Полівалентна менінгококова полісахаридно-білкова кон’югована вакцина

1. Імунологічна композиція, яка містить комбінацію з чотирьох окремих і роздільно приготованих кон’югатів капсульного полісахариду з білком, причому перший кон’югат містить імунологічно ефективну кількість очищеного капсульного полісахариду N.meningitidis серогрупи W-135, кон’югованого з вказаним білком-носієм, який являє собою анатоксин дифтерії, другий кон’югат містить імунологічно ефективну кількість очищеного капсульного полісахариду N.meningitidis серогрупи Y, кон’югованого з вказаним білком-носієм, третій кон’югат містить імунологічно ефективну кількість очищеного капсульного полісахариду UA (21) 2003087937 (22) 22.01.2002 (24) 25.11.2010 (86) PCT/US02/01963, 22.01.2002 (31) 60/263,435 (32) 23.01.2001 (33) US (46) 25.11.2010, Бюл.№ 22, 2010 р. (72) РАЙЕЛЛ РОБЕРТ П., US (73) АВЕНТІС ПАСТЕР, US (56) CAMPAGNE G. ET AL: "Safety and immunogenicity of three doses of a Neisseria meningitidis A + diphtheria conjugate vaccine in infants from Niger." PEDIATRIC INFECTIOUS DISEASE JOURNAL, (2000) 19/2 (144-150). , XP008015581. WO A 9845312, 15.10.1998. US 6146902, 14.11.2000. Lei Q.P. et al. "Quantification of free polisaccaride in meningococcal polysaccharide-diphtheria toxoid conjugate vaccines". Dev Biol. Basel, Karger, 2000, vol. 103, pp. 259-264. Lindberg Alf A. "Polyosides (encapsulated bacteria)" C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/ Life Sciences/ - 1999. 922. p. 925-932. Lindberg Alf A."Glycoprotein conjugate vaccines". Vaccine 17 (1999) S28-S36. WO 9006696, 28.06.1990. Lamb D.H. et al.:"Capillary electrophoretic analysis of meningococcal polysaccharide - diphtheria toxoid conjugate vaccines". - Dev Biol. Basel, Karger, 2000, vol. 103, pp.251-258. Campagne C. et al.:"Development of a meningococcal A/C conjugate vaccine". 46th Annual meeting December 7 - December 11, 1997. Кулініч Л.Я., Воловник С.В. Довідник з біології за ред. к.бн. Брайона О.В. та к.б.н. Мотузного В.О.. К.: Радянська школа. - 1986. - с.38.). Peter C Fusco et al.: "Meningococal vaccine developmen: a novel approach" (1998) Д5 MMWR Recommendatin and Report "Preventation and control of Meningococcal Disease…" June 30, 2000. 2 (19) 1 3 92579 4 N.meningitidis серогрупи А, кон’югованого з вказаним білком-носієм, і четвертий кон’югат містить імунологічно ефективну кількість очищеного капсульного полісахариду N.meningitidis серогрупи С, кон’югованого з вказаним білком-носієм, де капсульний полісахарид кожної серогрупи зв’язаний з білком-носієм через лінкер, що являє собою дигідразид адипінової кислоти. 2. Імунологічна композиція за п. 1, в якій перший кон’югат містить приблизно 4 мкг очищеного капсульного полісахариду N.meningitidis серогрупи W135, другий кон’югат містить приблизно 4 мкг очищеного капсульного полісахариду N.meningitidis серогрупи Y, третій кон’югат містить приблизно 4 мкг очищеного капсульного полісахариду N.meningitidis серогрупи А, а четвертий кон’югат містить приблизно 4 мкг очищеного капсульного полісахариду N.meningitidis серогрупи С. 3. Імунологічна композиція за п. 1, яка додатково містить ад’ювант. 4. Імунологічна композиція за п. 3, де вказаний ад’ювант включає алюмінієвий ад’ювант. 5. Імунологічна композиція за п. 4, в якій алюмінієвим ад’ювантом є гідроксид алюмінію. 6. Імунологічна композиція за п. 1, отримана у вигляді стерильної рідини. 7. Імунологічна композиція за п. 1, яка додатково містить фармацевтично прийнятний консервант. 8. Імунологічна композиція за п. 7, в якій вказаний фармацевтично прийнятний консервант вибраний з переліку, що включає бензиловий спирт, парабени, тіомерсал, хлорбутанол та бензалконію хлорид. Дана патентна заявка затверджує перевагу попередньої заявки США № 60263435, поданої 23 січня 2001 р. Передумови створення винаходу Область, до якої відноситься винахід Даний винахід в загальному випадку відноситься до медицини, а більш точно, до мікробіології, імунології, вакцин і профілактики інфекції, викликаної бактеріальним патогеном, за допомогою імунізації. Опис попереднього рівня техніки У всьому світі Neisseria meningitidis є основною причиною бактеріального менінгіту і сепсисів. Частка ендемічних менінгококових захворювань протягом останніх тридцяти років знаходиться в межах від 1 до 5 на 100000 в розвинених країнах і від 10 до 25 на 100000 в країнах, що розвиваються. (Reido, F.X., et. al. 1995). Під час епідемій частка менінгококових захворювань наближається до 1000 на 1000000. У Сполучених Штатах щорічно відбувається приблизно 2600 випадків бактеріального менінгіту і в середньому 330000 випадків в країнах, що розвиваються. Рівень смертності знаходиться в межах від 10 до 20%. Патогенні менінгококи взяті в полісахаридну капсулу, прикріплену до зовнішньої поверхні мембрани організму. На основі імунологічної специфічності капсульних полісахаридів було ідентифіковано тринадцять серогруп менінгококів. П'ять з даних тринадцяти серогруп викликають більшість менінгококових захворювань; вони включають в себе серогрупи А, В, С, W-135, і Y. Серогрупа А відповідальна за більшість епідемічних захворювань. Серогрупи В, С, і Υ викликають більшість ендемічних захворювань і локальних спалахів. Носоглоткова слизова оболонка людини є єдиним відомим природним резервуаром Neisseria meningitidis. Утворення колоній відбувається як на зовнішній поверхні клітин слизової оболонки, так і в субепітеліальній тканині носоглотки. Носійство менінгокока може продовжуватись протягом декількох місяців. Поширення менінгокока відбувається внаслідок прямого контакту або повітрянокраплинним шляхом. Менінгококи проникають в організм крізь слизовий епітелій через фагоцитар ні вакуолі в результаті ендоцитозу. Захисна сила організму при інвазії менінгокока залежить від комплемент-залежного лізису бактерій. Антитіла сироватки, які відповідальні за комплементзалежний лізис бактерії, в більшості випадків направлені проти зовнішніх капсульних полісахаридів. Описані вакцини, основані на менінгококових полісахаридах, що викликають імунну відповідь на капсульні полісахариди. Такі антитіла мають здатність до комплемент-залежного лізису менінгококів певних серологічних груп. Показано, що полісахаридні менінгококові вакцини ефективні у дітей і дорослих (Peltola, Η., et.al. 1977 and Artenstein, M.S., et.al. 1970), але ефективність обмежена у новонароджених і дітей раннього віку (Reingold, A.L., et.al. 1985). Подальші дози полісахариду в групі дітей раннього віку викликали слабку бустерну відповідь, або не викликали її. (Goldschneider, І., et.al. 1973 and Gold, R., et.al. 1977). Тривалість захисту, викликаного полісахаридними менінгококовими вакцинами, не є тривалою і складає приблизно від 3 до 5 років у дорослих і дітей старше 4 років (Brandt, В., et.al. 1975, Kayhty, Η., et.al. 1980, and Ceesay, S.J., et.al. 1993). У дітей у віці від року до чотирьох років тривалість захисту складає менше трьох років (Reingold, A.L., et.al. 1985). Полісахариди не здатні зв'язуватись з молекулами головного комплексу гістосумісності, що є необхідною умовою для презентації антигену лімфоцитам Т-хелперам і їх стимуляції, тобто, вони є Т-незалежними антигенами. Полісахариди здатні стимулювати B-лімфоцити до вироблення антитіл без допомоги лімфоцитів Т-хелперів. Як результат Т-незалежної стимуляції B-лімфоцитів після імунізації цими антигенами відсутня індукція пам'яті. Полісахаридні антигени здатні викликати дуже ефективні Т-незалежні відповіді у дорослих, але такі Т-незалежні відповіді слабкі у незрілої імунної системи немовлят і дітей раннього віку. Т-незалежні полісахаридні антигени можуть бути перетворені в Т-залежні антигени за допомогою ковалентного приєднання полісахаридів до молекул білка («носіїв» або «білків-носіїв»). Bклітини, які зв'язують полісахаридні компоненти 5 кон'югованої вакцини, можуть активуватись за допомогою клітин Т-хелперів, специфічних для пептидів, що є частиною кон'югованого білка-носія. Відповідь Т-хелперів на білок-носій забезпечує збільшення вироблення антитіл на полісахариди. Показано, що полісахариди серогрупи В є практично неімуногенними в популяціях людини (Wyle, F.Α., et.al. 1972). Хімічне приєднання полісахариду даної серогрупи до білків не змінює значуще імунну відповідь у лабораторних тварин (Jennings, H.J., et.al. 1981). Вважається, що причиною відсутності імунної відповіді на полісахарид цієї серогрупи є структурна схожість між полісахаридом серозгрупи В і полісіальованими глікопротеїнами хазяїна, такими як молекули адгезії нервових клітин. Описана менінгококова кон'югована вакцина, основана на полісахариді серогрупи С. Така моновалентна вакцина викликає сильну функціональну антитільну відповідь на капсульний полісахарид, присутній у штамі N.meningitidis, відповідному серогрупі С. Ця вакцина здібна тільки до захисту від захворювання, викликаного бактеріями серогрупи С. Існуючі вакцини, основані на менінгококових полісахаридах, мають обмежене застосування серед дітей раннього віку і не забезпечують довгострокового захисту дорослих. Єдина менінгококова вакцина, яка, як було показано, здатна викликати тривалий захист при ризику менінгококової інфекції у всіх груп, включаючи дітей, основана на полісахариді однієї серогрупи N.meningitidis і не забезпечує захист від інфекції іншими серогрупами. Таким чином, існує необхідність у менінгококовій кон'югованій вакцині, здатній надати широкий і тривалий захист дітей і дорослих від менінгококових захворювань при ризику менінгококової інфекції. Полівалентні менінгококові полісахариди згідно з винаходом вирішують цю проблему шляхом надання лікарських форм вакцин, в яких імуногенні полісахариди головних потагенних серогруп N.meningitidis перетворені у Т-залежні антигени за допомогою кон'югації з білками-носіями. Суть винаходу Даний винахід надає імунологічні препарати для терапії, основані на кон'югатах білка з полісахаридом менінгокока патогенної Neisseria meningitidis. Даний винахід надає імунологічні препарати, що складаються з двох або більше кон'югатів полісахариду з білком, причому кожний з кон'югатів містить капсульні полісахариди Neisseria meningitidis, кон'юговані з білком-носієм. Даний винахід надає імунологічні препарати, що складаються з двох або більше окремих кон'югатів полісахариду з білком, причому кожний з кон'югатів містить капсульні полісахариди різних серогруп Neisseria meningitidis, кон'югованих з білком-носієм. Даний винахід надає менінгококові вакцини, основані на кон'югатах білка з полісахаридом патогенної Neisseria meningitidis. Даний винахід надає полівалентні менінгококові вакцини, що складаються з імунологічно ефективної кількості від двох до чотирьох окремих кон'югатів полісахариду 92579 6 з білком, причому кожний з кон'югатів містить різні капсульні полісахариди, кон'юговані з білкомносієм, і кожний капсульний полісахарид відібраний з групи, що складається з капсульних полісахаридів серогруп А, С, W-135 і Y. Даний винахід також надає спосіб виробництва полівалентного менінгококового полісахариднобілкового препарату, що складається з очищення двох або більше капсульних полісахаридів патогенної Neisseria meningitidis; кон'югування очищеного полісахариду з одним або більше білкаминосіями і комбінування кон'югатів для приготування полівалентного менінгококового полісахариднобілкового препарату. Даний винахід додатково надає спосіб включення імунної відповіді на капсульний полісахарид N.meningitidis, що полягає у введенні імунологічно ефективної кількості імунологічного препарату згідно з винаходом людині або тварині. Даний винахід надає полівалентну менінгококову вакцину, що складається з імунологічно ефективної кількості від двох до чотирьох окремих кон'югатів полісахариду з білком, причому кожний з кон'югатів містить різні капсульні полісахариди, кон'юговані з білком-носієм, і кожний капсульний полісахарид відібраний з групи, що складається з капсульних полісахаридів серогруп А, С, W-135 і Y. Даний винахід надає спосіб захисту людини або тварини, сприйнятливої до інфекції N.meningitidis, що полягає у введенні імунологічно ефективної дози вакцини згідно з винаходом людині або тварині. Всі патенти, що цитуються, патентні заявки та інші публікації включені тут повністю у вигляді посилання. Докладний опис винаходу Даний винахід включає в себе імунологічні препарати двох або більше окремих кон'югатів полісахариду з білком, причому кожний з кон'югатів складається з капсульного полісахариду, кон'югованого з білком-носієм. Таким чином, даний винахід включає в себе препарати, які містять два або більше різних капсульних полісахаридів, кон'югованих з одним або більше білком-носієм (носіями). Капсульні полісахариди можуть бути приготовані стандартними способами, відомими фахівцям в даній області техніки (див. Список літератури). У даному винаході представлені капсульні полісахариди, приготовані з N.meningitidis серогруп А, С, W-135 і Y. У переважному варіанті здійснення винаходи такі кон'югати менінгококових серогруп виготовляються в окремих технологічних процесах і оформляються у вигляді однієї дози вакцини. Наприклад, капсульні полісахариди N.meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ очищаються окремо. У переважному варіанті здійснення даного винаходу очищені полісахариди деполімеризуються і активуються до кон'югації з білком-носієм. У переважному варіанті здійснення даного винаходу капсульні полісахариди N.meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ частково деполімеризуються у м'яких умовах окислення. 7 Після деполімеризації або часткової деполімеризації полісахаридів може йти етап активації. Під "активацією" мається на увазі хімічна обробка полісахариду для забезпечення хімічних груп, здатних до реакції з білком-носієм. Переважний спосіб активації включає в себе обробку дигідразидом адипінової кислоти у фізіологічному розчині з pH 5,0±0,1 протягом приблизно двох годин при температурі від 15 до 30°С. Один з методів активації описаний у патентній заявці США 5965714. Після активації капсульні полісахариди можуть потім бути кон'юговані з одним або більше білками-носіями. У переважному варіанті здійснення згідно з винаходом кожний капсульний полісахарид кон'югується окремо з одним типом білканосія. У переважному варіанті здійснення винаходу капсульні полісахариди N.meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ - кожний окремо - кон'югуються з одним і тим же типом білка-носія. Білки-носії можуть включати в себе інактивовані бактеріальні токсини, такі як дифтерійний анатоксин, CRM197, анатоксин правця, анатоксин коклюшу, Е.соlі LT, Е.соlі ST і екзотоксин A Pseudomonas aeruginosa. Також можуть застосовуватись білки зовнішньої мембрани бактерій, такі як зовнішній мембранний комплекс С (ОМРС), порини, трансферин-зв'язувальні білки, пневмолізин, поверхневий білок А пневмококу (PspA) або білок поверхневої адгезії пневмококу (PsaA). Як білкиносії можуть застосовуватись інші білки, такі як овальбумін, гемоціанін лімфи слимака (KLH), бичачий сироватковий альбумін (ВSA) або очищене білкове похідне туберкуліну (PPD). Білки-носії переважно є білками, які нетоксичні і нереактогенні і доступні у достатній кількості і достатньої чистоти. Білки-носії повинні піддаватись стандартним способам зшивання. У переважному варіанті здійснення даного винаходу як білок-носій застосовується дифтерійний токсин, очищений з культур Corynebacteria diphtheriae і хімічно детоксифікований із застосуванням формальдегіду. Після зшивання капсульного полісахариду з білком-носіем кон'югати полісахариду з білком можуть бути очищені (збагачені відносно кількості кон'югата полісахариду з білком) різними способами. Однією з цілей етапу очищення є видалення непов'язаного полісахариду з кон'югата полісахариду з білком. Один з методів очищення, що включає в себе ультрафільтрацію у присутності сульфату амонію, описаний у патентній заявці США 6146902. Як альтернатива, кон'югати можуть бути очищені від білка і полісахариду, які не прореагували, будь-яким зі стандартних способів, включаючи, серед інших, ексклюзійну хроматографію, центрифугування у градієнті щільності, хроматографію гідрофобної взаємодії або фракціонування у сульфаті амонію. Див., наприклад, P.W. Anderson, et.al. (1986). J. Immunol. 137:1181-1186. Див. також H.J. Jennings and С. Lugowski (1981) J. Immunol. 127;1011-1018. Після кон'югації полісахариду і білка-носія імунологічні препарати згідно з винаходом готуються шляхом об'єднання різних кон'югатів полісахариду з білком. Імунологічні препарати згідно з винаходом містять два або більше різні капсульні поліса 92579 8 хариди, кон'юговані з одним або більше білкомносієм (носіями). Переважний варіант здійснення згідно з винаходом пов'язаний з бівалентним імунологічним препаратом, що складається з капсульних полісахаридів N.meningitidis серогрупи А або С, окремо кон'югованих з анатоксином дифтерії. Більш переважно, даний винахід є тетравалентним імунологічним препаратом, що складається з капсульних полісахаридів N.meningitidis серогруп А, С, W-135 і Y, окремо кон'югованих з анатоксином дифтерії. Способи приготування і застосування білківносіїв і різні можливі способи кон'югації добре відомі фахівцям в даній області техніки. Кон'югати згідно з винаходом можуть бути приготовані фахівцями в даній області техніки з використанням вказівок, що містяться в даному винаході, також як інформації, легко доступної в літературі загального призначення. Вказівки також можуть бути отримані з будь-якої або всіх наступних патентних заявок США, описи яких включені в даний опис повністю у вигляді посилання: США 4356170; США 4619828; США 5153312; США 5422427 і США 5445817. Імунологічні препарати згідно з винаходом отримують шляхом окремого приготування кон'югатів білка з полісахаридом для різних серогруп менінгокока і подальшого об'єднання кон'югатів. Імунологічні препарати згідно з винаходом можуть застосовуватись як вакцини. Лікарські форми вакцин згідно з винаходом можуть бути виконані із застосуванням стандартних способів даної області техніки. Препарати вакцин згідно з винаходом можуть також містити один або більше ад'ювантів. Ад'юванти включають, як приклад, але не обмеження, алюмінієві ад'юванти, ад'ювант Фройнда, BAY, DC-chol, рсрр, монофосфорил ліпід A, CpG, QS-21, токсин холери і форміл-метіоніловий білок. Див., наприклад, Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach, 1995 (M.F. Powell and M.J. Newman, edc, Plenum Press, NY). Ад'юванти переважно є алюмінієвими ад'ювантами, такими як гідроксид алюмінію або фосфат алюмінію. Як показано нижче, вакцини та імунологічні препарати згідно з даним винаходом викликають Т-залежну імунну відповідь на різних тваринних моделях, тоді як полісахаридна вакцина викликає Т-незалежну імунну відповідь. Таким чином, препарати згідно з винаходом є також інструментами дослідження, придатними для вивчення біологічних шляхів і процесів, залучених до Т-незалежних імунних відповідей на антигенні N.meningitidis. Кількість вакцини згідно з винаходом для застосування у людини або тварини і режим застосування можуть бути визначені згідно зі стандартними способами, добре відомими фахівцям у фармацевтичній і ветеринарній області, з урахуванням таких факторів як конкретний антиген, ад'ювант (якщо присутній), вік, стать, вага, вид і стан конкретної тварини або пацієнта і спосіб застосування. У даному винаході для забезпечення ефективних доз для вакцинації від N.meningitidis кількість полісахариду і білка-носія може знаходитись приблизно в межах від 0,02 мкг до приблизно 5 мкг на кг ваги. У переважних препараті і способі 9 згідно з винаходом дози знаходяться приблизно в межах від 0,1 мкг до 3 мкг на кг ваги. Наприклад, для ефективного дозування буде потрібно тим менше антитіл, чим коротше постінфекційний період, так як у бактерій буде менше часу для проліферації. Таким же чином ефективне дозування буде залежати від бактеріального навантаження в момент встановлення діагнозу. Можуть бути розглянуті для терапевтичного застосування множинні ін'єкції, що застосовуються з інтервалом декілька днів. Полівалентні кон'югати згідно з винаходом можуть застосовуватись у вигляді однієї дози або у вигляді серій (тобто з «бустерною дозою» або «бустерними дозами»). Наприклад, діти можуть отримувати одну дозу в ранньому дитинстві, потім вводиться бустерна доза у віці до десяти років, як в цей час рекомендується для інших вакцин для попередження дитячих захворювань. Бустерна доза генерує антитіла з примованих B-клітин, тобто, анамнестичну відповідь. Тобто полівалентна кон'югована вакцина викликає сильну первинну (тобто наступну за одиничним застосуванням вакцини) функціональну антитільну відповідь у групі дітей раннього віку у порівнянні з ліцензійною полісахаридною вакциною і здатна викликати анамнестичну відповідь (тобто наступну після застосування бустерної дози), тим самим демонструючи, що захисна імунна відповідь, яка викликається полівалентною кон'югованою вакциною згідно з винаходом, є тривалою. Препарати згідно з винаходом можуть включати в себе рідкі форми для застосування через природні анатомічні отвори, тобто оральне, назальне, вагінальне, пероральне, інтрагастральне, мукозне (тобто через лінгвальну, альвеолярну, ясенну, нюхову або респіраторну слизові оболонки) застосування і т.д., лікарські форми, такі як суспензії, сиропи або еліксири; і форми для парентерального, підшкірного, інтрадермального, внутрішньом'язового, внутрішньоочеревинного або внутрішньовенного застосування (тобто застосування шляхом ін'єкції), такі як стерильні суспензії і емульсії. Переважним є внутрішньовенне і парентеральне застосування. Такі препарати можуть бути змішані з відповідним носієм, розріджувачем або наповнювачем, таким як стерильна вода, фізіологічний розчин, глюкоза або подібне до них. Препарати також можуть бути ліофілізованими. В залежності від бажаного способу застосування і приготування, препарати можуть містити допоміжні речовини, такі як зволожуючі або емульгуючі агенти, pH забуферюючі агенти, желатинуючі або збільшуючі в'язкість домішки, консерванти, смакові агенти, барвники і т.п. Для розробки відповідних способів виготовлення без зайвих експериментів може бути використане стандартне керівництво, наприклад, «REMINGSTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE», 17-е видання, 1985, включене тут у вигляді посилання. Препарати згідно з винаходом для зручності представлені у вигляді рідких форм, наприклад, ізотонічних водних розчинів, суспензій, емульсій або в'язких сумішей, які можуть бути забуферені до вибраного рівня pH. Якщо переважна абсорбція 92579 10 у шлунковому тракті, препарати згідно з винаходом можуть бути "твердими": у вигляді пілюль, таблеток, капсул, каплет і т.п., включаючи "тверді" форми із затриманим вивільненням активного інгредієнта або такі, що мають рідкий наповнювач, тобто рідину, покриту желатином, желатин розчиняється в шлунку для доставки препарату в кишечник. Якщо бажане назальне застосування або застосування через дихальні шляхи, препарати можуть бути у формі спрей-дозатора і розподілятись з його допомогою, у вигляді помпового дозатора або аерозольного дозатора. Аерозолі звичайно знаходяться під тиском, що створюється вуглеводнем. Помпові дозатори переважно можуть видавати відміряні дози або дози, що мають певний розмір частинок. Рідкі форми звичайно готувати легше, ніж гелі, інші в'язкі препарати і тверді препарати. До того ж рідкі препарати частково є більш зручними для застосування, особливо у вигляді ін'єкції або орально, для тварин, дітей, особливо маленьких дітей, та інших, хто може мати складності з ковтанням пілюль, таблеток, капсул і т.п., або у випадках застосування у вигляді мультидоз. З іншого боку, в'язкі препарати можуть бути у вигляді лікарських форм з відповідним рівнем в'язкості для забезпечення більш тривалого контакту зіслизовою оболонкою, такою як внутрішня оболонка шлунка або слизова оболонка носа. Очевидно, вибір відповідного носія та інших домішок буде залежати виключно від способу застосування і природи конкретної форми дозування, наприклад, для рідкої форми дозування (тобто якщо лікарська форма препарату повинна бути розчином, суспензією, гелем або іншою рідкою формою), або твердої форми дозування (тобто якщо лікарська форма препарату повинна бути пілюлями, таблетками, капсулами, каплетами, формою із затриманим вивільненням активного інгредієнта або формою з рідким наповнювачем). Розчини, суспензії і гелі звичайно містять переважно воду (переважно очищену воду), в доповнення до активних інгредієнтів. Може бути присутньою незначна кількість інших інгредієнтів, таких як регулятори pH (наприклад, така основа як NaOH), емульгатори або диспергуючі агенти, агенти буферизації, консерванти, зволожувальні агенти, желатуючі агенти, (наприклад, метилцелюлоза), барвники і/або смакові домішки. Препарати можуть бути ізотонічними, тобто вони можуть мати такий же осмотичний тиск, як і кров або слізна рідина. Бажана ізотонічність препаратів згідно з винаходом може бути досягнута застосуванням виннокислого натрію, пропіленгліколю або іншого неорганічного або органічного розчину. Хлорид натрію є особливо переважним для буферів, що містять іони натрію. В’язкість препаратів може підтримуватись на вибраному рівні застосуванням фармацевтично допустимого згущувального агента. Метилцелюлоза є переважною, так як вона легко доступна, економічна і проста у роботі. Інші відповідні згущувальні агенти включають в себе, наприклад, ксантанову смолу, карбоксиметилцелюлозу, гідроксип 11 ропілцелюлозу, карбомер і т.п. Переважна концентрація згущувача буде залежати від вибраного агента. Важливим моментом є застосування такої кількості, при якій буде досягнута вибрана в'язкість. В'язкі препарати звичайно готуються з розчинів за допомогою додавання таких згущувальних агентів. Для збільшення терміну зберігання препаратів може бути використаний фармацевтично прийнятний консервант. Може бути придатним бензиловий спирт, хоча також можуть застосовуватись різні консерванти, включаючи, наприклад, парабени, тіомерсал, хлорбутанол, бензалконію хлорид. Відповідна концентрація консерванту знаходиться в межах від 0,02% до 2%, в залежності від загальної ваги, хота можуть бути і істотні відмінності, в залежності від вибраного агента. Фахівцям в даній області техніки повинно бути очевидним, що компоненти препаратів повинні бути хімічно інертними по відношенню до кон'югатів полісахариду N.meningitidis з білком-носієм. Даний винахід додатково описується наступними ілюстративними, не обмежувальними прикладами, в яких викладено в деталях декілька переважних варіантів здійснення концепції даного винаходу. Інші приклади даного винаходу повинні бути очевидними для фахівців в даній області техніки в рамках концепції даного винаходу. Приклади Приклад 1 Виготовлення порошків очищених капсульних полісахаридів Neisseria meningitidis серогруп А. С, W-135 і Υ Виготовлення неочищеної пасти Заморожені у вологому стані посівні культури Neisseria meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ окремо: розморожували і переносили в рідке поживне середовище Watson Scherp і висівали в бутлі Blake, що містять як субстрат агар Mueller Hinton. Бутлі Blake інкубували при 35-37°С в атмосфері СО2 протягом 15-19 годин. Після періоду інкубації культуру витягували з бутлів Blake і додавали в 4л-флакони, що містять поживне середовище Watson Scherp. Флакони інкубували при 35-37°С протягом 3-7 годин на платформному шейкері. Вміст 4л-флаконів переносили у ферментер, що містить поживне середовище Watson Scherp. Ферментер інкубували при 35-37°С протягом 7-12 годин з додатковим живленням і антипінними домішками, контролюючи вміст розчиненого кисню і pH. Після періоду інкубації вміст ферментера переносили в 500 л резервуар, додавали цетавлон і матеріал перемішували протягом 1 години. Культуру, оброблену цетавлоном, центрифугували приблизно при 15000 до 17000 xg і швидкості потоку приблизно від 30 до 70 л на годину. Проводили повторне осадження неочищеного полісахариду з супернатанту цетавлоном. До супернатанту додавали цетавлон і матеріал перемішували протягом щонайменше 1 години при кімнатній температурі. Матеріал зберігався при температурі 1-5°С протягом 8-12 годин. Осаджений полісахарид збирали шляхом центрифугування при приблизно 45000-50000 xg і швидкості потоку від 300 до 400 мл на хвилину. Зібрана маса 92579 12 зберігалась при -60°С або нижче до подальшої обробки. Приготування порошку очищеного полісахариду Інактивовану масу розморожували і переносили у змішувач. Масу перемішували з 0,9 Μ хлоридом кальцію до отримання гомогенної суспензії. Суспензію центрифугували приблизно при 10000 xg протягом 15 хвилин. Супернатант декантували через безворсову серветку в посудину як первинний екстракт. У пасту додавали другий об'єм 0,9 Μ хлориду кальцію і перемішували до отримання гомогенної суспензії. Суспензію центрифугували, як описано вище, супернатант об'єднували з супернатантом першої фракції. Усього було виконано чотири екстракції, а супернатанти об'єднані. Об'єднані екстракти концентрували за допомогою ультрафільтрації із застосуванням 10-30 кДа MWCO Spiral Would модулів ультрафільтрації. У концентрат додавали хлорид магнію, а pH доводили до 7,2-7,5, використовуючи гідроксид натрію. У концентрат додавали ДНКазу і РНКазу та інкубували при 25-28°С при перемішуванні протягом 4 годин. Додавали етанол до концентрації 30-50%. Осаджені нуклеїнові кислоти і білки видаляли шляхом центрифугування при 10000 xg протягом 2 годин. Супернатант відділяли і осаджували полісахарид, додаючи етанол до 80% і відстоюючи протягом ночі при температурі 1-5°С. Спирт відкачували сифоном і осаджений полісахарид центрифугували протягом 5 хвилин при 10000 xg. Осаджений полісахарид промивали спиртом. Полісахарид промивали ацетоном і центрифугували протягом 15-20 хвилин при 10000 xg. Полісахарид сушили під вакуумом. Вихідний порошок полісахариду розводили в розчині ацетату натрію. Додавали хлорид магнію і pH доводили до 7,2-7,5 розчином гідроксиду натрію. У розчин додавали ДНКазу і РНКазу та інкубували при температурі 2528°С при перемішуванні протягом 4 годин для видалення залишкових нуклеїнових кислот. Після інкубації з цими ферментами додавали рівний об'єм розчину ацетат натрію-фенол в суміш полісахарид-фермент і вміщували на платформний шейкер при температурі 1-5°С приблизно на 30 хвилин. Суміш центрифугували при 10000 xg протягом 15-20 хвилин. Витягували верхній водний шар, зберігаючи його. Рівний об'єм розчину ацетат натрію-фенол додавали в рідкий шар і екстрагували, як описано вище. Усього було виконано чотири екстракції для видалення білка і ендотоксину з розчину полісахариду. Об'єднані водні екстракти десятиразово розбавляли водою для ін'єкцій і проводили діаліз проти 10 об'ємів води для ін'єкцій. Додавали хлорид кальцію до діалізованого полісахариду. Додаванням етанолу до 80% полісахариду осаджували протягом ночі при температурі 1-5°С. Супернатант спирту видаляли і полісахарид збирали шляхом центрифугування при 10000 xg протягом 15 хвилин. Очищений полісахарид двічі промивали етанолом і один раз ацетоном. Промитий порошок сушили під вакуумом в сушильній шафі. Висушений порошок зберігали при 30°С або нижче до проведення кон'югації. 13 Приклад 2 Деполімеризація порошку очищеного капсульного полісахариду Neisseria meningitidis серогруп A, Cf W-135 і Υ Матеріали, що застосовуються у приготуванні, включають в себе порошки очищеного полісахариду Neisseria meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ (приготованих згідно з прикладом 1), стерильний 50 мМ буфер ацетату натрію, pH 6,0, стерильну 1 н соляну кислоту, стерильний 1 н гідроксид натрію, 30% перекис водню і стерильний фізіологічний розчин (0,85% хлориду натрію). Полісахарид кожної серогрупи деполімеризували в окремій реакції. Резервуар з нержавіючої сталі наповнювали 60 г порошку очищеного полісахариду. До полісахариду додавали 50 мМ стерильний буфер ацетату натрію, pH 6,0, до отримання концентрації 2,5 г полісахариду на літр. Розчин полісахариду перемішували при температурі 1-5°С протягом 12-24 годин для поліпшення розчинення. Реакційний резервуар з'єднували з теплообмінником. Додатково додавали 50 мМ буфер ацетату натрію, pH 6,0, для розбавлення полісахариду до реакційної концентрації 1,25 г на літр. Розчин полісахариду нагрівали до 55°С±0,1. У реакційну суміш додавали аліквоту 30% перекису водню для отримання реакційної концентрації перекису водню 1%. Хід реакції контролювали за зміною розміру молекули полісахариду з плином часу. Кожні 15-20 хвилин аліквоти витягували з реакційної суміші і вводили в колонку HPSEC для вимірювання розміру молекули полісахариду. Коли розмір молекули полісахариду досягав необхідного молекулярного розміру, нагрівник вимикали і розчин полісахариду швидко охолоджували до температури 5 °С за допомогою циркуляції через баню з крижаною водою. Розчин деполімеризованого полісахариду концентрували до 15 г на літр, приєднуючи реакційний резервуар до пристрою для ультрафільтрації, оснащеного картриджами з регенерованою целюлозою. Розчин концентрованого деполімеризованого полісахариду діалізували проти 10 об'ємів стерильного фізіологічного розчину (0,85% хлориду натрію). Деполімеризований полісахарид зберігали при температурі 1-5°С до наступного етапу технологічного процесу. Розмір молекули деполімеризованого полісахариду визначали за допомогою пропущення через хроматографічну колонку гель-фільтрації, що продаються під торговою маркою «Ultahydrogel™250», які калібрувались з використанням декстранових стандартів молекулярного розміру і статичного розсіювання лазерного світла під декількома кутами. Кількість полісахариду визначали за вмістом фосфору для серогрупи А, використовуючи спосіб Bartlet, G.R.J. (1959) Journal of Biological Chemistry, 234, pp.466-468, і за вмістом сіалової кислоти для серогруп С, W-135 і Y, використовуючи спосіб Svennerholm, L. (1955) Biochimica Biophysica Acta 24, pp.604-611. Вміст оацетилу визначали способом Hesterin, S. (1949) Journal of Biological Chemistry 180, p.249. Залишкову активність визначали способом Park, J.T. and Johnson, M.J. (1949 Journal of Biological Chemistry 92579 14 181, pp.149=151). Структурну цілісність деполімеризованого полісахариду визначали за допомогою 1 Н- і 13С-ЯМР білка. Чистоту деполімеризованого полісахариду визначали, вимірюючи вміст LAL (ендотоксину) і вміст залишкового перекису водню. Приклад 3 Одержання дериватизованого деполімеризованого полісахариду Neisseria meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ Матеріали, використані при приготуванні, включають в себе капсульний полісахарид серогруп А, С, W-135 і Υ Neisseria meningitidis деполімеризований перекисом водню (приготований згідно з прикладом 2), дигідразид адипінової кислоти, 1етил-3-(3-диметиламінопропіл)карбодіімід (EDAC) тільки для серогрупи А, ціанборгідрид натрію, стерильну 1 н соляну кислоту, стерильний 1 н гідроксид натрію, стерильний 1 Μ хлорид натрію і стерильний фізіологічний розчин (0,85% хлорид натрію). Дериватизований полісахарид кожної серогрупи одержували в окремій реакції. Резервуар з нержавіючої сталі заповнювали очищеним деполімеризованим полісахаридом і розбавляли стерильним 85% фізіологічним розчином до досягнення реакційної концентрації 1 г на літр. Тільки для серогрупи А додавали EDAC як концентровану аліквоту, розчинену в стерильному 0,85% фізіологічному розчині, до досягнення реакційної концентрації 1 г на літр. Доводили pH до 5,0+0,1, і підгримували pH на цьому рівні протягом 2 годин, використовуючи стерильну 1 н соляну кислоту і стерильний 1 н гідроксид натрію, при кімнатній температурі (від 15 до 30°С). Через 2 години в реакційну суміш додавали концентровану аліквоту ціанборгідриду натрію, розчинену в 0,85% фізіологічному розчині, до досягнення реакційної концентрації 2 г на літр. Реакція проходила при перемішуванні при кімнатній температурі (від 15 до 30°С) протягом 44 годин ±4 години, pH підтримувався на рівні 5,5±0,5. Після вказаного реакційного періоду pH доводили до 6,0+0,1 і дериватизований полісахарид концентрували до 12 г полісахариду на літр, приєднавши реакційний резервуар до пристрою для ультрафільтрації, оснащеного 3000 MWCO картриджами з регенерованою целюлозою. Концентрований дериватизований полісахарид діалізували проти 30 об’ємів 1 Μ хлориду натрію, потім 10 об'ємів 0,15 Μ хлориду натрію. Резервуар від'єднувати від пристрою для ультрафільтрації і зберігали при температурі 1-5°С протягом 7 днів. Резервуар знов приєднували до пристрою для ультрафільтрації, оснащеного 3000 MWCO картриджами з регенерованою целюлозою, і діалізували проти 30 об'ємів 1 Μ хлориду натрію, потім 10 об'ємів 0,15 Μ хлориду натрію. Розмір молекули одержаного дериватизованого полісахариду, кількість полісахариду і вміст оацетилу вимірювали тими ж способами, які застосовувались при деполімеризації полісахариду. Вміст гідразиду вимірювали за допомогою методу з використанням 2,4,6-тринітробензенсульфонової кислоти за Snyder, S.L. and Sobocinski, P.Z. (1975) Analytical Biochemistry 64, pp.282-288. Структурну цілісність одержаного дериватизованого полісахариду визначали за допомогою 1Н- і 13С-ЯМР білка. 15 Чистоту одержаного дериватизованого полісахариду визначали шляхом вимірювання рівня непов'язаного гідразиду, вмісту LAL (ендотоксину) і вмісту залишкового ціанборгідриду. Приклад 4 Приготування білка-носія Приготування неочищеного білка анатоксину дифтерії Ліофілізовані посівні культури відновлювали та інкубували протягом 16-18 годин. Аліквоту культури вміщували в 0,5 літровий флакон, що містить поживне середовище для зростання, і флакон з культурою інкубували при температурі 34,5-36,5°С на ротаційному шейкері протягом 7-9 годин. Аліквоту з флакона з культурою переносили в 4-х літровий флакон, що містить поживне середовище для зростання, і флакон з культурою інкубували при температурі 34,5-36,5°С на ротаційному шейкері протягом 14-22 годин. Культури з 4-х літрового флакона використали для інокуляції ферментера, що містить середовище для зростання. Ферментер інкубували при температурі 34,5-36,5°С протягом 70-144 годин. Вміст ферментера відфільтровували через об'ємний фільтр в посудину-колектор. В урожай додавали аліквоту розчину формальдегіду, 37%, до досягнення концентрації 0,2%. Доводили pH до 7,4-7,6. Урожай відфільтровували через картридж 0,2 мікронного фільтра в стерильні 20-літрові бутлі. Бутлі інкубували при температурі 34,5-36,5°С протягом 7 днів. У кожний 20-літровий бутель додавали аліквоту розчину формальдегіду, 37%, до досягнення концентрації 0,4%. Доводили pH сумішей до рівня 7,4-7,6. Бутлі інкубували на шейкері при температурі 34,5-36,5°С протягом 7 днів. У кожний 20-літровий бутель додавали аліквоту розчину формальдегіду, 37%, до досягнення концентрації 0,5%. Доводили pH суміші до 7,4-7,6. Бутлі інкубували при температурі 34,5-36,5°С протягом 8 тижнів. Неочищений анатоксин тестували на рівень детоксикації. Бутлі зберігали при температурі 1-5 °С в період тестування. Очищення неочищеного білка анатоксину дифтерії Неочищений анатоксин нагрівали до кімнатної температури і вміст 20-літрових бутлів об'єднували в резервуарі для очищення. Доводили pH анатоксину до 7,2-7,4 і додавали вугілля в неочищений анатоксин і перемішували протягом 2 годин. Суміш вугілля і анатоксину відстоювали протягом години і потім відфільтровували через картридж з об'ємним фільтром у другий резервуар очищення. У фільтрат додавали твердий сульфат амонію до досягнення 70% насичення. Доводили pH до 6,87,2 і розчин відстоювали протягом 16 годин. Осаджені білки збирали шляхом фільтрації і промивали розчином сульфату амонію 70% насичення, pH 7,0. Осад розчиняли в стерильній дистильованій воді і розчин білка відфільтровували в посудинуколектор з нержавіючої сталі. Доводили pH до 6, 87,2 і додавали сульфат амонію до 40% насичення. Доводили pH розчину до 7,0-7,2 і розчин відстоювали протягом 16 годин. Осад відділяли шляхом фільтрації і видаляли. У фільтрат додавали сульфат амонію до 60% насичення і pH доводили до 7,0=7,2. Суміш відстоювали протягом 16 годин і 92579 16 осаджені білки збирали шляхом фільтрації. Осад розчиняли у стерильній дистильованій воді, відфільтровували для видалення нерозчинених білків і діалізували проти 0,85% фізіологічного розчину. Концентрування і стерильне фільтрування очищеного білка анатоксину дифтерії Розчин білка концентрували до 15 г на літр і діалізували проти 10 об'ємів 0,85% фізіологічного розчину, використовуючи 10000 MWCO картридж з фільтром з регенерованої целюлози. Концентрований розчин білка стерилізували шляхом фільтрації через 0,2-мікронну мембрану. Розчин білка зберігали при температурі 1-5°С до проведення кон'югації. Концентрацію білка визначали методом Lowry, O.H. et.al. (1951) Journal of Biological Chemistry 193, p.265-275. Чистоту білка визначали на стерильність, вміст LAL (ендотоксин) і вміст залишкового формальдегіду. Приклад 5 Приготування моновалентних кон'югатів полісахариду з білком анатоксину дифтерії Neisseria meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ Матеріали, використані при приготуванні, включають в себе дериватизований адипіновою кислотою полісахарид Neisseria meningitidis серогруп А, С, W-135 і Υ адипінової кислоти (приготовану згідно з прикладом 3), стерильний білок анатоксину дифтерії (приготований згідно з прикладом 4), EDAC, сульфат амонію, стерильну 1 н соляну кислоту і стерильний фізіологічний розчин (0,85%). Кон'югат полісахариду кожної серогрупи одержували в окремій реакції. Всі чотири кон'югати готували наступним способом. Резервуар з нержавіючої сталі заповнювали очищеним дериватизованим адипіновою кислотою полісахаридом при реакційній концентрації від 700 до 1000 мкмолей реактивного гідразиду на літр і очищеним білком анатоксину дифтерії з реакційною концентрацією від 3,8 до 4,0 г білка на літр. Використали фізіологічний розчин 0,85% для розбавлення вихідних матеріалів до потрібної реакційної концентрації і pH доводили до 5,0±0,1. До суміші білка з полісахаридом додавали аліквоту EDAC до досягнення реакційної концентрації від 2,28 до 2,4 г на літр. pH реакції підтримували на рівні 5,0±0,1 протягом 2 годин при температурі 15-30°С. Через 2 години pH доводили до 7,0±0,1, використовуючи стерильний 1 н гідроксид натрію, і підтримували реакційну суміш при температурі 1-5°С протягом 16-20 годин. Реакційну суміш нагрівали до температури 1530°С і реакційний резервуар приєднували до пристрою для ультрафільтрації, оснащеного картриджами з регенерованою целюлозою. Додавали твердий сульфат амонію до 60% насичення (для серогруп A, W-135 і Y) і до 50% насичення (для серогрупи С). Реакційну суміш кон'югата діалізували проти 20 об'ємів розчину сульфату амонію 60% насичення (для серогруп A, W-135 і Y) і розчину сульфату амонію 60% насичення (для серогрупи С), потім 20 об'ємів фізіологічного розчину, 0,85%. Діалізований кон'югат був відфільтрований перший раз через фільтраційну капсулу, що містить 1,2-мікронний і 0,45-мікронний фільтри, потім 17 через другу фільтраційну капсулу, що містить 0,22мікронний фільтр. Кількість полісахариду і вміст о-ацетилу вимірювали тими ж способами, які застосовували при деполімеризації і одержанні похідних полісахариду. Кількість білка визначали способом Lowry. Розмір молекули кон'югата визначали, пропускаючи через хроматографічну колонку гель-фільтрації, що продається під торговою маркою «TSK6000PW», в якій використовувались ДНК як маркер мертвого об'єму, АТФ як маркер повного об'єму і бичачий тиреоглобулін як референсний маркер. Додатково, розмір молекули кон'югата, елюйованого з колонки TSK6000PW, вимірювали за допомогою статичного розсіювання лазерного світла під декількома кутами. Антигенні властивості кон'югата вимірювали за зв'язуванням з антитілами до полісахаридів даної серогрупи, використовуючи метод ELISA «подвійний сендвіч». Чистоту кон'югатів визначали, вимірюючи кількість непов'язаного (некон'югованого) полісахариду шляхом елюювання через хроматографічну колонку з гідрофобним носієм, вимірюючи кількість некон'югованих білків за допомогою капілярного електрофорезу, перевіркою на стерильність, вимірюючи вміст LAL (ендотоксин), вміст залишкового EDAC і вміст залишкових іонів амонію. Приклад 6 Формування полівалентної менінгококової вакцини з кон'югата дифтерійного анатоксину з полісахаридом менінгокока А, С, W-135 і Υ Матеріали, використані у приготуванні, включають в себе кон'югати анатоксину дифтерії з полісахаридом серогруп А, С, W-135 і Υ (приготовані згідно з прикладом 5), фізіологічний розчин (0,85% хлорид натрію, забуферений стерильним 100 мМ фосфатом натрію). У фізіологічний розчин (0,85%), що знаходиться в резервуарі-колекторі з нержавіючої сталі, додавали аліквоту стерильного фізіологічного розчину, забуференого 100-500 мМ фосфатом натрію, до одержання кінцевої концентрації фосфату натрію у вакцині 10 мМ. У резервуар-колектор, що містить 10 мМ стерильний фізіологічний розчин фосфату натрію, додавали аліквоту кожного з двох-чотирьох стерильних моновалентних кон'югатів анатоксину дифтерії з полісахаридом менінгокока до одержання кінцевої концентрації 8 мкг полісахариду кожної серогрупи на мілілітр буфера. Сформований тетравалентний кон’югат перемішували і відфільтровували через 0,2 мкм фільтр у другий резервуар-колектор. Кількість вмісту полісахариду кожної серогрупи в полівалентній композиції визначали за допомогою аналізу компонентного складу сахаридів, використовуючи іонообмінну хроматографію з високим значенням pH з імпульсним амперометричним детектором. Кількість білка вимірювали способом Lowry. pH вакцини вимірювали, використовуючи комбінацію електродів, сполучених з pH-метром. Антигенні характеристики полівалентної кон'югованої вакцини вимірювали за зв'язуванням з антитілами до полісахаридів даної серогрупи, використовуючи спосіб ELISA «подвійний сендвіч». Імуногенність полівалентної кон'югованої вакцини 92579 18 вимірювали за здатністю кожного кон'югату, що знаходиться у вакцині, викликаючи як основну, так і бустерну анти-полісахаридну IgG-імунну відповідь на тваринних моделях. Чистоту полівалентної кон'югованої вакцини визначали, вимірюючи кількість непов'язаного (некон'югованого) полісахариду, використовуючи іонообмінну хроматографію з високим значенням pH з імпульсним амперометричним детектором, вміст LAL (ендотоксин), вміст пірогенів; перевіркою на стерильність, перевіркою на загальну безпеку. Приклад 7 Приготування полівалентного кон'югата білка анатоксину дифтерії з полісахаридом менінгокока, ад'ювованого гідроксидом алюмінію Приготування кон'югата абсорбованого гідроксидом алюмінію. Матеріали, використані в приготуванні, включають в себе кон'югати анатоксину дифтерії з полісахаридом серогруп А, С, W-135 і Y, приготування описане у прикладі 5, стерильний фізіологічний розчин (0,85% хлорид натрію) і стерильний гідроксид алюмінію в фізіологічному розчині (0,85% хлорид натрію). У резервуар-колектор, що містить біологічний розчин, додавали аліквоту кожного з моновалентних кон'югатів анатоксину дифтерії зі стерильним полісахаридом менінгокока до одержання кінцевої концентрації 8 мкг полісахариду кожної серогрупи на мілілітр буфера. У полівалентну кон'юговану вакцину додавали аліквоту стерильного гідроксиду алюмінію у фізіологічному розчині (0,85% хлориду натрію) до досягнення кінцевої концентрації 0,44 мг іонів алюмінію на мілілітр вакцини. Приклад 8 Приготування кон'югата, ад'ювованого фосфатом алюмінію Матеріали, використані при приготуванні, включають в себе кон'югати анатоксину дифтерії з полісахаридом серогруп А, С, W-135 і Y, приготовані, як описано в прикладі 5, стерильний фізіологічний розчин (0,85% хлорид натрію) і стерильний фосфат алюмінію в фізіологічному розчині (0,85% хлорид натрію). У резервуар-колектор, що містить біологічний розчин, додавали аліквоту кожного з кон'югатів анатоксину дифтерії зі стерильним моновалентним полісахаридом менінгокока до досягнення кінцевої концентрації 8 мкг полісахариду кожної серогрупи на мілілітр буфера. У вакцину полівалентного кон'югата додавали аліквоту стерильного фосфату алюмінію в фізіологічному розчині (0,85% хлориду натрію) до досягнення кінцевої концентрації 0,44 мг іонів алюмінію на мілілітр вакцини. Приклад 9 Імуногенність тетравалентної кон'югованої вакцини Тетравалентну кон'юговану вакцину досліджували на її здатність викликати імунну відповідь у маленьких лабораторних тварин перед клінічним використанням. Для вивчення імуногенності кон'югованої вакцини відносно полісахаридної вакцини використовувались миші, щури і кролики. Ці тваринні моделі корисні, так як вони дають можливість відрізнити кон'юговану вакцину від відповідної полісахаридної за характером імунної відповіді. 19 92579 Кон'югована вакцина викликає Т-залежну імунну відповідь в цих моделях, тоді як полісахаридна вакцина викликає Т-незалежну імунну відповідь. При вивченні імуногенності на мишах кон'югат розбавляли фізіологічним розчином (0,85% хлориду натрію) для застосування від однієї четвертої до однієї шістнадцятої дози для людини. Мишам вводили одну або дві дози вакцини, або кон'югованої, або полісахаридної, і через два тижні після вакцинації брали зразки крові. Одна група мишей служила як неімунізована контрольна група. Антитіла до кожної серогрупи полісахаридів вимірювали в тесті ELISA. Зразки сироватки інкубували з надлишком кожного капсульного полісахариду, пов'язаного з ямкою мікротитрувального планшета ELISA. Для скріплення полісахариду кожної серогрупи з ямки мікротитрувального планшета використовувався метильований альбумін сироватки людини. Після інкубації ямки мікротитрувального планшета промивали буфером і до комплексу антитіло-полісахарид додавали кон'югат вторинне антитіло-фермент, який зв'язувався з антитілом до полісахариду менінгокока. Мікротитрувальний планшет промивали і додавали хімічний субстрат до кон'югату антитіло-полісахарид менінгококавторинне антитіло-фермент. Фермент гідролізує частину хімічного субстрату, який в результаті забарвлюється. Кількість забарвленої субстанції пропорціонально кількості кон'югата антитілополісахарид менінгокока-вторинне антитілофермент, пов’язаного з ямкою мікротитрувального планшета. Силу вакцини визначали шляхом порів 20 няння з референсною антисироваткою для кожної серогрупи, яку вимірювали на такому ж мікротитрувальному планшеті, методом розрахунку паралельних з використанням чотирипараметричної оцінки. Референсна антисироватка миші проводилась на тій же лінії мишей, які окремо імунізувались трьома дозами кон'югованої вакцини для кожної серогрупи. Референсній антисироватці миші присвоїли титри, як зворотне значення розведення, що дає оптичну щільність 1,0. Дані, представлені в таблиці 1, є зведенням анти-полісахаридних IgG-титрів для кожної серогрупи, отриманих на мишах Swiss-Webster, вакцинованих двома дозами або тетравалентною кон'югованою вакциною, у вигляді лікарських форм як рідкої, так і з хлоридом амонію, або відповідною тетравалентною полісахаридною вакциною. IgGтитри вимірювали у змішаній сироватці у групи мишей чисельністю десять штук. Дві групи по десять мишей використали для вимірювання імунної відповіді на кожну лікарську форму вакцини. Обидві групи вакцинували в перший день. На 15 день (через два тижні після вакцинації) взяли зразки крові у однієї групи з 10 мишей, а другу групу з 10 мишей вакцинували другою дозою вакцини на 15 день. Через два тижні, на 29 день, взяли зразки крові у другої групи з 10 мишей і у неімунізованої контрольної групи. Всі антитіла відтитрували в один і той же час, у двох груп, 15-и денній і 29-и денній, зразки крові аналізували в один і той же час разом з неімунізованим контролем і мишачою референсною сироваткою. Таблиця 1 Титри анти-полісахаридних IqG об'єднаної сироватки мишей Swiss-Webster, вакцинованих або тетравалентним кон'югатом, або полісахаридом Доза мкг ps Кон'югат (не ад'ювант) 0,25 Кон'югат (без ад'юва- 0,50 нта) Кон'югат (без ад'юва1,0 нта) Кон'югат (гідроксид 0,25 алюмінію ) Кон'югат (гідроксид 0,50 алюмінію) Кон'югат (гідроксид 1,0 алюмінію) Полісахарід (без 1,0 ад'юванта) Неімунізовані нд Група вакцини Anti-Men A Anti-Men C 15 днів 29 днів 15 днів 29 днів 131 2640 250 1510 171 6220 416 2050 Anti-Men W-135 15 днів 29 днів 1350 6100 849 26000 Anti-Men Y 15 днів 29 днів 5660 4830 5980 112000 249 4500 525 2740 1450 16600 11300 59100 2920 4500 1010 2980 2300 33700 11600 124000 5800 9550 2280 1010 4810 71900 26400 330000 6210 9350 2630 12800 7870 94000 32700 302000 136 173 184 205 612 608 4470 3910 110 145 623 777 Тетравалентна кон'югована вакцина, як без ад'юванта, так і ад'ювована гідроксидом алюмінію, здатна викликати сильну анти-полісахаридну IgGімунну відповідь в даній мишачій моделі. Ад'ювант, гідроксид алюмінію, служить для поліпшення як первинної, так і бустерної відповідей на кожний з чотирьох кон'югатів серогруп полісахариду. Тетравалентна полісахаридна вакцина викликає незначну імунну відповідь на серогрупи А, С, W-135 в даній мишачій моделі у порівнянні з неімунізованою контрольною групою, тоді як серогрупа Υ дійсно викликає значну імунну відповідь, але не викликає бустерної відповіді. У цій моделі тетравалентна полісахаридна вакцина не викликає бустерну відповідь на всі чотири серогрупи полісахаридів. Дана модель дає можливість легко відрізняти полісахаридну вакцину від кон'югованої вакцини як за силою імунної відповіді, так і за 21 92579 характером бустерної відповіді для кон'югованої вакцини кожної серогрупи. Неад'ювовану форму тетравалентної кон'югованої вакцини вивчали у клінічних умовах на безпеку і імуногенність на молодих здорових дорослих і здорових дітях молодшого віку. При вивченні дорослих пацієнтів вакцинували однією дозою вакцини у вигляді лікарської форми, що містить 4 мкг кожного з чотирьох кон'югатів, в перерахунку на полісахарид. Зразки крові брали безпосередньо перед вакцинацією і 28 днів опісля після вакцинації. Антитіла на кожний з кон'югатів певної серогрупи визначали в тесті ELISA, що дало кількість анти-полісахаридного IgG. Метод ELISA дуже схожий з методом вимірювання, що застосовується при вимірюванні кількості IgG-антитіл, що містяться в мишачій сироватці. Коротко, зразки сироватки інкубували в ямках мікротитрувального планшета ELISA, покритих надлишком менінгококового полісахариду, пов'язаного з планшетом за допомогою метильованого альбуміну сироватки людини. Кількість пов'язаних антитіл визначали реакцією з моноклональними антитілами миші проти IgG людини, кон'югованих з пероксидазою хріну. Подальша реакція з пероксидазним субстратом давала хромогенні продукти, виміряні спектрофотометричним способом. Одержана оптична щільність хромофору корелювала з кількістю IgG-антитіл в сироватці, пов'язаних з менінгококовим полісахаридом на мікротитрувальному планшеті. Кількість антитіл визначали шляхом порівняння з контрольною сироваткою людини (CDC1922) з відомим вмістом антитіл, використовуючи метод 4-и-параметричної логістичної кривої. 22 Додатково визначали здатність антитіл викликати лізис бактерій певних серогруп. Зразки сироватки були спочатку інактивовані шляхом нагрівання до руйнування комплемента. Зразки сироватки розводили двократно на стерильному мікротитрувальному планшеті з 96 ямками. Бактерії певних серогруп разом з комплементом маляти кролика додавали в розчини сироватки та інкубували. Після періоду інкубації додавали агарове покриття в суміш сироватка/комплемент/бактерія. Агаровому покриттю давали можливість затвердіти і потім інкубували протягом ночі при 37°С при вмісті вуглекислого газу 5%. Наступного дня підраховували присутні в ямках колонії бактерій. Кінцеву точку титрування визначали як величину, обернену максимальному розведенню сироватки, що дає кілінг більше 50% у порівнянні зі значенням в контрольних ямках з комплементом. Дані в таблиці 2 є зведенням середніх концентрацій анти-полісахаридних IgG для кожної серогрупи і середніх значень титру бактерицидних антитіл сироватки (БАС) в сироватці дорослих до і після вакцинації тетравалентною кон'югованою вакциною, у вигляді лікарської форми, що містить 4 мкг полісахариду на дозу. Імунна відповідь на всі кон'югати чотирьох серогруп була задовільна, що порівняно з імунною відповіддю, отриманою за допомогою ліцензійної полісахаридної вакцини як в показнику IgG-антитіл, так і в показнику функціональної бактерицидної антитільної відповіді. Вакцини були визначені як безпечні для даної вікової групи і профіль безпеки був визначений як порівняний з профілем ліцензійної полісахаридної вакцини. Таблиця 2 УКГ (усереднена за групою концентрація) анти-полісахаридного IgG і УТГ (усереднений за групою титр) бактерицидних антитіл сироватки для здорових молодих дорослих, вакцинованих тетравалентною менінгококовою кон'югованою вакциною у вигляді лікарської форми, що містить 4 мкг на дозу полісахариду Імунна відповідь Νдо/Nпісля на серогрупу A 28/28 С 28/28 W-135 28/28 Υ 28/28 IgG УКГ (мкг/мл) [95% С1] До 3,3 [2,3-4,8] 0,4 [0,2-0,7] 0,6 [0,3-1,0] 1,3 [0,7-2,5] У групах раннього віку - діти молодше дворічного віку - імунна відповідь на полісахаридну вакцину була слабкою з очікуваним часом зникнення імунітету один рік. Дітям від 12- до 15-місячного віку вводили одиничну дозу тетравалентної кон'югованої вакцини у вигляді лікарської форми, що містить 4 мкг кожної серогрупи полісахариду на дозу, і через два місяці після першої дози ним вводилась друга доза тетравалентної кон'югованої вакцини. Зразки крові брали до першої і другої вакцинацій і через місяць після другої вакцинації. Після 38,4 [22,2-66,4] 5,5 [3,0-10,1] 5,8 [2,9-11,7] 6,8 [3,2-14,6] БАС УТГ [95% С1] До 487 [231-1027] 16,4 [7,1-37,7] 10,0 [5,9-16,9] 19,0 [8,0-41,2] Після 6720 [4666-154281 1560 [800-40421 609 [250-1481] 390 [143-1061] Антитільні відповіді на кон'югати чотирьох серогруп зведені в таблицю 3. Для кожної серогрупи спостерігались бустерні IgG-антитільна і функціональна бактерицидна антитільна відповіді після другої дози тетравалентного кон'югата. Рівень IgGантитіл, викликаний кон'югованою вакциною порівняний з такою, викликаною ліцензійним полісахаридом для даної вікової групи; після 6 тижнів IgGантитільна відповідь на серогрупу С полісахариду 3,6 мкг/мл (2,96-4,49). Однак рівень бактерицидних антитіл, викликаний кон'югованою вакциною, наба 23 92579 гато вище, ніж такий, що звичайно викликається ліцензійною полісахаридною вакциною для цієї вікової групи - після 6 тижнів титри БАС 7,2 (5,010,4). Передбачається, що причиною такої невідповідності між IgG-антитілами і бактерицидними антитілами в групі раннього віку є те, що полісаха 24 рид викликає високу частку антитіл з низькою авідністю в групі раннього віку. Навпаки, виявляється, що кон'югат викликає набагато велику частку антитіл з високою авідністю. Передбачається, що антитіла з високою авідністю відповідальні за бактерицидну активність. Таблиця 3 УКГ (усереднена за групою концентрація) анти-полісахаридних IgG і УТГ (усереднені за групою титри) бактерицидних антитіл сироватки у здорових дітей раннього віку (вік 1-2 роки), вакцинованих двома дозами тетравалентної менінгококової кон'югованої вакцини, у вигляді лікарської форми, що містить 4 мкг на дозу полісахариду Імунна відповідь на серогрупу Ν1/Ν2 /Ν3 А 8/8/8 С 8/8/8 W-I35 8/8/8 Υ 8/8/8 IgG УКГ [95% С1] До дози 1 До дози 2 Після дози 2 0,2 2,1 4,4 [0,1-0,4] [0,9-4,8] [2,1-9,1] 0,2 1,0 1,5 [0,0-0,7] [0,3-3,1] [0,6-3,6] 0,1 0,6 1,5 [0,1-0,2] [0,2-1,9] [0,8-3,1] 0,3 1,2 4,5 [0,2-0,4] [0,5-2,8] [2,7-7,6] У доповнення до здатності тетравалентної кон'югованої вакцини викликати високу функціональну антитільну відповідь у груп раннього віку в порівнянні з ліцензійною полісахаридною вакциною тетравалентна кон'югована вакцина здатна викликати анамнестичну відповідь, яка показує, що захист, який викликається тетравалентною кон'югованою вакциною згідно з винаходом є тривалим. При створенні тетравалентної кон'югованої вакцини перші дослідження проводили на лікарській формі у вигляді бівалентного АС-кон'югата. Вакцина показала більш широку область дії, ніж діючий ліцензійний моновалентний С-кон'югат, але не захищає від захворювання, що викликається серогрупами W-135 і Y. Клінічне дослідження провели на новонароджених пацієнтах, у яких порівнювали імунну відповідь на бівалентну АС-полісахаридну вакцину з відповіддю на бівалентну АС-кон'юговану вакцину. У цьому дослідженні третю групу новонароджених розглядали як контрольну групу, і вони отримували кон'югат Haemophilus influenzae типу b. Всі три групи, що вакцинуються, отримували одні і ті ж дитячі вакцини. Група бівалентного АС-кон'югата отримала три дози вакцини кон'югата (4 мкг полісахариду на дозу) у віці 6, 10 і 14 тижнів. Група бівалентного АС-полісахариду отримала дві дози вакцини бівалентного АС-полісахариду (50 мкг полісахариду на дозу) у віці 10 і 14 тижнів. Група кон'югата Haemophilus influenzae типу b отримала три дози вакцини кон’югата у віці 6, 10 і 14 тижнів. Зразки крові брали на 6-ому тижні, до вакцинації, і 18-ому тижні, 4 тижні опісля після вакцинації. Коли немовлята досягли 11-12 місячного віку, взяли зразки крові,а діти, які отримали або бівалентну БАС УТГ [95% С1] До дози 1 87 [1,4-55,1] 6,7 [2,0-23,0] 6,2 [2,2-17,2] 5,7 [3,7-8,8] До дози 2 1328 [179-9871] 117 [37,7-365] 22,6 [2,8-185] 98,7 [20,4-478] Після дози 2 3158 [1857-5371] 304 [128-721] 430 [172-1076] 304 [101-920] АС-кон'юговану вакцину, або бівалентну АСполісахаридну вакцину, одержали бустерну дозу АС-полісахариду. Бустерна доза полісахариду вводилась для того, щоб встановити, чи буде у пацієнтів викликана анамнестична відповідь. Результати цього дослідження, як первинна імунна відповідь так і бустерна імунна відповідь, викликана полісахаридом, представлені в таблиці 4 для IgG-антитільної відповіді і таблиці 5 для БАСА-антитільної відповіді. IgG-антитільна відповідь після первинних серій була приблизно однаковою як для полісахаридної, так і для кон'югованої вакцин. Однак бактерицидна антитільна відповідь у пацієнтів, вакцинованих кон'югатом, була істотно вищою, ніж відповідь у пацієнтів, вакцинованих полісахаридом. Як спостерігалось у однорічних пацієнтів, вакцинація новонароджених полісахаридом викликає дуже невелику кількість бактерицидних функціональних антитіл. Антитіла, що викликаються у новонароджених полісахаридною вакциною, приблизно є антитілами з низькою авідністю, тоді як виявляється, що кон'югована вакцина викликає антитіла з високою авідністю, тим самим даючи набагато більш високі титри бактерицидних антитіл. Високий рівень функціональних антитіл, що викликається бустерною дозою полісахаридної вакцини у пацієнтів, які отримали кон'юговану вакцину в серіях первинної вакцинації, показала, що такі пацієнти були примовані на імунологічну пам'ять або Т-залежну антитільну відповідь. У пацієнтів, які отримали полісахаридну вакцину в серіях первинної вакцинації, викликалась помірна відповідь на бустерну дозу полісахариду, що є ознакою Т-незалежної відповіді. 25 92579 26 Таблиця 4 УКГ (усереднена за групою концентрація) анти-полісахаридних IgG у новонароджених на серогрупи А і С до і після як первинних серій імунізації (у віці 6, 10 і 14 тижнів), так і бустерної вакцинації бівалентним АСполісахаридом, введеним у віці 11-12 місяців Імунна відповідь на вакцину серогрупи Серогрупа А: АС-кон'югат Первинна вакцинація УКГ [95% С1] PS бустерна вакцинація УКГ [95% С1] N До Після N До Після 34 АС-полісахарид 35 НІВ-кон'югат 36 Серогрупа С: АС-кон'югат 31 АС-полісахарид 35 НІВ-кон'югат 36 3,4 [2,2-5,4] 3,0 [1,7-5,3] 3,2 [2,2-4,5] 5,8 [4,3-8,0] 5,5 [4,1-7,3] 0,6 [0,4-0,8] 1,6 [0,9-2,8] 2,3 [1,4-3,9] 2,0 [1,2-3,5] 2,8 [2,0-3,9] 5,3 [3,8-7,4] 0,5 [0,3-0,7] 31 30 NA 31 30 NA 0,2 [0,1-0,3] 0,9 [0,5-1,4] NA 7,0 [4,0-12,0] 3,1 [2,0-4,7] NA 0,1 [0,1-0,2] 0,6 [0,3-1,0] NA 8,1 [4,5-14,5] 2,8 [1,7-4,7] NA Таблиця 5 УТГ (за групою усереднений титр) БАС антитіл у новонароджених на серогрупи А і С до і після як первинних серій імунізації (у віці 6, 10 і 14 тижнів), так і бустерної вакцинації бівалентним АС-полісахаридом, введеному у віці 11-12 місяців Імунна відповідь на вакцину серогрупи Первинна вакцинація УТГ [95% С1] N До Після Серогрупа А: АС-кон'югат 34 АС-полісахарид 32 НІВ-кон'югат 35 11,8 [7,2-19,3] 14,7 [8,5-25,4] 11,2 [6,8-18,3] 117 [101-312] 7,0 [4,7-10,5] 6,7 [4,3-10,5] Серогрупа С: АС-кон'югат 34 АС-полісахарид 32 НІВ-кон'югат 36 50,8 [24-107] 62,7 [29-131] 45,3 [21,9-133] 189 [128-278] 25,4 [14,4-44,6] 7,3 [4,7-11,3] У доповнення до переваг, які даний винахід пропонує для поліпшення захисту проти менінгококових захворювань в групі раннього віку і більш широкого захисту проти серогруп А, С, W-135 і Y, тетравалентні кон'югати можуть забезпечити захист від інших патогенів шляхом включення антитільної відповіді на білок-носій. Коли тетравалентна кон'югована вакцина, із застосуванням кон'югата анатоксину дифтерії, була введена новонародженим, ці пацієнти також отримали звичайну дитячу імунізацію, яка включала анатоксин дифтерії. Внаслідок цього, у пацієнтів не було видимого поліпшення антитільної відповіді на анатоксин дифтерії. Однак спостерігалась сильна бустерна відповідь на анатоксин дифтерії, коли кон'югати анатоксину дифтерії вводили пацієнтам, PS бустерна вакцинація УТГ [95% С1] N До Після 24 26 NA 27 26 NA 10,1 [5,6-18,0] 6,1 [3,9-9,5] NA 373 [162-853] 24,1 [11-53] NA 4,6 [3,6-5,6] 4,1 [3,9-4,3] NA 287 [96,2-858] 14,4 [7,9-26,1] NA які паралельно не отримали вакцин, що містять анатоксини дифтерії. Ці пацієнти отримали серію дифтерійного і правцевого токсоїдів і коклюшної вакцини (DTP) за триразовою схемою у 2-, 3- і 4місячному віці. У цьому дослідженні пацієнти отримали або одиничну дозу бівалентної АСкон'югованої вакцини, або одиничну дозу бівалентної АС-полісахаридної вакцини у віці 2-3 років. Зразки крові брали під час вакцинації і 30 днів опісля після вакцинації. У бівалентних АС-кон'югатах використовувався анатоксин дифтерії як білокносій. Імунна відповідь на анатоксин дифтерії для двох груп вакцин представлена у таблиці 6. Як очікувалось, у цих пацієнтів полісахарид не стимулював антидифтерійну імунну відповідь, однак 27 92579 спостерігалась сильна антидифтерійна Імунна відповідь у пацієнтів, що отримали АС-кон'югат. Отже, менінгококова кон'югована вакцина може забезпечити додаткову перевагу, стимулюючи 28 імунну відповідь на білок-носій, таким чином забезпечуючи захист від захворювань, що викликаються Corynebacteria diphtheriae, у разі використання анатоксину дифтерії як білок-носій. Таблиця 6 УТГ (усереднені титри за групою) антидифтерійних антитіл за тестом ELISA в IU/мл у здорових дітей раннього віку, вакцинованих або бівалентною АСОМ-вакциною, кон'югованою з анатоксином дифтерії, у вигляді лікарської форми, що містить 4 мкг полісахариду на дозу, або бівалентною АС-полісахаридною вакциною у вигляді лікарської форми, що містить 50 мкг полісахариду на дозу Імунна відповідь на вакцини групи: АС-кон'югат Nдо/Nпісля АС-полісахарид 103/102 104/103 Антидифтерійні антитіла (ELISA- IU/мл) [95% С1] до після 0,047 21,2 [0,036-0,060] [11,6-38,6] 0,059 0,059 [0,045-0,076] [0,045-0,077] Список літератури: Frasch, C.E., Zollenger, W.D. and Poolman, J.T. (1985) Review of Infectious Diseases 7, pp.504-510. Reido, F.X., Plikaytis, B.D. and Broome, C.V. (1995) Pediatric Infectious Deasese Journal 14, pp.643-657. Artenstein, M.S., Gold, R., Zimmerly, J.G., Wyle, F.A., Schneider, H. and Harkins, С (1970) The New England Journal of Medicine 282, pp.417-420. Peltola, H., Makela, H., Kayhty, H., Jousimies, H., Herva, E., Hallstrom, K., Sivonen, Α., Renkonen, O.V., Pettay, О., Karanko, V., Ahvonen, P., and Sarna, S. (1997) The New England Journal of Medicine 297, pp.686-691. Reingold, A.L., Broome, C.V., Hightower, A.W., Ajello, G.W., Bolan, G.A., Adamsbaum, С, Jones, E.E., Phillips, C, Tiendrebeogo, H., and Yada, A. (1985) The Lancet 2, pp. 114-118. Goldschneider, I., Lepow, M.L., Gotschlich, E.G., Mauck, F.T., Bache, F., and Randolph, M. (1973) The Journal of Infectious Diseases 128, pp.769-776. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Gold, R., Lepow, M.L., Goldschneider, I.f and Gotschlich, E.G. (1977) The Journal of Infectious Diseases 136, S31-S35. Brandt, B.L. and Artenstein, M.S. (1975) The Journal of Infectious Diseases 131, pp.S69-S72. Kayhty, H., Karanko, V., Peltola, H., Sarna, S., and Makela, H. (1980) The Journal of Infectious Diseases 142, pp.861-868. Cessey, S.J., Alien, S.J., Menon, Α., Todd, J.E., Cham, K., Carlone, G.M., Turner, S.H., Gheesling, L.L., DeWitt, W., Plikaytis, B.D., and Greenwood, B. (1993) The Journal of Infectious Diseases 167, pp. 1212-1216. Wyle, F.A., Artenstein, M.S., Brandt, G.L., Tramont, E.G., Kasper, D.L., Altieri, P.L., Berman, S.L., and Lowenthal, J.P. (1972) The Journal of Infectious Diseases 126, pp.514-522. Jennings, H.J., and Lugowski, C. (1981) The Journal of Immunology 127, pp.1011-1018. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601