминокислот 114-478, аллотип Gmla, Gmlz). Легкую цепочку изолировали от крови здорового человека (IDEC Pharmaceuticals Corporation, La Jolla, CA); РНК оттуда использовали для синтеза кДНК, которую затем амплифицировали, используя методы PCR (праймеры получали в точности согласно Kabat). Тяжелую цепочку изолировали (используя методы PCR) из кДНК, полученной от РНК, которую, в свою очередь, получали из клеток, в которые был трансфектирован вектор человека lgG1 (см., 3 Prot. Eng. 531, 1990; вектор pN(162). Две аминокислоты заменяли в изолированном lgG1 человека для соответствия последовательности аминокислот согласно Kabat, а именно: в положении 225 аминокислоту валин заменяли на аланин (GTT на GCA), а в положении 287 аминокислоту метионин заменяли на лизин (ATG на AAG). 3) Блоки легких и тяжелых цепочек иммуноглобулина человека содержат искусственные сигнальные последовательности для секреции цепочек иммуноглобулина. 4) Блоки легких и тяжелых цепочек иммуноглобулина человека содержат специфические рестрикционные сайты ДНК, которые позволяют вводить вариабельные участки легких и тяжелых (1986); Sahagan et al., J.lmmunol. 137:10661074 1986). См. также Muron, Nature 312:597 (December 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5/3 (March 1985); Marx, Science 229 455 (August 1985); and Morrison Science 229:1202-1207 (September 1985). Robinson et al. в международной зaявке WO 88/04936 описывают химерное антитело, имеющее константный участок человека, и вариабельный участок мыши, которое обладает специфичностью к эпитопу CD20; участок мыши химерного антитела, согласно Robinson, получают из моноклонального антитела 2Н7 мыши (гамма 2b, каппа). Хотя в этих ссылках указано, что описанное химерное антитело является "первым кандидатом" при лечении нарушений В-клеток, это утверждение можно рассматривать не более чем предложение специалистам в данной области техники установить, является ли предложение корректным для данного специфического антитела, в частности, поскольку в ссылках не приводится данных, подтверждающих терапевтическую эффективность, а также важных данных по испытаниям на высших млекопитающих, например приматах или человеке. Методологии получения химерных антител известны специалистам в данной области техники. Например, легкие и тяжелые цепочки могут быть экспрессированы по отдельности, в виде, например, легкой цепочки иммуноглобулина и тяжелых цепочек иммуноглобулина в отдельных плазмидах. Затем их очищают и собирают in vitro в полные антитела. Известны методологии получения таких структур. См., например, Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 (1974). Также известны параметры реакции in vitro для получения антител IgG из укороченных изолированных легких и тяжелых цепочек. См., например, Beychok, S., Cells of Immunoglobulin Synthsis, Academic Press, New York, p. 69, 1979. Возможна также коэкспрессия легких и тяжелых цепочек в одних и тех же клетках для достижения внутриклеточной ассоциации и связи тяжелых и легких цепочек в полные антитела H2L2 IgG. Такую коэкспрессию можно выполнить, используя те же самые или различные плазмиды в одной и той же клетке хозяина. Другой способ, наиболее предпочтительный для разработки химерного антитела анти-СD20 кроме человека/человека, основан на использовании вектора экспрессии, включающий аb initio ДНК, кодирующую константные участки тяжелых и легких цепочек из источника человека. Такой вектор позволяет вставить ДНК, кодирующую вариабельный участок кроме человека таким образом, что можно получать ряд антител анти-СD20 кроме человека. Затем проводят скрининг и анализ для различных характеристик (например, специфика связывания, участки связывания эпитопа и т.д.). После этого в настоящий вектор можно включать кДНК, кодирующую вариабельные участки легких и тяжелых цепочек предпочтительного или желательного антитела анти-СD20. Предпочтительными являются такие типы векторов как Тандемные Химерные Векторы Экспрессии Антител ("ТСАЕ"). Наиболее предпочтительным вектором ТСАЕ, который использовали для получения иммунологически активных химерных антител анти-СD20 для терапевтического лечения лимфом, является 7 27946 цепочек иммуноглобулина, которые обеспечивают переход рамки считывания без изменения аминокислот, обычно присутствующих в цепочках иммуноглобулина. 5) Блок DНFР содержит cобственный эукариотический промотор ( главный промотор на основе глобина мыши, "ВЕТА") и область полиаденирования (полиаденирование бычьего гормона роста, "ВGН"). 6) Блок МЕО содержит собственный эукариотический промотор (ВЕТА) и участок полиаденирования (раннее полиаденирование SV40, "SV"). В отношении вектора ТСАЕ 8 и блока NЕО участок Коzak был частично ослаблен последовательностью согласно Коzak (который включал левый сайт Сlа I): Cla l -3 +1 GGGAGCTTGG ATCGAT ccTct ATG Gtt (В векторе ТСАЕ 5.2 замена между участками С1а 1 и АТО, а именно: ссАсс.) Перечень полной последовательности ТСАЕ 8 (включая специфические компоненты четырех блоков транскрипции) представлен на фиг. 2 (SЕQ. ID.NО. 1). Специалисты в данной области техники оценят тот факт, что векторы ТСАЕ дают возможность значительно сократить время получения иммунологически активных химерных антител анти-СD20. Получение и изоляция константных участков легких и тяжелых цепочек кроме человека, последующее их включение в констатные участки блоков транскрипции легких цепочек у человека и в констатные участки блоков транскрипции легких цепочек у человека позволяет производить иммунологически активные химерные антитела антиСD20. Наиболее предпочтительный вариабельный участок кроме человека со специфичностью к антигену СD20 получен из мыши по технологии создания гибридом. С помощью методов полимеразной цепной реакции ("РСR") непосредственно в векторе ТСАЕ 8 клонировали вариабельные участки легких и тяжелых цепочек мыши, что является наиболее предпочтительным путем включения в вектор ТСАЕ вариабельных участков кроме человека. Такое предпочтение главным образом основывается на эффективности реакции РСR и точности включения. Однако существуют другие эквивалентные способы выполнения этой задачи. Например, используя ТСАЕ 8 (или эквивалентный вектор), можно получить последовательность вариабельных участков антитела анти-СD20 кроме человека с последующим синтезом сегментов последовательности или, при необходимости, всей последовательности; после этого полную искусственную последовательность включают в соответствующее местоположение внутри вектора. Специалисты в данной области техники могут выполнить эту задачу. Согласно изобретению, наиболее предпочтительные иммунологически активные химерные антитела анти-СD20 были получены путем использования вектора ТСАЕ 8, включающего вариабельные участки мыши, полученные от моноклонального антитела к СD20. Это антитело (описываемое подробно ниже), обозначено как "2В8". Полная последовательность вариабельных участ ков, полученных от 2В8 в векторе ТСАЕ 8 ("антиСD20 в ТСАЕ 8") приведена на фиг. 3 (SЕQ. ID. NО 2). Клеточная линия хозяина, используемая для экспрессии белка, предпочтительно имеет происхождение от млекопитающих. Специалисты в данной области техники способны определить пpедпочтительные специфические клеточные линии хозяина, которые лучше всего соответствуют желательному генному продукту, который необходимо в них экспрессировать. Стандартные клеточные линии хозяина включают, но не ограничены, DG44 и DUXBII (линию яичника китайского хомяка (СНО), DHFR минус), HELA (цервикальную карциному человека), CVI (линию почек мартышки), COS (производную CVI с Т-антигеном SV40), R1610 (фибробласты китайского хомяка) BALBC/3T3 (фибробласты мыши), НАК (линию почек хомяка), SP2/0 (миелому мыши), Р3х63Аg3.653 (миелому мыши), BFA-lclBPT (клетки бычьего эндотелия), RAJI (лимфоциты человека) и 293 (почки человека). Клеточные линии хозяина обычно получают из коммерческих источников, из Американской Коллекции Культур Ткани или выбирают из изданной литературы. Предпочтительной клеточной линией хозяина является DG44 (СНО) или SP2/0. См. Urland, G. et al., "Effect of gamma rays and dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions." Som. Cell & Mol. Gen. 12/6:555-566 (1986), и Shulman, M. et al., "A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies." Nature 276:269 (1978) соответственно. Предпочтительной клеточной линией хозяина является DG44. Трансфекцию плазмиды в клетку хозяина можно осуществить любым методом, известным в данной области техники. Они включают, но не ограничены, трансфекцию (включая электрофорез и электропорацию), слияние клетки с упакованной ДНК, микроинъекцию и инфекцию интактным вирусом. См. Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors." Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez и Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, MA 1988). Наиболее предпочтительно введение плазмиды в хозяина производят путем электропорации. Примеры Следующие примеры не следует рассматривать как ограничивающие изобретение. Примеры иллюстрируют: визуализацию дозы с помощью меченных радиоактивными изотопами антител анти-СD20 ("l2В8"); меченное радиоактивными изотопами антитело анти-СD20 ("Y2B8") и иммунологически активное химерное антитело антиСD20 ("С2В8"), полученное с использованием специфического вектора ("ТСАЕ 8") и вариабельных участков, полученных из мышиного моноклонального антитела анти-СD20 ("2В8"). 1. Меченное радиоактивными изотопами антитело 2В8 анти-СD20 А. Получение моноклонального антитела анти-СD20 (мышиного) ("2В8") Мышей BALB/C неоднократно иммунизировали клеточной линией SB лимфобластов человека (cм. Adams, R.A. et al., "Direct implantation and serial transplantation of human acute lymphoblastic leukemia in hamsters, SB-2." Can Res 28:1121-1125 (1968); эта клеточная линия находится в Амери 8 27946 канской Коллекции Культур Тканей (АТСС), Rockville, MD., под порядковым номером АТСС CCL 120), путем еженедельных инъекций в течение 3-4 месяцев. Идентифицировали мышей, обнаруживающих высокие титры антител анти-СD20 в сыворотке, что определяли путем ингибирования известных антител специфических для CD20 (использовали антитела анти-СD20 - Leu 16, Beckton Dickinson, San Jose, CA, Cat. No 7670; and Bl. Coulter Corp., Hialeah, FL, Cat. No 6602201); у таких мышей удаляли селезенки. Клетки селезенки сливали с клетками миеломы SP2/0 мыши согласно протоколу, описанному у Einfeld, D.A. et al., EMBO (1988) 7:711 (SP2/0 имеет в АТСС номер ATCC CRL 8006). Специфичность CD20 анализировали с помощью радиоиммуноанализа. Затем очищенное ан125 ти-СD20 Bl помечали радиоактивным изотопом I способом, описанным Valentine, M. A. et al., (1989) 125 J. Biol. Chem. 264:11282. (I Sodium lodihe, ICN, Irvine, CA, Cat. No. 28665H). Проводили скрининг гибридом при совместной инкубации 0,05 мл среды в каждой лунке для сливания вместе с 0,05 мл 125 анти-СD20 BI (10 нг), маркированного I в 1%ном бычьем сывороточном альбумине (BSA), физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS, рН 7,4), и 0,5 мл того же самого буфера, содержащего 100000 клеток SB. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре клетки высевали путем переноса в титрационный планшет с 96 лунками (V&P Scientific, San Diego, CA), тщательно промывали. Двойные лунки, содержащие немеченный анти-СD20 BI, и лунки, не содержащие ингибирующего антитела, использовали соответственно как положительный и отрицательный контроль. Лунки, содержащие антитела с более чем 50%-ным ингибированием, увеличивали и клонировали. Антитело, проявляющее самое высокое ингибирование, получили от клонируемой клеточной линии, обозначенной здесь как "2В8". В. Приготовление конъюгата 2B8-MX-DTPA i. MX-DTPA 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусную кислоту, меченную углеродом14, ("MX-DTPA, меченный углеродом-14") использовали как хелатный агент для конъюгации меченного радиоактивного изотопа с 2В8. Манипулирования с MX-DTPA проводили таким образом, чтобы поддерживать условия отсутствия металлов, то есть использовали не содержащие металлов реагенты и, по возможности, также применяли пластмассовые полипропиленовые контейнеры (фляги, мензурки, градуированные цилиндры, наконечники пипеток), которые мыли с Alconox и прополаскивали водой Milli-Q. MX-DTPA получали в виде сухого твердого вещества у Dr. Otto Gansow (National Institute of Health, Bethesda, MD) и сохраняли в сухом виде при 4°С (в защищенном от света месте), с основными растворами, приготовленными в воде Milli-Q при концентрации 2-5 мМ, которые хранили при -70°С. MX-DTPA также получали от Immunology Coulter (Hialeah, Флорида) как двунатриевую соль в воде и хранили при -70°С. ii. Приготовление 2В8 Очищенный 2В8 подготавливали для конъюгации с MX-DTPA, помещая антитело в не содержащий металлов раствор 50 мМ бицина-NaOff, рН 8,6, содержащий 150 мМ NaCI, с использованием повторного буферного обмена с помощью вращающихся фильтров CENTRICON 30ТМ (30,000D, MWCO; Amicon). Как правило, в (фильтр добавляли 50-200 мкл белка (10 мг/нл) с последующим добавлением 2 мл буфера бицина. Фильтр центрифугировали при 4°С в роторе Sorval SS-34 (6,000 оборотов в минуту, 45 мин). Поддерживаемый объем составлял приблизительно 50-100 мкл, причем этот процесс повторяли дважды, используя тот же самый фильтр. Поддерживаемый объем помещали в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл с завинчивающимся колпачком, испытывали белок, разбавляли до 10,0 мг/мл и хранили при 4°С до использования. Аналогично белок помещали в 50 мМ цитрата натрия, рН 5.5, содержащий 150 мМ NаСl и 0,05% азида натрия, используя предшествующий протокол. iii. Конъюгация 2В8 с МХ-DТРА Конъюгацию 2В8 с МХ-DTPA выполняли в полипропиленовых трубках при температуре окружающей среды. Замороженные основные растворы МХ-DTPA оттаивали немедленно перед применением. 50-200 мл белка при 10 мг/мл вступали в реакцию с МХ-DTPA при молярном соотношении МХ-DTPA к 2В8, равном 4:1. Реакции инициировали, добавляя запасной раствор МХ-DTPA при осторожном перемешивании; конъюгацию проводили накануне вечером (с 14 до 20 часов) при температуpе окружающей среды. Нереагировавший МХ-DTPA удаляли из конъюгата диализом или повторной ультрафильтрацией, как описано выше в примере 1.В.ii, в не содержащем металлов стандартном солевом растворе (0,9% вес/объем), содержащем 0,05% азида натрия. Концентрацию белка доводили до 10 мг/мл и сохраняли при 4°С в полипропиленовой трубке до мечения радиоактивными изотопами. iv. Определение включения МХ-DТРА Включение МХ-DTPA определяли путем подсчета сцинтилляции и сравнения значения, полученного с очищенным конъюгатом, с удельной активностью МХ-DTPA, меченного углеродом-[14]. Для некоторых исследований, в которых использовали нерадиоактивный МХ-DTPA (Coulter Immunology), включение МХ-DTPA определяли, инкубируя конъюгат с излишком раствора радиоактивного носителя иттрия-[90] известной концентрации и удельной активности. Основной раствор хлорида иттрия известной концентрации готовили в не содержащем металлов растворе 0,05 Н НСl, к которому добавляли не содержащий носителя иттрий-[90] (хлорид). Аликвотные пробы этого раствора анализировали путем подсчета сцинтилляции в жидкости для определения точной удeльной активности для этого реагента. Объем реагента хлорида иттрия, равный 3-кратному числу молей хелата, которые желательно присоединить к антителу (кaк правило, 2 моль/моль антитела), добавляли в полипропиленовую трубку и рН доводили до 4,0-4,5 при добавлении 2 М натриевого ацетата. Затем добавляли конъюгированное антитело, и смесь инкуби 9 27946 ровали в течение 15-30 минут при температуре окружающей среды. Реакцию гасили, добавляя 20 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕDТА) к окончательной концентрации 1 мМ и рН раствора доводили приблизительно до 6 при добавлении 2М натриевого ацетата. После 5 минут инкубации весь объем очищали при помощи высокоразрешающей эксклюзионной хроматографии (описанной ниже). Объединяли элюированные фракции, содержащие белок, определяли концентрацию белка и анализировали аликвотные пробы на радиоактивность. Включение хелата вычисляли с помощью удельной активности препарата хлорида иттрия-[90] и концентрации белка. v. Иммунореактивность 2В8-МХ-DТРА Оценивали иммунореактивность конъюгированного 2В8, используя для всех клеток твердофазный иммуноферментный анализ (ЕLISА). Клетки SВ в средней лог-фазе фазы высевали из культуры центрифугированием и промывали два раза с 1Х НВSS (сбалансированный солевой раствор Хенкса). Клетки разводили до 1-2 X 106 клеток/мл в НВSS и помещали аликвотные пробы в полистирольные микропланшеты с 96 лунками при 50000-100000 клеток на лунку. Микропланшеты высушивали под вакуумом в течение 2 часов при 40-45°С для фиксации клеток на пластмассе. Микропланшеты хранили в сухом виде при -20°С до их применения. Для анализа микропланшеты нагревали до температуры окружающей среды непосредственно перед использованием, блокировали 1Х РВS (физиологическим раствором с фосфатным буфером), рН 7,2-7,4, содержащим 1% ВSА (бычьего сывороточного альбумина (2 часа). Образцы для анализов разбавляли в 1Х РВS 1% ВSА, наносили на микропланшеты и последовательно разбавляли (1:2) в том жe самом буфере. После инкубации микропланшетов в течение 1 часа при температуре окружающей среды микропланшеты промывали три раза 1Х РВS. Вторичное антитело (козлиный антимышиный специфический к lgG1 НRР конъюгат объемом 50 мкл) добавляли в лунки (разбавление 1:1500 в 1Х РВS/1% ВSА) и инкубировали в течение 1 часа при температуре окружающей среды. Микропланшеты промывали четыре раза в 1Х РВS при добавлении раствора субстрата АВТS (раствор 50 мМ натриевого цитрата, рН 4,5, содержащий 0,01% АTВS и Н2O2 0,001%). Микропланшеты читали при 405 нм после 15-30 минут инкубации. Антиген-отрицательные клетки НSВ включали в анализ для мониторинга неудельного связывания. Иммунореактивность конъюгата вычисляли с помощью графика значений оптической плотности по отношению к соответствующему фактору разбавления и сравнивали их с полученными значениями, используя природное антитело (представляющее 100%-ную иммунореактивность), тестируемое на том же микропланшете; далее несколько значений части линейного титрационного профиля сравнивали и определяли среднее значение (данные не представлены). vi. Подготовка 2BS-MX-DTPA, меченного индием-[111] ("l2В8") Конъюгаты помечали радиоактивными изотопами индия-[111], свободными от носителя. Алик вотную пробу изотопа (0,1-2 мКи/мг антитела) в 0,05 М HCI перемещали в полипропиленовую трубку и добавляли приблизительно одну десятую часть объема 2 М HCI, не содержащего металлов. После инкубации в течение 5 минут добавляли раствор 2 М натриевого ацетата, не содержащего металлов, для доведения рН раствора до величины 4,0-4,4. Приблизительно 0,5 мг 2B8-MX-DTPA добавляли из основного раствора 10,0 мг/мл DTPA в нормальном физиологическом растворе соли, или в 50 мМ натриевого цитрата в 150 мМ NaCI, содержащего 0,05% азида натрия, и сразу же осторожно перемешивали раствор. Раствор проверяли с помощью лакмусовой бумаги, получали значение 4,0-4,5 и смесь инкубировали при температуре окружающей среды в течение 15-30 минут. Затем реакцию гасили путем добавления 20 мМ EDTA к окончательной концентрации 1 мМ, а рН реакционной смеси доводили приблизительно до 6,0, используя 2 М ацетат натрия. После 5-10 минут инкубации некомплексообразующий радиоизотоп удаляли при помощи эксклюзионной хроматографии. Блок HPLS (жидкостной хроматографии высокого давления) включал Waters Model 6000 или систему поставки растворителя TosoHaas Model TSK-6110, укомплектованную соответственно инъекционным клапаном Waters U6K или Rheodyne 700. Хроматографические сепарирования выполняли, используя гельпроникающую колонну (BioRad SEC-250; 7.5х300 мм или сравнительную колонну TosoHaas) и ограничивающую колонну SEC-250 (7,5х100 мм). Система была оборудована коллектором фракций (Pharmacia Frac200) и монитором UV с фильтром диаметром 280 нм (Pharmacia model UV-1). Образцы наносили и равномерно элюировали с помощью 1Х РВS, рН 7,4, при скорости потока 1,0 мл/мин. Половину миллилитровых фракций собирали в стеклянные трубки и их аликвотные пробы подсчитывали в гамма-счетчике. Нижние и верхние окна устанавливали от 100 до 500 КэВ соответственно. Включение радиоизотопов вычисляли, суммируя радиоактивность, связанную с пиковыми значениями белка при элюации, и делили это число на общую радиоактивность, элюированную из колонны; затем это значение представляли в процентном соотношении. В некоторых случаях включение радиоизотопов определяли с помощью моментальной тонкослойной хроматографии ("IТLС"). Меченный радиоактивными изотопами конъюгат разбавляли в соотношении 1:10 или 1:20 в растворе, содержащем 1Х РВS, или в растворе 1Х РВS/ 1 мМ DТРА, затем 1 мкл наносили на расстоянии 1,5 см от одного конца полоски бумаги SG ITLC размером 1х5 см. Бумагу обрабатывали с помощью восходящей хpоматографии, используя раствор 10% ацетата аммония в метаноле и воды в объемном соотношении 1:1. Полоску высушивали, разрезали поперек на две пoловины, и радиоактивность каждой части определяли подсчетом гамма-излучения. Радиоактивность нижней части полоски (радиоактивность, связанную с бeлком) представляли в виде процента от суммарной радиоактивности, определенной путем сложения значений для верхней и нижней половин (данные не приведены). 10 27946 Определяли удельные активности путем измерения радиоактивности соответствующих аликвoтных проб конъюгата, меченного радиоактивными изотопами. Это значение корректировали для эффективности счетчика (обычно 75%) и соотносили с концентрацией белка в конъюгате, предварительно определив оптическую плотность при 280 нм. В результате получили значение, выраженное в мКи/мг протеина. В некоторых экспериментах 2В8-МХ-DТРА помечали индием-[111] согласно протоколу, описанному выше, за исключением очистки жидкостной хроматографией высокого давления. Этот протокол обозначают как "mix-and-shoot". vii. Приготовление 2B8-МХ-РТРА, меченного иттрием ("Y2В8") Для приготовления конъюгата 2В8-МХ-DТРА, меченного иттрием ("Y2В8"), следовали тому же самому протоколу, описанному для приготовления l2В8, меченного иттрием, за исключением использования 2 нг НСl. Все препараты конъюгатов, меченных иттрием, очищали эксклюзионной хроматографией, как описано выше. С. Исследования животных кроме человека i. Биораспределение 2В8-МХ-DТРА, меченного радиоактивными изотопами l2В8 оценивали для биораспределения в ткани у мыши линии ВАLВ/c в возрасте шести-восьми недель. Конъюгат, меченный радиоактивными изотопами, приготавливали, используя клиническую стадию препарата 2В8-МХ-DТРА, затем следовали протоколу "mix-and-shoot", описанному выше. Удельная активность конъюгата составляла 2,3 мКи/мг, и из конъюгата получали препарат в РВS с рН 7,4, содержащим 50 мг/мл НSА (сывороточного альбумина человека). Мышам вводили внутривенно 100 мл l2В8 (приблизительно 21 мКи). Троих мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации через 0, 24, 48, и 72 часа. После умерщвления хвост, сердце, легкие, печень, почки, селезенку, мышцы и бедренную кость удаляли, промывали и взвешивали. Брали образцы крови для анализа. Определяли радиоактивность каждого образца путем подсчета гаммаизлучения, а также соответственно процент введенной дозы на грамм ткани паритета. Также учитывали влияние активности крови отдельных органов. Согласно отдельному протоколу, аликвотные пробы 2В8-МХ-DТРА, которые инкубировали при 4°С и 30°С в течение 10 недель, помечали радиоактивными изотопами индия [111] до удельной активности 2,1 мКи/мг для обоих препаратов. Затем эти конъюгаты использовали при исследованиях биораспределения в мышах как описано выше. Для дозиметрических измерений 2В8-МХDТРА помечали радиоактивным индием [111] до удельной активности 2,3 мКи/мг и вводили приблизительно 1,1 Ки каждой из 20 мышей линии ВАLВ/c. Впоследствии пять мышей умерщвляли через 1, 24, 48 и 72 часа, а их органы удаляли и подготавливали для анализа. Кроме того, участки кожи, мышцы и кости удаляли и обрабатывали для анализа; также собирали мочу и фекалии и анализировали в течение того же самого времени 24-72 часа. С помощью аналогичного способа 2В8-МХDТРА помечали радиоактивным изотопом иттрия [90] и оценивали его биологическое распределение в мышах линии ВАLВ/c с интервалом времени 72 часа. После очищения жидкостной эксклюзионной хроматографией высокого давления четырем группам по пять мышей вводили внутривенно приблизительно 1 мКи подготовленного для клинических испытаний кoнъюгата с удельной активностью 12,2 мКи/мг. Группы впоследствии умерщвляли через 1, 24, 48 и 72 часа, а их органы и ткани анализировали, как описано выше. Радиоактивность каждого образца ткани определяли, измеряя энергию тормозного излучения счетчиком сцинтилляций гамма-излучения. Значения активности впоследствии выражали как процент вводимой дозировки на грамм ткани или как процент вводимой дозировки на орган. Хотя органы и ткани промывали неоднократно для удаления избыточной крови, перфузию органов не проводили. Таким образом учитывали влияние активности внутренней крови на общее значения активности органа. ii. Локализация опухоли с помощью l2В8 Определяли локализацию меченного радиоактивными изотопами 2В8-МХ-DТРА в тимусэктомированных мышах, несущих опухоль В-клеток Ramos. Тимусэктомированным мышам в возрасте шести-восьми недель вводили подкожно (в левый бок) 0,1 мл PРМI-1640, содержащего 1,2х107 клеток опухоли Ramos, которые предварительно адаптировали для роста в тимусэктомированных мышах. Опухоли возникали в течение двух недель и располагались по весу в диапазоне от 0,07 до 1,1 граммов. Мышам вводили внутривенно 100 мкл 2В8-МХ-DТРА (16,7 мКи), помеченного индием [111], и умерщвляли группы из трех мышей путем цервикальной дислокации через 0, 24, 48, и 72 часа. После умерщвления хвост, сердце, легкие, печень, почки, селезенки, мышцы, бедренную кость и опухоль удаляли, вымывали, взвешивали, брали образцы крови для анализа. Определяли радиоактивность каждого образца путем подсчета гамма-излучения и процент вводимой дозы на грамм ткани. iii. Биораспределение и изучение локализации опухоли с помощью 2В8-МХ-DТРА, меченного радиоактивными изотопами После предварительного эксперимента по биораспределению, описанного выше (пример I.В.viii.а), конъюгированное 2В8 помечали радиоактивным изотопом индия [111] с удельной активностью 2,3 мКи/мг, и непосредственно вводили каждой из двадцати мышей линии ВАLВ/c 1,1 Ки для определения биораспределения меченного радиоактивными изотопами вещества. Впоследствии группы из пяти мышей в каждой умерщвляли через 1, 24, 48 и 72 часа, а их органы и часть кожи, мышцы и кости удаляли и обрабатывали для анализа. Кроме того, мочу и фекалии собирали и анализировали в течение интервалов времени 24-72 часа. Уровень радиоактивности крови снижался от 40,3% при инъекции дозы на грамм через 1 час до 18,9% через 72 часа (данные не приведены). Значения для сердца, почек, мышц и селезенки оставались в диапазоне от 0,7-9,8% в течение эксперимента. Уровни радиоактивности, обнаруженной в легких, снижались от 14,2% через 11 27946 1 час до 7,6% через 72 часа. Аналогично значения на грамм вводимой дозы для печени составили соответственно 10,3% и 9,9%. Эти данные использовали для определения поглощенных доз радиации l2В8, описанных ниже. Биораспределение конъюгата, меченного иттрием [90], с удельной активностью антитела 12,2 мКи/мг определяли в мышах линии ВАLВ/с. Получали включения радионуклидов (90%) и очищали меченное радиоактивными изотопами антитело НPLС (жидкостной хроматографией высокого давления). Распределение радиоактивности в ткани определяли в главных органах, и коже, мышцах, костях, моче и фекалиях через 72 часа и выражали в процентах вводимой дозы на грамм ткани. Результаты (нe приведены) подтверждали, что хотя уровни радиоактивности крови снижались от приблизительно 39,2% вводимой дозы на грамм через 1 час до 15,4% через 72 часа уровни радиоактивности в хвосте, сердце, почках, мышцах и селезенке оставались постоянными, равными 10,2% или ниже на протяжении эксперимента. Важно то, что радиоактивность кости располагалась в диапазоне от 4,4% вводимой дозы на грамм кости через 1 час дo 3,2% через 72 часа. В совокупности эти результаты показывают, что малые дозы свободного иттрия были в конъюгате и что малые дозы свободных радиоактивных металлов высвобождались в ходе эксперимента. Эти данные использовали для определения доз поглощенной радиации для Y2В8, описанного ниже. Для исследований локализации опухоли приготавливали 2В8-МХ-DТРА и помечали радиоактивными изотопами индия 111 до удельной активности 2,7 мКи/мг. Затем сто микролитров помеченного коньюгата (приблизительно 24 Ки) вводили каждой из 12 тимусэктомированных мышей, имеющих опухоль В-клеток Ramos. Опухоли располагались по весу в диапазоне от 0,1 до 1,0 граммов. После инъекции через 0, 24, 48, и 72 часов брали образцы крови объемом 50 мл путем пункции глазного дна, затем мышей умерщвляли посредством цервикальной дислокации и удаляли хвост, сердце, легкие, печень, почки, селезенку, мышцы, бедренную кость и опухоль. После обработки и взвешивания тканей определяли радиоактивность каждого образца ткани, используя счетчик гамма-излучения, а значения выражали как процент вводимой дозы на грамм. Результаты (не представлены) показали, что концентрации 111 In-2В8-МХ-DТРА в опухоли устойчиво возрастали на протяжении хода эксперимента. Тринадцать процентов вводимой дозы накапливалось в опухоли через 72 часа. Уровни крови, напротив, снижались в течение эксперимента от свыше 30% через 0 часов до 13% через 72 часа. Все другие ткани (за исключением мышц) содержали от 1,3 до 6,0% вводимой дозы на грамм ткани к концу эксперимента; мышечная ткань содержала приблизительно 13% вводимой дозы на грамм. D. Исследования человека i. 2В8 и 2В8-МХ-DТРА: Иммуногистологические исследования в тканях человека Определяли реактивность мышиного моноклонального антитела 2В8 в ткани, используя набор 32 различных тканей человека, фиксирован ных ацетоном. Антитело 2В8 реагировало с антигеном анти-СD20, которое имело ограниченную структуру распределения ткани, наблюдаемую только в субпопуляции клеток в лимфоидных тканях, имеющих только гематопоэтическое происхождение. В лимфатическом узле наблюдали иммунореактивность в популяции зрелых корковых В-лимфоцитов, а также в пролиферирующих клетках герминальных центров. Положительную реактивность также наблюдали в периферической крови, областях В-клеток миндалин, белой пульпе селезенки и у 40-70% медуллярных лимфоцитов, обнаруженных в тимусе. Положительная реактивность также наблюдалась в фолликулах собственно тонких слоев (пейровых бляшках) толстого кишечника. И, наконец, положительные результаты получали при применении антитела 2В8 в популяции или рассеянных лимфоидных клетках стромы различных органов, включая мочевой пузырь, молочные железы, шею, пищевод, легкие, околоушную железу, простату, тонкую кишку и желудок (данные не представлены). Обнаружено, что все клетки однослойного эпителия, так же как и многослойного эпителия и эпителия различных органов, являются нереактивными. Аналогично отсутствие реактивности установлено в нейроэктодермальных ячейках, включая клетки головного, спинного мозга и периферических нервов. Было обнаружено, что мезенхимальные элементы, например клетки скелетных и гладких мышц, фибробластов, клетки эндотелия, и полиморфоядерные клетки опухоли также являются отрицательными (данные не представлены). Оценивали реактивность конъюгата 2В8-МХDТРА в ткани, используя набор из шестнадцати тканей человека, фиксированных в ацетоне. Как было показано ранее в отношении природного антитела (данные не приведены), конъюгат 2В8МХ-DТРА распознавал антиген СD20, который проявил сильно ограниченную структуру распределения, поскольку его обнаруживали, только в субпопуляции клеток лимфатического происхождения. В лимфатическом узле иммунореактивность наблюдали в популяции В-клеток. Высокую реактивность наблюдали в белой пульпе селезенки и в медуллярных лимфоцитах тимуса. Иммунореактивность также наблюдали в рассеянных лимфоцитах в мочевом пузыре, сердце, толстом кишечнике, печени, легком и матке, которую объясняли наличием опухолевых клеток в этих тканях. Как и у природного антитела, никакой реактивности не наблюдали в нейроэктодермальных клетках или в мезенхимальных элементах (данные не представлены). ii. Клинический анализ l2В8 (томография) и Y2В8 (терапия) а. Исследование терапии однократной дозой при клиническом испытании в фазе I/II В настоящее время проводится клинический анализ l2В8 в фазе I/II (томография), сопровождаемый введением однократной терапевтической дозы Y2В8. При исследовании однократной дозы следуют следующей схеме. 1. Сбор периферических стволовых клеток (РSС) или клеток костного мозга (ВМ) с очисткой. 2. Томография l2В8. 12 27946 Уровень дозировки 1 2 3 3. Терапия Y2В8 (три уровня дозировки). 4. Трансплантация РSС или аутогенного ВМ (в случае необходимости основанная на абсолютном 3 подсчете нейтрофилов менее 500 в мм в течение трех последовательных дней или тромбоцитов 3 менее 20000 в мм , если исследование не обнаруживает восстановления костного мозга.) Уровни дозировки Y2В8 были следующими: Уровень дозировки 1 2 3 Дозировки (мКи) 10 15 20 Необходимо провести лечение троих пациентов на каждом из уровней дозировки для определения максимально переносимой дозы (МТD). Томографические исследования (дозиметрию) проводят следующим образом: предпочтительную дозу при томографии для немеченного антитела (то есть 2В8) определяют для первых двух пациентов. Эти первые два пациента получают 100 мг 3 немеченного 2В8 в 250 см обычного физиологического раствора, а через 4 часа им вводят 0,5 мКи 12В8, берут анализ крови для получения данных биораспределения по времени t=0, t=10 минут, t=120 минут, t=24 часа и t=48 часов. Пациентов сканируют с получением множества местных изображений с помощью гамма-камеры во время t=2 часа, t=24 часа и t=48 часов. После сканирования при t=48 часов пациенты получают 250 мг 2В8, как описано, затем им вводят в кровь 4,5 мКи l2В8 и сканируют, как описано. Если 100 мг 2В8 дают хорошую томографию, то следующие два пациента получают 50 мг 2В8, как описано, затем вводят 0,5 мКи l2В8, далее через 48 часов вводят 100 мг 2В8 и затем 4,5 мКи l2B8. Если 250 мг 2В8 дают хорошую томографию, то следующие два пациента получают 250 мг 2В8, как описано, затем им вводят 0,5 мКи l2B8, через 48 часов 500 мг 2В8 и затем 4,5 мКи l2B8. Следующим пациентам вводят самое низкое количество 2В8, что обеспечивает оптимальное отображение. Оптимальное отображение определяют как: (1) наилучшее эффективное отображение при самом медленном исчезновении антитела; (2) наилучшее распределение, минимизирующее компартментализацию в отдельном органе; (3) наилучшее субъективное разрешение изображения патологического изменения (сравнение опухоль/фон). Для первых четырех пациентов первая терапевтическая дозировка Y2B8 будет начинаться через 14 дней после введения последней дозировки l2B8; для следующих пациентов первая терапевтическая дозировка Y2B8 будет начинаться от двух до семи дней после введения l2B8. До введения Y2B8 пациентам, кроме первых четырех, вводят 2В8, как описано, затем внутривенно вводят Y2B8 через 5-10 минут. Берут анализ крови для биораспределения по времени t=0, t=10 минут, t=120 минут, t=24 часа и t=48 часов. Пациенты получают повторные дозировки Y2B8 (вводят ту же самую дозировку, как и первую) приблизительно каждую неделю с шестой по восьмую при максимуме четыре дозировки или общую суммарную дозировку 80 мКи. Наиболее предпочтительно, чтобы пациенты не получали последующую дозировку Y2B8, пока показательWВС (формулы крови) у пациентов больше либо равен 3000 и AGC больше либо равен 100000. После завершения исследования уровня с тремя дозировками определяют максимально переносимую дозу. В исследования вводят дополнительных пациентов, которые будут получать максимально переносимую дозу. II. Получение химерных антител анти-СD20 Дозировка (мКи) 20 30 40 Необходимо провести лечение троих пациентов на каждом из уровней дозировок для определения максимально переносимой дозы ("максимально переносимая доза"). Томографические исследования (дозиметрию) проводят следующим образом: каждого пациента включают в два исследования биораспределения in vivo при использовании l2В8. В первом исследовании вводят внутривенно 2 мг l2В8 (5мКи) через один час; спустя одну неделю 2В8 (то есть неконъюгирующее антитело) вводят внутривенно со скоростью, не превышающей 250 мг/ч, затем немедленно вводят внутривенно 2 мг l2В8 (5 мКи) через один час. При обоих исследованиях немедленно после инфузии l2В8 каждого пациента подвергают томографии, которую повторяют при времени t=14-18 часов (если указано), t=24 часа; t=72 часа и t=96 часа (если указано). Для метки индия [111] определяют среднее время сохранения во всем организме; такие определения также делают для распознаваемых органов или органов, поврежденных опухолями ("области, представляющие интерес"). Области, представляющие интерес, сравнивают с концентрациями метки во всем организме. На основании этого сравнения, используя стандартные протоколы, можно определить локализацию и концентрацию Y2B8. Если определяемая суммарная доза Y2В8 в более чем в восемь (8) раз превышает расчетную дозу для всего организма или если расчетная суммарная доза для печени превышает 1500 сГр, то лечение Y2B5 не проводят. Если результаты томографических исследований приемлемы, то на 0,0 или 1,0 мг/кг веса пациента вводят внутривенно 2В8 со скоростью не более 250 мг/ч. Затем внутривенно вводят Y2B5 (10,20 или 40 мКи) со скоростью 20 мКи/ч. в. Клиническое испытание в фазе I/II: исследование терапии многократной дозой В настоящее время проводят клинический анализ Y2B5 в фазе I/II: исследование терапии многократной дозой. Для исследования многократной дозы используют следующую схему. 1. Сбор РSС или ВМ. 2. Томография l2В8. 3. Терапия Y2B8 (три уровня дозировки) для четырех дозировок или общей суммарной дозировки 80 м Ки. 4. Трансплантация РSС или аутогенного ВМ (основанная на решение практикующего врача). Уровни дозировки Y2B8 были следующими: 13 27946 продукция ("С2В8") А. Конструирование вектoра экспресии ДНК химерного иммуноглобулина анти-СD20 РНК изолировали из клетки гибридомы мыши 2В8 (как описано Chomczynki, P. et al., "Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction." Anal. Biochem. 162:156-159 (1987) и получали из нее кДНК. вариабельные участки ДНК легких цепочек иммуноглобулина мыши изолировали из кДНК цепной реакцией полимеразы с помощью набора праймеров ДНК с гомологией к сигнальным последовательностям легких цепочек мыши на 5' конце и J-участками легких цепочек мыши на 3' конце. Последовательности праймеров были следующими: 1. Смысловой VL (SEQ. ID. NO. 3) 5' ATC AC AGATCT CTC ACC ATG GAT TTT CAG GTG CAG ATT ATC AGC TTC 3' (подчеркнутая часть является сайтом Bgl II; весь участок является кодоном начала.) 2. Антисмысловой VL(SEQ. ID. NO. 4) 5' TGC AGC ATC CGTACG TTT GAT TTC CAG CTT 3' (подчеркнутая часть является сайтом Wl Bsi.). См. фиг. 1 и 2 для соответствующих сайтов Bgl II и Wl Bsi в ТСАЕ 8 и фиг. 3 для соответствующих сайтов в анти-СD20 в ТСАЕ 8. Эти получаемые в результате фрагменты ДНК клонировали непосредственно в векторе ТСАЕ 8 перед константным доменом легких цепочек каппа человека и секвенировали. Определяемая последовательность ДНК для вариабельных участков легких цепочек мыши изображена на фиг. 4 (SEQ. ID. NO. 5); см. также фиг. 3, нуклеотиды от 978 до 1362. На фиг. 4 также показаны последовательности аминокислот этого вариабельного участка, а также каркасные участки и участки CDR. Вариабельные участки легких цепочек мыши из 2В8 расположены в семействе каппа VI мыши. См. Kabat, выше. Вариабельные участки тяжелых цепочек мыши аналогично изолировали и клонировали перед константными доменами IgGI человека. Праймеры были следующими: 1. Смысловой VH (SEQ. ID. NO. 6) 5 'GCG GCT CCC ACGCGT GTC CTG TCC CAG 3' (подчеркнутая часть является сайтом Mlu I). 2. Антисмысловой VH (SEQ ID. NO. 7) 5' GG (G/C) TGT TGT GCTAGC TG (A/C) (A/G) GA GAC (G/A) GT GA 3' (подчеркнутая часть является сайтом Nhe I). См. фиг. 1 и 2 для соответствующих сайтов Mlu I и Nhe I в ТСАЕ 8 и фиг. 3 для соответствующих сайтов в анти-СD20 в ТСАЕ 8. Последовательность для этих тяжелых цепочек мыши представлена на фиг. 5 (SEQ. ID. NO. 8); см. также фиг. 3, нуклеотиды от 2401 до 2820. На фиг. 5 также показана последовательность аминокислот из этих вариабельных участков мыши, а также каркасных участков и участков CDR. Вариабельные участки тяжелых цепочек мыши из 2В8 находятся в семействе VH2B мыши. См. Kabat, выше. В. Приготовление химерного анти-СD20, выработанного трансфектомой яичника китайского хомяка и SP2/0 Клетки DG44 яичника китайского хомяка ("СНО") выращивали в среде SSFM II минус гипоксантина и тимидина (Gibco, Grand Island, NY, Form No 910456PK); клетки миеломы мыши SP2/0 выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла ("DMEM") ( Irvine Scientific, Santa Ana, Ca, Cat. No 9024) при добавлении 5% эмбриональной бычьей сывороткой и 20 мл/л глутамина. Четыре миллиона клеток электропорировали с плазмидой ДНК либо из 25 мг яичника китайского хомяка или из 50 мг SP2/0, которую разрезали с помощью Not I, используя систему электропорации ВТХ 600 (ВТХ, San Diego, CA) в 0,4 мл одноразовой кюветы. Применяли 210 вольт для яичника китайского хомяка или 180 вольт для SP2/0, 400 микрофарад, 13 Ом. Каждую электропорацию размещали на шесть планшетов с 96 ячейками (приблизительно 7000 клеток в ячейке). На планшеты наносили среду, содержащую G418 (GENETICIN, Gibco, Cat. No 860-1811) в 400 мг/мл активного соединения для яичника китайского хомяка (среда далее включала 50 мкМ гипоксантина и 8 мкМ тимидина) или 800 мг/мл для SР2/0. Электропорации проводили в последующие два дня и затем 2 или 3 дня до образования колоний. Супернатант из колоний исследовали на наличие химерного иммуноглобулина с помощью ЕLISА, специфического для антитела человека. Колонии, производящие наибольшее количество иммуноглобулина, размножали и помещали в 96ячеечные планшеты, содержащие среду плюс метотрексат (25 нМ для SР2/0 и 5 нМ для яичника китайского хомяка) и подавали среду каждые два или три дня. Исследовали супернатанты, как описано выше, а также колонии, производящие наибольшее количество иммуноглобулина. Химерное анти-СD20 антитело очищали от супернатанта, используя аффинную хроматографию белка А. Очищенное химерное анти-СD20 анализировали при помощи электрофореза в полиакриламидном геле и доводили очистку до более чем приблизительно 95%. Родство и специфичность химерного антитела определяли на основе 2В8. Химерное антитело анти-СD20 тестировали на связывание при прямых и конкурирующих испытаниях, и при сравнении с мышиным анти-СD20 моноклональным антителом 2В8 оно показало сравнимое родство и специфичность для ряда случаев СD20 положительных линий В-клеток (данные не представлены). Константу кажущегося сродства ("Кар") химерного антитела определяли путем прямого связывания меченного радиоактивными изотопами 1129 химерного анти-СD20 и сравнивали с меченным радиоактивными изотопами 2В8 по графику Scatchard; установленная константа Кар для химерного анти-СD20, полученного из яичника китайского хомячка, составила 5,2х10-9 М, а для антитела, полученного из SР2/0 - 7,4х10-9 М. Расчетная константа Кар для 2В8 составила 3,5х10-9 М. Использовали прямую конкуренцию при радиоиммунном анализе для подтверждения специфичности и сохранения иммунореактивности химерного антитела путем сравнения его способности эффективно конкурировать с 2В8. Потребовались достаточные эквивалентные количества химерных антител анти-СD20 и 2В8 для 50%-ного ингибирования связывания с антигенами СD20 на В-клетках (данные не представлены), то есть наблюдали минимальную потерю ингибирования активности антител анти-СD20, возможно благодаря химеризации. Результаты примера II.В показывают, что химерные антитела анти-СD20 были получены из трансферктом яичника китайского хомячка и SР2/0 с ис 14 27946 пользованием векторов ТСАЕ 8. Эти химерные антитела имели в основном ту же самую специфичность и способность к связыванию как мышиное моноклональное антитело 2В8 анти-СD20. С. Определение иммунoлогической активности химерных антител анти-СD20 i. Анализ С1q человека Химерные антитела анти-СD20, полученные из клеточных линий яичника китайского хомячка и SP2/0, оценивали на связывание C1q человека при анализе в проточной цитометрии с использованием флуоресцентного меченного C1q (C1q, получали от Quidel, Mira Mesa, CA, Prod. No A400, а метку FITC от Sigma, St. Louis МО, Prod. No F-7250; FITC). Мечение C1q производили согласно протоколу, описанному в Selected Methods In Cellular Immunology, Michell & Shiigi, Ed. (W.H. Freeman & Co., San Fracisco, CA, 1980, p. 292). Аналитические результаты получали с использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACScanTM (флуоресцию измеряли в диапазоне 515545 нм). Эквивалентные количества химерного антитела анти-СD20, lgG1 человека, К-белка миеломы (Binding Site, San Diego, Ca, Prod. No. BP078), и 2В8 инкубировали с эквивалентным количеством клеток SB, положительных к CD20, затем промывали буфером FACS (0,2% BSA в PBS, рН 7,4, 0,02% азида натрия) для удаления неприсоединившегося антитела и инкубировали с C1q, меченным FITC. После 30-60 минут инкубации клетки опять промывали. Три условия, включая C1q, меченный FITC в качестве контрольного, анализировали на FACScanTM и составляли инструкции для их получения. Результаты представлены на фиг. 6. Результаты на фиг. 6 показывают, что значительное увеличение флюоресценции наблюдали только при условии химерного антитела анти-СD20: то есть только клетки SB с прилегающим к ним химерным антителом анти-СD20 были положительны на C1q, в то время как при других условиях такую же структуру получали как контрольную. ii. Зависимый от комплемента лизис клетки Химерные антитела анти-СD20 анализировали на их способность лизировать клеточные линии лимфомы в присутствии сыворотки человека (источник комплемента). SB клетки, положительные к CD20, 51 помечали 51Cr путем смешивания 100 мкКи Сг с 1х106 SB клеток в течение 1 часа при 37°С. Меченные SB клетки инкубировали в присутствии эквивалентных количеств комплемента человека и эквивалентных количеств (0-50 г/мл) химерных антител анти-СD20 или 2В8 в течение 4 часов при 37(С (см., Brunner, К.Т. et al., "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labeled allogenic target cells in vitro." Immunology 14:181-189 (1968). Результаты представлены на фиг. 7. Результаты фиг. 7 показывают, что при этих условиях химерные антитела анти-CD20 произвели значительный лизис (49%). iii. Анализ эффектов клеточной цитотоксичности в зависимости от антитела Для этого исследования использовали СD20положительные клетки (SB) и CD20-отрицательные клетки (линия HSB лейкемии Т-клеток; см. Adams, Richard, Formal Discussion", Can. Res. 27:2479-2482 (1967); ATCC deposit No. ATCC CCL 120.1) и помечали их 51Сг. Анализ проводили согласно протоколу, описанному в Brunner, К.Т. et al., "Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51Cr-labeled allogenic target cells in vitro." Immunology 14:181-189 (1968). Наблюдали значительный лизис СD20положительных целевых SB клеток, зависимый от химерных антител анти-СD20 (меченных 51Сг) в коно це 4 часа инкубации при 37 С. Этот эффект наблюдали для антитела, полученного из яичника китайского хомячка и SP2/0 (клетками эффектора были периферические лимфоциты человека; соотношение клеток эффектора к мишени составляло 100:1). Эффективный лизис целевых клеток получали при 3,9 г/мл. Напротив, при тех же условиях мышиное моноклональное антитело 2В8 анти-СD20 давало статистически незначительный эффект и отсутствовал лизис СD20отрицательных клеток HSB. Результаты представлены на фиг. 8. Результаты примера II показывают, что химерные антитела анти-СD20 из примера I были иммунологически активны. III. Истощение клеток in vivo c помощью химерного анти-CD20 А. Исследование приматов кроме человека Проводили три отдельных исследования приматов кроме человека. Для удобства они обозначены здесь как "Химерное анти-СD20: СНО и SP2/0"; "Химерное анти-СD20: СНО" и "Высокая дозировка химерного анти-СD20". Условия были следующими. Химерное анти-СD20: СНО и SP2/0 Шесть обезьян cynomolgus весом от 4,5 до 7 кг (White Sands Research Center, Alamogordo, HM) разделили на три группы по две обезьяны в каждой. Оба животного каждой группы получали ту же самую дозу иммунологически активного химерного антитела антиСD20. Одно животное в каждой группе получало очищенное антитело, выработанное трансфектомой СНО; другое получало антитело, выработанное трансфектомой SP2/0. Три группы получали дозировки антитела, соответствующие 0,1 мг/кг, 0,4 мг/кг и 1,6 мг/кг ежедневно в течение четырех (4) последовательных дней. Химерное иммунологически активное антитело анти-СD20 смешивали со стерильным физиологическим раствором и вводили внутривенно. Образцы крови брали перед каждой инфузией. Дополнительные образцы крови брали, начиная с 24 часов после последней инъекции (Т=0) и после этого на 1, 3, 7, 14 и 28 дни. Затем брали образцы крoви с интервалом в две недели до завершения исследования на 90-й день. Приблизительно 5 мл цельной крови от каждого животного центрифугировали со скоростью 2000 об/мин в течение 5 минут. Плазму брали для анализа уровней растворимых химерных антител анти-СD20. Осадок (содержащий лейкоциты периферической крови и эритроциты крови) повторно суспендировали в сыворотке эмбриона жеребенка для анализа флуоресцентно меченного антитела (см. "Fluorescent Antibody Labeling of Lymphoid Cell Population" выше). Химерное анти-CD20: СНО Шесть обезьян cynomolgus весом от 4 до 6 килограммов (White Sands) разделяли на три группы по две обезьяны в каждой. Всем животным вводили иммунологически активные химерные антитела антиСD20, выработанные трансфектомой СНО (в стерильном физиологическом растворе). Три группы разделяли следующим образом: подгруппа 1 получала ежедневно внутривенные инъекции 0,01 мг/кг антитела с 15 27946 промежутком через четыре (4) дня; подгруппа 2 ежедневно получала внутривенные инъекции 0,4 мг/кг антитела с промежутком через четыре (4) дня; подгруппа 3 получала однократную внутривенную инъекцию 6,4 мг/кг антитела. У всех трех подгрупп образцы крови получали до начала лечения; дополнительные образцы крови также брали при Т=0, 1, 3, 7, 14 и 28 дней после последней инъекции. Эти образцы обрабатывали для анализа флуоресцентно меченного антитела (см. "Fluorescent Antibody Labeling of Lymphoid Cell Population" выше). Кроме определения количества В-клеток периферической крови, брали биопсии лимфоузлов на 7, 14 и 28 дни после последней инъекции, а также окрашивали препарат одной клетки для количественного определения популяций лимфоцитов при проточной цитометрии. Высокая дозировка химерного анти-СD20 Двум обезьянам cynomolgus (White Sands) вводили 16,8 мг/кг иммунологически активных химерных антител анти-СD20 из трансфектом СНО (в стерильном физиологическом растворе) еженедельно в течение четырех последовательных недель. После завершения лечения обоих животных анестезировали для удаления костного мозга, а также брали биопсию лимфоузлов. Оба набора тканей окрашивали для определения наличия В-лимфоцитов, используя Leu 16 для проточной цитометрии по протоколу, описанному в Ling, N.R. et al., "B-cell and plasm-cell antigens". Leucocyte Typing III White Cell Differentiations Antigens, A.J. McMichael, Ed. (Oxford Unilersity Press, Oxford UK 1987), p. 302. Флуоресцентное мечение антител лимфоидной клеточной популяции После удаления плазмы лейкоциты дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса ("HBSS") и повторно суспензировали в эквивалентном объеме плазмы эмбриональной бычьей сыворотки (инактивация при нагревании до 56°С в течение 30 минут). Препарат клетки в объеме 0,1 мл распределяли в каждую из шести (6) конических трубок для центрифугирования объемом 15 мл. Флуоресцентные меченные моноклональные антитела со специфичностью для маркеров CD2 на поверхности лимфоцитов человека (АМАС, West-brook, Я), CD20 (Becton Dickinson) и IgM человека (Binding Site, San Diego, CA) добавляли в 3 трубки для определения популяций Т- и В-лимфоцитов. Все реагенты предварительно тестировали на положительную реакцию соответствующих антигенов лимфоцитов обезьян. Химерное антитело анти-CD20, связанное с поверхностью В-клетки CD20 обезьяны, обнаружили в четвертой трубке, используя поликлональное козлиное антитело IgG человека, связанное с фикоэритрином (АМАС). Этот реагент предварительно адсорбировали на lg-сефарозной колонне для обезьяны, чтобы предотвратить взаимную реактивность к Ig обезьяны. Таким образом, осуществили специфическое обнаружение и количественное определение химерного анти-СD20 антитела, связанного с клетками. Пятая трубка содержала реагенты анти-lgМ и анти-lgG человека для двойного окрашивания популяции В-клеток. Шестой образец включали без реагентов для опреде ления аутофлуоресценции. Клетки инкубировали с флуоресцентными антителами в течение 30 минут, промывали и фиксировали в 0,5 мл буферного раствора для фиксаций (0,15 М NaCI, 1% параформальдегида, рН 7,4) и анализировали на приборе Becton Dickinson FACScanTM. Популяции лимфоцитов первоначально обнаруживали путем прямого перпендикулярного светорассеяния угла в точечнографическом растре с непомеченными лейкоцитами. Изолировали суммарную популяцию лимфоцитов, исключая все остальные популяции. Последующие измерения флюоресценции отражали только селективные, специфические для лимфоцитов явления. Иcтощение В-лимфоцитов периферической крови Не установлено никаких заметных для наблюдения отличий между эффективностью антител, производимых СНО и SP2/0, при истощении В-клеток in vivo, хотя наблюдали небольшое увеличение восстановления В-клеток после 7-го дня у обезьян, которым вводили химерные антитела анти-СD20, вырабатываемые трансфектомой СНО при уровне дозы, равной 1,6 мг/кг и 6,4 Мг/кг, а у обезьян, которым вводили антитело, вырабатываемое SP2/0 - при уровне дозы 0,4 мг/кг. На фиг. 9А, В и С представлены результаты, полученные при исследовании химерного анти-СD20: СНО и SP2/0. Фиг. 9А относится к уровню дозы 0,4 мг/кг; фиг. 9В - к: уровню дозы 1,6 мг/кг и фиг. 9С - к уровню дозы 6,4 мг/кг. Как видно из фиг. 9, катастрофическое сокращение (>95%) уровней В-клеток в периферической крови наблюдали после терапевтического лечения на всех тестируемых диапазонах дозы. Эти уровни сохранялись вплоть до семи (7) дней после инфузии. После этого периода времени начиналось восстановление В-клеток, причем время инициации восстановления не зависело от уровней доз. При исследовании химерного анти-СD20: СНО использовали в 10 раз меньшую дозу концентрации антитела (0,01 мг/г) для инъекций (общая 0,04 мг/кг) с интервалом четыре инъекции ежедневно. На фиг. 10 представлены результаты этого исследования. Такие дозы истощали популяцию В-клеток периферической крови до приблизительно 50% нормального уровня, определяемого с помощью либо анти-поверхностного lgМ или антитела Leu 16. Результаты также показывают, что насыщаемости антигена СD20 в популяции В-лимфоцита не достигали при использовании иммунологически активного химерного антитела антиСD20 при такой концентрации дозы и за такой времени для приматов кроме человека. В-лимфоциты, покрытые антителами, были обнаружены в образцах крови в течение первых трех дней после начала терапевтического лечения. Однако уже на седьмой день клетки, покрытые антителами, не были обнаружены. В табл. 1 обобщены результаты воздействия однократных и многократных доз иммунологически активного химерного антитела анти-СD20 на популяции клеток периферической крови. Однократная доза составляла 6,4 мг/кг, многократная доза - 0,4 мг/кг через четыре (4) последовательных дня (эти результаты получены от обезьян, описанных выше). 16 27946 Таблица 1 Популяция клеток периферической крови при исследовании введения приматам С2В8 Обезьяна Доза День CD2 Анти-Hu IgG Анти-Нu IcG+ Анти-Нu IgM* Leu-16 % Истощение В-клеток А 0,4 мг/кг предварительное обескровливание 0 81,5 86,5 0,2 0,3 9,4 0,0 0 97 (4 дозы) 7 (1 доза) 6.4 мг/кг D (1 доза) 78 28 предварительное обескровливание 0 85,5 4,1 66 81,7 94,6 0,1 0,2 14,8 0,1 0 99 922 0,1 0,1 0,1 99 84,9 : 6,9 53 28 предварительное обескровливание 7 84,1 8,7 41 77,7 85,7 0,0 0,1 0,2 0,1 17,0 0,0 0 99 86,7 14,7 15 28 предварительное обескровливание 7 76,7 8,1 62 85,7 94,7 0,1 0,1 0,1 0,2 14,4 0,0 0 99 85,2 9,2 46 28 6.4 мг/кг 99 2,1 21 С 1,2 21 (4 дозы) 0,1 21 0.4 мг/кг 0,0 93,3 7 В 85,5 21 85,9 6,7 53 * Двойное окрашивание популяции указывает на степень покрытия В-клетками химерными анти-CD-20 Данные, представленные в табл. 1, показывают, что истощение В-клеток периферической крови при условиях доступа антитела произошло быстро и эффективно, независимо от уровней однократной или многократной дозы. Кроме того, истощение наблюдалось в течение по крайней мере семи (7) дней после последней инъекции, а частичное восстановление В-клеток наблюдали на 21-й день. В табл. 2 представлено воздействие иммунологически активных химерных антител анти-СD20 на популяции клеток лимфоузлов при использовании режима лечения, приведенного в табл. 1 (4 ежедневных дозы по 0,4 мг/кг; 1 доза -6,4 мг/кг). Приводятся также сравнительные значения для здоровых лимфоузлов (контрольная обезьяна, подмышечный и паховый) и здорового костного мозга (две обезьяны). Таблица 2 Популяция клеток лимфоузлов Обезьяна Доза День CD2 Анти-Hu laG А 0,4 мг/кг (4 дозы) 7 14 28 75 14 28 77 14 28 66,9 76,9 61,6 9,4 83,2 84,1 5,5 74,1 66,9 19,6 19,7 9,9 15,7 17,9 23,1 В 0.4 мг/кг (4 дозы) С 6.4 мг/кг (1 доза) 17 Анти-Hu lgG+ % подавления Leu-16 Анти-Hu IgM В-лимфоцидов 7,4 40,1 1 0,8 22,6 44 26,0 36 29,9 52,2 0 0,7 14,5 64 14,6 64 22,3 35,2 13 1,1 23,9 41 21,4 47 27946 Продолжение таблицы 2 Анти-Hu lgG+ % подавления Leu-16 Анти-Hu IgM В-лимфоцидов 12,5 19,7 51 0,2 8,7 78 12,9 68 Обезьяна Доза День CD2 Анти-Hu laG D 6.4 мг/кг (1 доза) 7 14 28 83,8 74,1 84,1 17,9 12,8 55,4 52,1 25,0 31,2 41,4 39,5 нет данных нет данных 65,3 29,8 19,0 28,0 11,4 16,6 нет данных нет данных Здоровые Лимфоузлы Контрольный 1 Подмышечный Паховый Здоровый костный мозг Контрольный 2 Контрольный 3 Результаты табл. 2 показывают эффективное истощение В-лимфоцитов при обоих режимах лечения. Табл. 2 также показывает, что у приматов кроме человека не получают полной насыщаемости В-клеток в лимфатических тканях при применении иммунологически активного химерного антитела анти-СD20. Кроме того, на седьмой (7) день после лечения, наблюдая клетки, покрытые антителами, визуализировали заметное истощение В-клеток лимфоузлов на 14-й день. На основе этих данных проводили исследование введения однократной высокой дозы химерного антиСD20, причем основное внимание уделяли фармако логии и токсикологии. То есть это исследование проводили для оценки любой токсичности, связанной с введением химерного антитела, а также эффективности истощения В-клеток периферической крови лимфатических узлов и костного мозга. Кроме того, поскольку данные табл. 2 показывают, что при этом исследовании большая часть В-клеток лимфоузлов истощалась между 7 и 14 днями после начала лечения, то режим еженедельной дозировки может дать более эффективные результаты. В табл. 3 приведены исследования результатов введения высокой дозы химерного анти-СD20. Таблица 3 Популяции клеток лимфоузлов и костного мозга Популяции лимфоцитов (%) a b с Обезьяны CD2 Е 90,0 Паховый лимфоузел 5,3 4,8 6,5 22 F 91,0 6,3 5,6 6,3 22 G 89,9 5,0 3,7 5,8 36 Н 85,4 12,3 1,7 1,8 36 Е 46,7 4,3 2,6 2,8 22 F 41,8 3,0 2,1 2,2 22 G Н 35,3 25,6 0,8 4,4 1,4 4,3 1,4 4,4 36 36 CD20 mlgM+aнти-C2B8 C2B8 К-во днeй Костный мозг 18 d 27946 a Обозначает популяцию, окрашенную с Leu 16. Обозначает популяцию, окрашенную дважды, положительную для поверхностных IgM клеток и клеток, покрытых химерными антителами. c Oбозначает полное окрашивание популяции для химерного антитела, включая двойное окрашивание поверхностного IgM положительных клеток и одиночное окрашивание (поверхностный IgM отрицательных клеток). d Количество дней после инъекции окончательной дозы 16,8 мг/кг. При исследовании обоих животных на 22-й день после прекращения лечения обнаружили менее 5% В-кпеток по сравнению с 40% в контрольных лимфоузлах (см. табл. 2 выше). Аналогично в костном мозге животных, которым вводили химерное антитело анти-СD20, уровни СD20 положительных клеток составляли менее 3% по сравнению с 11-15% у здоровых животных (см. табл. 2 выше). Из животных, которых исследовали на 36-й день после прекращения лечения, одно животное (Н) имело приблизительно 12% В-клеток в лимфоузле и 4,4 % В-клеток в костном мозге, в то время как другое животное (G) приблизительно 5% В-клеток в лимфоузле и 0,8% в костном мозге. Эти данные подтверждают значительное истощение В-клеток. Результаты примера III.А подтверждают то, что введение низких доз иммунологически активного химерного анти-СD20 приводит к длительному истощению В-клеток периферической крови у приматов. Эти данные также указывают, что значительное истощение популяций В-клеток было достигнуто в периферических лимфоузлах и костном мозге при повторном введении высоких доз антитела. Продолжительный контроль тестируемых животных показал, что даже при таком серьезном истощении В-лимфоцитов периферической крови в течение первой недели лечения не наблюдали никаких неблагоприятных для здоровья эффектов. Кроме того, обнаруженное восстановление популяции В-клеток позволяет сделать вывод, что лечение не оказывало неблагоприятного воздействия на плюрипотентные стволовые клетки этих приматов. В. Клинический анализ С2В8 i. Клинические испытания С2В8 в фазе I/II: исследование терапии однократной дозой Пятнадцать пациентов, имеющие гистологически зарегистрированные рецидивы В-клеток лимфомы, получали С2В8 в фазе I/II при клиническом испытании. Каждый пациент получал однократную дозу С2В8 при исследовании с увеличением дозы. 2 Три пациента получили дозы: 10 мг/м ; 50 мг/м2; 2 2 2 100 мг/м ; 250 мг/м и 500 мг/м . Лечение проводили путем внутривенной инфузии через проходной фильтр размером 0,22 микрон С2В8, разбавленного 3 до окончательного объема 250 см или при максимальной концентрации 1 мг/мл стандартного физиологического раствора. Начальная скорость состав3 ляла 50 см /час в течение первого часа. Если не наблюдали никакой токсичности, то скорость введе3 ния дозы увеличивали до максимальной 200 см /час. Токсичность (как указывал специалист) располагалась в диапазоне от "нет" до "лихорадки" и до "замедленной" (два пациента), до "серьезной" (один пациент); все пациенты завершили терапевтическое лечение. Лимфоциты периферической крови анализировали для определения воз действия С2В8 на Т-клетки и В-клетки. Последовательно у всех пациентов наблюдали истощение В-лимфоцитов периферической крови, причем после инфузии С2В8 это истощение поддерживалось в течение более двух недель. Один пациент (получавший 100 мг/м2 С2В8) проявил частичный ответ на лечение С2В8 (снижение более чем на 50% суммы произведений перпендикулярных диаметров всех измеряемых индикатором поражений), продолжающийся более чем четыре недели, во время которых никакие новые поражения не появлялись, а ни одно из имеющихся поражений не увеличивалось. По крайней мере один пациент (получавший 2 500 мг/м ) обнаружил незначительный ответ на лечение С2В8 (снижение менее чем на 50%, но не менее 25% суммы произведений двух самых длинных перпендикулярных диаметров всех измеряемых индикатором поражений). Для демонстрации эффективности результаты РВLs представлены на фиг. 14; данные пациента, проявляющего РR, представлены на фиг. 14А: для пациента, проявляющего МR, данные приведены на фиг. 14В. На фиг. 14 указано: =лимфоциты; b □=СD3+клетки (Т-клетки); ▲=СD20+клетки; ●=СD19+клетки; = каппа; =лямбда и =С2В8. Очевидно, что маркеры В-клеток СD20 и СD19, каппа и лямбда истощались в течение более чем двух недель. Причем имелось небольшое первоначальное снижение количества Тклеток, которое вернулось к приблизительному исходному уровню за относительно короткий промежуток времени. ii. Клиническое испытание С2В8 в фазе I/II: исследование терапии многократной дозой Для этого исследования пригодны пациенты, имеющие гистологическое подтверждение лимфомы В-клеток с регистрацией прогрессирующей болезни. Исследование состоит из двух частей: в фазе I, включающей увеличение дозы для определения значения токсичности, ограничивающей дозу и для определений биологически активного допустимого уровня дозы, три пациента будут получать еженедельно внутривенно инфузии С2В8 в общем количестве из четырех (4) отдельных инфузии. Суммарная доза на каждом из трех уровней будет следую2 2 2 щей: 500 мг/м (125 мг/м /инфузии); 1000 мг/м 2 2 2 (250 мг/м /инфузии); 1500 мг/м (375 мг/м /инфузии). Определяют биологически активную допустимую дозу и самую низкую дозу допустимой токсичности и адекватной активности. В фазе II дополнительные пациенты получат биологически активную допустимую дозу с акцентом на определение активности четырех доз С2В8. IV. Комбинированная терапия: С2В8 И Y2B8 Способ комбинированной терапии с применением С2В8 и Y2B8 исследовали на ксенографической модели мыши (мыши nu/nu, самки, в возрасте приблизительно 10 недель) с использованием лимфобластической опухоли В-клеток (клетки опухоли Ramos). Для сравнения дополнительным мышам также вводили С2В8 и Y2B8. Клетки опухоли Ramos (АТСС, СРL 1596) содержали в культуре, используя RРМI1640, дополненный 10% эмбриональной сывороткой жеребенка 19 27946 и глутамином при 37°С и в 5% СО2. Опухоли инициировали в девяти самках голых мышей в возрасте около 7-10 не-дель путем подкожной инъекции 6 1,7х10 клеток Ramos в объеме 0,10 мл (НВSS), ис3 пользуя шприц объемом 1 см с иглой массой 25 г. Животных содержали под колпаком в ламинарном потоке и во всех клетках изымали продукты жизнедеятельности и подавали пищу и воду. Клетки опухоли пассировали после эксцизии опухоли и пропускания их через фильтр с 40 ячейками. Клетки промывали дважды с 1Х НВSS (50 мл) центрифугированием (1300 об/мин), повторно суспендировали в 6 1Х НВSS до 10х10 клеток/мл и замораживали до -70°С до использования. Для эксперимента размораживали клетки от нескольких замороженных серий, осаждали центрифугированием (1300 об/мин) и промывали дважды 1Х НВSS. Клетки затем повторно суспендировали до 6 приблизительно 2,0х10 клеток/мл. Приблизительно 9-12 мышей получали инъекцию 0,10 мл суспензии 3 клеток с использованием шприца объемом 1 см с иглой весом 25 г. Инъекции производили приблизительно в среднюю области левого бока животного. Опухоли развивались приблизительно через две недели. Опухоли иссекали и обрабатывали, как описано выше. Исследуемые мыши получали инъекции 6 1,67х10 клеток в 0,10 мл; НВSS, как описано выше. На основе предварительных экспериментов по дозированию определено, что 200 мг С2В8 и 100 мКи Y2B8 будут использовать для исследования. Девяносто самок мышей nu/nu (приблизительно 10недель-ного возраста) получали инъекции клеток опухоли. Приблизительно десять дней спустя брали для исследования четыре группы из 24 мышей по шесть мышей в группе, причем поддерживали сравнимое распределение размера опухоли в каждой группе (средний размер опухоли, выраженный как произведение длины на ширину опухоли, составлял 2 приблизительно 80 мм ). Следующие группы получали инъекции, как указано, через хвостовую вену, используя шприц Гамильтона объемом 100 мкл с иглой весом 25 г: А - стандартный физиологический раствор; В - Y2B8 (100 мКи); С - С2В8 (200 мкг); D - Y2B8 (100 мКи)+С2В8 (200 мкг). Группы, тестируемые на С2В8, получали вторую инъекцию С2В8 (200 мкг/мышь) спустя семь дней после начальной инъекции. Измерения опухоли проводили через каждые два или три дня, используя кавернометр. Подготовка материалов для введения производилась согласно следующим протоколам. А. Подготовка Y2B8 Хлорид иттрия-[90] (6 мКи) помещали в полипропиленовую трубку и доводили рН до 4,1-4,4 с помощью не содержащего металла 2М ацетата натрия. Добавляли и осторожно перемешивали при встряхивании 2В8-МХ-DТРА (0,3 мг в стандартном физиологическом растворе; см. выше для приготовления 2В8-МХ-DТРА). После 15 минут инкубации реакцию гасили путем добавления 0,05 на объем 20 мМ ЕDТА и 0,05 на объем 2М ацетата натрия. Концентрацию радиоактивности определяли путем растворения 5,0 мкл реакционной смеси в 2,5 мл 1хРВS, содержащего 75 мг/мл НSА и 1 мМ DТРА ("рецептурный буфер"). Подсчет выполняли, добавляя 10,0 мкл к 20 мл коктейля сцинтилляции Есоlumе. Остаток реакционной смеси добавляли к рецептурному буферу объемом 3,0 мл, стерильно фильтровали и сохраняли при 2-8°С до использования. Определяли удельную активность (14 мКи/мг на время инъекции) с использованием концентрации радиоактивности и рассчитанной концентрации белка, основанной на количестве антитела, добавляемого в реакционную смесь. Связанную с белком радиоактивность определяли, используя моментальную тонкослойную хроматографию. Включение радионуклидов составило 95%. Y2B8 разбавляли в рецепторном буфере непосредственно перед применением и стерильно фильтровали (окончательная концентрация радиоактивности составила 1,0 мКи/мл). В. Приготовление 02В8 С2В8 приготавливали, как описано выше. С2В8 получали в виде стерильного реагента в стандартном физиологическом растворе при 5,0 мг/мл. Перед инъекцией С2В8 разбавляли в стандартном физиологическом растворе до 2,6 мг/мл и стерильно фильтровали. С. Результаты После лечения размер опухоли представляли в виде произведения длины на ширину, а измерения проводили по дням, указанным на фиг. 11 (Y2B8 по сравнению с физиологическим раствором), фиг. 12 (С2В8 по сравнению с физиологическим раствором); и фиг. 13 (Y2B8+С2В8 по сравнению с физиологическим раствором). Также определяли стандартную погрешность. Как указано на фиг. 13, комбинация Y2B8 и С2В8 проявила эффекты уничтожения опухолевых клеток, сравнимые с эффектами, проявляемыми как Y2B8, так и С2В8. V. Стратегии альтернативной терапии С точки зрения предшествующих примеров очевидны стратегии альтернативной терапии. Одна из таких стратегий заключается в использовании терапевтической дозы С2В8, после чего в пределах приблизительно одной недели вводят комбинацию либо 2В8 и меченного радиоактивными изотопами 2В8 (например, Y2B8); или 2В8, С2В8 и, например, Y2B8; или С2В8 и, например, Y2B8. Дополнительная стратегия заключается в использовании меченных радиоактивными изотопами С2В8. Такая стратегия позволяет использовать преимущества иммунологически активного участка С2В8 и преимущества, связанные с радиоактивной меткой. Предпочтительные радиоактивные метки включают иттрий-[90], имеющий больший период полураспада при циркуляции С2В8 по сравнению с мышиным антителом 2В8. Благодаря способности С2В8 истощать В-клетки, а также благодаря преимуществам использования радиоактивной метки, предпочтительная альтернативная стратегия заключается в введении пациенту однократных доз или многократных доз С2В8 для истощения большей части или всех периферических В-клеток. Это потребовало бы применения меченного радиоактивными изотопами 2В8. В результате истощения В-клеток периферической крови меченное радиоактивными изотопами 2В8 обладает повышенной возможностью поражать клетки опухоли. Предпочтительно используют 2В8, меченное йодом[131]. В литературе имеются сообщения о результатах применения этой метки (см. Каminski). Меченное радиоактивными изотопами 2В8 (или С2В8) также 20 27946 применяют вначале для увеличения проницаемости опухоли с последующим однократным или многократным введением С2В8. Цель этой стратегии заключается в увеличении возможности попадания С2В8 как в наружную, так и во внутреннюю массу опухоли. Дальнейшая стратегия включает применение хемотерапевтических агентов в комбинации с С2В8. Эти стратегии включают так называемое "поражающее" лечение хемотерапевтическим агентом с последующим введением С2В8, сопровождаемым повторением этого протокола. В качестве альтернативы возможно проведение начального лечения однократными или многократными дозами С2В8 и последующего хемотерапевтического лечения. Предпочтительные хемотерапевтические агенты включают (но не ограничены): циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон, см. Armitage, J.O. et al., Cancer 50:1695 (1982), приведенные здесь в качестве ссылки. Вышеописанные альтернативные стратегии терапии не ограничивают изобретение, а иллюстрируют его. VI. Информация о депозитах Анти-СD20 в ТСАЕ 8 (трансформированный в Е. coli для депозита) был внесен в Американскую Коллекцию Культур Тканей (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования штаммов микроорганизмов для патентной процедуры ("Будапештский Договор"). Микроорганизм тестировали в АТСС 9 ноября 1992 года и определи его жизнеспособность на эту дату. АТСС присвоил этому микроорганизму следующий номер штамма АТСС: АТСС 69119 (анти-СD20 в ТСАЕ 8) Гибридому 2В8 регистрировали в АТСС 22 июня 1993 года согласно Будапештскому договору. Жизнеспособность культуры определили на 25 июня 1993 года и зарегистрировали в АТСС эту гибридому под следующем номером AТСC: HB 11388. G. Характеристика последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (i) Авторы : Anderman Darrell, Henna Nabil, Laonard John, Newman Roland и Mitchell Reft и William H Rastetlei (ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЛИМФОМЫ В-КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНЫХ И МЕЧЕННЫХ РАДИОАКТИВНЫХ АНТИТЕЛ В В-ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА С ОГРАНИЧЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЕЙ АНТИГЕНА (iii) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 8 (iv) АДРЕС: (A) Адресат: Фармацевтическая Корпорация АЙДЕК (B) Улица: 11011 Торреяна Роуд (C) Город: Сан Диего (D) Штат: Калифорния (Е) Страна: США (F) Почтовый индекс: 92121 (v) КОМПЬЮТЕРНАЯ ЧИТАЕМАЯ ФОРМА: (A) Тип носителя: Дискета, 3.5 дюйм, 1.44 МБ (B) Компьютер: Макинтош (C) Операционная система: MS DOS (D) Программное обеспечение: Microsoft Word 5.0 (vi) ДАННЫЕ О НАСТОЯЩЕЙ ЗАЯВКЕ: (A) Номер заявки: (B) Дата подачи: (C) Классификация: (viii) ИНФОРМАЦИЯ О ПАТЕНТНОМ ПОВЕРЕННОМ/АГЕНТЕ: (А) Имя: Burgoon, Richard P. Jr. (B) Номер регистрации: 34,787 (C) Номер дела: (ix) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ: (А) Телефон: (619) 550-8500 (В) Телефакс: (619) 550-8750 (2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID № 1 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 8546 оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Цепочка: одиночная (D) Топология: круговая (ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (iii) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: да (iv) АНТИ-СМЫСЛОВАЯ: нет (iх) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID № 1 21 27946 22 27946 23 27946 24 27946 25 27946 (3) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID № 2 (i) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) Длина: 9209 оснований (В) Тип: нуклеиновая кислота (С) Цепочка: одиночная (D) Топология: круговая (ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: ДНК (геномная) (iii) ГИПОТЕТИЧЕСКАЯ: да (iv) АНТИ-СМЫСЛОВАЯ: нет (ix) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID № 2 26 27946 27 27946 28 27946 29 27946 30